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COMPOSITIONS DE MICRO-ORGANISMES PROBIOTIQUES, GRANULES LES
CONTENANT, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS UTILISATIONS.
La présente invention a pour objet une composition
probiotique ou prémix comprenant des micro-organismes
probiotiques vivants ou revivifiables et des parois de
levures et/ou des levures désactivées, la présence des parois
de levures et/ou de levures désactivées permettant notamment
la stabilisation des micro-organismes probiotiques. Cette
composition ou prémix peut être utilisé pour la préparation
de granulés qui seront destinés à l'alimentation animale.
Le terme probiotiques désigne des micro-organismes
vivants, qui lorsqu'ils sont ingérés en quantité suffisante
exercent un effet positif sur l'organisme hôte en améliorant
les propriétés de sa flore intestinale au-delà des effets
nutritionnels traditionnels. Ils constituent une alternative
à l'emploi des antibiotiques dans l'alimentation animale. Il
s'agit le plus souvent de bactéries ou de levures présentes
soit dans les aliments soit dans les compléments
alimentaires.
Il existe quatre grands types de probiotiques
- les ferments lactiques (les lactobacilles et les coques),
- les bifidobactéries d'origine humaine ou animale,
- les différentes levures dont les levures de type
Saccharomyces,
- les autres bactéries sporulées, dont Bacillus subtillis et
cereus.
Les micro-organismes tués par la chaleur ne répondent
pas à la définition des probiotiques, même si certains effets
thérapeutiques ont pu leur être attribués.
Par extension, le terme probiotiques désigne
également les aliments contenant de tels micro-organismes.
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Les probiotiques sont de plus en plus utilisés tant en
alimentation humaine qu'en alimentation animale, notamment
comme substitut aux antibiotiques compte tenu notamment d'un
retour à une alimentation plus saine, plus naturelle et plus
respectueuse de l'environnement. En nutrition animale, ces
micro-organismes sont en général ajoutés dans un aliment
granulé par l'intermédiaire d'un prémix contenant également
des vitamines, des oligo-éléments et des acides aminés.
L'introduction des micro-organismes probiotiques dans
les granulés n'est cependant pas aisée, en effet, les micro-
organismes probiotiques sont le plus souvent détruits au
cours du processus de granulation. Cette étape de la
fabrication des granulés est effectuée en présence de vapeur
à des températures comprises entre 60 C et 100 C et sous des
pressions allant de 0,5 à 3,5 bars; température et conditions
d'humidité dans lesquelles les micro-organismes sont
généralement détruits.
Dans la demande de brevet EP 0 694 610, la résistance à
la granulation de levures de l'espèce Phaffia rhodozyma qui
produisent un colorant, l'astaxanthine, et sont utilisées
dans l'alimentation piscicole pour donner la couleur rouge
aux saumons et truites d'élevage, a été améliorée par séchage
en présence d'un sucre comme le glucose.
Cependant, il ne s'agissait pas là de levures
probiotiques qui doivent rester vivantes jusqu'à leur
ingestion par les animaux afin de remplir leurs fonctions.
De façon surprenante et inattendue, les inventeurs ont
trouvé que des micro-organismes probiotiques pouvaient
présenter une stabilité améliorée dans les prémix au cours du
temps par mélange avec des parois de levures et/ou des
levures désactivées en lieu et place des autres supports de
prémix traditionnellement utilisés tels la farine de blé où
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le carbonate de calcium. Cette stabilité améliorée au cours
du temps les rendant alors plus résistants à la granulation.
L'utilisation de parois de levures dans le domaine de la
pharmacologie et de l'agroalimentaire a déjà été décrite. Ces
parois sont utilisées en tant qu'excipient dans la
fabrication de comprimés pharmaceutiques, notamment comme
agent liant à propriétés désintégrantes (Ozeki et al. AAPS
PharmSciTech, 2003;4(3) :E41) ou encore comme composant de
produit d'enrobage (EP 1 159 882, Yuasa et al. Int J. Pharm.,
2002, Apr 26;237(1-2): 15-22). A la connaissance de la
Société Demanderesse, la possibilité de les utiliser pour
améliorer la stabilité de micro-organismes vivants ou
revivifiables n'a cependant pas à ce jour été envisagée.
