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Co-colloïdes supramoléculaires obtenus à l'aide de systèmes
macrocycliques polyanioniques
La présente invention décrit une méthode de dispersion de
substances hydrophobes en phase aqueuse. Une telle méthode est utile
pour de nombreuses applications, notamment pour la formulation de
substances actives pharmaceutiques ou cosmétiques.
L'un des problèmes majeurs rencontré lors du développement et
de l'utilisation de nombreuses substances biologiquement actives réside
dans leur nature hydrophobe. En phase aqueuse, les substance's actives
hydrophobes ont tendance à précipiter, limitant ainsi considérablement
leurs concentrations biodisponibles et leurs activités biologiques. Il est
possible d'augmenter la concentration biodisponible de substances
actives hydrophobes en phase aqueuse de plusieurs façons, par exemple,
par inclusion dans des molécule hôtes appropriées, telles que des
cyclodextrines, ou bien par encapsulation dans une dispersion colloïdale
appropriée, telle que des micelles, des liposomes ou des nanoparticules
lipidiques. Les méthodes d'encapsulation peuvent également apporter
une protection des molécules contre la dégradation par la lumière ou par
des réactions enzymatiques. Les autres méthodes qui permettent de
modifier la concentration des substances actives sont l'utilisation de co-
solvants ou de co-solutés ou les modifications de pH. Par ailleurs,
l'utilisation de co-cristaux permet la modification de cinétique de
dissolution et permet ainsi de modifier la signature pharmacocinétique
d'une substance active.
Pour préparer des dispersions colloïdales, on utilise une ou
plusieurs molécules amphiphiles. Une molécule amphiphile -est une
molécule qui combine de façon covalente un groupe hydrophobe apolaire
et un groupe hydrophile polaire. Les molécules amphiphiles ont une
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double affinité, pour les phases apolaires (air, huile, solvants
organiques) d'une part, et pour l'eau, d'autre part. Les lipides sont des
exemples de molécules amphiphiles.
Au dessus d'une concentration critique dans un environnement
aqueux, les molécules amphiphiles sont généralement capables de
s'auto-assembler en formant des structures de nature colloïdale,
caractérisées par la présence de particules en suspension. Le type de
structure colloïdale obtenu dépend de la structure chimique des
molécules amphiphiles, et notamment du rapport de la taille de la tête
polaire et de la taille de la queue apolaire de la molécule.
Les dispersions colloïdales peuvent être utilisées pour augmenter
la concentration biodisponible des substances actives hydrophobes. Le
principe est que la substance active hydrophobe doit être associée avec
les groupements hydrophobes des molécules amphiphiles.
Toutefois, un inconvénient des méthodes utilisant des molécules
amphiphiles réside dans le fait que le pourcentage maximum (appelé
aussi facteur de charge qui est calculé en unité de poids) de substances
actives pouvant être dispersées dans la structure colloïdale est trop
faible, de l'ordre de 5 à 10 %. Un autre inconvénient de ces assemblages
colloïdaux est leur faible stabilité dans le temps, notamment à
température ambiante.
Ces problèmes ont été surmontés par l'utilisation de
nanoparticules lipidiques solides (également connues sous l'abbréviation
SLN .pour solid lipid nanoparticles en anglais) qui regroupe les
nanocapsules et les nanosphères polymériques. De telles structures sont
de nature matricielle. Dans ce cas, les facteurs de charge sont
généralement plus élevés, de l'ordre de 30%, et la stabilité dans le
temps est améliorée.
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Par ailleurs, des méthodes utilisant des produits de la famille des
calix arènes ont été décrites. Ainsi, le brevet US 2005/0240051 Al de N.
Yasuda et M. Furukawa décrit notamment une méthode utilisant des
calix arènes pour solubiliser des matériaux à base de carbone, tels que
des fullérènes, du graphite, du diamant et des colorants, dans un solvant
organique non aqueux tel que le toluène, une huile ou une résine.
Cependant, les calix arènes utilisés dans ce brevet ne sont pas solubles
dans l'eau et ce brevet ne concerne pas une méthode de dispersion des
substances pharmaceutiques ou cosmétiques.
Dans la demande de brevet WO 03/024583, les auteurs décrivent
un système de dispersion dans l'eau utilisant des calix arènes de nature
amphiphile et non hydrophile. Ces calix arènes amphiphiles peuvent
s'auto-assembler spontanément et former des dispersions colloïdales.
L'addition d'une molécule hydrophobe à cette suspension colloïdale de
calix arènes est possible mais n'est pas nécessaire.
Dans deux articles (Eur. J. Pharm. Biopharm., 2004, 58(3), 629-
636 et J. Pharm. Pharmacol., 2004, 56(6), 703-708), W. Yang et MM. De
villiers ont montré qu'il était possible de solubiliser la nifédipine, le
furosémide et la niclosamide (des substances actives d'intérêt
pharmaceutiques très peu solubles dans l'eau) en utilisant des para
sulfonato-calix arènes dans une solution aqueuse acide. Cependant, les
objectifs de ces travaux et les procédés utilisés sont différents de la
présente invention. En effet, W. Yang et MM. De villiers ne décrivent
qu'une méthode de solubilisation et non une méthode de dispersion
colloïdale, notamment caractérisée par la présence de particules.
Plus récemment, les systèmes de co-cristaux, fondés sur des
systèmes d'assemblages supra-moléculaires non-covalents ont été
utilisés pour modifier les propriétés pharmacocinétiques et physiques
des produits pharmaceutiques. Dans ce cas, on utilise les interactions
non-covalentes connues pour qu'un agent cristallisant soit lié à une
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substance pharmaceutique lui conférant ainsi des propriétés physiques,
une stabilité et un taux de dissolution différents.
