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NOUVELLE CLASSE DE COMPOSES DERIVES DE TERPENE A ACTIVITE
ANTIBIOTIQUE, COMPOSITIONS LES CONTENANT ET UTILISATIONS
La présente demande concerne une nouvelle classe de
composés dérivés de terpène, possédant une activité antibiotique, de
formules (I) ou (II)
0 0 0
A A
ou
~~ 5
(i) (n)
dans laquelle A est choisi parmi NR1, O, S, CR2R3 ou R-(CH2)n R' dans
lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et
Rl, R2 et R3 sont des substituants, et n est supérieur ou égal à 1, en
particulier égal à 2.
Les progrès apportés par les antibiotiques dans le domaine
médical sont aujourd'hui remis en question par l'apparition et la propagation
de germes résistants à ces antibiotiques. Ainsi, en France, un des pays où
l'on consomme le plus d'antibiotiques, on observe de nom.breuses bactéries
É
résistantes aux antibiotiques. La relation de cause à effet entre ces deux
phénomènes semble claire, même si elle n'est pas rigoureusement
démontrée. Parmi les exemples les plus importants, on retrouve les
Staphylocoques qui sont parmi les bactéries les plus résistantes (comme
par exemple le staphylocoque doré résistant à la méthicilline) ainsi que le
Streptococcus pneumoniae résistant à la pénicilline, les entérocoques
résistants à la vancomycine, les salmonelles polypharmacorésistantes et la
tuberculose à bacilles multirésistants.
De plus, des déséquilibres de la flore intestinale peuvent
survenir suite à un traitement antibiotique (antibiothérapie) destiné à
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soigner une infection. Ces déséquilibres entraînent eux-mêmes des
infections digestives (diarrhées), notamment des infections digestives liées
à Clostridium difficile (ICD, ou CDAD pour Clostridium difficile-associated
disease). Clostridium difficile est un bacille, gram-positif, anaérobie qui
est
la première cause de diarrhées infectieuses nosocomiales chez l'adulte
(environ 15 à 25% des cas de diarrhées post-antibiotiques et plus de 95%
des cas de colites pseudomembraneuses) (Hurley et al. Arch. Intern. Med
2002 ; 162 :2177-84), et est naturellement partiellement résistant à la
majorité des antibiotiques utilisés en clinique. Des traitements oraux à base
de metronidazole ou de vancomycine sont utilisés en première intention.
Les patients rechutent dans 25% des cas ce qui génère des traitements
longs et coûteux. Ainsi aux seuls Etats-Unis, les cas de diarrhées
survenant à la suite d'un traitement antibiotique sont estimés à 12,2 cas
pour 10 000 patients/jour entre 1987 et 1998 ou 7 à 8 cas pour 1000
admissions (http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/infDis/Cdiff-CCJM02-06
.pdf). La France et l'Europe sont de plus en plus sensibilisées à cette
infection par C. difficile puisque la souche la plus virulente se répand dans
ces pays. Une épidémie de C. difficile provoquée par une souche très
virulente a d'ailleurs eu lieu en France en mars 2006 (source Institut
Français de Veille Sanitaire ; Euro Surveill. 2006 11:E060914.1). Les
personnes touchées par ce type d'infection meurent dans 0,6 à 1% des
cas. Ces chiffres sont en progression et le coût estimé aux Etats-Unis est
de l'ordre de 3669 à 7234 $ par patient.
Par ailleurs, à l'heure actuelle, relativement peu de
biomatériaux sont protégés par des antimicrobiens. Les cathéters
imprégnés d'antimicrobiens sont les dispositifs médicaux pour lesquels on
dispose du plus de données. On retrouve essentiellement deux
combinaisons de molécules: la chlorhexidine et la sulfadiazine d'argent ou
la minocycline et la rifampicine. L'efficacité in vivo des premiers est
controversée et serait limitée dans te temps (<10 jours). De plus certains
cas d'anaphylaxie liés à l'usage de cathéters protégés par ces molécules
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ont été décrits (Terazawa et ai. Anesthesiology. 1998 Nov;89(5):1296-8;
Kluger Anaesth Intensive Care. 2003 Dec;31(6):697-8; Stephens et al. Br J
Anaesth. 2001 Aug;87(2):306-8). Une nouvelle génération de cathéters
imprégnés par la chlorhexidine et la sulfadiazine d'argent, non plus sur la
seule face extérieure du cathéter mais aussi sur la face interne (ou lumière)
s'est révélée réduire la colonisation (Rupp ME et al. Ann lntern Med. 2005
Oct 18;143(8):570-80). Mais l'étude n'a pu démontrer une diminution
significative des cas de septicémie. Les cathéters traités avec la
minocycline et la rifampicine semblent faire preuve d'une efficacité
supérieure, mais leur usage est limité par le risque qu'une utilisation
abusive, à titre préventif, n'entraîne l'apparition de bactéries résistantes
et
leur fasse perdre par conséquent leur place dans l'arsenal thérapeutique.
Ce dernier point est d'autant plus préoccupant que la rifampicine est l'un
des rares antibiotiques systémiques efficaces sur les infections des
prothèses.
