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WO 2008/009859 1 PCT/FR2007/051686
Modulateurs de SCARB-1 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs
du récepteur
SCARB-1, pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés
associés à une
hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou
pronostic in
vitro de ces pathologies.
Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une
excrétion
exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200 g/cm2
mesuré
au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une
peau
grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un
grain de
peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir
de
support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P.
acnes en
particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions
acnéiques.
Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les
androgènes.
L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous
dépendance
hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de
traitement pour
les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande
sébacée.
Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou
des
agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande
surrénale. Les
anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la
spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant, ces
agents
présentent des effets secondaires sévères. Ainsi, toute grossesse doit être
absolument
empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le fcetus mâle.
Ces agents
sont prohibés chez les patients masculins.
Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des
hormones
stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique
similaire, mais avec
des effets secondaires réduits.
La demanderesse a maintenant découvert que le gène codant pour le récepteur
SCARB-
1 était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression
était régulée
par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande préputiale de souris.
Elle propose
dès lors de cibler le gène SCARB-1 ou son produit d'expression, pour prévenir
ou
améliorer les phénomènes d'acné, ainsi que les désordres cutanés associés à
une
hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse.
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Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés
vulgaires,
comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore
les
acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou
professionnelle.
La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic, in vitro ou
pronostic in
vitro, basées sur la détection du niveau d'expression ou d'activité du SCARB-
1.
SCARB-1
Les récepteurs éboueurs ("scavengers") sont des protéines de surface
cellulaire, qui sont
typiquement trouvées sur les macrophages et qui se lient à divers types de
lipoprotéines
modifiées, telles que les lipoprotéines de basse densité (LDL). Cette famille
de récepteurs
transmembranaires, qui présente une grande diversité structurelle, est
impliquée dans
l'endocytose et la phagocytose des cellules apoptotiques et des bactéries,
ainsi que dans
l'adhésion cellulaire. Ces récepteurs interviendraient aussi dans le dépôt du
LDL
cholestérol des macrophages au niveau des parois des artères coronaires, au
cours des
premières phases de la formation d'une plaque d'athérosclérose.
SCARB-1 ("scavenger receptor class B, member 1", désigné également SRB-1, ou
Cla-1)
appartient à la famille des récepteurs "éboueurs" ("scavengers"), de classe B,
et est un
récepteur des lipoprotéines de haute-densité, qui médie l'incorporation de
cholestérol
dans les cellules. SRB-1 peut aussi servir de récepteur à des lipoprotéines
non-HDL et
jouerait un rôle important dans le transport inverse du cholestérol.
L'expression de ce
gène serait induite par la testostérone dans des macrophages et des
hépatocytes en
culture (Langer et al, Biochem Biophys Res Commun. 2002, 296(5) :1051-1057).
Millena
et al (Mol Cell Endocrinol, 2004, 224(1-2) :29-39) ont, de leur côté, montré
qu'une
augmentation de la production androgénique en réponse au TGFP était associée à
des
niveaux élevés d'ARNm de SCARB-1.
Dans le contexte de l'invention, le terme gène SCARB-1 ou acide
nucléique
SCARB-1 signifie le gène ou la séquence nucléique codant pour un récepteur
transmembranaire SCARB-1. Si la cible visée est de préférence le gène humain
ou son
produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules
exprimant un
récepteur SCARB-1 hétérologue, par intégration génomique ou expression
transitoire
d'une séquence d'acides nucléiques exogène codant pour l'enzyme (par exemple
une
enzyme d'un autre organisme).
Une séquence d'ADNc humain de SCARB-1 est reproduite en annexe (SEQ ID No.1).
Il
s'agit de la séquence NM005505 dont la partie codante se situe de l'acide
nucléique 70 à
1599.
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Applications diagnostiques
Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de
suivi de
l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une
hyperséborrhée
chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité du
SCARB-1,
de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs,
dans un
échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un
sujet
contrôle.
L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine
SCARB-1
par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode,
notamment
pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm
correspondant,
par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du SCARB-
1 peut
être également envisagé.
Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet contrôle est un sujet sain .
Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre
cutané lié
a une hyperséborrhée, le sujet contrôle fait référence au même sujet à un
temps
différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette
mesure de la
différence d'expression ou de l'activité du SCARB-1, ou d'expression de son
gène ou
d'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre
l'efficacité d'un
traitement, notamment un traitement par un modulateur du SCARB-1, tel
qu'envisagé plus
haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à
une
hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou
à la
nécessité, de poursuivre ce traitement.
