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CA 02661567 2013-06-10
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MICROPARTICULES A BASE DE COPOLYMERE AlVIPHIPHILE ET DE
PRINCIPE(S) ACTIF(S) A LIBÉRATION MODIFIÉE ET FORMULATIONS
PHARMACEUTIQUES EN CONTENANT
Domaine de l'invention
La présente invention concerne de nouveaux transporteurs de principe(s)
actif(s) -PA-, en particulier protéinique(s) et peptidique(s), ainsi que de
nouvelles
formulations pharmaceutiques à libération modifiée contenant lesdits
transporteurs de PA.
Les applications thérapeutiques (humaines et vétérinaires) de ces formulations
sont
nombreuses.
La référence PA utilisée dans tout le présent exposé vise au moins un principe
actif.
Par "libération modifiée", on désigne une libération prolongée ou retardée ou
pulsatile.
Plus précisément les nouveaux transporteurs de PA visés par l'invention sont
des
microparticules de polymères amphiphiles, par exemple des polyaminoacides
modifiés par
des groupements hydrophobes. Ces microparticules contiennent au moins un PA
associé
au polymère et peuvent se présenter sous forme de suspensions colloïdales ou
sous forme
sèche.
Contexte de l'invention
Dans le domaine de la libération prolongée des PA pharmaceutiques, notamment
des peptides et protéines thérapeutiques, on cherche très souvent à reproduire
au mieux
chez le patient une concentration plasmatique en peptide ou en protéine proche
de la
valeur observée chez le sujet sain.
Cet objectif se heurte à la faible durée de vie des protéines dans le plasma,
ce qui
conduit à injecter de façon répétée la protéine thérapeutique. La
concentration plasmatique
en protéine thérapeutique présente alors un profil en dents de scie,
caractérisé par des pics
élevés de concentration et des minima de concentration très bas. Les pics de
concentration,
très supérieurs à la concentration basale chez le sujet sain, ont des effets
nocifs très
marqués du fait de la toxicité élevée des protéines thérapeutiques telles que
l'interleukine
IL-2. Par ailleurs, les minima de concentration sont inférieurs à la
concentration nécessaire
pour avoir un effet thérapeutique, ce qui entraîne une mauvaise couverture
thérapeutique
du patient et des conséquences graves à long terme.
Aussi, pour reproduire chez le patient une concentration plasmatique en
protéine
thérapeutique proche de la valeur idéale pour le traitement du patient, il
importe que la
formulation pharmaceutique considérée permette de libérer la protéine
thérapeutique sur
une durée prolongée, de façon à limiter les variations de concentration
plasmatique au
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cours du temps.
Par ailleurs, cette formulation active doit, de préférence, satisfaire au
cahier des
charges suivant, déjà connu de l'homme de l'art :
1 - libération prolongée d'une protéine thérapeutique active et non dénaturée,
par
exemple humaine ou synthétique, de sorte que la concentration plasmatique est
maintenue au niveau thérapeutique ;
2 - viscosité de la formulation suffisamment basse pour être aisément
injectable ;
3 - forme biocompatible et biodégradable ;
4 - forme ne présentant ni toxicité, ni immunogénicité ;
5 - forme ayant une excellente tolérance locale.
Pour tenter d'atteindre ces objectifs, l'une des meilleures approches
proposées
dans l'art antérieur fut de développer des formes à libération prolongée de
protéine(s)
thérapeutique(s) constituées par des suspensions, liquides et peu visqueuses,
de nano-
particules chargées en protéines thérapeutiques. Ces suspensions ont permis
l'adminis-
tration aisée de protéines thérapeutiques natives.
Ainsi, la protéine thérapeutique a été associée à des nanoparticules d'un
copolyaminoacide comprenant des groupements hydrophobes et des groupements
hydrophiles.
Le brevet US-B-5,904,936 décrit des particules submicroniques (NPV) - de
taille moyenne
comprise entre 0,01 et 0,5 1.fin - et des particules micrométriques
(microniques) (MPV)
- de taille moyenne comprise entre 0,5 et 20 1.im - de copolymère amphiphile
de poly-
aminoacides comprenant au moins deux types d'aminoacides, l'un étant neutre
hydro-
phobe, l'autre étant ionisable. Des protéines telles que l'insuline
s'adsorbent spontanément
en solution aqueuse à ces particules. Le copolymère de polyaminoacide est, par
exemple,
un copolymère bloc de poly(L-leucine-b-L-glutamate de sodium). Ce brevet
décrit
l'agrégation de NPV en MPV par addition à une suspension colloïdale de poly-
Leu/Glu de
sels monocationiques (sulfate d'ammonium), polycationiques (Fe2+, Fe3+, Zn2+,
Ca2+, Al2+,
Al3+ ou Cu2+), d'acide (HC1) ou de polymères cationiques (polylysine).
La demande de brevet WO-A-03/104303 divulgue des polyaminoacides amphiphiles
comprenant des résidus aspartique ou des résidus glutamique, au moins une
partie de ces
résidus étant porteurs de greffons comportant au moins un motif alpha-
tocophérol (par ex.:
polyglutamate ou polyaspartate greffé par l'alpha tocophérol d'origine
synthétique ou
naturelle). Ces homopolyaminoacides modifiés hydrophobes forment spontanément
dans
l'eau une suspension colloïdale de nanoparticules, lesquelles sont aptes à
s'associer
aisément en suspension aqueuse à pH = 7,4 avec au moins une protéine active
(insuline).
La durée de libération in vivo de la (ou les) protéine(s) active(s) (par ex.
insuline)
vectorisée par les suspensions selon US-B-5,904,936 ou WO-A-2003/104303
gagnerait à
être augmentée.
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L'augmentation de la durée de libération a été partiellement obtenue par les
formes
pharmaceutiques décrites dans la demande PCT WO-A-05/051416. Dans cette
demande
est divulguée une suspension colloïdale de nanoparticules (0,001 - 0,5 m) de
poly(L-
glutamate de sodium) modifié hydrophobe, utilisée à une concentration telle
qu'après
injection sous-cutanée, il se forme in situ chez le patient un gel au contact
de l'albumine
endogène. La protéine est alors lentement libérée sur une période typiquement
d'une
semaine. Cependant, lorsque la concentration en protéine thérapeutique à
administrer est
relativement élevée, comme c'est le cas par exemple pour l'hormone de
croissance
humaine, la durée de libération est limitée à quelques jours seulement.
Objectifs de l'invention
Il est souhaitable d'améliorer cet art antérieur en proposant une formulation
pharmaceutique pour la libération prolongée de PA :
= permettant après injection par voie parentérale (par ex. sous-cutanée)
d'obtenir une durée de libération in vivo prolongée pour des PA (par ex.
protéines,
peptides thérapeutiques et petites molécules) non dénaturés et fortement
concentrés, par exemple à plusieurs mg/ml.
= et qui serait stable à la conservation tant sur le plan physico-chimique
que
biologique.
Pour ce faire, il convient d'agréger entre elles les nanoparticules de la
formulation selon
WO 05/051416 en microparticules, au moyen d'ions multivalents de polarité
opposée à
celle des groupements (GI) ionisables du polyaminoacide amphiphile, lesdits
ions étant
présents dans des proportions bien définies. Cela conduit à une sélection
d'une population
spécifique de microparticules, permettant une prolongation significative de la
durée de
libération du PA (par ex. protéine ou peptide) avec lequel elles sont
associées. Certains
ions multivalents, comme Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2 ou leurs mélanges ou
Al3+, Fe3+ ou
leurs mélanges, confèrent une excellente tolérance à une telle formulation
pharmaceutique
liquide pour la libération prolongée de PA.
Cette formulation peut par exemple comprendre une suspension colloïdale,
aqueuse, de
basse viscosité, à base de particules micrométriques de polyglutamate greffé
par l'alpha-
tocophérol d'origine synthétique, de taille comprise entre 0,5 et 100 lm,
contenant des
ions multivalents Mg2+, Ca2 , Zn2+, Fe2+, Cu2+ Al3+ ou Fe3+, avec un rapport
r,
répondant à la formule r = n x[1M] ,
õou
[GI]
- n est la valence desdits ions multivalents,
- [IM] est la concentration molaire en ions multivalents,
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- [GI] est la concentration molaire en groupements ionisables GI,
compris entre 0,3 et 10.
Ces particules micrométriques sélectionnées sont issues de l'agrégation d'un
grand
nombre de nanoparticules de copolymère amphiphile.
Une suspension de microparticules chargée en PA (par ex. hGH) peut ainsi être
fabriquée
par floculation avec des ions multivalents Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+ A13
ou Fe3+, cette
floculation étant suivie d'une maturation et d'un lavage. La suspension peut
être ensuite
lyophilisée ou atomisée puis reconstituée avec de l'eau pour réaliser une
formulation prête
à injecter.
Il est clair que ces formes de poudres sèches de microparticules sont a priori
avantageuses au regard de la conservation. En effet, elles devraient permettre
d'accroître la
stabilité physique de ces microparticules et la stabilité du PA.
Cependant, dans le cadre d'une utilisation thérapeutique de ces poudres de
microparticules
par voie parentérale, la difficulté consiste à pouvoir aisément disperser (ou
mettre en
suspension) extemporanément ces poudres pour obtenir une forme liquide micro-
particulaire, plus précisément une suspension reconstituée qui soit stable,
par exemple au
moins pendant quelques minutes, voire au moins quelques dizaines de minutes, à
température ambiante. Cette stabilité est notamment recherchée afin de
permettre une
manipulation aisée de cette suspension reconstituée. Il importe également que
cette
suspension reconstituée puisse être facilement injectée par passage au travers
d'une
aiguille creuse associée à une seringue ou à un stylo d'injection (type stylo
à insuline).
Enfin, il convient de tenir compte du fait que les opérations de dispersion,
de manipulation
et d'injection de la suspension reconstituée sont destinées à être exécutées
par les patients
ou le personnel médical.
Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de l'invention serait de
proposer de
nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de
polymère
amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon
la
formulation décrite dans le WO-A-05/051416, ces microparticules étant chargées
en PA et
ayant vocation à présenter des propriétés améliorées, notamment sous forme
solide sèche,
en particulier au regard de leur aptitude à la dispersion (ou dispersibilité),
et, s'agissant de
la suspension reconstituée, de sa stabilité et de son aptitude à être
facilement manipulée et
injectée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles microparticules
obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile,
biodégradable et
hydrosoluble, lesdites microparticules étant chargées en PA et ayant de bonnes
propriétés
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de dispersion que ce soit en phase aqueuse ou organique, tout en conservant
l'intégrité
desdites microparticules.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles microparticules
obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile,
biodégradable et
5 hydrosoluble, lesdites microparticules étant chargées en PA et ayant
d'excellentes
propriétés de stabilité sous forme solide et sèche.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de
préparation
de microparticules sous forme solide et sèche, ces microparticules étant par
ailleurs :
¨> obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile,
biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon
la formulation décrite dans le WO-A-05/051416,
¨> chargées en PA,
¨> et telles que définies dans les objectifs ci-dessus.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de préparation de
microparticules sous forme solide et sèche, du type de celui visé dans
l'objectif précédent
et qui soit par ailleurs simple, économique et industriel.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation
pharmaceutique
comprenant de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de
nanoparticules de
polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de
celles selon
la formulation décrite dans le WO-A-03/104303, ces microparticules étant par
ailleurs :
¨> chargées en PA,
¨> et telles que définies dans les objectifs ci-dessus.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation
pharmaceutique
pour la libération prolongée de PA, remédiant aux carences de l'art antérieur,
et en
particulier permettant après injection par voie parentérale (par ex. sous-
cutanée) d'obtenir
une durée de libération in vivo prolongée de PA (par ex. protéines, peptides
thérapeutiques
ou petites molécules) non dénaturés. Un autre objectif de l'invention est de
proposer une
formulation pharmaceutique permettant après injection par voie parentérale
(par ex. sous-
cutanée) d'obtenir une durée de libération in vivo prolongée de protéines ou
peptides
thérapeutiques fortement concentrés, par exemple à plusieurs mg/ml.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation
pharmaceutique à
libération prolongée du PA in vivo, qui soit stable à la conservation tant sur
le plan
physico-chimique que biologique.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation
pharmaceutique à
libération prolongée du PA in vivo, qui présente au moins l'une des propriétés
suivantes :
biocompatibilité, biodégradabilité, atoxicité, bonne tolérance locale.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation
pharmaceutique
pour la libération prolongée lente de PA in vivo, comprenant des
microparticules de
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polymère PO amphiphile auto-associées à au moins un PA (microparticules
PO/PA), le
polymère PO étant un polymère biodégradable, hydrosoluble, porteur de
groupements
hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles (de préférence ionisables (GI)
au moins
en partie ionisés) formant spontanément dans l'eau une suspension de
nanoparticules
colloïdales, ce polymère PO étant, par exemple, un polyaminoacide dont la
chaîne
principale est formée par des résidus aspartique ou des résidus glutamique, au
moins une
partie de ces résidus étant modifiée par greffage d'au moins un groupement
hydrophobe
GH, dans la chaîne ou en bout de chaîne.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un nécessaire de
reconstitution de
la formulation telle que définie dans les objectifs sus-énoncés, ce nécessaire
étant par
exemple simple à l'utilisation, de sorte qu'il puisse être mis en oeuvre
aisément par le
patient ou par le personnel médical.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de reconstitution
de la
formulation telle que définie dans les objectifs sus-énoncés, ce procédé étant
par exemple
simple à mettre en oeuvre en particulier par le patient ou le personnel
médical.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation
pharmaceutique
solide pour la libération prolongée de PA, en particulier une forme poudre
sèche pour
inhalation et administration pulmonaire :
= à base de microparticules de PO associées à au moins un PA telles que
définies dans les objectifs sus-énoncés ; ou
= obtenue à partir de la formulation telle que définie dans les objectifs
sus-
énoncés.