Plus de 150 millions de cathéters veineux sont posés chaque
année aux Etats Unis dans les hôpitaux et les cliniques, dont 5 millions de
cathéters veineux centraux. Dans ce même pays 800000 stents sont
utilisés chaque année. Le marché du cathéter et des stents en 2004 est de
13,1 milliards de dollars et est en augmentation de 12,3 % par an
(http://www.marketresearch.com). Cette progression est supérieure a celle
du médicament qui est de 7% (http://www.interphanna.ch/fr/1926.asp). On
estime qu'en 2009 le marché atteindra environ 23 milliards de dollars. Il faut
aussi remarquer qu'il y existe une forte demande pour des dispositifs
médicaux tendant à réduire les risques. Les stents traités avec le
tacrolimus qui diminue les risques de resténose ont une progression
supérieure a celle des cathéters classiques. Des stents qui seraient traités
avec des molécules limitant les infections devraient donc aussi trouver des
débouchés. Le marché des greffes veineuses est de l'ordre de 500 millions
de dollars par an (hors amérique du nord) (http://www.alpha-
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research.com/coinoanv.htmi). Ces données sont résumées dans une revue
récente (Raad et al. Arch. Intern. Med 2002, 162 871-879):
- la rifampicine seule ou associée à la minocycline est
fréquemment utilisée pour traiter les dispositifs médicaux. La combinaison
de ces deux molécules est une méthode efficace, puisque la rifampicine est
l'un des rares antibiotiques actifs sur des bactéries en croissance lente,
notamment sur les Staphylocoques à coagulase négative qui sont la cause
la plus fréquente d'infection des cathéters, des stents et des greffes
veineuses. Dans de larges études multicentriques, on estime qu'ils
diminuent de 80% le risque d'infection, et que leur utilisation ferait gagner
500000$ à un hôpital qui utilise 850 cathéters veineux centraux.
Cependant, l'utilisation de ces cathéters est ralentie par la crainte de
sélectionner des résistants à la rifampicine dans le cadre d'un traitement
préventif ;
- les sels d'argents qui ont un large spectre antimicrobien sont
également utilisés pour le traitement de dispositifs médicaux. Ce traitement
est décrit selon les études, comme inefficace ou relativement efficace dans
la prévention de la colonisation de cathéters posés pour moins de 10 jours.
Ils sont inopérants sur des cathéters posés pour plus longtemps. Il
semblerait que le collagène chélate les sels d'argent et inhibe leur activité.
De plus ils peuvent être responsables de réactions d'hypersensibilités.
- l'association chlorexidine-sulfadiazine d'argent: le traitement
de cathéters par cette association ne semble pas très efficace, et leur
intérêt est très discuté sur le long terme.
La présente demande concerne une nouvelle classe de
composés possédant une activité antibiotique, plus particulièrement une
activité antibactérienne à large spectre gram-positif, sur des bactéries
telles
que Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus
faecalis, Bacillus anthracis et Clostridium difficile. Les composés de cette
classe présentent de plus un faible poids moléculaire, ne sont pas toxiques
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in vitro et in vivo et ne présentent pas de réaction croisée avec les
résistances connues. Parmi cette classe de composés antibiotiques, on
citera préférentiellement la margaucine, qui peut être isolée à partir d'un
surnageant de culture d'une souche bactérienne.
5
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1: Formule développée de la margaucine ;
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un composé de formule (I) ou
(II) :
0 1 0 0 1 0
A
ou
3
(I) (II)
dans laquelle A est choisi parmi NRj, O, S, CR2R3 ou R-(CH2)r,-R' dans
lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et
Rl, R2 et R3 sont des substituants, et n est supérieur ou égal à 1, en
particulier égal à 2.
Les formules (I) et (II), telles que décrites dans l'ensemble de
cette demande, englobent les formules présentant d'éventuels substituants
- sur les atomes constituant A (tels que Ri, R2 et R3) ; et/ou
- sur les carbones en positions 1 et/ou 3 et/ou 5 (position
terminale), tels que Xi, X'l, X2, X3 et X'3
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~I )c1
A
X2
XS 3
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, A est
choisi parmi NH, O, S, CH2 ou R-(CH2)n-R' dans lequel R et R' sont,
indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2 et n=2.
Dans un mode de réalisation particulier, dans les formules ci-
dessus, le carbone en position 1 est un CH2, le carbone en position 3 est
un CH, le carbone en position terminale est un CH3.
Ainsi, la présente invention concerne un composé de formule
(I) ou (II) :
0
C-
A A
~ ou
(I) (II)
dans laquelle A est choisi parmi NH, O, S, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel
R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention ne vise
pas, en tant que tel, le mélange synthétisé chimiquement selon le procédé
décrit par Schank et al. (Chemistry of free cyclic vicinal tricarbonyl
compounds ('1,2,3-triones'). Part 2. Redox reactions of 1,2,3-triones with
ene-1,2-diols ('reductones'), 2-alkoxy-en-1-ols, ene-1,2-diamines, and
related species. Helvetica Chimica Acta (2002), 85(5), 1295-1326), c'est-à-
dire que l'invention n'a pas pour objet le mélange des composés de
formules (III) et (IV) selon :
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- - -- ~ ~ 7
O' O
et
(III) (IV)
dans laquelle le carbone en position 1 est un CH2, le carbone en position 3
est un CH, le carbone en position terminale est un CH3, synthétisé dans les
conditions de Schank et al.. En revanche, l'invention vise les composés
produits par une bactérie et leurs mélanges, selon le procédé décrit ci-
après à titre d'exemple, et concerne l'utilisation de ces composés et
mélanges quel que soit leur mode de production (notamment par synthèse
ou par une bactérie), en particulier la margaucine, dans des compositions
ou les applications de ces composés ou mélanges décrits dans la présente
demande.