Il existe donc un réel besoin en micro-organismes
probiotiques qui soient stables au cours du temps de telle
sorte que l'effet escompté sur la santé de l'animal qui les
ingère soit réel.
L'invention a donc pour objet une composition
probiotique ou prémix comprenant :
- de 0,5 à 75 % de micro-organismes probiotiques vivants ou
revivifiables (a) choisis dans le groupe comprenant les
levures probiotiques, les bactéries probiotiques de type
ferments lactiques choisis parmi les lactobacilles, et
bifidobactéries à l'exception des bacillis, et leurs
mélanges,
- de 10 à 95% d'un composé (b) choisi parmi les parois de
levures et les levures désactivées, et
- de 0 à 95 %, d'un complément nutritionnel(c) comprenant
notamment des vitamines, et/ou des oligoéléments, et/ou
des acides aminés, et/ou d'autres additifs destinés à
l'alimentation animale,
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les pourcentages étant exprimés en poids sec par rapport au
poids total de la composition.
Dans la présente invention, on entend par micro-
organismes revivifiables ou viables des micro-
organismes qui, en présence d'un milieu nutritif retrouvent
leur capacité à se diviser et former des colonies.
A titre d'exemple, de levure probiotique on peut citer
les levures probiotiques choisies dans le groupe comprenant
les levures du genre Saccharomyces, de préférence de l'espèce
Saccharomyces cerevisiae, ou du genre kluyveromyces telle que
la Kluyveromyces marxianuset leurs mélanges.
Des exemples préférés de souches de Saccharomyces
cerevisiae sont la souche Saccharomyces cerevisiae Sc47
déposée auprès du NCYC sous le numéro 47, la souche
Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la collection
Pasteur (CNCM) sous le numéro I-1077, la souche Saccharomyces
cerevisiae déposée auprès de la collection Pasteur (CNCM)
sous le numéro I-1079, la souche Saccharomyces cerevisiae
déposée auprès de la collection MUCL sous le numéro 39 885,
la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la
collection CBS sous le numéro 39 493.94, la souche
KZuyveromyces marxianus déposée auprès de la collection
MUCL sous le numéro 39434, et leurs mélanges.
De façon tout à fait préférentielle la composition selon
la présente invention comprend des levures correspondant à la
souche Saccaharomyces cerevisiae Sc47 déposée auprès du NCYC
sous le numéro 47.
Ainsi, selon un mode de réalisation tout à fait particulier,
ladite composition probiotique ou prémix comprend :
- de 0,5 à 75 %, de préférence 5 à 30 % de levures vivantes
ou revivifiables,
- de 10 à 80%, de préférence 25 à 50 % de parois de levures
et/ou de levures désactivées,
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- de 0 à 95 %, de préférence 5 à 80 % de complément
nutritionnel,
les pourcentages étant exprimés en poids sec par rapport au
poids total de la composition.
5 Cette composition est particulièrement adaptée à
l'alimentation des animaux monogastriques.
Les parois de levures, quant à elles, peuvent être
choisies parmi toutes sortes de levures de qualité
alimentaire, par exemple, Saccaharomyces cerevisiae. Plus
particulièrement, les parois de levure proviennent des
levures commercialisées sous les marques PRONARDY ,
SAFMANNAN , ou encore BIOMOS par respectivement les sociétés
Prodessa, Biospringer et Alltech.
Les parois de levures peuvent être obtenues selon les
procédés connus de l'homme du métier, on citera plus
particulièrement l'autolyse des cellules de levures suivie de
la séparation par des moyens physiques de la partie
insoluble, contenant les parois, de la partie soluble.
Dans le cadre de la présente invention, les levures
désactivées sont considérées comme étant des levures dénuées
de tout pouvoir ferment. N'importe quel type de levures
désactivées peut être utilisé pour autant qu'il soit de
qualité alimentaire, par exemple les Saccharomyces. Elles
sont obtenues selon les procédés connus de l'homme du métier,
et plus particulièrement par des traitements thermiques.
Selon un mode de réalisation tout à fait avantageux de
l'invention, les levures désactivées ont un taux de matière
sèche supérieure à 95%.