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de
détermination
d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un
désordre cutané
associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de
l'activité
du SCARB-1, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses
promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un
échantillon
biologique d'un sujet contrôle.
Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de
la protéine
SCARB-1 par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode,
notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm
correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de
l'activité du
SCARB-1 peut être également envisagé.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble
cutané lié à
une hyperséborrhée ou une acné. Le sujet contrôle , dans cette méthode,
signifie un
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sujet ou une population de référence saine . La détection de cette
susceptibilité permet
la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des
signes liés
à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon
biologique testé peut
être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une
biopsie. De
préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la
peau,
obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de
sébum.
Méthodes de criblage
Un objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés
candidats pour
le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés
associés à une
hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à
moduler
l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1 ou l'expression de son gène ou
l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du
composé pour le
traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à
une
hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables
de
moduler l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1, ou l'expression de
son gène, ou
l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage
de composés
candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des
désordres cutanés
associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes :
a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges
réactionnels ;
b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un
ou plusieurs des composés à tester ;
c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine SCARB-1, de
l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses
promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges
réactionnels ;
d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou
de l'activité de la protéine SCARB-1, de l'expression de son gène ou de
l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans
l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au
mélange non traité.
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Par modulation , on entend tout effet sur l'expression ou l'activité du
récepteur,
l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à
savoir
éventuellement une stimulation (c'est à dire une activité agoniste), mais de
préférence
une inhibition, partielle ou complète (c'est à dire une activité antagoniste).
La différence
d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé
en
l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement,
par
expression d'une protéine , on entend la quantité de cette protéine
Par activité d'une protéine , on entend son activité biologique ;
Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à
déclencher la
transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc
indirectement
la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine
naturelle ou
avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de
composés
chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non
caractérisés, ou
d'un mélange de composés.
Différentes techniques peuvent être mises en ceuvre pour tester ces composés
et
identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression
ou de
l'activité du récepteur SCARB-1.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des
cellules
transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie
du
promoteur du gène SCARB-1, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer
l'expression dudit gène rapporteur.
Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un
substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT
(chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta
glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP
(Green
Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur,
ou de son
activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques,
fluorométriques,
ou de chimioluminescence, entre autres.
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Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des
cellules
exprimant le gène SCARB-1, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer
l'expression dudit gène.
La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule
exprimant le gène
SCARB-1 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une
cellule
ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes
d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale,
clitoridienne, ou
encore la glande sébacée de la peau.
II peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique
hétérologue,
codant pour un récepteur SCARB-1, de préférence humain, ou de mammifère.
Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que
par
exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293.
L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par
toute méthode
connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-
dextran,
liposome, virus, électroporation, ou microinjection.
Dans cette méthode, l'expression de SCARB-1 peut être déterminée en mesurant
le taux
de transcription dudit gène, ou son taux de traduction.
Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm
correspondant
produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine
correspondante produite.
L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection
quantitative ou
semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur
l'hybridation
de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles
(Northern
Blot, RT-PCR, protection à la RNase). Il peut être avantageux d'utiliser des
marqueurs de
détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou
autres ligands
(par exemple, avidine/biotine).
En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel
ou par
protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un
ARNm
connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une
hybridation
spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué
(radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un
ARNm connu
dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du
tissu où la
séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions
d'hybridation
lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm
recherché et la
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sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de
ribonucléases
spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés
avec la
sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite
déprotéinisé
et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides
marqués sont
détectés par autoradiographie.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique
du
produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type
polyclonal ou
monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un
anticorps
polyclonal anti-SCARB-1 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un
animal tel
qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière, prélèvement puis
épuisement de
l'antisérum selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un
anticorps
monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler
et Milstein
(Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation
d'anticorps
monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des
anticorps
monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome.
On peut
également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage
("phage
display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont
typiquement
des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du
phage
(par exemple fUSE5 pour E.coli).
Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase
homogène; en
un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à
titre
d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps
de capture est
immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non
limitatifs de
phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de
polystyrène, ou des
particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.
Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de
détection
peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-
anticorps
formés.
La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des
protéines
isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in
vivo) peut être
réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est
rendue possible
grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par
l'hydrolyse
enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les
protéines sont
isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la
digestion
enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée
par
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séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico-
chimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi
séparés est
réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au
spectromètre de masse
(mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une
matrice
connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite
identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple
Mascot).
Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste
à préparer
des mélanges réactionnels comprenant chacun un récepteur SCARB-1 et l'étape c)
décrite ci-dessus consiste à mesurer la capacité de liaison du composé au
récepteur et la
modulation de son activité.