La présente invention concerne tout particulièrement un
composé de formule (I) ou (II) :
Ch ~ C~' O
~ Ç1IÇIIJ'
=~ ~ ou
(I) (II)
dans laquelle A est choisi parmi NR,, O, S, CR2R3 ou R-(CH2)n-R' dans
lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, N, O, S ou C, et Ri, R2
et R3 sont des substituants et n est supérieur ou égal à 1, en particulier
égal à 2. De préférence A est choisi parmi NH, O, S, CH2 ou R-(CH2)2-R'
dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2.
Les modes particuliers quant à la présence ou l'absence
d'éventuels substituants sur les atomes constituant A et à la présence ou
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l'absence d'éventuels substituants sur les carbones en positions 1 et/ou 3
et/ou 5 peuvent être combinés de façon indépendante.
Par composé de l'invention, on entend aussi bien le composé
dans sa formule (I) ou dans sa formule (II), c'est-à-dire pris
individuellement
quel que soit son mode de préparation. Dans un mode de réalisation
particulier, la présente invention concerne le composé de formule (I), tel
que décrit dans le cadre de la présente demande et en particulier le
composé de formule (I) produit par une bactérie, et ses utilisations.
L'invention concerne également les mélanges de ces deux
composés isomères, quelle que soit la proportion des composés (I) et (II), à
l'exception du mélange obtenu par synthèse chimique selon le procédé de
Schank et al. Les mélanges peuvent comprendre les formes (I) et (II) même
si l'activité antibiotique de chacune de ces deux formes n'est pas
équivalente. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le mélange
comprend les formes (I) et (II), dans lequel éventuellement une seule forme
à une activité antibiotique. Dans un mode de réalisation particulier d'un
mélange selon l'invention, la forme (I) a une activité antibiotique.
La présente invention vise également un procédé de
préparation d'un composé de formule (I) ou (II), et plus particulièrement un
procédé de préparation de la margaucine, comprenant (a) la mise en
culture d'une souche bactérienne, et (b) la récupération, en particulier la
purification, du composé de formule (I) ou (II) à partir du surnageant de
culture.
Dans un mode de réalisation particulier, la souche
bactérienne utilisée dans le cadre d'un procédé selon l'invention est la
souche JPL84 ou JPL86, et le composé produit est le composé de formule
(I).
Par mise en culture , on entend le fait de maintenir la
souche bactérienne, particulièrement la souche JPL84, ou toute souche
dérivée telle que définie dans la présente demande, dans des conditions de
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culture permettant sa survie et sa multiplication. Dans un mode de
réalisation particulier, la mise en culture s'accompagne également de la
production de l'antibiotique de formule (I) ou (II) ou de leur mélange ou
favorise cette production. Le terme mise en culture sera utilisé
indifféremment et selon la même définition que le terme fermentation .
Ainsi, tout milieu nutritif liquide peut convenir à la culture de la
souche bactérienne, de la souche JPL84, ou de souches dérivées, dans la
mesure où ce milieu contient une source de carbone, d'azote et de sels
inorganiques. Dans un mode de réalisation, on préférera le milieu CYE
(Casitone Yeast Extract), un milieu agar à base d'extrait de levure, dont la
composition est par exemple la suivante : peptone à 10g/I, extrait de levure
à 1 g/1 et CaC12 à 1 g/I.
D'autres conditions de culture connues de l'homme du métier
peuvent également être modifiées, telles que la température, l'agitation ou
non de la culture, et l'aération ou non de la culture. Dans un mode
réalisation particulier, la souche bactérienne, particulièrement la souche
JPL84, ou des souches dérivées, est cultivée à une température comprise
entre 0 et 45 C, préférentiellement entre 20 et 37 C, et encore plus
préférentiellement à 28 C, sous agitation et aération (culture aérobie).
La durée recherchée de la culture, dans les conditions ci-
dessus, dépend du moment auquel la production de l'antibiotique
recherché est optimale ou est maximale, et cette durée est calculée par
rapport à la mise en culture de la souche. Ainsi, la durée de culture
(période entre la mise en culture et l'arrêt de cette culture) est d'environ
15
à 24 heures, préférentiellement entre 18 et 20 heures.
Par purification , on entend toute technique permettant
d'isoler l'antibiotique recherché des autres constituants du surnageant de
culture. Par exemple, et de façon non limitative, on peut citer l'extraction
par solvants, la précipitation, la chromatographie en phase inverse (HPLC),
la chromatographie échangeuse d'ions ..., ou la combinaison de deux ou
plusieurs de ces techniques.
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Le procédé de l'invention peut également comprendre une
étape, optionnelle, entre l'étape (a) de mise en culture et l'étape (b) de
purification, consistant en la séparation du surnageant de culture des
cellules et autres débris cellulaires, par exemple par centrifugation.
5 De façon optionnelle, l'antibiotique purifié peut par la suite
être converti en sels (formes salifiées), incluant des sels non toxiques
pharmaceutiquement acceptables, par une réaction standard avec des
acides organiques ou inorganiques. Ces sels seront obtenus,
particulièrement lorsque A égal N.
10 De plus, l'antibiotique purifié, ou des sels de celui-ci, peuvent
peut être obtenu sous forme anhydre, par lyophilisation.
La présente invention vise aussi un composé de formule (I)
ou (II) ou leur mélange, tel que décrit ci-dessus obtenu par un procédé
mettant en oruvre une culture de bactéries, tel que décrit dans cette
demande.