Lorsqu'un mélange de levures désactivées et de parois de
levures est utilisé, l'origine des levures peut être
identique ou différente.
La composition probiotique de l'invention présente une
homogénéité très satisfaisante.
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Sans vouloir être liés par aucune théorie, la présence
des parois de levure et/ou des levures désactivées dans la
composition ou prémix selon l'invention permet de stabiliser
les micro-organismes probiotiques, par une diminution de la
teneur en eau des micro-organismes probiotiques et une
stabilisation de cette teneur en eau au cours du temps. Cette
teneur en eau augmente par contre fortement lorsqu'on utilise
un support de prémix classique tel que décrit dans l'art
antérieur et comprenant notamment une farine de blé ou un
carbonate de calcium. De plus, l'usage du carbonate peut
engendrer des problèmes d'abrasivité et de ségrégation.
Ainsi selon un mode de réalisation particulier, la
variation du taux de matière sèche des micro-organismes
probiotiques, VA, mesurée selon le Test A suivant est
positive.
Test A :
Au temps To, c'est-à-dire avant le mélange des micro-
organismes probiotiques avec les parois de levures et/ou
levures désactivées, la teneur en matière sèche des micro-
organismes probiotiques est mesurée par la méthode ISO 1741.
On obtient une valeur MSo.
Au temps T= 14 jours, c'est-à-dire 14 jours après le mélange
des micro-organismes probiotiques avec les parois de levures
et/ou levures désactivées, la teneur en matière sèche des
micro-organismes probiotiques est mesurée. On obtient une
valeur MST.
On calcule alors V=[(MST - MSo) /MSo] x 100 .
De façon préférée, la variation du taux de matière sèche
des micro-organismes probiotiques V est supérieure à 0,5%, de
préférence supérieure à 1%.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition
ou prémix selon l'invention comprend en outre un complément
nutritionnel comprenant notamment des vitamines et/ou des
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oligoéléments et/ou des acides aminés et/ou d'autres additifs
destinés à l'alimentation animale.
Les vitamines entrant dans la composition sont choisies
dans le groupe comprenant : la vitamine A, la vitamine D3, la
vitamine E, les vitamines B1, B2, B5, B6, B12, C, PP, la
biotine, l'acide folique, la choline, la vitamine K3, de
l'acide panthoténique, et leurs mélanges.
Les oligoéléments entrant dans la composition peuvent
être des sels minéraux de qualité alimentaire. Ils sont
choisis dans le groupe comprenant : le cuivre, le zinc, le
fer, le manganèse, l'iode, le sélénium, et leurs mélanges.
Les acides aminés entrant dans la composition sont
choisis dans le groupe comprenant : la méthionine, la lysine,
la L-thréonine, le tryptophane, et leurs mélanges.
La composition probiotique ou prémix décrite
précédemment peut être incorporée directement dans les
aliments pour animaux. De façon générale, la composition
selon l'invention est incorporée aux aliments à raison de
5.10' à 5.1010 CFU (Colony Forming Unit) de micro-organismes
probiotiques par kg d'aliment complet, de préférence de 5.108
à 1.1010 CFU par kg d'aliment complet.
Par exemple, quand le micro-organisme probiotique de la
composition selon l'invention est la levure Saccharomyces
cerevisiae Sc47 commercialisée par la Société Lesaffre sous
la marque BIOSAF , la composition selon l'invention sera
incorporée à l'alimentation animale de façon 'à avoir 2,5 à
8.109 CFU de Saccharomyces cerevisiae Sc47 par kg d'aliment
complet.
La composition probiotique décrite ci-dessus peut
également être utilisée dans des granulés probiotiques
destinés notamment à l'alimentation animale.
Ainsi, selon un autre mode de réalisation, l'invention
porte sur des granulés probiotiques qui comprennent :
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- la composition probiotique ou prémix décrite ci-dessus, et
- un mélange nutritionnel adapté à l'espèce animale visée.
De manière générale, les granulés de l'invention sont
constitués de un pour mille en poids de micro-organismes
probiotiques.