Brève description de l'invention
Pour atteindre ces objectifs, parmi d'autres, les inventeurs ont eu le mérite
de
découvrir, après de longues et laborieuses recherches, que, de façon tout à
fait surprenante
et inattendue, l'atomisation de formulations à base de PO amphiphile (par
exemple de
copolyamino-acides) et de PA conduit à des microparticules PO/PA sèches, très
stables,
permettant de reconstituer des suspensions aqueuses de microparticules en
milieu liquide
dont la taille est comprise entre 0,5 et 100 p.M.
Par ailleurs, les inventeurs ont eu le mérite de mettre au point des moyens de
reconstitution d'une suspension à partir de ces microparticules, lesdits
moyens permettant
d'optimiser leur dispersion aussi bien en phase liquide aqueuse qu'en phase
liquide
organique.
Une dispersion aisée, de bonne qualité et stable est en effet un préalable à
l'utilisation de ces suspensions reconstituées à partir de microparticules
sèches PO/PA, à
titre de formulations injectables.
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L'atomisation est une technique industrielle connue pour obtenir des
particules
sèches à partir d'une solution ou suspension de la matière constitutive
desdites particules.
L'atomisation ou spray chying consiste à évaporer très rapidement dans un flux
d'air ou de
gaz inerte chaud des gouttelettes nébulisées de cette solution ou suspension.
Dans le
domaine pharmaceutique, l'atomisation peut être délicate car elle impose une
contrainte
thermique qui peut s'avérer rédhibitoire pour certains PA thermosensibles tels
que les PA à
base de protéines ou d'autres composés peptidiques. Le recours à l'atomisation
pour
produire des particules sèches à base d'excipients et de PA ne va donc pas de
soi, sauf à
choisir des excipients aptes à empêcher ou à minimiser la dénaturation des PA
peptidiques.
C'est ainsi que la demande US-A-2005/0158392 divulgue la préparation de
microparticules solides lipophiles chargées en PA peptidique par atomisation.
Cette
dernière consiste soit à atomiser une solution aqueuse contenant de l'acide
hyaluronique,
du PA et un agent de surface lipophile (par ex. lécithine) voire un autre
tensioactif du type
Tween 80 ; soit, dans un premier temps, à atomiser une solution aqueuse
contenant de
l'acide hyaluronique, du PA et éventuellement un tensioactif du type Tween 80
pour
obtenir des particules primaires, et, dans un deuxième temps, à atomiser une
solution
alcoolique d'agent de surface lipophile (par ex. lécithine) dans laquelle sont
dispersées les
particules primaires. On met l'accent dans cette demande US sur la combinaison
protectrice acide hyaluronique et agent de surface lipophile (par ex.
lécithine), ce dernier
étant destiné à former un film d'enrobage des microparticules à base d'acide
hyaluronique
et de PA. Ce document ne fait pas mention ni même allusion à la mise en oeuvre
de PO
amphiphiles et encore moins de copolyaminoacides amphiphiles, à titre
d'excipients ou de
transporteurs de PA formant ensemble les microparticules.
Un autre exemple d'atomisation est celui décrit dans l'article Maa et al, J
Pharm
Sci, 87(2), 152-159, 1988. Selon ce document, le PA (l'hormone de croissance
humaine)
est complexé par du zinc en présence de tensio-actifs biodégradables, avant
d'être atomisé
en microparticules.
Il apparaît donc que l'atomisation de protéines est une opération délicate
nécessitant l'utilisation de formulations complexes comprenant de nombreux
excipients
présents pour protéger le PA lors du procédé et garantir sa stabilité au
stockage, ce qui est
particulièrement crucial pour certaines molécules sensibles telles que
l'hormone de
croissance humaine ("human Growth Hormone" hGH).
Par ailleurs, le mérite des inventeurs est d'autant plus grand que l'art
antérieur
n'enseigne rien sur le difficile problème de la dispersion et de la
stabilisation dans un
liquide de microparticules sèches (s'agissant notamment des microparticules de
PO
amphiphile) conçues pour la libération prolongée de PA.
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D'où il s'ensuit que l'invention concerne dans un premier aspect, des
microparticules de
polymère (PO) contenant au moins un principe actif (PA), le polymère P0:
= étant un (co)polymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur
de groupements hydrophobes (OH) et de groupements hydrophiles,
= formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans
l'eau, à pH = 7,0, en condition isotonique,
= et étant associé de façon non covalente avec le PA;
lesdites rnicroparticules étant caractérisées :
a. en ce qu'elles sont obtenues par atomisation d'une solution ou d'une
suspension
colloïdale de PO comprenant au moins un PA,
b. par une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 0,5 et 100 pm, de
préférence
entre 1 et 70 pm, de préférence entre 2 et 40 lun,
c. et en ce qu'elles sont dispersibles en suspension colloïdale dans un
test de
dispersibilité DP I.
Dans un deuxième aspect, l'invention concerne un procédé de préparation de
microparticules de polymère PO associé avec au moins un principe actif (PA),
ces
microparticules PO/PA étant en particulier celles définies ci-dessus selon le
premier aspect
de l'invention,
i. le polymère PO :
O étant un (co)polymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur
de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles (de
préférence ionisables (GI), au moins en partie ionisés),
e formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans
l'eau, à pH = 7,0, en condition isotonique,
e et étant associé de façon non covalente avec le PA,
ii. lesdites microparticules ayant une taille, mesurée dans un test T,
comprise entre 0,5
et 100 gm, de préférence entre 1 et 70 pm, de préférence entre 2 et 40 gm,
caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à atomiser une solution ou
une suspension
colloïdale de PO contenant du PA.
Selon une variante intéressante, les microparticules obtenues par atomisation
sont
redispersées dans un milieu liquide essentiellement aqueux (de préférence
comprenant des
ions multivalents comme moyen de dispersion) puis la dispersion obtenue est
lyophilisée.
Dans un troisième aspect, l'invention concerne une formulation pharmaceutique
liquide pour la libération prolongée de PA, caractérisée en ce qu'elle
comprend une
suspension colloïdale, de basse viscosité, à base de microparticules de PO,
contenant au
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moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le
premier aspect de
l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le
deuxième aspect de
l'invention.
Dans un quatrième aspect, l'invention concerne un nécessaire de reconstitution
en
particulier de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième
aspect de
l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend :
= des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules
étant
celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles
obtenues par le
procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention ;
= et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant :
¨> les liquides essentiellement aqueux ;
¨> les liquides essentiellement organiques et miscibles à l'eau ;
¨> et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau.
Dans un cinquième aspect, l'invention concerne un procédé de reconstitution en
particulier de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième
aspect de
l'invention, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement :
= à mélanger :
= des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules
étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou
celles
obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de
l'invention ;
= et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant :
--> les liquides essentiellement aqueux ;
¨> les liquides essentiellement organiques et miscibles à
l'eau ;
¨> et les liquides essentiellement organiques non miscibles à
l'eau.
= et à agiter ce mélange.
Dans un sixième aspect, l'invention concerne une formulation pharmaceutique
solide pour la libération prolongée de PA, caractérisée en ce qu'elle comprend
une forme
poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire :
= à base de microparticules de PO contenant au moins un PA, ces
microparticules
étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou
celles obtenues par
le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention ;
= ou obtenue à partir de la formulation telle que définie ci-dessus selon
un troisième
aspect de l'invention.
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Avantages :
Sans vouloir être lié à la théorie, on peut penser que les groupements
hydrophobes
des polymères PO, qui peuvent s'assembler en domaines hydrophobes, jouent un
rôle
important dans le processus de libération modifiée du PA, tout comme dans la
stabilisation
5 de celui-ci.
On peut avancer que des interactions physiques (non covalentes) se développent
entre les domaines hydrophobes du polymère amphiphile PO et le PA, en
particulier
protéinique. Cette forte affinité de la protéine pour le polymère conduit à sa
libération
prolongée après administration sous-cutanée. Ce mécanisme de libération
diffère
10 notablement, et peut être éventuellement conjugué, à celui observé pour les
micro-
particules d'acide polylactique, d'acide polylactique-glycolique ou encore à
celles de
hyaluronate de sodium, dans lesquelles la libération du PA est essentiellement
liée à la
diffusion de l'actif et à la dégradation/érosion de la particule.
L'affinité de la protéine pour le polymère PO permet de limiter le phénomènes
d'agrégation des protéines et autres dégradations qui peuvent intervenir lors
du procédé
d'atomisation, sans nécessité d'avoir recours à d'autres stabilisants (par ex.
sucres, tensio-
actifs). Cet effet protecteur de PO permet également d'obtenir aisément des
formulations
liquides stables au stockage. Enfin le PO, lorsqu'il a un caractère
essentiellement
amorphe (notamment lorsque c'est un polyaminoacide), confère aux
microparticules
d'excellentes propriétés de stabilité physique lorsqu'elles sont conservées
sous forme
sèche.
Il apparaît donc que la présence de ces polyaminoacides amphiphiles PO apporte
des
leviers supplémentaires pour la libération modifiée du PA ainsi que pour sa
stabilisation
vis-à-vis de l'agrégation ou d'éventuelles dégradations chimiques.
De plus, la nature amphiphile du polymère PO permet, lors du procédé
d'atomisation, de
pouvoir utiliser soit une phase entièrement aqueuse, soit une phase
entièrement organique
volatile, soit un mélange volatil de phase aqueuse et organique, ce qui offre
une grande
souplesse dans la mise en oeuvre du procédé.
En outre, du fait de leur nature chimique, les microparticules formées à
partir d'un
PO du type (co)polyaminoacide sont biodégradables, biocompatibles et elles
possèdent
généralement de bonnes propriétés de tolérance locale.
Concernant le procédé d'obtention des microparticules solides et sèches
suivant
l'invention, à savoir l'atomisation, il est par nature facilement
industrialisable.
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Enfin, les microparticules selon l'invention et les formulations en contenant
sont
non toxiques et bien tolérées localement.
Description détaillée de l'invention
Définitions :
Dans l'ensemble de cette demande, la conjonction "ou" doit être prise dans le
sens
inclusif de "l'un ou l'autre ou les deux".
Ainsi, par exemple, un alkyle linéaire pouvant comporter au moins un
hétéroatome (0, N ou S) ou au moins une insaturation peut avoir deux
hétéroatomes, N et
S, et une insaturation.
Dans tout le présent exposé, à la différence des microparticules selon
l'invention,
le terme "particules submicroniques" ou "nanoparticules" désigne des
particules de taille
(mesurée dans un test T décrit ci-après), supérieure ou égale à 1 nm et
inférieure à
500 nm, de préférence comprise entre 5 et 250 nm.
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, le terme
"polyaminoacide"
couvre aussi bien les polyaminoacides naturels que les polyaminoacides
synthétiques,
ainsi que les oligoaminoacides comprenant de 10 à 20 résidus acide aminé au
même titre
que les polyaminoacides comprenant plus de 20 résidus acide aminé.
Les résidus acide aminé préférés de la chaîne polyaminoacide principale sont
ceux
ayant la configuration L; le type de liaison préféré est le type alpha, c'est-
à-dire une
liaison peptidique entre un groupe alpha-amino d'un aminoacide et le groupe
carboxyle, en
position 1, d'un autre alpha-aminoacide.
Au sens de l'invention, le terme "protéine" désigne, par exemple, aussi bien
une
protéine qu'un peptide, qu'il s'agisse d'un oligo ou d'un polypeptide. Cette
protéine (ou ce
peptide) peut être modifiée ou non, par exemple, par greffage d'un ou de
plusieurs
groupements polyoxyéthyléniques.
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes
"association" ou
"associer" employés pour qualifier les relations entre un ou plusieurs PA et
les polymères
PO signifient en particulier que le ou les principes actifs sont liés au(x)
polymère(s) PO
par une liaison non covalente, par exemple par interaction électrostatique ou
hydrophobe
ou liaison hydrogène ou gêne stérique.
l' aspect de l'invention : les microparticules
Caractéristique (a):
Le fait d'associer, avant atomisation, le PA, par exemple une protéine ou un
autre
composé peptidique, avec un polymère PO amphiphile, tel qu'un
(co)polyaminoacide
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amphiphile, présente de nombreux avantages, à la fois au niveau du procédé lui-
même et
au niveau des propriétés des microparticules produites par atomisation.