Un mélange d'isomères de formules (I) et (II) tel que décrit ci-
dessus peut également être obtenu par synthèse chimique, comme par
exemple celle divulguée dans la publication de Schank et al. (Chemistry of
free cyclic vicinal tricarbonyl compounds ('1,2,3-triones'). Part 2. Redox
reactions of 1,2,3-triones with ene-1,2-diols ('reductones'), 2-alkoxy-en-1-
ols, ene-1,2-diamines, and related species. Helvetica Chimica Acta (2002),
85(5), 1295-1326). Cette synthèse aboutit à la production d'un mélange à
partir duquel on peut isoler, si approprié, l'un des composés de formule (I)
ou (II).
Lorsque le composé de l'invention est obtenu par un procédé
de culture de bactéries tel que décrit ci-dessus, il conserve une trace de sa
production bactérienne et peut être distingué du même composé produit
par synthèse chimique, du fait de la différence observée dans leurs
rapports C12/C13 respectifs. Ainsi, le composé de formule (I) ou le composé
de formule (II) produits chimiquement possède un rapport C12/C13 différent
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du composé de formule (I) ou composé de formule (II), obtenu par un
procédé bactérien, et particulièrement différent du composé de formule (I)
ou composé de formule (II) obtenu à partir des bactéries citées dans la
présente demande. Dans un mode de réalisation particulier, la margaucine
produite chimiquement possède un rapport C12/C13 différent de la
margaucine obtenue par un procédé bactérien, et particulièrement différent
de la margaucine obtenue à partir des bactéries citées dans la présente
demande.
Entre aussi dans le cadre de la présente invention une
composition comprenant au moins un composé de formule (I) ou (II) tel que
décrit ci-dessus, à l'exception du mélange de composés de formules (I) et
(II), lorsque celui-ci est obtenu par synthèse chimique selon la méthode
publiée par Schank et al.
Dans un mode de réalisation particulier, une composition
selon l'invention comprend au moins un composé de formule (I) ou (II)
obtenu par un procédé de production dans une bactérie décrit ci-dessus,
particulièrement une composition comprenant au moins le composé de
formule (I) obtenu à partir de la souche JPL84.
De plus, l'invention concerne une composition qui comprend
au moins un transporteur et/ou un véhicule, et un composé de formule (I)
ou (II) :
01 O
~ 0 '~'ÇA
rA
ou
(I) (II)
dans laquelle A est choisi parmi NRI, O, S, CR2R3 ou R-(CH2)õ-R' dans
lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et
Rl, R2 et R3 sont des substituants, et n est supérieur à 1, de préférence
égal à 2. Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend
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au moins un véhicule et au moins le composé de formule (I), en particulier
la margaucine (composé de formule III). Dans cette composition, le
composé est obtenu par synthèse chimique ou par procédé comprenant
une culture de bactéries.
Par véhicule , on entend toute substance qui permet la
formulation de l'antibiotique au sein d'une composition. Dans un mode de
réalisation préféré, le véhicule est une substance ou une combinaison de
substances physiologiquement acceptable(s), c'est-à-dire approprié pour
l'utilisation de la composition en contact avec un être vivant (par exemple
un mammifère non-humain, et préférentiellement un être humain), et est
donc préférentiellement non toxique. De tels véhicules physiologiquement
acceptables sont par exemple de l'eau, une solution saline, des solvants
miscibles dans l'eau, des sucres, des lieurs, des excipients, des pigments,
des huiles végétales ou minérales, des polymères solubles dans l'eau, des
agents tensio-actifs, des agents épaississants ou gélifiants, des agents
cosmétiques, des agents conservateurs, des agents alcalinisants ou
acidifiants .... Des compositions particulières de l'invention sont des
compositions pharmaceutiques, c'est-à-dire qu'elles sont formulées pour
être administrées ou appliquées à un être vivant, à des fins thérapeutiques
ou prophylactiques. Ces compositions pharmaceutiques contiennent des
véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une administration par
voie systémique ou locale, particulièrement par injection, pour une
application en contact avec un être vivant, par ingestion, ou utilisation sous
une forme solide, gélatineuse, liquide ou en aérosol. Alternativement, les
compositions de l'invention sont appliquées sur des matériaux qui seront en
contact avec un être vivant tel que défini ci-dessus. Dans un mode de
réalisation particulier, la composition comprend un véhicule
pharmaceutiquement acceptable et la margaucine.
L'invention concerne également une composition qui
comprend au moins un composé de formule (I) ou (II) tel que défini dans la
présente demande, le cas échéant associé à un transporteur et/ou un
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véhicule tel que défini dans la présente demande, et qui comprend en plus
au moins une deuxième molécule, différente, active contre des
microorganismes. Par molécule active , on entend, un composé
chimique ou biologique, notamment un composé de faible poids
moléculaire, par exemple un peptide, qui a la capacité de détruire, de
neutraliser l'activité ou d'empêcher la prolifération des microorganismes.
Cette molécule active peut être, à titre d'exemple, un antibiotique ou un
bactéricide. La molécule active est préférentiellement choisie parmi un
composé actif contre les bactéries gram-négatives et/ou un composé
fongicide et/ou les composés listés dans le tableau 3 ci-après ou les
composés suivants : les sels d'argents, la minocycline, la chlorexidine, la
sulfadiazine, la rifampicine ....