Au vu de ce qui précède, l'invention a notamment pour but de
mettre en oeuvre une nouvelle méthode consistant à disperser des
substances actives hydrophobes, telles que des substances d'intérêt
pharmaceutiques ou cosmétiques, en solu-tion aqueuse.
L'invention a également pour objet, de proposer de nouvelles
dispersions qui ne présentent pas l'ensemble des inconvénients précités
dans l'art antérieur et en particulier qui sont stables dans le temps.
Enfin, l'invention a également pour objet de proposer de
nouvelles dispersions qui peuvent être utilisées comme véhicules pour
des substances actives hydrophobes d'intérêt pharmaceutique ou
cosmétique.
De manière surprenante et avantageuse, le demandeur vient
maintenant de découvrir que ces buts pouvaient être atteints en mettant
en oeuvre un procédé de dispersion en milieu aqueux d'une molécule
hydrophobe, telle que des substances actives hydrophobes d'intérêt
pharmaceutiques ou cosmétiques, qui comprend une étape consistant à
former un complexe supramoléculaire entre ladite molécule hydrophobe
et ladite molécule hydrophile.
Dans la suite du texte, les dispersions ainsi obtenues dans le
cadre de la présente invention, sont désignées par les termes
dispersions co-colloïdales .
Ainsi, le procédé de dispersion selon l'invention, permet de
générer des dispersions co-colloïdales de molécules actives hydrophobes
en solution aqueuse.
De plus, ces dispersions co-colloïdales sont stables dans le
temps.
Ainsi, selon une première variante de l'invention, il est proposé
une dispersion co-côlloïdale dans un milieu aqueux d'au moins un
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complexe supramoléculaire amphiphile dans laquelle ledit complexe
amphiphile comprend ûne molécule hydrophile et une molécule
hydrophobe associées par des liaisons non covalentes.
La présente invention utilise la formation d'une association
5 inter-moléculaire et non-covalente entre une molécule de substance
active hydrophobe, dite molécule invitée et une molécule hydrophile
hôte appropriée. Cette association résulte dans la formation de
complexes supramoléculaires amphiphiles comprenant une tête polaire et
une queue apolaire. En phase aqueuse, ces complexes supramoléculaires
amphiphiles sont capables de s'auto-assembler et former des suspensions
de particules, caractéristiques des dispersions côlloïdales. La taille des
particules obtenues varie entre 10 nm et 1 m, et préférentiellement
entre 100 et 450 nm.
Cette méthode permet donc de disperser une molécule
hydrophobe dans une phase aqueuse sous forme d'une dispersion de
nature colloïdale. Une phase aqueuse contient au moins 50% d'eau et
peut être constituée par exemple d'eau pure, d'une solution isotonique,
d'un milieu physiologique ou d'un soluté pharmaceutique injectable ou à
usage topique.
Les dispersions co-colloïdales décrites dans la présente invention
diffèrent de toutes les dispersions colloïdales connues, par exemple
celles qui utilisent des lipides, en ce qu'il n'existe pas de liaisons
covalentes dans l'assemblage de l'entité amphiphile. Elles diffèrent
donc également de toutes les dispersions colloïdales connues en ce que
la molécule hydrophobe que l'on veut disperser est nécessaire à la
formation de la structure colloïdale formée en milieu aqueux.
Ainsi, à l'inverse des dispersions colloïdales décrites dans la
demande de brevet WO 03/024583, les dispersions co-colloïdales selon
la présente invention sont constituées par l'assemblage de deux
molécules, l'une hydrophile et l'autre hydrophobe formant un complexe
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supramoléculaire amphiphile; ainsi, aucune des deux molécules ne peut
former une dispersion colloïdale quand elle est utilisée seule. Il s'agit
donc bien d'états de matière différents.
Les molécules hôtes hydrophiles qui sont utilisées dans
l'invention utilisent notamment des dérivés de la famille des calix
arènes, et préférentiellement des calix arènes hydrosolubles anioniques,
par exemple les molécules de para-sulfonato calix[4]arène et de para-
sulfonato calix[6]arène.
Par hydrophile, on entend au sens de la présente invention, un
composé soluble dans l'eau qui est capable de créer des liaisons
hydrogènes avec les molécules d'eau.
En particulier, les calix arènes utilisés dans la présente invention
sont des composés hydrophiles étant donné qu'ils portent des fonctions
polaires et ionisables.
Les calix arènes utilisées dans la présente invention présentent la
formule générale (I)
R1
R3 R4
(R5),, R6)y
-[ ~ ~]-
n
R2
dans laquelle,
- R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupement polaire,
tel qu'un hydroxyl, un carboxylate, un sulfonate, un phosphonate, un
sulfonamide ou un amide, ou un groupement alkyle, alcène ou alcyne,
linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitués, notamment par
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un groupement polaire, et préférentiellement un atome d'hydrogène ou
un groupe sulfonate.
- R2 représente un groupe polaire, tel qu'un hydroxyle, un
carboxylate, un sulfonate, un phosphonate, un sulfonamide, un amide, un
ester ou un alkyl, ramifié ou substitué par un groupement polaire et
préférentiellement un hydroxyle si R1 est un sulfonate ou un groupe
phophonate si R1 est un atome d'hydrogène.