Le traitement physique d'atomisation confère aux microparticules sèches
solides
obtenues une structure particulière à l'origine de bon nombre de leurs
propriétés
avantageuses. Cette structure est correctement caractérisée par ce mode
d'obtention par
atomisation, de même que par les fonctions attachées à ces propriétés
avantageuses.
Caractéristique (b):
Cette caractéristique est définie objectivement par le test T décrit ci-après.
Test T de mesure de la taille des microparticules par diffraction laser :
a-Test TO dans le cas où les microparticules sont sous forme sèche
1 Matériel et conditions opératoires
Granulomètre laser Malvern Mastersizer 2000
Module Voie liquide Hydro 2000SM
Volume du fluide vecteur dispersant 150 ml
Longueurs d'onde (bleu et rouge) 466 et 632 nm
Vitesse d'agitation 2400 tr/min
Domaine d'analyse 0,02 !lm à 2000 m
Modèle optique (théorie de Mie)
Valeurs des indices de réfraction utilisés :
Fluide dispersant (heptane) nfluide = 1,39 + i0
Polystyrène latex nPolystyrène latex = 1,59 +
i0
Valeurs de l'obscuration pour déclencher l'analyse Entre 5 % et 20 %
Temps d'acquisition 10 s
2 Préparation de l'échantillon
- Préparer une solution de Span 80 à 0,1 % dans l'heptane (pour cela peser
0,01 g de
poudre de Span 80 dans un flacon de 20 ml puis ajouter par pesée de l'heptane
afin
d'obtenir au final 10 g),
- Peser environ 6 mg de poudre dans un tube à essai de 5 mL,
- Ajouter 0,7 g d'heptane contenant 0,1 % de Span80 dans le dans le tube à
essai,
- Placer le tube à essai pendant 2 min dans un bain à ultrason afin de
bien disperser la
poudre.
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3 Analyse de l'échantillon
Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos
est
vidangé et remplacé par de l'heptane. L'agitation du module Hydro 2000SM est
positionnée à 2400 tr/min.
Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales précitées :
- alignement du faisceau laser,
- enregistrement des bruits de fond.
Après ces étapes, introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante :
ajouter au
goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon dilué jusqu'à ce que
l'obscuration
soit comprise entre 5 % et 20 % et lancer l'acquisition.
On obtient les données relatives au D50, qui est le diamètre en dessous duquel
se
trouvent 50 % des objets analysés.
Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations
différentes.
b- Test T1 dans le cas où les microparticules sont sous forme de dispersion
aqueuse
1 Matériel et conditions opératoires
Granulomètre laser Malvern Mastersizer 2000
Module Voie liquide Hydro 2000SM
Volume du fluide vecteur dispersant 150 ml
Longueurs d'onde (bleu et rouge) 466 et 632 mn
Vitesse d'agitation 2400 tr/min
Domaine d'analyse 0,02 kun à 2000 jam
Modèle optique (théorie de Mie)
Valeurs des indices de réfraction utilisés :
Fluide dispersant (eau) nfluide = 1,33 + i0
Polystyrène latex= 1 59 + i0
Ilpolystyrène latex 5
Valeurs de l'obscuration pour déclencher l'analyse Entre 5 % et 20 %
Temps d'acquisition 10 s
2 Préparation de l'échantillon
L'échantillon à analyser est introduit dans la cellule tel quel ou peut
éventuellement être
redilué par de l'eau dans le cas d'échantillons très diffusants.
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3 Analyse de l'échantillon
Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos
est
vidangé et remplacé par de l'eau déminéralisée fraîche. L'agitation du module
Hydro 2000SM est positionnée à 2400 tr/min.
Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales précitées :
- alignement du faisceau laser,
- enregistrement des bruits de fond.
Après ces étapes, introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante :
ajouter au
goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon dilué jusqu'à ce que
l'obscuration
soit comprise entre 5 % et 20 % et lancer l'acquisition.
On obtient les données relatives au D50, qui est le diamètre en dessous duquel
se
trouvent 50 % des objets analysés.
Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations
différentes.
c-Test T2 dans le cas où les microparticules sont en dispersion dans un
solvant organique
Ce test est analogue au test Ti. Il faut remplacer néanmoins dans ce cas l'eau
par un
solvant parfaitement miscible au liquide de dispersion et dans lequel les
particules ne
gonflent pas. Dans de nombreux cas l'heptane est utilisé.
1 Matériel et conditions opératoires
Granulomètre laser Malvern Mastersizer 2000
Module Voie liquide Hydro 2000SM
Volume du fluide vecteur dispersant 150 ml
Longueurs d'onde (bleu et rouge) 466 et 632 nm
Vitesse d'agitation 2000 tr/min
Domaine d'analyse 0,02 Jim à 2000
Modèle optique (théorie de Mie)
Valeurs des indices de réfraction utilisés :
Fluide dispersant (par exemple heptane) nheptane = 1,39 + i0
Polystyrène latex= 1 59 + i0
npolystyrène latex
Valeurs de l'obscuration_pour déclencher l'analyse Entre 5 % et 20 %
Temps d'acquisition 10 s
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2 Préparation de l'échantillon
Pour préparer l'échantillon à analyser, il faut diluer 400 L de l'échantillon
à analyser
dans un tube à essai de 5 mL avec 600 ilL d'heptane, puis passer la
préparation au
vortex pendant 10 5 s.
5 3 Analyse de l'échantillon
Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos
est
vidangé et remplacé par de l'heptane. L'agitation du module Hydro 2000SM est
positionnée à 2400 tr/min.
Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales précitées :
10 - alignement du faisceau laser,
- enregistrement des bruits de fond.
Après ces étapes, introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante :
ajouter au
goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon dilué jusqu'à ce que
l'obscuration
soit comprise entre 5 % et 20 % et lancer l'acquisition.
15 On obtient les données relatives au D50, qui est le diamètre en dessous
duquel se
trouvent 50 % des objets analysés.
Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations
différentes.
Caractéristique (c):
Cette caractéristique est définie objectivement par le test DP1 décrit ci-
après.
Test de dispersibilité DP1 des poudres :
mg environ de poudre de particules sont introduits dans un flacon de 3 ml muni
d'un
septum. La masse précise des particules est alors déterminée (mi). 1 ml de
solution de
25 reconstitution est ajouté à la poudre à travers le septum à l'aide d'une
seringue de 1 ml
munie d'une aiguille de 25G 5/8 - 0,5x16 mm (de type BD MicrolanceTM3 par
exemple) et
le flacon est agité de manière manuelle par intermittence pendant 15 min. Le
flacon est
pesé de façon à connaître la masse exacte de solution introduite (m2). A
l'issue de ce
temps, la totalité de la suspension est aspirée à travers une seringue de 1 ml
(de type Braun
30 Injeckt-F Luer 1 ml ¨ ref 9166017V) munie d'une aiguille de 25G et
transvasée dans un
nouveau flacon préalablement taré et on détermine la masse m3 de solution
récupérée.
On note l'aspect qualitatif de la dispersion (facilité à disperser, opacité,
homogénéité
visuelle de la solution), la possibilité ou non de l'injecter à travers une
aiguille de 25G, le
pourcentage de solution récupérée :
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% = M3 x 1 00/(Mi+m2)
et on mesure la taille des microparticules selon un test Ti ou T2 (selon que
le liquide de
dispersion est une solution aqueuse ou un liquide organique).
On considère que la poudre a de bonnes propriétés de dispersion dans le
liquide si:
- la suspension obtenue contient des microparticules de diamètre moyen
compris entre 2
et 40 jam,
- l'aspect de la suspension est homogène,
- elle peut être injectée à travers une aiguille de 25G et si
- au moins 80 % de la suspension peuvent être ainsi récupérés.
Au-delà des caractéristiques (a), (b) & (c), les microparticules selon
l'invention
peuvent être définies objectivement par le fait qu'elles sont stables dans un
test ST1 ou
dans un test ST2.
Test ST1 de stabilité physique des microparticules sèches :
La taille des microparticules présentes dans la poudre sèche atomisée est
mesurée dans la
semaine qui suit l'atomisation de la poudre sur un granulomètre laser selon le
test TO. La
poudre est alors placée dans une étuve à 30 C pendant une semaine. Un
échantillon
témoin est laissé à 5 C. Une mesure de taille est réalisée à nouveau après
dispersion dans
les mêmes conditions qu'au temps tO. Les distributions des particules avant et
après
vieillissement sont comparées.
Test ST2 de stabilité colloïdale des particules en suspension :
La poudre de microparticules est dispersée dans le liquide de dispersion sous
agitation magnétique à la concentration à laquelle on veut observer sa
stabilité et est
laissée à agiter sous agitation magnétique modérée pendant au minimum 2 h
(mesure t0).
La taille des particules est mesurée sur un granulomètre laser selon le test
Ti ou T2 en
fonction du milieu (aqueux ou organique) de dispersion.
La suspension est ensuite laissée au repos pendant 7 jours à 5 C. Le culot de
sédimentation est dispersé par agitation quelques minutes (jusqu'à obtention
d'une
suspension homogène après observation visuelle). Une mesure de taille est
réalisée à
nouveau après dispersion dans les mêmes conditions qu'au temps tO.
Le polymère PO
Les polymères PO selon l'invention sont des polymères biodégradables,
hydrosolubles et porteurs de groupements hydrophobes GH et de groupements
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hydrophiles (de préférence des groupements GI ionisables, au moins en partie
ionisés).
Les groupements hydrophobes GH peuvent être en nombre réduit vis-à-vis du
reste de la
chaîne et peuvent se situer latéralement à la chaîne ou intercalés dans la
chaîne, et être
répartis de façon aléatoire (copolymère statistique) ou répartis sous forme de
séquences ou
de greffons (copolymères blocs ou copolymères séquencés).
Suivant un mode préféré de réalisation de l'invention, le polymère PO est un
(co)polyaminoacide amphiphile.
Un tel choix de PO procure une excellente compatibilité avec les PA de type
protéine(s)/peptide(s). Il est ainsi possible de simplifier grandement la
composition de la
solution ou suspension de départ du PA de type protéine(s)/peptide(s) avec le
polymère
PO. Cette solution ou suspension de départ peut comprendre uniquement le PA et
le PO
dans une phase aqueuse ou organique. L'absence d'autres ingrédients permet
qu'une telle
solution ou suspension de départ peut être filtrée (taille des pores : 0,2
i.tm) avant
l'atomisation, ce qui permet de réaliser cette dernière dans des conditions
aseptiques.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le PO est choisi parmi
les
(co)polyaminoacides amphiphiles et leurs mélanges.
De préférence, les polyaminoacides selon la présente invention sont des
oligomères
ou des homopolymères comprenant des résidus récurrents acide glutamique ou
aspartique
ou des copolymères comprenant un mélange de ces deux types de résidus . Les
résidus
considérés dans ces polymères sont des acides aminés ayant la configuration D,
L ou D/L
et sont liés par leurs positions alpha ou gamma pour le résidu glutamate ou
glutamique et
alpha ou bêta pour le résidu aspartique ou aspartate.
Suivant un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, le polymère
PO
est un polyaminoacide formé par des résidus aspartiques ou des résidus
glutamiques, au
moins une partie de ces résidus étant porteuse de greffons comportant au moins
un
groupement hydrophobe GH. Ces polyaminoacides sont notamment du type de ceux
décrits dans la demande de brevet PCT W0-A-00/30618.
Selon une première éventualité, le (ou les) PO est (sont) défini(s) par la
formule
générale (I) suivante (le radical ¨COOR3 inclut les formes où la liaison entre
le carboxyle
et R3 est une liaison ionique ¨000- R3):
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A.-COOR3
-
R24 _
_ i .... Ir.,,m NHR1
r'qy-------=N
- n
Oy A H 0
R4
[GH]
(I)
dans laquelle :
= RI est choisi dans le groupe constitué par H, alkyle linéaire en C2 à
C10,
alkyle ramifié en C3 à C10, benzyle, et -R4-[GE1], ou
= I\IFIRI est un résidu acide aminé terminal ;
= R2 est choisi dans le groupe constitué par H, acyle linéaire en C2 à Cm,
acyle ramifié en C3 à C10, et -R4-[GH] ou
= R2 est un résidu pyroglutamate terminal ;
= R3 est H, ou
= R3 est de préférence sélectionné dans le groupe comprenant :
- les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe
comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium,
- les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe
comprenant :
= les cations à base d'amine,
= les cations à base d'oligoamine,
= les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant
particulièrement préférée),
= les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis
dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou
d'arginine,
- ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le
sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine ;
= R4 représente une liaison directe ou un espaceur à base de 1 à 4 résidus
acide aminé ;
= A représente indépendamment un radical -CH2- (résidu aspartique) ou -
CH2-CH2- (résidu glutamique) ;
= n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est
suffisamment basse pour que PO mis en solution dans l'eau à pH = 7 et à
25 C, forme une suspension colloïdale de particules submicroniques de
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PO ; de préférence en + mlest compris entre 1 et 25 % molaire et mieux
encore entre 1 et 15 % molaire ;
n + m est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à 1000,
de préférence entre 50 et 300;
9 MI représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de
carbone.