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque le composé
de l'invention, seul ou en mélange ou lorsqu'une composition selon
l'invention est utilisé pour traiter les infections digestives liées à C.
difficile
(ICD), il n'est pas nécessaire de prévoir de l'administrer en combinaison
avec un autre antibiotique, tel que par exemple ceux cités dans le tableau
6. En effet, dans le traitement des ICD, le composé de l'invention a une
activité bactéricide contre C. difficile sans pour autant perturber la flore
intestinale ; la co-administration d'autres antibiotiques pourrait annuler
l'effet surprenant du composé de l'invention vis-à-vis de la préservation de
la flore intestinale.
Dans un autre mode de réalisation, une composition de
l'invention comprend au moins deux composés de formule (I) ou (II) tels
que définis ci-dessus, mais qui diffèrent l'un de l'autre par leur structure,
à
savoir leur composition en atomes ou par la position de leurs différents
substituants. Par exemple, la composition comprend au moins deux
composés de formule (I) qui diffèrent par la nature de l'élément A, par les
substituants situés sur l'élément A, et/ou par les substituants aux positions
1, 3 et/ou 5. Une autre composition selon l'invention comprend au moins
deux composés de formule (II) qui diffèrent par la nature de l'élément A, par
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les substituants situés sur l'élément A, et/ou par les substituants aux
positions 1, 3 et/ou 5.
L'invention vise également une composition qui comprend au
moins un composé de formule (I) et un composé de formule (II), dans
laquelle A est identique dans les deux composés et est choisi parmi NH, S,
CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de
l'autre, NH, O, S ou CH2, c'est-à-dire comprend deux isomères du même
composé quant à la position des doubles liaisons.
Dans un mode de réalisation particulier, les compositions
selon l'invention comprennent en plus un véhicule ou un transporteur.
La présente invention porte également sur l'utilisation d'un
composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou d'une
composition telle que définie ci-dessus, comme médicament, et tout
particulièrement comme antibiotique (qui détruit ou empêche la prolifération
de micro-organismes) et/ou bactéricide (qui détruit ou empêche la
prolifération des bactéries).
Dans un mode de réalisation particulier, le composé de
formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou la composition de
l'invention possède une activité bactéricide contre des bactéries gram
positives (coloration de gram) ou des bactéries possédant une paroi fine
composée de plusieurs couches dont une lipidique, c'est-à-dire que le
composé détruit les bactéries ou ralentit leur croissance.
Dans un mode de réalisation particulier, le composé de
formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou la composition de
l'invention est utilisé pour traiter les infections causées par des bactéries
du
genre Clostridium. Plus particulièrement, le composé de formule (I) ou (II)
pris individuellement ou en mélange ou la composition de l'invention est
utilisé pour traiter les infections causées par Clostridium difficile, et de
préférence les infections digestives liées à Clostridium difficile (ICD)
telles
que les diarrhées simples, post-antibiotiques, ou les colites
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pseudomembraneuses (CPM). De préférence, l'utilisation comme
médicament concerne le composé de formule (I) ou celui de formule (III).
Ainsi, l'invention concerne un composé, un mélange ou une
composition selon l'invention, tout particulièrement la margaucine ou une
5 composition la comprenant, pour l'utilisation comme médicament,
préférentiellement comme antibiotique ou bactéricide.
Dans ses utilisations thérapeutiques ou méthodes
thérapeutiques [qui comprennent l'administration à un être vivant d'au
moins un composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en
10 mélange ou d'une composition selon l'invention], le(s) composé(s), le
mélange ou la composition le (ou les) comprenant, peut être sous forme
solide (cachet, poudre, gélule, pilule, suppositoire, comprimé à libération
accélérée, comprimé gastrorésistants, comprimé à libération prolongée),
gélatineuse (gel, pommade, crème, ovule), liquide (sirop, solution
15 injectable, collyre) ou en aérosol (spray, vapeur, gaz). Ainsi, suivant sa
forme galénique, le composé, le mélange ou la composition de l'invention
peut être administré par voie orale, transmuqueuse-buccale, nasale,
ophtalmique, otologique (dans l'oreille), vaginale, rectale, parentérale
(intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée), transcutanée (ou
transdermique ou percutanée) ou cutané. Une administration ou une forme
galénique permettant de favoriser l'activité bactéricide du composé de
formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou d'une composition
selon l'invention, au niveau de l'intestin, constitue un mode de réalisation
particulier de l'invention.
Les doses administrées sont celles conventionnellement
utilisées pour les autres antibiotiques ou combinaisons d'antibiotiques. A
titre indicatif, des doses variant de 30 mg/kg/jour à 100 mg/kg/jour, suivant
l'age ou le poids du patient, la sévérité ou le stade de l'infection, le
nombre
d'administrations quotidiennes ou le mode d'administration, peuvent être
administrées ; chez l'adulte principalement, des doses entre 1 g/jour et 10
g/jour sont habituelles.
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La présente invention concerne également l'utilisation d'un
composé de formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange, pour la
fabrication d'une composition utile dans la lutte contre les infections
bactériennes, dans le traitement ou la prophylaxie des infections
bactériennes, plus particulièrement de maladies résistantes aux
antibiotiques administrés jusqu'à ce jour.
Par maladies résistantes , on entend toute infection dont
l'origine est entièrement ou partiellement bactérienne. Plus
particulièrement, l'expression maladies résistantes telle qu'employée
dans le cadre de la présente demande englobe les infections dont au moins
un agent responsable est sensible à un composé antibiotique de l'invention,
qu'il soit utilisé seul ou en combinaison avec un autre composé de
l'invention ou une autre molécule active. On peut citer par exemples les
maladies multirésistantes (résistantes à plusieurs classes d'antibiotiques)
ou toutes les infections causées par des bactéries gram positives.