- R3 R4, R5, R6 représentent chacun indépendamment un atome
d'hydrogène, un groupe allcyle, alcène ou alcyne, éventuellement
substitué, notamment par un groupement polaire, en particulier des
fonctions hydroxyles, substituées ou pas, et préférentiellement un atome
d'hydrogène.
- X représente un atome de carbone, (lorsque x=1 et y=l) de
soufre ou d'oxygène (lorsque x=0 et y=0) ou d'azote (lorsque x=l et
y=0) ;
- n est un nombre compris entre 4 et 8.
Les substances actives hydrophobes invitées susceptibles d'être
dispersées en phase aqueuse selon l'invention sont très nombreuses. Les
exemples décrits ci-dessous montrent que l'invention permet de
- disperser sous forme de dispersions co-colloïdales des molécules ayant
des structures chimiques très différentes. Les expériences conduites
montrent que les molécules à disperser doivent présenter une partie
hydrophobe et des groupes chimiques qui permettent les interactions de
nature non covalente avec les molécules hôtes hydrophiles. Les
interactions de nature non-covalentes mises en jeu peuvent inclure des
liaisons hydrogènes, des interactions ion-ion, des interactions ion-
dipôle, des interactions cation-n, des interactions z-7i, des forces de Van
Der Walls ou des interactions hydrophobes. La taille de la substance
active hydrophobe ne constitue pas une condition restrictive.
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Ainsi la présente invention a également pour objet un procédé de
dispersion en milieu aqueux d'une molécule hydrophobe d'intérêt
pharmaceutique comprenant une étape consistant à former un complexe
amphiphile supramoléculaire entre ladite molécule hydrophobe et une
molécule hydrophile.
En variante, il est également proposé un procédé de dispersion en
milieu aqueux d'un agent cosmétique hydrophobe comprenant une étape
consistant à former un complexe amphiphile supramoléculaire entre ledit
agent hydrophobe et une molécule hydrophile.
La présente invention concerne également un procédé
permettant d'obtenir des dispersions co-colloïdales qui consiste à
ajouter une composition comprenant, dans un solvant organique, au
moins un calix arène hydrosoluble anionique à une composition
comprenant, dans un solvant organique, une molécule hydrophobe, à
ajouter un solvant aqueux puis à éliminer ledit solvant organique.
En particulier, le procédé permettant d'obtenir des dispersions
co-colloïdales est le suivant.
1.) Solubilisation des molécules en solvant organigue.
La molécule hôte et la molécule invitée sont préalablement
solubilisées séparément dans un solvant organique puissant,
préférentiellement le tétrahydrofurane (THF). Les quantités de produits
et les volumes de solvant sont déterminés en fonction des concentrations
et du volume final souhaités. Par exemple, à l'échelle du laboratoire,
pour obtenir une dispersion co-colloïdale de substance active à une
- concentration finale de 50 mg/L, on solubilise 2,5 mg de molécule hôte,
préférentiellement le para-sulfonato calix[4]arène, dâ.ns 5 mL de THF et
on solubilise séparément 2,5 mg de substance active dans 5 ml de THF.
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2.) Formation du co-colloïde.
Les deux solutions sont ensuite mélangées à part égale (5 mL
pour une préparation à l'échelle du laboratoire) et maintenues sous
agitation constante, par exemple avec un agitateur magnétique réglé à
350 tours par minutes ou un appareil de type Vortex. Puis, le solvant
final, par exemple de l'eau pure (50 mL), est progressivement ajouté
avec un débit fixe de 200 mL/s et en maintenant une agitation constante
pendant une demi-heure.
3.) Formation du co-colloïde.
Le solvant organique initial est ensuite éliminé,
préférentiellement par évaporation, par exemple en plaçant la dispersion
pendant 15 minutes, sous pression réduite et à une température de 40 C.
La dispersion co-colloïdale finalement obtenue apparaît homogène,
légèrement opaque à l'examen visuel, montrant ainsi que la substance
active hydrophobe a été dispersée de façon homogène.
Les conditions techniques (volumes de solvant, quantités de
produits, durée de chaque phase, etc.) indiquées ci-dessus sont données
à titre d'exemple et peuvent, bien entendu, être adaptées en fonction de
la nature de la substance active hydrophobe, ainsi que des volumes et
des concentrations finales souhaitées.
Les substances actives qui peuvent être dispersés selon
l'invention incluent par exemple des substances actives sur le système
nerveux périphérique et central, sur les fonctions rénales,
cardiovasculaires, gastro-intestinales, sanguines, immunes, hormonales,
génitales ou reproductives, des anti-inflammatoires, des anti-
parasitaires, des antibiotiques, des anticancéreux, des antidotes, des
vitamines, des produits pour la nutrition parentérale ou des produits à
usage dermatologique, topique ou ophtalmologique.
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Les substances actives hydrophobes d'intérêt pharmaceutique qui
peuvent être dispersées sous forme de co-colloïdes incluent par exemple
la penclomédine, le tamoxifène, la tétracaïne, la chlorhexidine, la
mifepristône, l'étoposide, la clarithromycine, le benzafibrate,
5 l'azithromycine, l'itraconazole, le propofol, le palmitoyl de rhizoxin, le
clofibrate, l'acide clofibrique, le gemfibrozil, l'acediasulfone,
l'acétophenetidine, le l-acétyl-2-phénylhydrazine, l'alexidine, le
chlorate d'ambenomium, l'amidinomycine, le p-chlorobenzhydrazide, la
2,3-diaminophénazine, le dichlorphénamide, la divicine, etc.
10 Par hydrophobe, on entend au sens de la présente invention, une
substance active dont la solubilité dans l'eau est insuffisante pour
préparer des formulations à des concentrations suffisamment élevées
pour obtenir l'activité recherchée.