Dans une forme préférée de réalisation de l'invention :
GH est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alkoxy du type :
--OCH2(CH2-CH2)3.8-CH3 , oléyle, tocophéryle ou cholestéryle, et
Io 114 représente une liaison de valence
simple.
Selon une deuxième éventualité, PO répond à l'une des formules générales (II),
(III) et (IV) suivantes (le radical ¨COOR3' inclut les formes où la liaison
entre le
carboxyle et R3' est une liaison ionique --00(- R3)+
COOR 3'
A H H A/C00R30*
L_LR4 pH]
PH]
====.. N
I _mg R3 I -ni
H 0 0 H
(II)
'
COOR COOR3
H A A H
- ,
PHI
4 [GH]
0 H H o
COOR
[GH] n" I
\ 4 N 4 ./.[GH1
R R
0 H
V)
dans lesquelles :
GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de
carbone ;
R30 est une chaine alkylène linéaire bivalente en C2 à C6;
13 R3 est H, ou
9 +R3 est de préférence sélectionné dans le groupe comprenant :
- les cations métalliques= avantageusement choisis dans le sous-groupe
comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium,
RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA/EP
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- les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe
comprenant :
= les cations à base d'amine,
= les cations à base d'oligoamine,
5 = les
cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant par-
ticulièrement préférée),
= les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans
la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine,
- ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le
10 sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine,
= R5 est une chaine alkylène linéaire bivalente en Ci à C8 dans laquelle
une ou
deux unités méthylènes, de préférence à chaque extrémité de R50, peuvent être
indépendamment remplacées par ¨0¨ ou ¨NI-1¨ ;
= R4 représente une liaison directe ou un espaceur à base de 1 à 4 résidus
acide
15 aminé ;
= A représente indépendamment un radical -CH2- (résidu aspartique) ou -CH2-
CH2- (résidu glutamique) ;
= n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à
1000,
de préférence entre 50 et 300.
Suivant une variante intéressante, R4 représente une liaison de valence
simple.
Selon une troisième éventualité, PO comprend au moins une
copolyhydroxyalkylglutamine (de préférence alkyl est éthyl) essentiellement
neutre
comprenant une multiplicité de groupements hydrophobes (GH) pendants,
identiques ou
différents entre eux. La copolyhydroxy-alkylglutamine est porteuse de groupes
hydroxy-
alkylamino. Ces groupes hydroxyalkylamino sont, de préférence, liés au
copolymère par
l'intermédiaire d'une liaison amide. Les hydroxyalkylamines utilisables pour
amidifier le
carboxyle de résidus glutamates et donner cette copolyhydroxyalkylglutamine
sont
identiques ou différentes entre elles et sont par exemple choisies parmi la 2-
hydroxyéthylamine, la 3-hydroxypropylamine, la 2,3-dihydroxypropylamine, le
tris(hydroxyméthyl)aminométhane et la 6-hydroxyhexylamine.
Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans
un
greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement
(spacer)
permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne principale de
copolyglutamates. Cette rotule peut comprendre, par ex. au moins une liaison
covalente
directe ou au moins une liaison amide ou au moins une liaison ester. Par
exemple, la rotule
peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment : les
résidus
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acide aminé, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par
exemple des
diamines), les dérivés des polyols (par exemple des diols) et les dérivés des
hydroxyacides. Le greffage des GH sur la chaîne copolyglutamate ou
polyhydroxyalkylglutamine peut passer par la mise en oeuvre de précurseurs de
GH, aptes
à se lier à la chaîne copolyglutamate ou copolyhydroxyalkylglutamine. Les
précurseurs
des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le
groupe
comprenant les alcools et les amines, ces composés pouvant être
fonctionnalisés
facilement par l'homme de l'art. Pour plus de détails sur cette
copolhydroxyalkylglutamine (de préférence alkyl est éthyl), on se référera au
FR-A-
2 881 140
Suivant une variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des trois
éventualités susvisées, tout ou partie des radicaux hydrophobes GH des PO sont
choisis de
façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant :
= un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et
pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence 0, N ou S) ou
au moins une insaturation,
= un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs
cycloalkyles annelés et contenant éventuellement au moins une insatu-
ration ou au moins un hétéroatome (de préférence 0, N ou S),
= un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et
pouvant comporter au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome
(de préférence 0, N ou S).
Suivant une autre variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des
trois
éventualités susvisées, le groupement hydrophobe GH est choisi dans le groupe
comprenant les radicaux alkoxy du type : ¨OCH2(CH2-CH2)3_8-CH3 , oléyle,
tocophéryle
ou cholestéryle, et R4 représente une liaison de valence simple.
Suivant une autre variante avantageuse, les n groupements GH du PO, notamment
selon au moins l'une des trois éventualités susvisées, représentent chacun
indépendamment
les uns des autres un radical monovalent de formule suivante :
H 0
I
6
R
R5
(GH)
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dans laquelle :
- R5 est méthyle (résidu alanine), isopropyle (valine), isobutyle (leucine),
secbutyle (isoleucine), benzyle (phénylalanine) ;
- R6 représente un radical hydrophobe comportant de 6 à 30 atomes de
carbone ;
- 1 varie de 0 à 6.
Selon une caractéristique remarquable de l'invention, tout ou partie des
radicaux
hydrophobes R6 des PO sont choisis de façon indépendante, dans le groupe de
radicaux
comportant :
= un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et
pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence 0, N ou S) ou
au moins une insaturation,
= un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs
cycloalkyles annelés et contenant éventuellement au moins une
insaturation ou au moins un hétéroatome (de préférence 0, N ou S),
= un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et
pouvant comporter au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome
(de préférence 0, N ou S).
En pratique et sans que cela ne soit limitatif, le radical hydrophobe R6 du
greffon
du PO est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alkoxy du type :
¨OCH2(CH2-CH2)3_8¨CH3 , oléyle, tocophéryle ou cholestéryle.
Avantageusement, la chaîne principale du polyaminoacide est:
un homopolymère d'alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-glutamique ;
un homopolymère d'alpha-L-aspartate ou d'alpha-L-aspartique
ou un copolymère d'alpha-L-aspartate/alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-
aspartique/
alpha-L-glutamique.
De manière remarquable, la distribution des résidus aspartiques ou glutamiques
de
la chaîne polyaminoacide principale du PO est telle que le polymère ainsi
constitué est soit
aléatoire, soit de type bloc, soit de type multibloc.
Selon un autre mode de définition, PO a une masse molaire qui se situe entre 2
000
et 100 000 g/mol, et de préférence entre 5 000 et 40 000 g/mol.
Selon une variante, PO est porteur d'au moins un greffon de type polyalkylène-
glycol lié à une résidu glutamate ou aspartate.
Avantageusement, ce greffon est de type polyalkylène-glycol est de formule (V)
suivante.
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4 p 8
R.....,....-n ---..x..---",......7017-1,,,--
R7
(V)
dans laquelle :
- R'4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4
résidus acide aminé ;
- X est un hétéroatome choisi dans le groupe comportant l'oxygène,
l'azote ou un soufre ;
- R7 et R8 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en
C 1 à C4 ;
- n" varie de 10 à 1000, de préférence de 50 à 300.
En pratique, le polyalkylèneglycol est par exemple un polyéthylène glycol.
Il est souhaitable, conformément à l'invention, que le pourcentage molaire de
greffage du polyalkylène glycol varie de 1 à 30 %.
Les polyaminoacides PO sont en outre extrêmement intéressants, du fait qu'à un
taux de greffage ajustable, ils se dispersent dans l'eau à pH = 7,4 (par
exemple avec un
tampon phosphate) pour donner des suspensions colloïdales.
De plus, des principes actifs PA tels que des protéines, des peptides ou des
petites
molécules peuvent s'associer spontanément à des nanoparticules de
polyaminoacides PO.
Il convient de comprendre que les PO contiennent des groupes ionisables qui
sont,
selon le pH et la composition, soit neutres (par exemple -COOH), soit ionisés
(par
exemple -COM,. Pour cette raison, la solubilité dans une phase aqueuse est
directement
fonction de la fraction de fonctions ionisées et donc du pH. En solution
aqueuse, dans le
cas de fonctions carboxyliques, le contre-ion peut être un cation métallique
tel que le
sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que les formes
protonées
de la triéthanolamine, du tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou d'une polyamine
telle que
la polyéthylèneimine.
Les PO de type polyaminoacide sont obtenus, par exemple, par des méthodes
connues de l'homme de l'art. Les polyaminoacides statistiques peuvent être
obtenus par
greffage du greffon hydrophobe, préalablement fonctionnalisé par l'espaceur,
directement
sur le polymère par une réaction classique de couplage. Les PO polyaminoacides
blocs ou
multiblocs peuvent être obtenus par polymérisation séquentielle des anhydrides
de N-
carboxy-aminoacides (NCA) correspondants.
On prépare par exemple un polyaminoacide, homopolyglutamate,
homopolyaspartate ou un copolymère glutamate/aspartate, bloc, multibloc ou
aléatoire
selon des méthodes classiques.
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Pour l'obtention de polyaminoacide de type alpha, la technique la plus
courante est
basée sur la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA),
décrite, par
exemple, dans l'article "Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de H.R.
Kricheldorf
"alpha-Aminoacid-N-Carboxy-Anhydrides and related Heterocycles" Springer-
Verlag
(1987). Lorsque la chaine latérale possède une fonction acide carboxylique,
les dérivés de
NCA sont de préférence des esters NCA-O-Me, NCA-O-Et ou NCA-O-Bz (Me = méthyl,
Et = éthyl et Bz = benzyl). Les polymères sont ensuite hydrolysés dans des
conditions
appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont
inspirées de
la description donnée dans la demande FR-A-2 801 226 de la demanderesse. Un
certain
nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type
poly(alpha-L-
aspartique), poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique) et poly(gamma-
L-
glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement. Le
polyaspartique de
type alpha-bêta est obtenu par condensation de l'acide aspartique (pour
obtenir un
polysuccinimide) suivie d'une hydrolyse basique (cf. Tomida et al. Polymer,
1997, 38:
4733-36).
Le couplage du greffon avec une fonction acide du polymère est réalisé
aisément
par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme agent de
couplage
et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine et dans
un solvant
approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-méthylpyrrolidone (NMP) ou
le
diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le
dicyclohexylcarbo-
diimide ou le diisopropylcarbodiimide. Le taux de greffage est contrôlé
chimiquement par
la stoechiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les
greffons
hydrophobes fonctionnalisés par un espaceur sont obtenus par couplage
peptidique
classique ou par condensation directe par catalyse acide. Ces techniques sont
bien connues
de l'homme de l'art.
Pour la synthèse de copolymère bloc ou multibloc, on utilise des dérivés NCA
préalablement synthétisés avec le greffon hydrophobe. Par exemple, le dérivé
NCA-
hydrophobe est copolymérisé avec le NCA-O-Bz puis on enlève par hydrolyse
sélectivement les groupes benzyles.
Le(s) principe(s) actif(s) PA
Concernant le PA, il est de préférence choisi dans le groupe comprenant: les
protéines, les
glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes
polyalkylèneglycol [de
préférence polyéthylèneglycol (PEG) : "protéines-PEGylées"], les peptides, les
polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les
polynucléotides et leurs
mélanges,
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et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe de érythropoïétine,
ocytocine,
vasopressine, hormone adrénocorticotrope, facteur de croissance épidermique,
facteur de
croissance plaquettaire (PDGF), facteurs de croissance hématopoïétiques et
leurs
mélanges, facteurs VIII et IX, hémoglobines, cytochromes, albumines,
prolactine,
5 hormone de libération de l'hormone lutéinisante (LHRH), antagonistes de la
LHRH,
agonistes de la LHRH, hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine,
hormone de libération de l'hormone de croissance, insuline, somatostatine,
glucagon,
interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-11, IL-12), interférons-a, f3 ou y,
gastrine,
tétragastrine, pentagastrine, urogastrone, sécrétine, calcitonine,
enképhalines, endorphines,
10 angiotensines, hormone de libération de la thyrotropine (TRH), facteurs de
nécrose
tumorale (TNF), facteurs neurotrophiques (NGF), facteur de croissance
granulocytaire (G-
CSF), facteur de croissance des granulocytes et macrophages (GM-CSF), facteur
de
croissance des macrophages (M-CSF), héparinase, protéine morphogénique osseuse
(BMP), peptide auriculaire natriurétique (hANP), glucagon-like peptide 1 (GLP-
1), facteur
15 de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), antigène recombinant de
l'hépatite B
(rHBs), rénine, cytokines, bradykinine, bacitracines, polymyxines, colistines,
tyrocidine,
gramicidines, cyclosporines et analogues synthétiques, modifications et
fragments actifs
pharmaceutiquement d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de
vaccins.
Selon une variante, le PA est une petite molécule organique hydrophobe,
20 hydrophile ou amphiphile du type de celles appartenant à la famille
des anthracyclines, des
taxoïdes ou des camptothécines ou du type de celles appartenant à la famille
des peptides
telles que la leuprolide ou la cyclosporine et leurs mélanges
Au sens du présent exposé, une petite molécule est notamment une petite
molécule non
protéinique, par exemple exempte d'acides aminés.