Le mélange nutritionnel est un mélange classiquement utilisé
par l'homme du métier pour la préparation de granulés
destinés à l'alimentation animale, sa composition dépend de
l'espèce animale visée mais comprend classiquement des
farines végétales comme par exemple la farine de blé et/ou
des tourteaux de soja ou de colza et/ou de la pulpe de
betterave et/ou la mélasse et/ou de l'urée, dans des
proportions bien connues de l'homme du métier. Le Prémix es.t
ensuite incorporé à des matières premières (aliments) dont la
nature et les quantités dépendent des espèces animales.
Ce mélange nutritionnel est éventuellement enrichi en
vitamines et/ou oligoéléments et/ou acides aminés et/ou
autres additifs destinés à l'alimentation animale qui sont
décrits ci-dessus en relation avec la composition probiotique
de l'invention.
Les granulés de l'invention sont préparés par un procédé
comprenant les étapes suivantes :
- préparation d'une composition ou d'un prémix probiotique
selon l'invention,
- incorporation ladite composition ou prémix à un mélange
nutritionnel adapté à l'espèce animale visée, de
préférence après un temps de latence d'au moins 14 jours ;
- injection de vapeur d'eau à une température comprise entre
60 C et 100 C sous des pressions allant de 0,5 à 3,5 bars
dans le mélange obtenu précédemment et pressage.
De façon avantageuse, la composition ou le prémix
contenant les micro-organismes probiotiques est laissé au
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repos pendant au mois 15 jours, de préférence pendant au
moins 1 mois avant d'être incorporé au mélange nutritionnel.
Les granulés obtenus selon le procédé de l'invention
présentent un taux de survie des micro-organismes
probiotiques très satisfaisant.
Selon un mode de réalisation particulier, le taux de
survie des micro-organismes probiotiques à la granulation
peut être mesuré par le rapport S qui correspond au ratio
entre le nombre de CFU après granulation (CFUaP) et le nombre
de CFU avant granulation (CFUaõ) multiplié par cent. Le taux
de survie des micro-organismes dans les granulés selon la
présente invention est tel que la valeur du rapport S est
supérieure ou égale à 20 %, de préférence supérieure ou égale
à 50 % et plus préférentiellement encore supérieure ou égale
à 70 %.
L'invention porte également sur un procédé pour
améliorer la stabilité de granulés probiotiques comprenant la
préparation d'une composition probiotique ou d'un prémix
comprenant des micro-organismes probiotiques et des parois de
levures et/ou des levures désactivées, et éventuellement un
complément nutritionnel comprenant notamment des vitamines,
et/ou des oligoéléments, et/ou des acides aminés, et/ou
d'autres additifs destinés à l'alimentation animale, cette
composition étant incorporée au mélange nutritionnel avant
l'étape de granulation par injection de vapeur et pressage.
Comme mentionné précédemment, il s'est avéré que la
résistance à la température de granulation réside notamment
dans l'augmentation ou le maintien de la teneur en matière
sèche du micro-organisme probiotique présent dans la
composition selon l'invention.
Les granulés de l'invention, ou obtenus selon les
procédés de l'invention sont destinés à être utilisés dans
l'alimentation animale.
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L'invention permet un apport en micro-organismes
probiotiques contrôlé, étant donné que la quantité de micro-
organismes probiotiques vivants au final dans l'aliment pour
animal représente au moins de 20 % de la quantité utilisée
5 pour la fabrication de la composition selon l'invention ou de
celle des granulés.
La présente invention sera plus précisément décrite et
illustrée dans les exemples et figures à suivre. Il est bien
entendu que ces exemples sont donnés uniquement à titre
10 d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne
constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLES
Exemple 1 : matériel utilisé
Les exemples de la présente invention sont réalisés avec le
matériel suivant :
Les levures probiotiques sont celles commercialisée sous la
marque BIOSAF (dans la suite des exemples seul le terme
BIOSAFO sera employé). Le produit BIOSAF est un concentré de
cellules vivantes de levures Saccharomyces cerevisiae souche
Sc47, 1.1010 CFU/g de BIOSAFO (NCYC - 47). Ce produit est
destiné exclusivement à l'alimentation animale, il se
présente sous la forme de microgranules et présente une
stabilité thermique jusqu'à 80 C.