De préférence, les substances actives hydrophobes d'intérêt
pharmaceutique pouvant être dispersées sous forme de co-colloïdes
incluent le tamoxifène, la tétracaïne, la chlorhexidine, la mifepristone,
la thalidomide et les molécules de la famille des taxanes.
Les taxanes constituent un groupe de produits pharmaceutiques,
incluant notamment le docétaxel et le paclitaxel, qui sont utilisés dans le
traitement du cancer. Les taxanes ont la propriété de prévenir la
croissance des cellules cancéreuses en interférant avec des structures
cellulaires appelées microtubules qui jouent un rôle essentiel pour la
division cellulaire.
Les microtubules se forment quand les cellules commencent à se
diviser et sont détruits après la division cellulaire. Les taxanes
empêchent la destruction des microtubules et empêchent ainsi les
cellules de se diviser.
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Le docétaxel et la paclitaxel sont ainsi administrés aux patients
par voie intraveineuse pour le traitement de maladies cancéreuses,
notamment pour les cancers du poumon, de la prostate, de l'ovaire ou du
sein.
Le docétaxel et le paclitaxel sont des molécules peu solubles
dans l'eau. Ainsi la préparation d'une formulation pharmaceutique à
base de docétaxel nécessite généralement de solubiliser préalablement le
docétaxel dans un mélange à base d'éthanol et de polysorbate, puis de
diluer la solution ainsi obtenue dans une solution aqueuse. Cette
solution transparente est ensuite injectée sous forme de perfusion
intraveineuse.
Toutefois, la présence résiduelle de polysorbate dans une telle
solution peut entraîner des effets toxiques significatifs lors de
l'administration de ladite solution par voie intraveineuse. Ces effets
toxiques peuvent nécessiter de pré-traiter les patients avec un
médicament anti-inflammatoire.
Ainsi, le procédé selon l'invention présente l'avantage de
disperser le docétaxel en milieu aqueux sans utiliser de polysorbate. On
obtient donc une formulation pharmaceutique moins toxique qui peut
être administrée par voie intraveineuse.
Par ailleurs, lorsque le médicament sous forme d'une dispersion
co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile
comprenant au moins un calixarène anionique hydrosoluble et du
docétaxel est administré, ce médicament présente l'avantage
supplémentaire de conduire à un effet anti-cancéreux satisfaisant.
La présente invention concerne donc un médicament
anticancéreux sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu
aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un
calix arène anionique hydrosoluble et d'une molécule de la famille des
taxanes.
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En particulier, la présente invention a pour objet un médicament
sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au
moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calix arène
anionique hydrosoluble et du docétaxel.
Plus particulièrement, l'invention concerne un médicament sous
la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un
complexe amphiphile comprenant au moins un calix arène anionique
hydrosoluble et du docétaxel pour son utilisation par voie intraveineuse
pour le traitement des maladies cancéreuses.
10- En particulier, ce médicament est utilisé pour le traitement du
cancer du sein et des poumons.
Le docétaxel peut être présent dans la dispersion co-colloïdale
dans une concentration allant de 0,01% à 1% en poids, par rapport au
poids total de la dispersion.
Par ailleurs, la thalidomide est une molécule connue pour ses
propriétés anti-angiogène. Ces propriétés en font un médicament utilisé
pour le traitement d'une forme de cancer appelé myélome multiple.
La thalidomide est un médicament généralement administré par
voie orale. Par ailleurs, il n'existe pas de formulation pharmaceutique
de la thalidomide permettant une administration par voie parentérale.
Ainsi, le procédé selon l'invention présente l'avantage de
disperser la thalidomide en milieu aqueux. On obtient donc une
formulation pharmaceutique qui peut être administrée par voie
parentérale, par exemple par voie intraveineuse, intramusculaire,
souscutanée ou intravitréale.
La présente invention a donc également pour objet un
médicament sous la forme -d'une dispersion co-colloïdale en milieu
aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un
calixarène anionique hydrosoluble et de la thalidomide.
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En particulier, ce médicament peut être administré aux patients
atteints de cancer et pour lesquels 1'administration par voie orale est
difficile voire impossible.
En effet, certains patients présentent des lésions de la région
buccopharyngée ou de l'oesophage qui rendent l'administration de
niédicaments par voie orale très difficile. Dans ce cas, la thalidomide
préparée peut être administrée par une voie parentérale, et notamment
par la voie intraveineuse.
En particulier, la thalidomide peut également être administrée
aux patients par voie intravitréale pour le traitement de la
dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA).
La DMLA est une maladie de la rétine provoquée par une
dégénérescence progressive de la macula, partie centrale de la rétine,
qui apparaît le plus souvent à partir de l'âge de 50 ans, et plus
fréquemment à partir de 65 ans, provoquant un affaiblissement important
des capacités visuelles, sans toutefois les anéantir.
La DMLA est caractérisée par l'apparition de ' néovaisseaux
choroïdiens. Ces derniers sont soit sous-épithéliaux, c'est-à-dire qu'ils
se développent sous l'épithélium pigmentaire et donc dits, "occultes",
soit sus-épithéliaux et donc dits "visibles". A cause des ses propriété
antiangiogène, la thalidomide peut prévenir le développement de ses
nouveaux vaisseaux et donc contribuer à stabiliser la progression de la
maladie.
La présente invention concerne ainsi plus particulièrement un
médicament sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu
aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un
calixarène anionique hydrosoluble et de la thalidomide pour son
utilisation par voie intravitréale pour le traitement de la dégénérescence
maculaire liée à l'âge.