25 Selon une autre variante, le PA est avantageusement choisi parmi au
moins l'une
des familles de substances actives suivantes : les agents de traitement de
l'abus d'alcool,
les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les
agents de
traitement de l'acromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les
agents de
traitement des allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires,
les
anticoagulants et antithrombotiques, les anticonvulsivants, les
antiépileptiques, les
antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques,
les anti-
infectieux, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les
antiparkinsoniens, les
anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de l'anhydrase
carbonique, les agents
cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les
vasodilatateurs, les
antiangineux, les antihypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de
cholinestérase,
les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les
stimulants du
système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les
inducteurs et
inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose,
les agonistes des
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récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les
agents de
traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la
fertilité, les
agents de traitements des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs
et les
immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les
antimigraineux, les relaxants des muscles, les analogues de nucléosides, les
agents de
traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines,
les agents
psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les
neuroleptiques,
les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de
traitements
dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les
anorexiques, les
antidouleurs non analgésiques, les antiépileptiques, les barbituriques, les
benzodiazépines,
les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de
ces produits.
Sur le plan quantitatif, il est particulièrement intéressant que la fraction
massique
en PA non associé aux particules micrométriques [PA non associé] en % en poids
soit telle
que:
o [PA non associé] < 1
o de préférence [PA non associé] < 0,5.
2ème aspect de l'invention : le procédé d'obtention des microparticules par
atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO contenant du
PA.
Selon une modalité préférée du procédé selon l'invention, le PO contenu dans
la
solution ou la suspension colloïdale destinée à être atomisée est au moins en
partie sous
forme de nanoparticules de PO ayant une taille, mesurée dans le test Ti,
inférieure à
500 nm, de préférence comprise entre 10 et 300 nm , et plus préférentiellement
encore
comprise entre 10 et 100 nm.
Avantageusement, la concentration en PO dans la solution ou la suspension
colloïdale à atomiser est, par exemple, comprise entre 5 mg/m1 et 100 mg/ml de
préférence
entre 10 mg/ml et 40 mg/ml.
Dans le cadre de l'invention, l'association PA/P0 est réalisée avant ou
pendant
l'étape d'atomisation.
Pour cette association le PO ou le PA peut être sous forme solide (de
préférence
une poudre) ou sous forme de suspension liquide.
Des techniques d'association d'un ou de plusieurs PA à PO avant l'étape
d'atomisation sont décrites notamment dans la demande de brevet WO-A-00/30618.
Elles
consistent par exemple à mélanger une suspension colloïdale de PO à une
solution ou une
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suspension de PA. Selon une variante, le PA sous forme poudre est mélangé à la
suspension de PO.
Suivant une variante intéressante de ce procédé d'obtention, les
microparticules de
polymère PO associé avec au moins un principe actif (PA) sont dispersées dans
un milieu
liquide essentiellement aqueux, ledit milieu contenant de préférence un moyen
Ml de
dispersion, et la dispersion obtenue est lyophilisée.
Le lyophilisat ainsi obtenu a pour avantage de faciliter la préparation des
formulations
liquides à base des microparticules (3ème aspect de l'invention décrit ci-
après), car ce
lyophilisat se disperse rapidement dans le liquide de reconstitution utile
pour prépare les
susdites formulations liquides.
Avantageusement, le moyen de dispersion M1 est choisi dans le groupe constitué
par:
i- des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des
groupements
ionisables du polymère PO et qui sont contenus dans la phase continue aqueuse;
ii- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une
préparation
injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc
contenus
dans les microparticules PO/PA atomisées;
iii- au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins
un
composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable);
iv- le changement de pH;
v- et les combinaisons d'au moins deux des moyens (i) à (iv);
le moyen (i) étant particulièrement préféré.
Pour plus de détails sur des exemples de possibilités d'exécution des moyens
Ml
(i) à (iv), on se reportera à la description qui suit des moyens de dispersion
M2.
De même, s'agissant du milieu liquide de dispersion, celui-ci peut contenir
les
mêmes additifs que ceux décrits pour le liquide de reconstitution défini infra
3ème aspect de l'invention: Formulations liquides à base des microparticules
obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO
contenant
du PA.
La formulation suivant l'invention peut être une forme pharmaceutique liquide
pour la libération prolongée de PA comprenant une suspension colloïdale, de
basse
viscosité, à base de microparticules de PO associées à au moins un PA, ces
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microparticules étant celles telles que définies ci-dessus ou celles obtenues
par le procédé
lui aussi tel que défini ci-dessus et dans les exemples infra.
Cette formulation a pour avantage d'être injectable par voie parentérale et
d'être liquide
dans les conditions d'injection.
Suivant l'invention, les qualificatifs "basse" ou "très faible viscosité"
correspondent, avantageusement, à une viscosité dynamique à 20 C inférieure
ou égale à
1000 mPa.s. De préférence, la viscosité dynamique de la formulation, mesurée à
20 C,
pour un gradient de cisaillement de 1000 s-1, est préférablement inférieure ou
égale à
500 mPa.s., de préférence comprise entre 2 et 200 mPa.s. par exemple, comprise
entre 1,0
et 100 mPa.s, voire entre 1,0 et 50 mPa.s.
Mesure de la viscosité dynamique
La mesure de référence pour la viscosité dynamique peut être réalisée, par
exemple, à
C à l'aide d'un rhéomètre AR1000 (TA Instruments) équipé d'une géométrie cône-
plan
(4 cm, 2 ). La viscosité y est mesurée pour un gradient de cisaillement de 10
s-1.
15 Cette faible viscosité rend les formulations de l'invention aisément
injectables par
voie parentérale, en particulier par voie muqueuse, sous-cutanée,
intramusculaire,
intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur. La
formulation selon
l'invention peut aussi être administrée par voie orale, nasale, pulmonaire,
vaginale ou
oculaire, entre autres.
20 La viscosité des formulations liquides de l'invention est faible aussi
bien à des
températures d'injection correspondant à des températures ambiantes, par
exemple
comprises entre 4 et 30 C, qu'à la température physiologique.
Les microparticules sèches formées par atomisation de PO (par ex. polyamino-
acide) amphiphile peuvent de plus être aisément redispersées pour former des
suspensions
ou des solutions microparticulaires faiblement visqueuses.
Moyen M2 de dispersion
S'agissant précisément de la dispersion ou mise en suspension des
microparticules
PO/PA atomisées dans un liquide de reconstitution pour préparer la
formulation, il est
prévu selon l'invention que ladite formulation comprenne un moyen M2 de
dispersion des
microparticules de PO/PA.
Ce moyen M2 de dispersion peut différer selon la nature de la phase continue
(c'est-à-dire du liquide de reconstitution) de la suspension entrant dans la
constitution de la
formulation.
Ainsi, quatre possibilités sont notamment envisageables selon l'invention :
1. La phase continue de la suspension est essentiellement aqueuse
2. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique
miscible à l'eau.
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3. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique
non
miscible à l'eau.
4. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique
miscible ou non à l'eau.
Par "phase continue essentiellement aqueuse", on entend, par exemple un
liquide
contenant au moins 60 % en masse d'eau.
Par "phase continue essentiellement organique", on entend, par exemple un
liquide
contenant au moins 60 % en masse de phase organique.
1. La phase continue de la suspension est essentiellement aqueuse
Plusieurs types de moyens M2 de dispersion, éventuellement combinés entre eux,
sont envisageables, à savoir que le moyen M2 de dispersion est par exemple
choisi dans le
groupe constitué par:
i- des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des
groupements
ionisables du polymère PO et qui sont contenus dans la phase continue aqueuse;
ii- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une
préparation
injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc
contenus
dans les microparticules PO/PA atomisées;
iii- au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins
un
composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable);
iv- le changement de pH;
v- et les combinaisons d'au moins deux des moyens (i) à (iv);
le moyen (i) étant particulièrement préféré.
(i). Moyen M2 de dispersion à base d'ions multivalents
Dans le cas où PO présente des groupements GI ionisables, le moyen M2 de
dispersion
peut comprendre des ions multivalents dont la polarité est opposée à la
polarité des
groupements ionisables GI (au moins en partie ionisés) du polymère PO et qui
sont
introduits dans la phase continue aqueuse, lors de la reconstitution de la
suspension/solution qui forme la suspension.
Au sens de l'invention, le terme "ions multivalents" désigne par exemple des
ions
divalents, des ions trivalents, des ions tétravalents et des mélanges de ces
ions.
Dans le cas où PO présente des groupements GI anioniques, les ions
multivalents sont des
cations multivalents, de préférence des cations divalents, plus
préférentiellement encore
choisis dans le groupe comprenant : Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+ou leurs
mélanges, ou des
cations trivalents, plus préférentiellement encore choisis dans le groupe
comprenant : Al3+,
Fe3+ ou leurs mélanges.
Il est possible qu'outre des ions multivalents, la formulation selon
l'invention contienne
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des ions (par ex. cations) monovalents, éventuellement actifs dans
l'agrégation des
nanoparticules en microparticules.
Ces ions multivalents sont amenés dans la formulation de l'invention, de
préférence sous
forme de solution saline (organique ou minérale) aqueuse, par exemple une
solution de
5 sulfate, chlorure, acétate, gluconate ou glutamate (ou autre acide aminé
anionique) de
cations multivalents.
Ce moyen M2 de dispersion à base d'ions multivalents convient plus
préférentiellement
dans le cas où PO amphiphile (par ex. un (co)polyaminoacide) est relativement
hydrophile.
(ii) et (iii) Moyen M2 de dispersion à base de composé (s) hydrophile (s) ou
comprenant au moins un enrobage à base de composé (s) hydrophile(s)
Le moyen M2 de dispersion peut comprendre essentiellement :
- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une
préparation
injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc
contenu dans les
microparticules PO/PA atomisées ;
- ou au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au
moins un
composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable).
Ces moyens M2 de dispersion peuvent être incorporés dans la formulation selon
plusieurs modes.
Suivant un premier mode, on ajoute à la suspension/solution de PO à atomiser
au
moins un composé hydrophile choisi parmi ceux utilisables dans une préparation
injectable, de préférence choisi dans le groupe comprenant :
--> les acides aminés (par ex. lysine, arginine, glycine) ;
---> les polyalkylène glycols, de préférence les polyéthylène glycols ;
---> les copolyalkylène glycols, de préférence les copolymères -
éthylèneglycol-
propylène-glycol (de type Poloxamer, Pluronic ou Lutrol);
¨> les polymères cellulosiques et leurs dérivés, de préférence les
carboxyalkyl-
celluloses (par ex. les carboxyméthylcelluloses) ou les alkylcelluloses (par
ex. les
méthylcelluloses) ;
---> les saccharides hydrogénés ou non, tels que le tréhalose, le sorbitol,
le mannitol, le
saccharose ;
--> les polyols tels que le propylène glycol ou le glycérol ;
---> les gélatines de préférence hydrolysées ;
---> les (co)polymères azotés, de préférence ceux contenus dans le groupe
comprenant
les polyacrylamides, les poly-N-vinylamides, les polyvinylpyrrolidones (PVP)
et les poly-
N-vinyl-lactames ;
---> les alcools polyvinyliques (APV);
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--> le polyglutamate de sodium ;
---> et leurs mélanges ;
ledit composé hydrophile d'enrobage comprenant de préférence au moins un
polymère
hydrophile.
Suivant un deuxième mode, les microparticules sont enrobées par au moins une
couche d'au moins un composé hydrophile tel que défini ci-dessus. Dans ce
deuxième
mode, le composé hydrophile comprend, de préférence, au moins un polymère
hydrophile
choisi parmi les composés hydrophiles tels que définis ci-dessus.
Le moyen M2 (ii) de dispersion à base d'au moins un composé hydrophile s'est
avéré particulièrement adapté pour les PO amphiphiles présentant une
hydrophobie
suffisamment élevée, par exemple un taux de groupements GH supérieur ou égal à
10 %
molaire pour un PO constitué par au moins un polyaminoacide.
L'enrobage (moyen M2 (iii)) des microparticules par une telle couche de
composé
hydrophile et biocompatible peut être, par exemple, réalisé par deux
atomisations
successives ; la deuxième atomisation, réalisée sur une suspension de
particules dans un
solvant non miscible avec lesdites microparticules, peut contribuer à
faciliter la dispersion
de ces particules.
Ce moyen M2 (iii) de dispersion, par enrobage hydrophile des microparticules,
permet à la suspension de microparticules de rester intègre et stable au moins
pendant
quelques jours, ce qui rend sa manipulation plus aisée.
Avantageusement, la combinaison d'un moyen M2 (ii) ou (iii) de dispersion des
microparticules à base de composé(s) hydrophile(s) et d'un moyen M2 (i) de
dispersion à
base d'ions divalents, contenus dans la phase aqueuse lors de la
reconstitution de la
formulation, permet une dispersion accélérée.