Le récepteur SCARB-1 peut être produit selon des techniques usuelles en
utilisant les
cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à
l'aide de
microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis),
des levures
(par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9
ou Sf21.
La mesure de l'activité se réfère à la détermination de l'activité d'adhésion
cellulaire,
activité de transporteur, d'activité apoptotique, d'activité dans le
métabolisme lipidique,
dans la transduction du signal et/ou dans la sécrétion de cytokine.
Un exemple de méthode de détection est présenté dans TIAN et al., Bio Env Sci,
2005,
18 :265-272. Cette méthode de détection de l'activité du récepteur est basée
sur
l'utilisation de lipoprotéines humaines marquées par fluorescence, les Dil-
lipoprotéines
(Dil-AcLDL et DiLHDL). La mesure de la liaison des Dil-lipoprotéines est
réalisée par
incubation de cellules Sf9, préalablement transformées avec un baculovirus à
une M.O.I
(multiplicité d'infection) de 5 avec des baculovirus possédant ou non la
séquence codante
pour le récepteur SCARB1, dans 50 L de milieu de culture Grace contenant 0,2%
de
BSA (sérumalbumine bovine) avec différentes concentrations de DiL-AcLDL et de
Dil-HDL
à température ambiante pendant quelques heures. Après incubation, les cellules
ont été
lavées deux fois avec un tampon phosphate (PBS) froid, détachées avec une
pipette et
transférées sur une plaque contenant 100 L de PBS. Les résultats ont été
quantifiés avec
un lecteur de fluorescence de plaque. La mesure de l'activité de liaison
spécifique du
récepteur est faite par différence entre l'activité de liaison des cellules
transformées avec
le baculovirus n'exprimant pas le récepteur (contrôle) et l'activité de
liaison les cellules
transformées avec le baculovirus exprimant le récepteur.
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Modulateurs du récepteur
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du récepteur
humain
SCARB-1 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus
pour la
préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de
l'acné, ou
des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de
l'acné, ou des
désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant
l'administration
d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur du récepteur humain
SCARB-
1, à un patient nécessitant un tel traitement.
L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur du récepteur
SCARB-1,
pour le traitement esthétique des peaux grasses.
De manière préférentielle, le modulateur est un antagoniste du récepteur. Le
terme
antagoniste ou inhibiteur se réfère à un composé ou une substance
chimique qui
élimine ou réduit substantiellement l'activité du récepteur SCARB-1. Le terme
substantiellement signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au
moins
35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au
moins 70%
ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui interagit avec,
et bloque, la
liaison du récepteur avec son ligand.
Un inhibiteur préféré interagit avec le récepteur en solution à des
concentrations en
inhibiteur de moins de 1 M, de préférence moins de 0,1 M, de préférence
encore moins
de 0,01 M.
Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide
antisens
d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne
polypeptidique
substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale
mime celle
de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).
Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti- récepteur SCARB-
1, de
préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps
inhibiteur
est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration
plasmatique
d'environ 0.01 g par ml à environ 100 g/ml, de préférence d'environ 1 g par
ml à environ
5 g/m l .
Il peut par exemple s'agir d'un anticorps qui se lie au domaine
extracellulaire collagénique
du récepteur, qui joue un rôle dans la liaison au ligand (Acton, 1993, J.
Biol. Chem. 268
(5): 3530-7). Des exemples d'anticorps neutralisants sont également décrits
dans la
demande W004/80385. D'autres anticorps neutralisants sont connus dans l'art
antérieur
(voir par exemple Frolov, 2000, J. Biol. Chem. 275 (17): 12769-12780).
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L'invention comprend l'utilisation de tels composés antagonistes du récepteur
SCARB-1
pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou tout désordre cutané
associé à une
hyperséborrhée.
D'autres composés modulateurs identifiés par la méthode de criblage décrite
plus haut
sont également utiles.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique,
en
association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions
peuvent être administrées par exemple par voie orale, parentérale, ou topique.
De
préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par
voie orale,
la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de
gélules,
de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules,
d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules
lipidiques
ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la
composition
pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour
perfusion ou pour injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement
destinée au
traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme
d'onguents, de
crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions,
de gels,
de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous
forme de
suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou
polymériques
ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée.
Cette
composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre,
sous forme
aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la
composition
pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une
lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la SCARB-1 allant
de
0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5% en poids par rapport au poids
total de la
composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou
des
combinaisons de ces additifs, tels que
- des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide
parahydroxybenzoïque;
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- des agents stabilisants;
- des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique;
- des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou
le
butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains
chelatants de
métaux.