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La thalidomide peut être présente dans la dispersion co-
colloïdale dans une concentration allant de 0,01% à 1% en poids, par
rapport au poids total de la dispersion.
Les dispersions co-colloïdales peuvent également contenir des
additifs divers tels que des régulateurs de pression osmotique, par
exemple le sucrose ou la glycérine, des oxydants tels que l'alpha-
tocophérol ou l'acide ascorbique ou des conservateurs tels que le
méthyl, l'éthyl- et le butyl-parabène.
Les compositions à usage cosmétique de l'invention incluent des
préparations pour la peau ou les cheveux, tels que des shampoings, des
préparations à usage cutané ou des lotions de protection solaires.
Les exemples qui suivent sont destinés à mieux comprendre
l'invention sans présenter un caractère limitatif. Ces exemples sont
illustrés par les figures 1 à 4 annexées représentant les dispersions co-
colloïdales conformes à la présente invention qui ont été caractérisées
au moyen de différentes techniques d'analyse.
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EXEMPLES
Préparation des dispersions co-colloïdales
5 Les exemples décrits ci-dessous ont permis de caractériser la
méthode de préparation des dispersions co-colloïdales ainsi que de
caracteriser la qualité desdites dispersions.
On prépare une dispersion co-colloïdale selon le procédé décrit
ci-dessus. Ainsi, dans une première solution, on solubilise 2,5 mg de
10 para-sulfonato calix[4]arène (désigné C4S dans les tableaux ci-dessous)
dans 5 mL de THF et on solubilise séparément, dans une deuxième
solution, 2,5 mg de tamoxifène (anticancéreux) dans 5 mL de THF. Le
tamoxifène est une substance active hydrophobe.
Les deux solutions sont ensuite mélangées à part égale et
15 maintenues sous agitation constante avec un agitateur magnétique réglé
à 350 tours par minutes ou un appareil de type Vortex. 50 mL d'eau pure
est ensuite progressivement ajoutée avec un débit fixe de 200 mL/s tout
en maintenant une agitation constante pendant une demi-heure.
On évapore ensuite le THF en plaçant le mélange pendant 15
minutes, sous pression réduite à une température de 40 C.
A la suite de ce procédé, on obtient une dispersion co-colloïdale
ayant une concentration finale en tamoxifène et en para-sulfonato
calix[4]arène de 50mg/L. La dispersion co-colloïdale apparaît homogène
et légèrement opaque à l'examen visuel, ce qui indique que le
tamoxifène a été dispersée de façon homogène.
Ce procédé a été réalisé à trois reprises en utilisant le para
sulfonato calix[6]arène (désigné par le terme C6S dans les tableaux ci-
dessous) et le tamoxifène à différentes concentrations afin d'obtein.ir des
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dispersions co-colloïdales ayant des concentrations finales en para
sulfonato calix[6]arène et en tamoxifène différentes.
Ce procédé a également été réalisé à quatre reprises en utilisant
le para sulfonato calix[4]arène et la tétracaïne à différentes
concentrations afin d'obtenir des dispersions co-colloïdales ayant des
concentrations finales différentes en para sulfonato calix[4]arène et en
tétracaïne (anesthésique local).
Ce procédé a été réalisé à deux reprises en utilisant le para
sulfonato calix[6]arène et le para sulfonato calix[4]arène avec la
chlorhexidine (antibiotique) à des concentrations égales.
Ce procédé a été réalisé à deux reprises en utilisant le para
sulfonato calix[6]arène et le para sulfonato calix[4]arène avec la
mifepristone (abortif) à des concentrations égales.
Le tamoxifène, la tétracaïne, la chlorhexidine et le mifepristone
utilisées dans ces préparations sont des substances
pharmacologiquement actives connues pour leur faible solubilité dans
l'eau.
Le tableau suivant indique les dispersions co-colloïdales qui ont
été obtenues ainsi que les concentrations finales en calix arènes
(molécules hôtes) et en substances actives hydrophobes (molécules
invitées) présentes dans de telles dispersions.
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Exemple Molécule hôte (concentration finale) Molécule invitée (concentration
finale)
No
1 C4S (50 mg/1) Tamoxifène (50 mg/1)
2 C6S (50 mg/1) Tamoxifène (50 mg/1)
3 C6S (55 mg/1) Tamoxifène (25 mg/1)
4 C6S (87,4 mg/1) Tamoxifène (12,4 mg/1)
C4S (50 mg/1) Tétracaïne (50 mg/1)
6 C4S (70 mg/1) Tétraca'ine (30 mg/1)
7 C4S (83 mg/1) Tétracaïne (17 mg/1)
8 C4S (50 mg/1) Tétraca'ine (50 mg/1)
9 C4S (50 mg/1) Chlorhexidine (50 mg/1)
C6S (50 mg/1) Chlorhexidine (50 mg/1)
11 C4S (50 mg/1) Mifepristone (50 mg/1)
12 C6S (50 mg/1) Mifepristone (50 mg/1)
Dans tous les cas, on obtient une dispersion co-colloïdale
homogène légèrement blanchâtre. Ainsi, les molécules actives
5 hydrophobes ont été dispersées dans une phase aqueuse alors qu'elles
sont peu ou faiblement solubles dans l'eau. De cette façon, ces
dispersions co-colloïdales peuvent être utilisées comme véhicules pour
des substances actives hydrophobes d'intérêt pharmaceutique.