Le terme traitement englobe aussi bien l'effet curatif
(destruction du microorganisme), obtenu avec au moins un composé de
l'invention ou une composition de l'invention, que l'amélioration des
symptômes observés chez le patient (et liés à la présence du ou des
microorganisme(s)) ou l'amélioration de l'état du patient. Ainsi, le terme
traitement s'applique au point d'infection principal ou secondaire(s), tout
comme aux symptômes découlant de l'infection.
Les composés, mélanges et compositions de l'invention sont
particulièrement utilisés dans le traitement des infections nosocomiales.
Par le terme prophylaxie , on entend toute utilisation d'au
moins un composé, un mélange ou une composition de l'invention, à titre
préventif, c'est-à-dire dans le but d'éviter l'apparition des symptômes après
la contamination ou une suspicion de contamination, ou de prévenir
l'infection par un microorganisme ou ses conséquences, particulièrement
dans le cas d'une infection due à une bactérie, plus particulièrement une
bactérie à gram-positif, et encore plus particulièrement une infection due à
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une bactérie du genre Clostridium telle que les infections digestives liées à
Clostridium difficile.
Les composés, mélanges ou compositions selon l'invention
sont utilisés en thérapie et en prophylaxie selon les formes galéniques et
modes d'administration indiqués ci-dessus. Dans un mode de réalisation
particulier, le composé utilisé est la margaucine, ou toute composition, telle
que définie dans la présente demande, comprenant au moins la
margaucine.
L'invention porte également sur l'utilisation des composés,
mélanges ou compositions de l'invention dans des applications
cosmétiques, alimentaires ou vétérinaires (animaux domestiques, volaille,
porcs, ovins, bovins ou animaux de compagnie).
Le composé de formule (I) ou (II) de l'invention pris
individuellement ou en mélange ou une composition selon l'invention est
particulièrement efficace contre les bactéries du genre Clostridium,
notamment les formes toxinogènes, telle que, à titre d'exemple, Clostridium
difficile, Clostridium pen`ringens, Clostiridum botulinum, Clostridium tetani,
Clostridium novyi, Clostridium histolyticum, Clostridium butyricum,
Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium ramosum,
Clostridium bifermentans, Clostridium paraperfringens, Clostridium
cadaveris, Clostridium clostridiiforme, Clostridium innocuum, Clostridium
limosum, Clostridium paraputrificum, Clostridium sporogenes, Clostridium
subterminale, Clostridium tertium, Clostridium baratii, Clostridium
argentinense, Clostridium chauvoei, Clostridium haemolyticum ou
Clostridium spp. En relation avec les bactéries Clostridium difficile,
l'invention vise le traitement des infections causées par des formes
toxinogènes de C. difficile, telle que la souche épidémique de PCR-ribotype
027. Du fait de son action particulièrement efficace sur les bactéries du
genre Clostridium telle que Clostridium difficile (CMI de l'ordre de 0,05
pg/ml) d'une part, et de sa plus grande activité vis-à-vis des bactéries du
genre Clostridium par rapport aux autres bactéries de la flore intestinale (30
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fois plus active) d'autre part, le composé de formule (I) ou (II) de
l'invention
pris individuellement ou en mélange ou une composition selon l'invention,
et en particulier la margaucine (III), est particulièrement intéressant pour
une utilisation à des fins de restauration de l'équilibre entre différentes
populations bactériennes intestinales (flore microbienne). Ainsi, la présente
invention vise également l'utilisation du composé de formule (I) ou (II) de
l'invention pris individuellement ou en mélange ou une composition selon
l'invention, et en particulier la margaucine (III), pour traiter des
infections
dues à des bactéries du genre Clostridium, plus particulièrement les
infections dues à C. difficile, telles que les ICD. Dans un mode de
réalisation particulier, le composé de formule (I) ou (II) de l'invention pris
individuellement ou en mélange ou une composition selon l'invention est
utilisé pour traiter les ICD consécutives à une antibiothérapie. Dans un
mode de réalisation préféré, ce composé est la margaucine ou la
composition comprend la margaucine (composé de formule III).
Sont particulièrement visés par les méthodes thérapeutiques
et prophylactiques décrites dans la présente invention, les patients
présentant une infection causée par C. difficile, et notamment (a) les
patients atteints d'une ICD, (b) les patients atteints d'une ICD sévère, (c)
les patients atteints d'une récidive d'ICD, la récidive étant caractérisée par
un nouvel épisode d'ICD survenant dans les 8 semaines suivant le début
du précédent épisode, que la souche de C. difficile soit la même ou
différente de celle de l'épisode précédent. Les méthodes thérapeutiques et
prophylactiques s'appliquent aussi bien aux ICD nosocomiales (patient
hospitalisé ou patient non-hospitalisé sorti d'un établissement de santé
depuis moins de 4 semaines) qu'aux ICD communautaires. Ces méthodes
visent donc particulièrement les patients des établissements de santé, des
maisons de retraite ou des établissements médico-sociaux, et tous les
patients présentant des facteurs de risque vis-à-vis des ICD, à savoir les
patients sous antibiothérapie (plus de 90% des cas), les personnes âgées
de plus de 65 ans, les personnes atteintes de maladie sous-jacente sévère,
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les patients ayant subi une intubation nasogastrique, les patients ayant
reçu des médicaments anti-ulcéreux et les patients en séjour hospitalier
prolongé.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé de
formule (I) ou (II) pris individuellement ou en mélange ou d'une composition
telle que définie ci-dessus, pour l'imprégnation de dispositifs, parmi
lesquels des dispositifs médicaux (ou biomatériel). Par imprégnation , on
entend l'application d'au moins un composé, d'un mélange ou d'une
composition de l'invention, et éventuellement sa pénétration (profonde ou
superficielle) sur le dispositif. Ainsi, l'invention vise aussi des
dispositifs
imprégnés du composé (seul, en mélange ou en composition) de
l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, les dispositifs sont des
dispositifs biomédicaux, c'est-à-dire des dispositifs à usage médical, tels
que par exemple, et sans être limitatif, des cathéters, des pansements, des
ciments osseux, des shunts cérébraux, des valves cardiaques .... Parmi les
dispositifs à usage biomédical, on préférera les dispositifs réalisés en
matériau polymère, tel que polyéthylène, polypropylène, polychlorure de
vinyle, polycarbonate, polyuréthane, acrylate et méthacrylate ou polyamide
ou les matériaux obtenus par tissage. Dans un mode de réalisation
particulier, ces dispositifs sont biocompatibles.