Suivant un autre mode particulier de réalisation, la phase continue aqueuse ou
l'enrobage hydrophile peut aussi contenir au moins un tensioactif injectable
tel que le
Tween 80, une lécithine, phosphatidyléthanolamine, phosphatidylsérine ou un
copolymère de polyoxypropylène-polyoxyéthylène (dénomination commerciale :
Poloxamer, Pluronic, Lutrol).
(iv) Moyen M2 de dispersion par changement de pH
Un autre moyen de dispersion envisageable selon l'invention consiste en un
moyen
de dispersion par changement de pH, de préférence avant atomisation. Ce type
de moyen
s'est avéré adapté notamment dans le cas où le PO amphiphile (par ex.
polyaminoacide) est
un composé porteur de fonctions ionisables et est par ailleurs très
hydrophile, c'est-à-dire
comprenant par exemple moins de 10 % molaire de groupements hydrophobes GH.
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En effet, la mise en oeuvre d'un tel moyen M2 (iv) permet d'augmenter
l'hydrophobie du PO amphiphile, en amenant le pH à une valeur telle que les
fonctions
ionisables du PO (par ex. du polyaminoacide) deviennent non ionisées (par
exemple
acidification dans le cas où le PO est un polyaminoacide hydrophile du type
polyGlu ou
polyAsp).
De préférence, ce moyen M2 (iv) de dispersion par changement de pH avant
atomisation est appliqué à la suspension/solution de PO juste avant
l'atomisation.
Ce moyen M2 (iv) de dispersion par changement de pH avant atomisation peut
être
combiné ou non:
= avec le moyen M2 (i) de dispersion à base d'ions multivalents mis en
uvre après
atomi-sation, dans l'étape de reconstitution ; ou
= avec le moyen M2 (ii) ou (iii) de dispersion à base de composé
hydrophile, de
préférence par enrobage M2 (iii) des microparticules par au moins un polymère
hydrophile.
2. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement
ore.rAimig
miscible à l'eau.
Le moyen de dispersion consiste dans cette phase organique miscible à l'eau.
Cette
phase peut ainsi par exemple contenir éthanol, N-méthylpyrrolidone,
diméthylsulfoxyde,
isopropanol, glycérol, ou glycofurol (tétrahydrofurfuryl alcool polyéthylène
glycol éther).
3. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique
non
miscible à l'eau
Suivant une voie intéressante de mise en oeuvre, le moyen de dispersion
comprend
un liquide lipophile, dont la température de fusion est de préférence
inférieure ou égale à
15 C, contenu dans la phase continue organique non miscible à l'eau.
De préférence, le liquide lipophile comprend au moins un mélange de
triglycérides
d'acides gras saturés ou au moins une huile végétale ou au moins un lipide ou
au moins un
dérivé de lipide ou au moins un acide gras ou au moins un dérivé d'acide gras.
Plus préférentiellement encore, le liquide lipophile comprend :
= un mélange de triglycérides d'acides gras saturés en Cg -C10 issu de
l'huile de noix
de coco, par exemple celui commercialisé sous la dénomination Miglyol 812 par
Sasol) ;
= au moins une huile végétale, de préférence l'huile de soja, l'huile de
palme, l'huile
de lin, l'huile de coton, l'huile de sésame, l'huile de tournesol, l'huile
d'arachide,
= au moins un lipide, de préférence une lécithine liquide, la vitamine E
synthétique
ou naturelle ;
= au moins un dérivé de lipide, de préférence
l'arachidoylphosphatidylcholine et la
stéaroylphosphatidyl-choline,
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= au moins un acide gras, de préférence l'acide oléique, l'acide
myristique, l'acide
palmitique, l'acide stéarique, et leurs sels ;
= au moins un dérivé d'acide gras, de préférence un dérivé de mono-, di- ou
tri-
glycéride, l'oléate d'éthyle, le lactate de lauryle, le stéarate de glycéryle,
le palmitate de
sorbitane, le stéarate de sorbitane, le monoléate de sorbitane, le polysorbate
;
= et leurs mélanges ;
avec la condition selon laquelle, dans le cas où certains des produits
énumérés ci-dessus
pris séparément ne sont pas liquides à une température inférieure ou égale par
exemple à
C, alors ces produits sont en mélange avec d'autres, de sorte qu'ils soient
liquides à
10 une température inférieure ou égale par exemple à 15 C.
Les dérivés de triglycérides d'acides gras sont particulièrement préférés,
notam-
ment un mélange de triglycérides d'acides gras saturés en Cg -C10 issu de
l'huile de noix de
coco, par exemple celui commercialisé sous la dénomination Miglyol 812 par
Sasol).
D'autres triglycérides à chaînes longues d'acides gras utilisables sont
notamment présents
15 dans des huiles végétales telles que l'huile de soja, l'huile de palme,
l'huile de lin, l'huile
de coton, l'huile de sésame, l'huile de tournesol ou l'huile d'arachide.
Les poudres de PO/PA atomisées se dispersent aisément dans cette phase
organique non miscible à l'eau, pour donner des suspensions stables de
microparticules qui
conservent leur intégrité pendant plusieurs jours et sont donc, là encore,
aisément
manipulables. Cette dispersion est particulièrement rapide sans qu'il soit
nécessaire
d'ajouter d'autre(s) moyen(s) de dispersion, même si cette éventualité est
envisageable.
4. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement orenique
miscible ou non à l'eau
Suivant une alternative intéressante de mise en oeuvre compatible avec les
2ème &
3ème possibilités s'agissant de la nature de la phase continue de la
suspension/solution
constituant la formulation, le moyen de dispersion comprend un enrobage des
microparticules par au moins un composé filmogène d'enrobage (de préférence
utilisable
pour une préparation injectable).
De préférence, le composé filmogène d'enrobage comprend au moins un polymère
hydrophobe choisi dans le groupe comprenant les polylactides, les
polyglycolides, les
poly(lactide-co-glycolide), les polyorthoesters, les polyanhydrides, les
acides poly-
hydroxybutyriques, les polycaprolactones, les polyalkylcarbonates, les
polymères PO
insolubles dans l'eau, leurs dérivés et leurs mélanges.
Suivant une variante, le composé filmogène d'enrobage est de nature lipidique
et
présente une température de fusion de préférence supérieure ou égale à 15 C et
comprend
au moins un mélange de triglycérides d'acides gras saturés ou au moins une
huile végétale
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ou au moins un lipide ou au moins un dérivé de lipide ou au moins un acide
gras ou au
moins un dérivé d'acide gras ou un mélange de ces produits.
Suivant un autre mode intéressant de réalisation, la phase continue organique,
par
exemple hydrophobe, ou l'enrobage hydrophobe peu(ven)t aussi contenir au moins
un
tensioactif injectable tel que le Tween 80, une lécithine, une
phosphatidyléthanolamine,
une phosphatidylsérine ou un copolymère de polyoxypropylène-polyoxyéthylène
(dénomination commerciale : Poloxamer, Pluronic, Lutrol).
Excipients/stabilisants
Il peut également être avantageux, pour faciliter les propriétés de dispersion
en phase
aqueuse ou améliorer encore la stabilité des suspensions aqueuses, que la
formulation
injectable comporte d'autres additifs, d'une part ceux ci-après désignés
"excipients/
stabilisants",et d'autre part des excipients classiques.
Les excipients/stabilisants peuvent être sélectionnés dans le groupe
comprenant :
¨> les nanoparticules d'au moins un polymère PO, PO étant un copolymère
amphiphile,
biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de
groupements hydrophiles ionisables (GT), au moins en partie ionisés, et
formant
spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH =
7,0, en
condition isotonique ;
--> les acides aminés ;
¨> les polyalkylène glycols, de préférence les polyéthylène glycols ;
--> les copolyalkylène glycols, de préférence les copolymères -
éthylèneglycol-
propylène-glycol (de type Poloxamer, Pluronic ou Lutrol) ;
¨> les polymères cellulosiques et leurs dérivés, de préférence les
carboxyalkyl-
celluloses (par ex. les carboxyméthylcelluloses) ou les alkylcelluloses (par
ex. les méthyl-
celluloses) ;
¨> les esters de sorbitane et d'acide(s) gras, de préférence les esters de
polyoxy-
alkylène (par ex. éthylène) glycol et d'au moins un acide (par ex. l'acide
oléique), de type
Tween (ou polysorbate) ;
¨> les tensioactifs à base de phospholipides et de polyalkylène glycols, de
préférence
de polyéthylène glycols ;
¨> les saccharides hydrogénés ou non, tels que le tréhalose, le sorbitol,
le mannitol, le
saccharose ;
--> les polyols tels que le propylène glycol ou le glycérol ;
¨> les gélatines de préférence hydrolysées ;
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les (co)polymères azotés, de préférence dans le groupe comprenant les
polyacrylamides, les poly-N-vinylamides, les polyvinylpyrrolidones (PVP) et
les poly-N-
vinyl-lactames ;
---> les alcools polyvinyliques (APV) ;
5 --> et leurs mélanges.
L'un des excipients (stabilisants) préférés conformément à l'invention est
formé par
des nanoparticules d'au moins un polymère PO, identique ou différent (de
préférence
identique) de celui constituant les microparticules.
10 La quantité de d'excipient/stabilisant mis en oeuvre dans la formulation
est de préférence
comprise entre 0,01 et 10 % en poids, et plus préférentiellement encore entre
0,1 et 5 % en
poids.
S'agissant des stabilisants comprenant des nanoparticules, ils sont
avantageusement
utilisés dans la formulation à raison de 1,5 à 3,5 % en poids, par exemple de
2,0 à 3,0 (=-===
15 2,5) % poids.
Le liquide de reconstitution
Outre les moyens de dispersion décrits ci-dessus, le liquide de reconstitution
mis en
uvre dans la préparation de la formulation selon l'invention peut comprendre
par
20 exemple :
- au moins un tampon ou au moins un sel injectable (tampon phosphate, tampon
citrate, chlorure de sodium) en concentration par exemple entre 0,001 M et 0,1
M
de préférence entre 0,005 M et 0,02 M, ce tampon ou ce sel injectable
permettant
d'ajuster le pH de la solution ;
25 - au moins un tensioactif injectable, de préférence de type polysorbate
tels le
Tween 20 et le Tween 80 ou de type Poloxamer tels le Lutrol F38, le Lutrol
F68 ou le Lutrol F127 dans des concentrations par exemple comprises entre
0,01 % et 2 %, de préférence entre 0,05 et 0,5 %.
Le liquide de reconstitution peut contenir de plus des agents densifiants tels
que des
30 saccharides, à savoir par ex. le saccharose, le D-mannitol ou le tréhalose
dans des
concentrations comprises entre 0,1 % et 10 %, de préférence entre 0,5 et 5 %.
La solution
de reconstitution peut également contenir un polymère viscosifiant injectable
choisi dans
le groupe comprenant les polysaccharides, les polymères synthétiques (par ex.
la carboxy-
méthylcellulose sodique), l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, les
poly-
35 alkylène glycols (par ex. polyéthylène glycols) et leurs mélanges.
L'utilisation de microparticules sèches de PO (par ex. polyaminoacide)
amphiphile
et l'utilisation d'un moyen ad hoc de reconstitution permet donc de répondre
au double
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objectif qui est de pouvoir obtenir des formulations pharmaceutiques à la fois
stables et
facilement dispersibles pour permettre leur injection par voie parentérale.
Outre les excipients/stabilisants susvisés pour l'amélioration de la
dispersion et de
la stabilité, les autres excipients classiques qui peuvent être ajoutés à la
suspension/
solution à atomiser ou à la formulation selon l'invention, sont, par exemple,
des
antimicrobiens, des tampons, des antioxydants ou des agents permettant
d'ajuster
l'isotonicité, qui sont connus de l'homme de l'art. On pourra par exemple se
référer à
l'ouvrage : Injectable Drug Development, P.K. Gupta et al., Interpharm Press,
Denver,
Colorado 1999.
Cet ajout d'excipients classiques peut être réalisé soit dans la phase aqueuse
de
dispersion, soit dans la solution/suspension avant atomisation.
Application de la formulation liquide selon l'invention
Bien que la formulation selon l'invention soit de préférence pharmaceutique,
cela
n'exclut pas pour autant les formulations cosmétiques, diététiques ou
phytosanitaires
comprenant au moins un PO tel que défini ci-dessus et au moins un PA.
zlème aspect de l'invention : Nécessaire de reconstitution de la formulation
selon
l'invention
Les microparticules de PO/PA et les liquides de reconstitution essentiellement
aqueux, les liquides de reconstitution essentiellement organiques et miscibles
à l'eau et les
liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau sont définis ci-
dessus.
Sème aspect de l'invention : Procédé de reconstitution, en particulier de la
formulation selon l'invention
Les microparticules de PO/PA et les liquides de reconstitution essentiellement
aqueux, les liquides de reconstitution essentiellement organiques et miscibles
à l'eau et les
liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau sont définis ci-
dessus.
Conformément à l'invention, il est envisageable de prévoir une filtration
stérilisante, sur des filtres de porosité égale, par exemple, à 0,2 p,m, de la
suspension
liquide de nanoparticules de laquelle sont issues les particules
micrométriques de la
formulation selon l'invention. L'agrégation en conditions stériles selon les
modes de
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préparation décrits ci-dessus permet ainsi d'injecter directement la
formulation à un
patient.