10 Différentes techniques ont été ensuite employées afin de
caractériser une dispersion co-colloïdale ayant une concentration finale
en tamoxifène et en para-sulfonato calix[6]arène égales à 50 mg/L
(correspondant à l'exemple n 2 dans le tableau' décrit ci-dessus). En
particulier, on a utilisé la diffusion dynamique de la lumière, la
microscopie à force atomique, la microscopie électronique à balayage et
la microscopie électronique à transmission. Ces techniques permettent
une analyse des particules colloïdales en suspension en phase aqueuse
ou après séchage.
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La technique de diffusion dynamique de la lumière (ou DLS pour
Dynamic Light Scaterring en langue anglaise) permet d'obtenir des
informations concernant la taille des particules. Lorsqu'un faisceau
lumineux monochromatique et polarisé rencontre une particule, la
lumière est diffusée dans toutes les directions de l'espace. Les
variations d'intensité de la lumière diffusée sont liées aux taux de
diffusion des molécules dans la région étudiée, car celles-ci sont
animées d'un mouvement brownien. Les données sont directement
analysées pour donner les coefficients de diffusion. Lorsque plusieurs
espèces moléculaires sont présentes, une distribution des coefficients de
diffusion peut être observée. Ces données sont ensuite traitées pour
obtenir le diamètre des particules. En effet, la relation entre le
coefficient de diffusion et la taille est fondée sur les relations
théoriques du mouvement brownien des particules sphériques (loi de
Stockes-Einstein). Ainsi, pour un milieu de viscosité connue, la mesure
du coefficient de diffusion de translation est suffisante pour calculer le
rayon hydrodynamique des particules. La détermination de la taille des
particules en solution est réalisée à température ambiante. Les analyses
sont faites à l'aide d'un spectromètre 4700C MALVERN. La source
lumineuse utilisée est un laser SIEMENS 40MW. Chaque mesure est
répétée dix fois, les tailles et les indices de polydispersité retenus
correspondant à la moyenne des dix mesures.
L'exploration en Microscopie à Force Atomique (ou AFM pour
Atomic Force Microscopy, en anglais) consiste en l'analyse d'une
surface, grâce à une fine pointe de quelques micromètres de long et
d'une centaine d'Angstrôms de diamètre, montée à l'extrémité d'un bras
mobile de silicium, appelé microlevier, ayant une constante de force
connue. Les différents appareils commercialisés présentent diverses
géométries. L'AFM utilisé est basé sur la technique de l'Explorei
(Topometrix Inc.). Dans ce montage, la céramique piézo-électrique
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servant à générer le mouvement de balayage porte le microlevier. Dans
les autres techniques, plus courantes, la céramique porte l'échantillon, le
reste de la tête AFM étant statique. L'équilibre des forces s'exerçant
entre la surface de l'échantillon et la pointe provoque des variations de
position du microlevier. Le signal est collecté sur un photo-détecteur à
quatre cadrans via la réflexion d'un laser sur le microlevier dont on
mesure la déflexion, proportionnelle aux forces agissant sur la sonde.
Ces données sont alors transformées en coordonnées spatiales, générant
ainsi une image de la surface. L'AFM mesure les forces entre la pointe
et l'échantillon. Ces forces dépendent de la nature de l'échantillon et de
la distance entre la pointe et l'échantillon. Lorsque la pointe s'approche
de la surface, elle subit d'abord des forces attractives à longue distance
(forces de van der Waals). Puis, à l'approche de la surface, les orbitales
électroniques de la pointe et de l'échantillon créent des forces répulsives
qui neutralisent les forces attractives avant de devenir les forces
dominantes. Les mesures sont réalisées en utilisant un microscope
"Explorer ThermoMicroscope" équipé d'un scanner delOO m, en mode
non-contact. La vitesse de balayage est de 1-2 Hz. Pour chaque
échantillon les balayages ont été réalisés à 50 m, 20 m, 10 m et 5
m. Les microleviers sont en silicium, la fréquence de résonance fo est
260 kHz et la constante de raideur est de 45 N.
Pour les études faites avec la microscopie électronique à
balayage, on dépose un volume de 50 l de dispersion co-colloïdale sur
une lamelle de verre, puis on laisse sécher à température ambiante
pendant 18 heures. Les échantillons sont ensuite recouverts d'une
couche d'or-palladium et observés à l'aide d'un microscope électronique
Hitachi S800 à 15kV.
Des études utilisant la microscopie électronique à transmission
après fracture à froid et après coloration négative sont aussi réalisées.
Pour ces dernières, on dépose un volume de 5 l de dispersion co-
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colloïdale à 0.2mM sur une grille de cuivre (300-mesh) recouverte d'un
film de Formvar (Polyvinyl formal). Après 5 minutes d'adsorption, les
échantillons sont colorés négativement, soit avec une solution aqueuse
de silicotungstène de sodium à 1%, soit avec une solution aqueuse
5 d'acétate d'uranyle à 4%. Ils sont ensuite immédiatement observés à
l'aide d'un microscope électronique Philips CM120 à 80 W.
La dispersion co-colloïdale selon l'exemple n 2 a été étudiée
selon les façons suivantes
Observations en microscopie à force atomique (AFM)
La figure 1 représente l'image obtenue en microscopie à force
atomique d'une dispersion co-colloïdale à base de tamoxifène et de para
sulfonato calix[6]arène C6S selon l'exemple n 2.
Ainsi, les études AFM sur la dispersion co-colloïdale mettent en
évidence l'existence de nanoparticules, même après séchage de
l'échantillon.