Les parois de levure utilisées sont constituées de parois de
Sacchromyces cerevisiae et préparées par autolyse suivie de
centrifugation.
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Les levures désactivées utilisées sont constituées de parois
de Saccharomyces cervisiae et préparées par traitement
thermique.
Les caractéristiques physiques sont données dans le tableau 1
ci-dessous :
Parois de levures Levures désactivées BIOSAF
Granulométrie Diamètre médian Diamètre médian Diamètre médian
182,4 m 178,4 .m 1354,2 m
68% des 68% des 68% des
particules particules particules ayant
ayant un ayant un un diamètre
diamètre diamètre compris entre
compris entre compris entre 992,5 et 1847,8
80,6 et 412,8 103,9 et 306,4 m
m m
Parois de levures Levures désactivées BIOSAF
Masse 0,452 0,629 0,797
volumique
apparente
g/cm3
Humidité % 3,5 4,5 7,0
Exemple 2
2.1 Préparation des prémix
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On prépare manuellement les différents mélanges (prémix 1 à
3) dont la composition est donnée dans le tableau 2 ci-
dessous:
matériel Prémix 1 Prémix 2 Prémix 3 Prémix 4
BIOSAFO 14% 14% 14% 14%
Parois de 14% 86 % - -
levures
Levures - - - 86%
désactivées
Farine de - - 14% -
blé
Complément 72% - 72% -
nutritionnel
Les pourcentages sont calculés en poids du poids total de
prémix.
Le prémix 3 correspond à une composition entrant dans la
composition de granulés de l'art antérieur.
2.2 - Evolution du taux de matière sèche
Le taux de matière sèche du BIOSAF présent dans chacun des
prémix 1 à 3 a été mesuré suivant la norme officielle ISO
1741 aux temps T= 1 jour, 2 jours, 7 jours et 14 jours.
Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure 1.
La variation de la teneur en matière sèche selon le Test A
est donnée dans le tableau ci-dessous
V = [ (MST - MSo) /MSo] x 100
Prémix / Temps de 1 jour 2 jours 7 jours 14 jours
contact
Prémix 1 + 0,1 % + 0,5% + 0,6% + 0,7%
Prémix 2 + 0,4% + 0,5% + 0,8% + 1,2%
Prémix 3 - 0,9% - 0,9% -1,0% - 1,2%
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Il est important de noter que le temps de contact entre le
BIOSAF et les autres composés du prémix joue un rôle
primordial, puisqu'il correspond à la mise en équilibre des
humidités des produits. Si le facteur temps est défavorable à
un mélange BIOSAF - farine de blé, il doit être au minimum
de 14 jours dans le cas de support à base de parois de
levures et/ou de levures désactivées.
Exemple 3
Des études antérieures ont montrées que le procédé de mélange
peut endommager le produit BIOSAF , le rendant plus apte à
capter l'humidité ambiante. Il était donc indispensable de
fabriquer les prémix parois de levures - BIOSAF dans des
conditions industrielles pour confirmer l'effet positif
desdites parois de levures.
3.1 Préparation de prémix selon un procédé industriel
Le Biosaf est stocké dans un silo haut de 5 à 6 mètres. Lors
d'une fabricatiôn, les levures sont transportées sur 50
mètres vers la mélangeuse via un transporteur pneumatique
vertical (transfert en phase dense) de 10 cm de diamètre. Une
arrivée d'air (préalablement traité, séché et refroidi),
permet de pousser le produit à travers le transporteur par
une succession de bouchons d'air et de bouchons de produit.
En sortie du transporteur, une benne peseuse contrôle le
poids du produit avant d'entrer dans la mélangeuse à socs où
est introduit simultanément le mélange. La mélangeuse
utilisée est une mélangeuse à socs, sa vitesse de rotation
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est de 120 tours/min, et la durée du mélange est de 60
secondes. Le prémix final est alors dirigé vers un
conditionnement en sacs ou en vrac.