6èrne aspect de l'invention : Formulation pharmaceutique solide
Cette formulation pour la libération prolongée de PA comprend une forme poudre
sèche pour inhalation et administration pulmonaire à base de microparticules
PO/PA ci-
dessus définies.
Autres aspects de l'invention
La présente invention vise également des produits solides, dérivés des micro-
particules de PO selon l'invention.
En pratique, ces produits dérivés peuvent notamment être constitués par des
poudres, des gels, des implants ou des films, entre autres.
Ainsi, l'invention vise des produits dérivés de la formulation selon
l'invention, pris
en tant que tels, quel que soit leur procédé d'obtention.
L'invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique
consistant essentiellement à administrer une quantité efficace au plan
thérapeutique de la
formulation telle que décrite dans le présent exposé, par voie parentérale, en
particulier par
voie muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale,
intra-
cérébrale ou dans une tumeur. La formulation selon l'invention peut aussi être
administrée
par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, entre autres.
Suivant une variante particulière de l'invention, cette méthode de traitement
thérapeutique consiste à administrer la formulation telle que décrite supra
par injection
parentérale : sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale,
intracérébrale
ou dans une tumeur, de préférence de manière à ce qu'elle forme un dépôt au
site
d'injection.
L'invention sera mieux comprise et ses avantages et variantes de mise en uvre
ressortiront bien des exemples qui suivent et qui décrivent la synthèse des PO
formés par
des polyaminoacides greffés par un groupement hydrophobe, leur transformation
en
système de libération prolongée de PA, à savoir en formulation selon
l'invention (poudre
de microparticules sèches) et les caractéristiques de stabilité et de
redispersibilité de tels
systèmes.
EXEMPLES :
EXEMPLE 1 : SYNTHESE D'UN POLYMERE AMPHIPHILE PO-A
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Synthèse d'un polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine
synthétique
On solubilise 15 g d'un acide alpha-L-polyglutamique (de masse équivalente à
environ
16 900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène, et obtenu par
polymérisation de
NCAG1u0Me suivie d'une hydrolyse, comme décrit dans la demande FR-A-2 801 226)
dans 288 ml de diméthylformamide (DMF) en chauffant à 80 C jusqu'à
solubilisation du
polymère. On refroidit la solution à 15 C et on ajoute successivement 2,5 g
de D,L-alpha-
tocophérol (> 98 % obtenu de Fluka ) préalablement solubilisé dans 8 ml de
DMF,
280 mg de 4-diméthylaminopyridine préalablement solubilisée dans 1 ml de DMF
et 1,6 g
de diisopropylcarbodiimide préalablement solubilisé dans 6 ml de DMF. Après 3
h sous
agitation, le milieu réactionnel est versé dans 1200 ml d'eau contenant 15 %
de chlorure de
sodium et d'acide chlorhydrique (pH = 2). Le polymère précipité est ensuite
récupéré par
filtration, lavé par de l'acide chlorhydrique 0,1 N, de l'eau et par de
l'éther diisopropylique.
Le polymère est ensuite séché à l'étuve sous vide à 40 C. On obtient un
rendement de
l'ordre de 90 %. La masse molaire mesurée par la chromatographie d'exclusion
stérique
est de 15 500 par rapport à un standard polyoxyéthylène. Le taux de tocophérol
greffé,
estimé par spectroscopie RMN du proton, est de 5,1 % molaire. Une suspension
de
nanoparticules du polymère dans l'eau est obtenue en le solubilisant dans
l'eau et en
ajustant le pH à 7 1 (neutralisation des carboxylates).
EXEMPLE 2 : SYNTHESE D'UN POLYMERE AMPHIPHILE PO-B
L'exemple 2 est adapté de l'exemple 1 en visant un taux de greffage de 20%
EXEMPLE 3: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L' IFN-a-2b
Préparation d'une solution contenant 20 mg/g de polymère et 0,25 mg/g d'IFN
200 g de solution de polymère PO-A à 30 mg/g sont introduits dans un flacon de
500 ml.
68 g d'eau sont ensuite introduits dans le flacon contenant le polymère. Une
solution
congelée d'IFN-a-2b concentrée à 2,8 mg/g est décongelée à 25 C pendant 1 h
et 26,8 g
de cette solution congelée sont introduits dans le flacon contenant la
solution de polymère.
Le mélange est laissé pendant 14 h à température ambiante.
La solution est filtrée sur un filtre stérilisant 0,2 m.
Atomisation de la solution polymère-IFN
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La solution est atomisée sur un appareil de spray-chying de type Büchi B290.
La solution
liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et nébulisée à travers une buse
de
pulvérisation alimentée en azote (700 kPa ¨ 900 1/h). Le débit d'aspiration
(air de séchage)
est de 40 m3/h. La température d'entrée est maintenue à 90 C, ce qui induit
dans ces
conditions une température en sortie de 45 C.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le
dosage de
l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune
forme
dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 4: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L' IFN-a-2b ET DU POLYSORBATE 80
La solution de polymère PO et d'interféron est préparée à l'identique de
l'exemple 3.
0,9 g de polysorbate 80 sont ajoutés à la solution avant atomisation.
Atomisation de la solution polymère-IFN en présence de polysorbate
La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans
l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est: D50 = 5 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le
dosage de
l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune
forme
dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 5: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES
ACIDIFIÉES DE POLYMERE PO-A CONTENANT DE L' IFN-a-2b
La solution de polymère PO-A et d'IFN est préparée à l'identique de l'exemple
3. Elle est
ensuite diluée par ajout d'eau de façon à ce que la concentration en polymère
PO-A soit de
15 mg/g (la concentration en IFN étant alors de 0,188 mg/g). Après filtration
sur 0,2 !am,
la solution est acidifiée par ajout de HC1 1 N jusqu'à obtention d'un pH = 4.
La solution
ainsi obtenue est opalescente.
Atomisation de la solution polymère-IFN acidifiée
La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans
l'exemple 3.
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Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le
dosage de
5 l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation.
Aucune forme
dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 6: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A ENROBÉES DE PVP ET CONTENANT DE L' IFN-a-2b
Une poudre de microparticules sèches de polymère PO-A et d'IFN est obtenue à
partir
d'un mélange PO-A/IFN selon le protocole utilisé à l'exemple 3.
A l'issue de l'étape d'atomisation, 1,5 g de cette poudre sont remis en
suspension dans une
solution éthanolique contenant 7 g/1 de polyvinylpyrrolidone (PVP) de grade
injectable de
type PVP K30. La suspension éthanolique est agitée 2 h puis elle est atomisée
une
deuxième fois sur l'appareil de spray-drying de type Büchi B290 muni d'un
piège
d'extraction pour solvant organique (boucle d'inertage à ¨20 C) et
fonctionnant en circuit
fermé sous azote. La solution liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et
nébulisée à
travers une buse de pulvérisation alimentée en azote (700 kPa ¨ 670 1/11). Le
débit
d'aspiration (air de séchage) est de 40 m3/h. La température d'entrée est
maintenue à
80 C, ce qui induit dans ces conditions une température en sortie de 55 C.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 6 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le
dosage de
l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune
forme
dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 7: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-B CONTENANT DE L' IFN-a-2b
Le protocole de préparation de la solution polymère-IFN et d'atomisation est
identique à
celui décrit dans l'exemple 3, mais en remplaçant le polymère PO-A par le
polymère PO-
B.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est: D50 = 4 m.
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Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le
dosage de
l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune
forme
dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 8: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'hGH
Préparation de la solution d'hGH concentrée :
60 g d'une solution d'hormone de croissance humaine recombinante
(concentration 3,9
mg/g) sont décongelés pendant 90 min à 25 C et concentrés environ 6 fois par
ultrafiltration frontale sur membrane à limite d'exclusion de 10 kD jusqu'à
obtention
d'une concentration de 24 mg/g (contrôlée par HPLC).
Mélange avec la solution de polymère
52 g d'une solution concentrée de polymère PO-A à 30 mg/g sont dilués à 19,5
mg/g par
ajout de 28 g d'eau. 8 g de la solution d'hGH à 24 mg/g sont versés lentement
sur la
solution de polymère ainsi diluée. Le mélange est laissé pendant une nuit à
température
ambiante puis filtré sur filtre stérilisant (taille des pores : 0,2 m).
Atomisation de la solution polymère-hGH
La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans
l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le
dosage de
l'hGH par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune
forme
dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 9: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'IL-2
Préparation de la solution d'IL-2 concentrée :
100 g d'une solution congelée d'IL-2 à la concentration de 2 g/1 stabilisée
par du SDS sont
décongelés à température ambiante puis la solution est refroidie à une
température
comprise entre 0 et 2 C. 100 g d'éthanol absolu sont ajoutés lentement à
cette solution de
façon à précipiter la protéine. Le précipité est récupéré par filtration sur
une membrane de
0,65/0,45 m dans une cellule de diafiltration frontale et lavé avec 200 g
d'eau. Le
précipité est séché par application d'un flux d'azote. Le précipité est alors
dissous dans 10
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g de soude 0,02 N préalablement refroidie (<5 C) de façon à obtenir une
solution limpide
de protéine à 20 mg/g et pH = 12 exempte de SDS. Le titre exact de la solution
est
déterminé par une méthode HPLC.
Mélange avec la solution de polymère
96 g d'une solution concentrée de polymère PO de l'exemple 1 (à 30 mg/g) sont
dilués par
ajout de 39 g d'eau. 9 g de la solution d'IL-2 concentrée précédente à 20 mg/g
sont
lentement versés sur la solution de polymère ainsi diluée.
Le mélange contenant 20 mg/g de polymère PO et 1,25 mg/g d'IL-2 est laissé
pendant une
nuit à température ambiante puis filtré sur filtre stérilisant 0,2 m.
Atomisation de la solution polymère-IL-2
La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans
l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le
dosage de
l'IL-2 par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune
forme
dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 10 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'INSULINE
Préparation de 40 g d'une solution d'insuline concentrée à 20,3 mg/g :
0,83 g d'insuline humaine recombinante (poudre) d'activité 28,7 Ul/g et
contenant 2,5 %
d'humidité sont introduits dans un flacon en verre. 23,62 g d'eau sont ajoutés
et l'insuline
est dispersée sous agitation magnétique lente. 6,22 g d'HC1 0,1 N sont ajoutés
jusqu'à
obtention d'une solution limpide d'insuline acide. 9,32 g de soude 0,1 N sont
alors ajoutés
de façon à obtenir une solution finale limpide ayant un pH compris entre 7 et
8. La
solution d'insuline est filtrée sur un filtre stérilisant 0,2 m.
Mélange avec la solution de polymère
37,66 g de la solution d'insuline concentrée précédente sont lentement versés
(sous
agitation magnétique) sur 220 g de solution de polymère PO à 30 mg/g. 72,34 g
d'eau sont
ajoutés à la solution. Le mélange est laissé pendant 4 h à température
ambiante puis filtré
sur 0,2 m.
Atomisation de la solution polymère-insuline
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La solution est ensuite atomisée sur un appareil de spray-drying de type Büchi
B290. La
solution liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et nébulisée à travers
une buse de
pulvérisation alimentée en azote (700 kPa ¨ 900 1/h). Le débit d'aspiration
(air de séchage)
est de 40 m3/h. La température d'entrée est maintenue à 120 C, ce qui induit
dans ces
conditions une température en sortie de 70 C.
Atomisation de la solution polymère-insuline
La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans
l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 lam.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le
dosage de
l'insuline par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation.
Aucune forme
dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 11: CARACTÉRISTIQUES DES MICROPARTICULES OBTENUES
SELON L'INVENTION : TAILLE ET STABILITÉ
La taille des microparticules est mesurée selon le test TO et la stabilité
selon la test Si.
L'évaluation de la dégradation de la protéine est réalisée par HPLC en
comparant un
chromatogramme de la formulation avant et après atomisation.
Exemples Taille Taille D50 après mise
Dégradation de la
D50 selon TO en stabilité selon ST1 protéine générée par
(11m) (1-tm) l'atomisation*
3 5 5 aucune
4 5 5 aucune
5 5 5 aucune
6 6 5 aucune
7 4 5 aucune
8 5 5 aucune
9 5 5 aucune
10 5 5 aucune
* aucune signifie qu'aucune forme dégradée n'a été observée.
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Les résultats démontrent que l'atomisation des protéines en présence d'un
polyaminoacide
amphiphile permet de préserver la stabilité de la protéine. Sous forme solide
la poudre est
stable selon le protocole décrit. Il s'agit d'une condition forcée et il est
anticipé que la
stabilité des poudres est d'au moins 2 ans à 5 C.
L'atomisation est une méthode susceptible de dégrader la protéine. L'analyse
par HPLC
montrent qu'aucune forme de dégradation est observée en comparant les
chromatogrammes avant et après atomisation.
L'atomisation d'une protéine en présence d'un polyaminoacide amphiphile
conduit à des
microparticules stables dans le temps et n'induit pas de dégradation de la
protéine.