Une analyse topographique de la taille de ces particules révèle
une hauteur de 75 nm et un diamètre approximatif de 300 nm. Ce
diamètre est légèrement plus grand que celui déterminé par diffusion de
la lumière (voir résultats ci-dessous) et s'explique par le léger
aplatissement des particules consécutif au séchage de l'échantillon.
Observations en microscopie électronique à transmission
La figure 2 représente des images d'une dispersion co-colloïdale
selon l'exemple n 2 en microscopie électronique à balayage avec trois
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grossissements différents ; les échelles (50 m, 10 m et 1 m) sont
indiquées sur les images.
La figure 3 représente des images d'une dispersion co-colloïdale
selon l'exemple n 2 obtenues par microscopie électronique à
transmission après coloration négative avec trois grossissements
différents : les échelles (2 m, 100 nm et 200 nm) sont indiquées sur les
images. En ce qui concerne, les images qui indiquent une échelle de 200
nm, ces dernières ont été réalisées à deux endroits différents de la
dispersion co-colloïdale.
La figure 4 représente des images d'une dispersion co-colloïdale
selon l'exemple n 2 obtenues par microscopie électronique à
transmission après fracture à froid négative avec deux grossissements
différents ; les échelles (2 m et 200 nm) sont indiquées sur les images.
En ce qui concerne, les images qui indiquent une échelle de 200 nm, ces
dernières ont été réalisées à trois endroits différents de la dispersion co-
colloïdale.
Ces images permettent d'identifier les particules de la dispersion
co-colloïdale. Elles montrent notamment une structure sphérique
externe, mais également une structure interne organisée en petites
vésicules. Une telle structure est différente de la structure
multilamellaire des liposomes.
Par ailleurs, on obtient des images similaires avec des
dispersions co-colloïdales à base de para-sulfonato calix[6]arène et de
griséofulvine ou de chlorhexidine.
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Mesure de la taille et de la polydispersité des particules
La dispersion co-colloïdale de tamoxifène et de
parasulphonatocalix[6] arène selon l'exemple n 2 a été analysée par
diffusion dynamique de la lumière immédiatement après sa formation.
Les mesures ont été répétées dix fois et montrent l'existence
d'une dispersion co-colloïdale constituées de particules monodispersées
ayant un diamètre moyen égal environ à 230 nm. L'indice de
polydispersité est de 0,03 démontrant que les particules ont un diamètre
constant.
Ces mesures ont été également répétées dix fois sur les
dispersions co-colloïdales des exemples 1 et 3 à 12. Les résultats sont
regroupés dans le tableau suivant.
Exemple Molécule hôte (concentration finale) / Mesure moyenne des particules
no. Molécule invitée (concentration finale) mesurées par DLS
1 C4S (50 mg/1) / Tarnoxifène (50 mg/l) 190 nm
2 C6S (50 mg/ml) / Tamoxifène (50 mg/1) 230 nm
3 C6S (55 mg/ml) / Tamoxifène (25 mg/1) 225 nm
4 C6S (87,4 mg/ml) / Tamoxifène (12,4 mg/1) 215 nm
5 C4S (50 mg/1) / Tétracâine (50 mg/1) 205 nm
6 C4S (70 mg/1) / Tétracaïne (30 mg/1) 440 nxn
7 C4S (83 mg/1) / Tétracâine (17 mg/1) 269 nm
8 C4S (50 mg/1) / Tétracaïne (50 mg/l) 220 nm
9 C4S (50 mg/1) / Chlorhexidine (50 mg/l) 275 mn
10 C6S (50 mg/1) / Chlorhexidine (50 mg/1) 460 nm
11 C4S (50 mgll) / Mifepristone (50 mg/1) 238 nm
12 C6S (50 mg/1) / Mifepristone (50 mg/1) 191 nm
Ces résultats montrent que la méthode de préparation de
dispersions co-colloïdales permet d'obtenir des populations relativement
homogènes de particules dont la taille varie approximativement entre
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150 nm et plus de 450 nm selon la nature des molécules hôtes et des
molécules invitées et le ratio de concentrations entre les deux
molécules.
Etudes de la stabilité des dispersions co-colloïdales
La stabilité des dispersions co-colloïdales selon les exemples 1 à
12 a été étudiée pour des températures égales à 4, 20, 40 et à 80 C. Les
dispersions sont placées dans des enceintes à température contrôlée et
des échantillons sont prélevés périodiquement pour analyser la taille et
la polydispersité des particules ou la morphologie en microscopie à
force atomique. Les résultats sont regroupés dans le tableau suivant.
Dispersion Molécule hôte Stabilité des particules mesurées par diffusion
no. Molécule invitée dynamique de la lumière à différentes températures
1 C4S (50 mg/1) A 20 C, la taille moyenne des particules décroît légèrement
Tamoxifène (50 mg/1) de 190 à 130 nm sur une période de 15 jours. A 80 C, la
taille moyenne des particules décroit de 190 à 175 nrn sur
une période de 15 jours
2 C6S (50 mg/ml) A 4 C, 20, 40 et 80 C la taille moyenne des particules est
Tamoxifène (50 mg/1) maintenue proche de 200 mn sur une période de 43 jours.
5 C4S (50 mg/1) A 4 C, la taille moyenne des particules augmente de 205 à
Tétraca'ine (50 mg/1) 230 nm et sur une période de 15 jours puis est maintenue
stable pendant 28 jours. A 20, 40 et 80 C, la taille moyenne
des particules décroît de 205 à 165 mn et sur une période de
jours puis est maintenue stable pendant 28 jours.