La composition des prémix réalisés industriellement est
donnée dans le tableau ci-après
matériel Prémix Prémix Prémix 5
ibis 3bis
BIOSAFO 14% 14% 56%
Parois de 14% - 44%
levures
Levures - - -
désactivées
Farine de - 14% -
blé
complément 72% 72% -
nutritionnel
3.2 - Evolution du taux de matière sèche
L'évolution du taux de matière sèche de BIOSAF en
fonction du temps de ces différents prémix a été mesurée
comme dans l'exemple 2.
De la même façon que pour des prémix réalisés de façon
manuelle, le taux de matière sèche de BIOSAF diminue dans le
prémix comprenant de la farine de blé (prémix 3bis) . il
passe de 93% à 91,7%.
Le taux de matière sèche dans les prémix selon
l'invention reste stable dans le prémix ibis (14% de parois
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de levures), mais augmente de 0,3% après un mois de contact
dans le prémix 5 (44% de parois de levures).
L'effet des parois de levures sur l'humidité de BIOSAF
est moins important lorsque le mélange est préparé dans des
5 conditions industrielles, néanmoins il n'y a pas une baisse
de la matière sèche de BIOSAF comme observée avec les
supports de prémix classiques (à base de blé par exemple).
Exemple 4
4.1 Préparation de granulés.
Des essais de granulation ont été réalisés sur une
presse de laboratoire à filière discoïdale plate fixe (Presse
KAHL.14 - 175 de 3 kW, ayant un diamètre et une épaisseur des
canaux respectivement de 4 et 20mm (soit un taux de
compression de 5)). Le conditionneur (INRA, Nantes, France) à
32 pales rotatives est long de 544 mm et possède un volume
3.75 1. Le moteur de 2.2 kW est contrôlé par un régulateur de
vitesse qui règle le débit. Les températures sont fixées au
niveau du conditionneur (à 80 et 90 C).
Deux lots de granulés ont été préparés dans les conditions
définies ci-dessus. Un premier lot de granulés a été préparé
avec une température d'injection de vapeur d'eau de 80 C, et
un second lot à une température d'injection de vapeur d'eau
de 90 C.
Les prémix ont été utilisés immédiatement après leur
préparation.
La composition des granulés est donnée ci-après
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Granulé 1 Granulé 2
Blé 29.3% 29.3%
Tourteau de soja 25% 25%
Tourteau de colza 20% 20%
Pulpe de betterave 20% 20%
Mélasse 3% 3%
Urée 2% 2%
Prémix 3 bis 0.7% -
Prémix 5 - 0.7%
4.2. Etude de la résistance à la granulation
Pour chacun des lots de granulés, le taux de survie du
BIOSAF a été mesuré. Les résultats sont donnés ci-après
granulé 80 C 90 C
Granulé 1 9,4% 2,6%
Granulé 2 23,9% 5,4%
Modes de calcul :
% résistance ou taux de survie = quantité de cellules revivifiables dans les
granulés
(en CFU/g) X 100 / quantité de cellules revivifiables dans la composition de
granulation juste avant granulation (en CFU/g).
Les résultats montrent un taux de survie très bas attestant
d'une très faible résistance à la granulation du BIOSAF
incorporé au prémix 3bis (granulés 1) par rapport à des lots
de BIOSAF incorporés dans le prémix 5 selon l'invention
(granulés 2).
Exemple 5
De la même façon que dans l'exemple 4, des granulés ont été
préparés à l'aide des prémix 3bis et 5 dont la composition
est donnée dans l'exemple 3. Cependant, ces prémix avaient
été préparés un mois avant la granulation.
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Granulé 1 Granulé 3
Blé 29.3% 29.3%
Tourteau de soja 25% 25%
Tourteau de colza 20% 20%
Pulpe de betterave 20% 20%
Mélasse 3% 3%
Urée 2% 2%
Prémix 3 bis 0.7% -
Prémix 5 - 0.7%
4.2. Etude de la résistance à la granulation
Pour chacun des lots de granulés, la résistance à la
granulation a été évaluée par détermination du taux de survie
du BIOSAF~. Les résultats sont présentés ci-après
granulé 80 C
Granulé 1 4,6%
Granulé 2 27,9%
Il en ressort que les granulés conformes à l'invention ont
une résistance à la granulation et donc un taux de survie six
fois plus important.