Dans un autre mode de réalisation, le dispositif imprégné est
un tissu à usage domestique ou industriel, tel que les lingettes.
L'invention porte également sur des souches bactériennes qui
ont la capacité de produire au moins un composé de formule (I) ou (II)
selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, les souches
produisent des composés selon l'invention dans les conditions de
fermentation exposées au point A ci-dessous (matériel et méthodes). Ces
souches peuvent produire un composé de formule (I) ou (II), pris
individuellement ou en mélange et en particulier la margaucine. A titre
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d'exemple, une telle souche est la souche JPL84 déposée, aux fins du
Traité de Budapest auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures
de Microorganismes ; Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; 75724
Paris Cedex 15 ; France), le 15 septembre 2006, sous le numéro CNCM I-
5 3669. Dans un mode de réalisation, en combinaison ou non avec les
précédents, les souches bactériennes sont des souches Bacillus.
L'invention porte également sur des souches dérivées des
souches décrites ci-dessus et en particulier sur toute souche dérivée de la
souche JPL84 ou JPL86, caractérisées en ce qu'elles conservent la
10 capacité de produire un composé de formule (I) ou (II) ou un mélange, et
plus particulièrement en ce qu'elles conservent la capacité de produire la
margaucine. Par dérivé , on entend toute souche qui n'est pas retrouvée
à l'état naturel, et obtenue à partir des souches naturelles par modification
de son patrimoine génétique, en particulier une souche obtenue par
15 recombinaison (souche recombinante), à condition qu'elle continue à
produire un composé de formule (I) ou (II) selon l'invention. Dans un mode
de réalisation particulier, la souche recombinante produit une plus grande
quantité de composés selon l'invention que la souche naturelle. La
modification du patrimoine génétique peut consister, entre autres, en la
20 modification des enzymes et autres protéines impliquées dans la
production et la sécrétion du composé de l'invention.
L'invention concerne également un procédé de modulation du
profil bactérien d'un échantillon biologique ou d'une surface, comprenant la
mise en contact de cet échantillon biologique ou de cette surface avec au
moins un composé selon la formule (I) ou (II) pris individuellement ou en
mélange ou une composition selon l'invention, dans des conditions
permettant de modifier le profil bactérien ; le procédé peut également
comprendre une seconde étape de constatation de la modulation.
Dans le cadre de l'invention, l'expression moduler le profil
bactérien signifie modifier le rapport existant entre les différentes
souches
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bactériennes présentes dans l'échantillon biologique ou sur la surface,
avant et après la mise en contact avec le composé ou la composition de
l'invention.
Le procédé de l'invention est approprié pour traiter les
surfaces de différents objets, comme par exemple les surfaces d'objets des
services médicaux (par exemple, en milieu hospitalier).
Ainsi, lorsque l'échantillon biologique ou la surface ne contient
que des bactéries sensibles au composé de l'invention, ou que les souches
contenues dans l'échantillon biologique ou sur la surface sont sensibles à
une composition de l'invention, l'expression moduler le profil bactérien
englobe la neutralisation de l'activité bactérienne, et en particulier la
destruction de l'ensemble des bactéries, c'est-à-dire l'élimination de tout
profil bactérien.
En revanche, lorsque l'échantillon ou la surface comprennent
d'une part des souches résistantes ou moins sensibles au composé ou
composition selon l'invention et d'autre part des souches sensibles à ce
même composé, l'expression moduler le profil bactérien signifie
entraîner une modification du rapport entre les souches résistantes au
composé de l'invention et les souches les plus sensibles. A titre d'exemple,
l'addition d'un composé selon l'invention entraîne une diminution des
souches gram positives, ce qui modifie le rapport souches gram positives /
souches gram négatives.
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EXEMPLES
A. MATERIEL ET METHODES
Souche JPL84
La margaucine qui est le composé de formule (III),
0 'V'
(III)
dans laquelle le carbone en position 1 est un CH2, le carbone en position 3
est un CH et le carbone en position terminale est un CH3, est produite par
la souche JPL84, une- souche isolée en 2005 d'un sol de la région d'Agout,
France. Cette souche a été déposée le 15 septembre 2006, auprès de la
C.N.C.M. (Collection Nationale de Culture de Microorganismes ; Institut
Pasteur ; Paris ; France), sous le numéro CNCM 1-3669. Un séquençage
du gène codant pour l'ARN 16S a été réalisé ; la souche JPL84 pourrait
être une souche Bacillus sp. La souche est maintenue à 4 C sur un milieu
CYE en gélose inclinée (CYE agar), contenant 10g de casitone, 1 g d'extrait
de levure, 1 g de CaCI2 et 14g de gélose, dans 1 litre d'eau.