8 C4S (50 mg/1) A 4 et 20 C, la taille moyenne des particules décroît de 220
Tétracàine (50 mg/1) à 170 et 150 nm, respectivement, sur une période de 15
jours.
11 C4S (50 mg/1) A 20 et 80 C, la taille moyenne des particules décroît de
Mifepristone (50 mg/1) 238 à 220 sur une période de 15 jours.
12 C6S (50 mg/1) A 20 C, la taille moyenne des particules décroît de 190 à
Mifepristone (50 mg/1) 174 sur une période de 15 jours. A 80 C, la taille
moyenne
des particules est maintenue à 190 nm pendant 15 jours.
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Ces résultats montrent que la taille des particules varie
faiblement, même lorsque les préparations sont maintenues pendant
plusieurs semaines à des températures basses (4 C) ou élevées (80 C),
montrant ainsi la remarquable stabilité des dispersions co-colloïdales.
Ainsi les résultats montrent que la taille des particules n'est
pratiquement pas influencée par la température de stockage. On observe
des résultats similaires pour d'autres dispersions co-colloïdales qui
n'ont pas été exemplifiées.
Etudes des interactions des suspensions colloïdales avec
l'albumine
Afin d'envisager une administration intraveineuse des
dispersions co-colloïdales, il est nécessaire de s'assurer que de telles
dispersions ne s'agrègent pas au contact de l'albumine qui est la
protéine la plus abondante dans le système sanguin. Les interactions des
dispersions co-colloïdales avec l'albumine ont donc également été
étudiées. Une solution à 1 mg/ml d'albumine bovine (BSA) a été ajoutée
à une dispersion co-colloïdale de tamoxifène et le mélange a été analysé
par diffusion dynamique de la lumière et en microscopie à force
atomique.
Les analyses par diffusion de lumière montrent que la taille des
particules en présence de BSA dépasse l m mais celles-ci restent
toujours monodispersées. Ce phénomène s'explique par la présence
d'une matrice protéique protectrice qui enveloppe les particules
colloïdales. Les images obtenues par microscopie à force atomique
révèlent au contraire l'existence de particules de taille bien plus réduite
que la taille normale des particules colloïdales (15 nm au lieu de 200 nm
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ou de 1000 nm). On explique cet aspect par le fait que la BSA forme un
gel protéique assez dense qui recouvre les particules co-colloïdales et ne
laisse entrevoir qu'une partie des particules à la surface du champ
examiné par le microscope à force atomique. Il apparaît donc que les
5 interactions avec la principale protéine sanguine ne dénaturent pas les
systèmes co-colloïdaux, mais que l'albumine peut former une matrice
autour des particules, qui pourrait les protéger pendant le transport dans
le sang.
10 Exemple de préparation d'une dispersion co-colloïdale
comprenant des molécules anti-cancéreuses
Le docétaxel, l'azacytidine et la thalidomide sont des substances
pharmacologiquement actives, connues pour leur faible solubilité dans
15 l'eau et connues pour leur activité thérapeutique contre certains types de
cancer. Des dispersions co-colloïdales ont été préparées selon le procédé
décrit ci-dessus et conservées pendant une semaine à température
ambiante. La taille moyenne des particules a été mesurée par DLS selon
la méthode décrite ci-dessus.
Le tableau ci-dessous résume ces données.
Exemple Molécule hôte Molécule invitée Mesure moyenne des
No (concentration finale) (concentration finale) particules mesurées par
DLS après 1 semaine à
température ambiante
13 C4S (5 mg/ml) Docetaxel (5 mg/ml) 221 nm
14 C4S (5 mg/ml) Thalidomide (5 mg/ml) 112 nm
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Propriétés anticancéreuses du docétaxel formulé sous forme
de co-colloïdes
Des souris de souche Swiss nude sont irradiées et reçoivent une
injection sous-cutanée de cellules Calu-6. Les cellules Calu-6 sont des
cellules tumorales humaines de poumon.
Lorsque la tumeur atteint un volume de 100 à 200 nm3, les
animaux sont répartis de façon aléatoire dans des groupes de traitement.
Selon leur groupe, les animaux reçoivent une série d'injections
intraveineuses de placebo ou de docétaxel formulés sous forme d'une
dispersion co-colloïdales à des concentrations variant entre 0,01 et 1%.
Les animaux font l'objet d'un examen clinique quotidien pendant lequel
le volume de la tumeur est mesuré. On constate un effet anticancéreux
satisfaisant du traitement avec le docétaxel formulé sous forme de co-
colloïdes.
Applications au traitement de la DMLA du thalidomide
formulé sous forme de co-colloïdes
Des lapins de souche Fauve de Bourgogne sont utilisés pour
induire une néovacularisation choroïdienenne. Des brûlures d'une
surface d'environ 75 m sont induites dans l'oril droit des animaux à
l'aide d'un laser argon à 532 nm appliqué pendant 0,1 seconde avec une
intensité de 150 mW et en utilisant un photocoagulateur Viridis (Quantel
Medical) autour du disque optique et entre les principales branches
vasculaires.
Ces brûlures entraînent la formation de néovaisceaux que l'on
mesure par des examens ophthalmologiques périodiques. Les animaux
sont répartis de façon aléatoire dans des groupes de traitement. Selon
leur groupe, les animaux reçoivent une injection intravitréale de placebo
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ou de thalidomide formulée sous forme de co-colloïdes à des
concentrations variant entre 0,01 et 1%. On constate un effet inhibiteur
satisfaisant du développement des néovaisceaux du traitement avec la
thalidomide formulée sous forme de co-colloïdes.