Les Figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la
portée.
Légendes des Figures
La Figure 1 montre la mesure de l'expression du gène SCARB-1 chez des souris
mâles
gonadectomisés et traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la combinaison
de
DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement
long terme).
A la fin de l'expérience les glandes préputiales ont été enlevées, l'ARN a été
isolé et
l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix.
GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule
DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste
du
récepteur aux androgènes)
DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone
(précurseur
des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en
androgène actif)
DHEA-Flu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de
Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagoniste du récepteur aux androgènes;
qui
bloque les effets des agonistes DHT et DHEA).
Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNm
La Figure 2 est un graphe d'une étude cinétique de 15 à 96 heures. Les points
1_24h et
1_24h(R1) montrent le niveau d'expression de SCARB-1 de souris contrôles (=
souris non
gonadectomisées; duplicata) au point 24 heures. Les points suivants
proviennent de
souris gonadectomisées et indiquent les temps successifs (en heures) de
l'étude
cinétique.
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WO 2008/009859 12 PCT/FR2007/051686
La ligne bleue pointillée représente l'expression dans les souris
gonadectomisées suite au
traitement avec le DHT au temps zéro. La ligne rouge représente l'expression
dans les
souris gonadectomisées sans traitement avec le DHT.
Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNm
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression de SCARB-1 dans la glande sébacée humaine et dans
l'épiderme humain.
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par
traitement à
la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN
totaux ont été
préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme.
L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module
microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les
protocoles fournis
par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A
partir de
l'ADNc double brin on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la
polymérase
T7 et un NTP précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite
fragmentés en
fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont
contrôlées en
utilisant le système Lab on a chip d'Agilent pour confirmer les bonnes
efficacités des
réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé,
rincée et
ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la
Streptavidine.
Après des lavages la puce est scannée et les résultats sont calculés en
utilisant le logiciel
MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque
gène ainsi
que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la
significativité de
l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à
l'hybridation de
l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide s'hybridant parfaitement (
perfect
match ) versus un oligonucléotide qui contient une mutation ( single
mismatch ) dans
la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1)
Tableau 1: Mesure de l'expression de SCARB-1 dans l'épiderme et dans la glande
sébacée humaine par utilisation de la technologie Affymetrix.
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Identifiant Nom du Expression Expression Significativité Significativité
Affymetrix gène dans la dans de de
glande l'épiderme l'expression* l'expression*
sébacée humain dans la dans
humaine glande l'épiderme
sébacée humain
humaine
201819_at Récepteur 190 77 1 1
scavenger
membre 1
de la classe
B
(SCARB1)
*Indicateur de la significativité du gène analysé dans l'échantillon indiqué :
présence (=1) ou absence (=0).
Résultats :
Le récepteur SCARB-1 est bien exprimé dans les deux tissus (glande sébacée,
épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée
humaine et
l'épiderme humain montre que SCARB-1 est exprimé plus fortement dans la glande
sébacée humaine.
Exemple 2 : expression de SCARB-1 dans la glande préputiale de souris
A. Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type
sébocytaire et
sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une
taille
suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des
technologies de
microdissection.
L'analyse de l'expression de SCARB-1 dans les glandes préputiales de souris a
été
réalisée dans des conditions de déficience en hormones stéroïdiennes
(notamment en
hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés
ont
ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone
(DHT) ou de
Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des
hormones
androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de
DHEA-
Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux
androgènes
bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces
conditions
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expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non
de
l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques
(Figure 1).
L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix
décrit ci-
dessus.
Résultat:
L'ARNm de SCARB-1 est induit par un traitement chronique pendant 7 jours aux
androgènes dans la glande préputiale.
B. Des souris mâles gonadectomisées et traitées avec le véhicule, ou le DHT.
Une étude
cinétique de l'expression du gène, de 15 minutes à 96 heures, a été réalisée.
Pour cela,
les glandes préputiales ont été prélevées pendant une période allant jusqu'à 4
jours
(traitement androgénique unique - observation d'une cinétique de court terme),
l'ARN a
été isolé, et l'expression des gènes a été analysée par la technique
Affymetrix (Figure 2).
Résultats:
La gonadectomie (qui provoque une déficience d'hormones stéroïdiennes) induit
une
diminution de la quantité d'ARNm de SCARB-1 dans la glande préputiale de la
souris.
L'ARNm de SCARB-1 dans la glande préputiale de la souris n'est pas induit par
un
traitement court terme avec le DHT (effet non visible à 18, 24, 48 et 96
heures).