Ces poudres peuvent être utilisés sous forme solide (inhalation, injection
sans aiguille par
un pistolet sous pression par exemple) ou sous forme d'une suspension
injectable après
reconstitution dans un milieu approprié.
EXEMPLE 12: RECONSTITUTION DE SUSPENSION A PARTIR DES POUDRES
DES EXEMPLES 3 A 10.
Le reconstitution des poudres est réalisé dans trois milieux différents selon
le protocole
décrit pour réaliser le test DP1 :
A. Une solution aqueuse de tampon phosphate salin à pH 7.4
B. Une solution aqueuse de chlorure de magnésium à 0,1 M
C. Une solution de triglycéride d'acide caprique (Miglyol 812)
Les échantillons sont ensuite évalués en réalisant les étapes suivants :
- dispersion dans un des milieux cités ci-dessus
-
transfert dans une seringue puis injection à travers une seringue de 25G
La suspension est considérée avoir des bonnes propriétés si au moins 80 % est
récupérer
par aspiration/injection à travers une aiguille de 25G.
Résultats :
Milieu A Milieu B Milieu C
Exemple Stabilité Stabilité
Stabilité
Test DP1 Test DP1 Test DP1
ST2 ST2 ST2
3 non conforme conforme
conforme conforme conforme
_
4 non conforme conforme
conforme conforme conforme
_ . _ .
5 non conforme non conforme
conforme conforme
6 non conforme conforme
conforme conforme conforme
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7
conforme conforme conforme conforme conforme conforme
8 non conforme - conforme
conforme conforme conforme
9 non conforme - conforme
conforme conforme conforme
10 non conforme - conforme
conforme conforme conforme
Il a été mesuré également que la protéine n'est pas dégradée après
reconstitution dans les
milieux A, B et C lors du test de stabilité.
5 Ces résultats montrent que l'obtention d'une suspension stable et injectable
des
microparticules dans l'eau tamponnée par du PBS à pH = 7,4 n'est possible
qu'avec la
composition de l'exemple 7. Pour la plupart des exemples (sauf la 5), le
milieu de
reconstitution comportant un sel divalent permet l'améliorer ces propriétés.
En milieu
Miglyol, toutes les formulations sont facilement dispersibles, injectables et
stables.
L'ensemble de ces propriétés n'est pas obtenu aisément selon le polymère
utilisé. Il est du
mérite des inventeurs d'avoir trouvé après de nombreux essais que certains
excipients et
milieux de reconstitution permettent d' obtenir ces propriétés.
EXEMPLE 13 : MESURE DE VISCOSITÉ DES FORMULATIONS RECONSTITUÉES
Une dispersion des poudres à 30 mg/mL dans les milieux B et C des exemples
précédents
(sauf la 5 dans le milieu B) donnent des suspension stables peu visqueuses ;
dans le milieu
B, les viscosités mesurées sont tous inférieures à 10 mPa.s et dans le milieu
C, les
viscosités sont tous de l'ordre de 30 à 40 mPa.s.
A titre de comparaison, une composition des mêmes polymères sous forme
nanoparticulaire selon l'art antérieure, ne peux pas être obtenue à cette
concentration (30
mg/mL) dans les valeurs de viscosités acceptables (< 100 mPa.$).
EXEMPLE 14: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L' IFN-a-2b OBTENUES SOUS FORME DE
POUDRE LYOPHILISÉE
Les particules sont tout d'abord préparées comme décrit à l'exemple 3. L'étape
d'atomisation est réalisée dans des conditions aseptiques et les particules
sont récupérées
dans un récipient stérile.
Redispersion des particules en présence d'ions Mg2+ :
Tout de suite après la phase d'atomisation les particules sont récupérées et
redispersées en
conditions aseptiques dans une solution aqueuse de MgCl2 à 0,10 M. La quantité
de
solution de MgC12 ajoutée est ajustée de façon à ce que la concentration en
polymère
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PO-A dans la suspension soit environ de 40 mg/ml. Le pH est ajusté à 6,5 par
ajout de
soude 1 N.
Lyophilisation
La suspension est répartie en récipients de type Lyoguard permettant de
garder la
suspension stérile lors de la lyophilisation : les récipients sont ensuite
lyophilisés
stérilement pendant un cycle de 72 h sur un lyophilisateur de laboratoire
(module de
paillasse Christ, Osterode, Allemagne). La poudre est répartie stérilement en
flacons avant
utilisation.
EXEMPLE 15: COMPARAISON DE LA RECONSTITUTION DES POUDRES DE
MICROPARTICULES OBTENUES A PARTIR DE L'EXEMPLE 3 ET CELLES DE
L'EXEMPLE 14
Pour cette comparaison, les volumes de suspension reconstituée sont identiques
dans les
deux cas (environ 1 ml) et les flacons de reconstitution sont identiques
(flacons en verre de
3 m1). Les quantités de poudre sont ajustées de façon à ce que les deux
suspensions
contiennent au final 40 mg/mi de polymère et 0,5 mg/m1 d'IFN-a-2b. La poudre
de
l'exemple 3 est reconstituée dans une solution aqueuse de MgC12 0,1 M alors
que la
poudre de l'exemple 14 (qui contient déjà des ions Mg2+) est reconstituée dans
l'eau pure.
Dans un premier temps, les flacons sont agités manuellement. Alors que la
poudre de
l'exemple 3 requiert au moins 15 min pour se redisperser, la dispersion est
plus rapide
pour la poudre de l'exemple 14 et en moins de 5 min, on obtient une suspension
homogène. Un barreau magnétique est alors inséré dans les flacons et les deux
flacons
sont agités de façon identique pendant 1 h.
A l'issue de cette agitation, les caractéristiques des deux suspensions sont
comparées : la
taille des particules et la viscosité des deux suspensions sont semblables.
Caractéristiques après 1 h d'agitation
Vitesse de redispersion magnétique
sous agitation manuelle viscosité
D50 (test Ti)
(20 C, 1000 s-i)
Poudre exemple 3 environ 15 min 12 iam 54 mPa.s
Poudre exemple 14 <5 min 10 lm 53 mPa.s
EXEMPLE 16 : PHARMACOCINÉTIQUE DE L'IFN CHEZ LE CHIEN APRES INJEC-
TION SOUS-CUTANÉE D'UNE FORMULATION A BASE DE POLYAMINOACIDES
AMPHIPHILES SOUS FORME MICROPARTICULAIRE
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Huit chiens Beagle naïfs (poids de 9 0,6 kg) ont été traités avec les
formulations
suivantes :
Nombre (IFN] [PO] pH/ Dose Dose Volume
Formulation
de chiens (mg/mi) (mg/mi) mOsm (pg/kg) (mUkg)
6,5/
IFN IR 4 0,5 0 60 0,12
354
6,5/
Formulation 1 4 0,5 40 60 0,12
560
L'IFN IR (IR pour immediate release, c'est-à-dire libération immédiate)
correspond à une
solution d'interféron humain recombinant (PCGen, lot IB05.0516) ajustée en
concentra-
tion, pH et osmolarité ([IFN] = 0,5 mg/ml, pH = 6,5, et 354 mOsm).
Les particules de la formulation 1 sont préparées selon l'exemple 14 à partir
du même lot
d'interféron PCGen : la poudre lyophilisée est remise en suspension dans l'eau
stérilement
(sous hotte à flux laminaire) selon un procédé analogue à celui décrit dans
l'exemple 15.
Les résultats pharmacocinétiques sont regroupés dans le tableau suivant :
Formulation Cm. SD T> 50 pg/mL SD AUCO-all SD RBA Tso%auc SD
(ng/mL) (h) (ng.h/m1) ( /0) (h)
IFN IR 25,2 0,4 22,6 0,6 162,5 27,2 100
5,1 0,7
Formulation 1 0,5 0,2 225,0 15,3 54,7 7,5 34
99,5 11,9
où:
- C. est la concentration sérique maximale en IFN;
- T > 50 pg/ml est le temps où la concentration sérique en IFN est supérieure
à
50 pg/ml ;
- AUC représente l'aire sous la courbe concentration sérique en IFN en
fonction du
temps ;
- RBA représente la biodisponibilité par rapport à une formulation
Immediate Release;
- T50%auc représente le temps nécessaire pour relarguer 50% de l'IFN
relargué au total.
L'IFN IR présente un profil de libération rapide avec une concentration
sérique maximale
de 25,2 0,4 ng/mL, atteinte après un temps médian de 5 h (étendue : 3 - 5
h). L'IFN
circulant n'est plus quantifiable au-delà de 24 h.
La formulation 1 offre une modification majeure du profil pharmacocinétique de
l'IFN,
avec une libération très lente, et une concentration sérique maximale de 0,5
0,2 ng/mL
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(50 fois inférieure à celle de la forme IR) atteinte après un temps médian de
60 h (étendue
: 48 - 96 h). L'allure générale de la pharmacocinétique est un profil plat en
pseudo-
plateau. Le niveau d'IFN circulant retourne à une concentration non
quantifiable entre 192
h et 240 h (8 et 10 jours). Cette formulation présente une AUC plus basse :
perte de
biodisponibilité relative de 66 % (RBA = 34%). Le T50%aue est environ 20 fois
supérieur à
celui de l'IFN IR.
EXEMPLE 17: PHARMACODYNAMIE DE L'INSULINE CHEZ LE CHIEN APRES
INJECTION SOUS-CUTANÉE D'UNE FORMULATION A BASE DE POLYAMINO-
ACIDES AMPHIPHILES SOUS FORME MICROPARTICULAIRE
La référence de cet exemple, le Lantus , est un analogue d'insuline modifiée
(insuline
glargine - Sanofi-Aventis). La modification de deux aminoacides sur la
structure primaire
de l'insuline humaine confère au Lantus des propriétés de libération
prolongée sur une
période de 24 h via une précipitation in situ.
Un groupe de 6 chiens Beagle sains (poids de 11,4 1 kg) a été traité avec la
formulation
Lantus au cours d'un essai croisé à 2 périodes et un groupe de 8 chiens
Beagle sains
(poids de 11,8 1 kg) a été traité par la formulation 2, deux par deux, au
cours d'un essai
croisé à 4 périodes. Le tableau récapitulatif des traitements est résumé ci-
dessous :
Nombre [insuline] [PO] Dose Dose Volume
de chiens (UI/g) (mg/g) (UI/kg) (p,L/kg)
Lantus
12 100 0 1 10
(lot 40N300)
Formulation 2 8 100 30 1 1 10
Les particules de la formulation 2 sont préparées selon l'exemple 10 en visant
un ratio de
mg de polymère PO pour 3,5 mg (100 UI) d'insuline. La formulation est préparée
par
dispersion de la poudre atomisée dans MgC12 0,1 M et agitation magnétique de
la
25 suspension pendant 1 h. Le pH de la formulation est de 6,2 et
l'osmolalité de 348 mOsm.
La taille des particules correspondantes, mesurée dans un test TI, est : D50 =
12 pm et la
viscosité de la formulation est d'environ 5 mPa.s à 20 C.
La glycémie est dosée par méthode enzymatique (hexokinase) sur un automate
d'analyses
30 biochimiques du sang (Advia 1650, Bayer Diagnostics).
L'analyse des résultats de pharmacodynamie est réalisée sur le pourcentage de
la glycémie
basale en fonction du temps.
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Les données pharmacodynamiques sont regroupées dans le tableau suivant :
n I/
Cmin SD APGCo-36h APGCformuiatio
SD T50%APGc SD
APGCLantus
(A) (%.h) SD (h)
(%)
Lantus 40 6 1250 342 13,3
3,1
Formulation 2 50 17 948 491 76 39 16,5
6,2
où:
- Cmin est le pourcentage minimum observé de la glycémie basale ;
- APGCo-36h ("Area Percent Glycemia Curve") représente la surface entre la
glycémie basale (100%) et la courbe représentant l'évolution de la glycémie
(exprimée en % de la glycémie basale) au cours du temps entre 0 et 36 h post-
dose;
- T50%ApGc représente le temps nécessaire pour obtenir 50 % de l'APGC0-
36h.
L'administration de la référence Lantus conduit à une baisse rapide de la
glycémie dès la
première heure. L'action hypoglycémiante de l'insuline glargine est ensuite
maintenue sur
une période comprise entre 18 et 36 h (retour de la glycémie à son niveau
basal après 30 h
en moyenne).
En comparaison, l'administration de la formulation 2 conduit également à une
baisse
rapide de la glycémie dès la l' heure. Le pourcentage de la glycémie basale
est ensuite
maintenu en plateau jusqu'à 36 h en moyenne. La Cmir, obtenue avec la
formulation 1 est
en moyenne plus haute que celle de la référence Lantus , ce qui devrait
permettre de
réduire considérablement les phénomènes d'hypoglycémie sévère chez les
patients
diabétiques.
La durée d'action de la formulation 2 est nettement supérieure à celle de la
référence
longue action Lantus . Ceci est illustré par une valeur moyenne de T50%APGc
plus élevée
pour la formulation 2.
Une perte d'APGC0-36h de seulement 24 % a été observée pour la formulation 2
par
rapport à la référence Lantus .