Fermentation ou mise en culture
La fermentation de cette souche est réalisée dans un milieu
CYE contenant 10g/1 de peptone, 1 g/1 d'extrait de levure et 1 g/1 de CaCI2.
Afin de produire la margaucine, la fermentation a été réalisée dans 10L de
milieu CYE tel que défini ci-dessus, à 28 C sous agitation et aération. Le
début de la production de la margaucine intervient au bout de 14h de
fermentation pour atteindre son pic entre 18 et 20h. La production
d'antibiotique a été contrôlée et quantifiée par un test de diffusion sur
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gélose contre Staphylococcus aureus (CIP 76.25) et par chromatographie
en phase liquide sous haute pression (HPLC) analytique.
Purification
La molécule a été purifiée par chromatographie en phase
inverse : de l'acétonitrile (10% V/V) ainsi que des billes fixatrices
(Amberlite
XAD-16) sont ajoutés à la culture. L'ensemble est placé à 4 C, sous
agitation pendant 12h. Les billes XAD-16 sont séparées de la culture,
lavées avec de l'eau et un mélange eau/méthanol (50/50) puis éluées avec
du méthanol (100%). Cet éluat est concentré par évaporation sous vide. La
margaucine est finalement purifiée par HPLC phase inverse sur colonne
préparative C18 en utilisant un gradient linéaire d'H20/0.1% TFA et
d'acétonitrille/0.1 % TFA allant de 20% à 80% d'acétonitrile/0.1 % TFA en 30
mn avec un flux de 10 ml/mn. Après lyophilisation, 30 mg de margaucine
ont été obtenus à partir de 10L de culture.
Détemination de la structure
La formule moléculaire a été déterminée par une combinaison
de techniques spectroscopiques: RMN à une et deux dimension(s) et
spectrométrie de masse.
Les analyses 13C, DEPT, 'H, COSY, HMQC et HMBC qui ont
été réalisées en milieu CD3OD avec un Bruker Avance DPX-300 équipé
d'une sonde directe QNP 5mm fonctionnant à 300 MHz pour 'H et à 75
MHz pour 13C sont présentées dans le Tableau 1.
Propriétés biologigues
a. Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI), et test sur
des bactéries multirésistantes
Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) ont été
évaluées sur des souches de référence, par microdilution dans le milieu
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Mueller Hinton Broth (MHB) selon les normes CLSI/NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards. (2003). Methods for Dilution
Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically-Sixth
Edition: Approved Standard M07-A6. NCCLS, Villanova, PA, USA).
La CMI a été déterminée comme étant la plus petite
concentration de margaucine qui inhibe toute culture visible d'une souche
bactérienne, après 18 heures de culture à 37 C.
L'activité antimicrobienne de la margaucine est présentée
dans les Tableaux 2 et 3.
b. Evaluation de la toxicité in vitro de la margaucine
La toxicité de_ la margaucine in vitro a été déterminée sur une
lignée cellulaire du cancer du sein (MCF7) ; brièvement, une boite de
culture 96 puits est ensemencée avec des cellules MCF7 (ATCC HTB-
22TM, environ 10000 cellules/puit), dans un milieu RPMI contenant 10% de
sérum de veau foetal (t=0). A t+1 (en jours, par rapport à
l'ensemencement), la molécule à tester est ajoutée. A t+2, la cytotoxicité
est mesurée par incorporation de MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyl tetrazolium bromide), selon Heeg K et al. (J Immunol Methods.
1985 Mar 18;77(2):237-46.). Les résultats de la cytotoxicité sont présentés
dans le tableau 4.
c. Evaluation de la toxicité in vivo de la margaucine
Trois (3) souris femelles OF1 de 25g (Charles River) ont reçu,
par Injection intra péritonéale 200pl d'une solution de margaucine à 12,5
mg/mi dans 10% de méthanol et 90% d'H20 (soit une dose de 100mg/kg).
Le contrôle de la survie des souris à été réalisé à T24, T48, T72 et T96
(temps en heures)
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d. Détermination de l'efficacité de la margaucine in vivo sur une infection
bactérienne
La molécule a été testée sur un modèle de septicémie à
Staphylococcus aureus, après infection de souris OF1 par injection
5 intraperitonéale de bactéries.
Sur un total de 11 souris femelles OF1, 25g (Charles River), à
TO, 3 souris ont reçu une injection intra péritonéale de 200p1 de LB + 5% de
mucine (contrôle des conditions d'élevage), et 8 souris ont reçu une
injection intrapéritonéale de 200pl d'une suspension bactérienne de
10 Staphylococcus aureus Smith (108 CFU/ml) dans du milieu LB + 5%
mucine (souris infectées).
Les 8 souris infectées ont été divisées en deux lots : à
t+3heures, 5 souris ont reçu une solution de margaucine à 12,5 mg/ml dans
10% de méthanol et 90% d'H20 (soit une dose de 100mg/kg), tandis que
15 les 3 autres souris n'ont pas reçu de margaucine (contrôle de l'infection).
La survie des souris a été contrôlée à 24 et 48 heures.
B. RESULTATS
20 Structure
Les analyses structurales ont permis de démontrer que la
formule brute de la margaucine est C12H1803.
L'analyse ESI-MS a permis de déterminer que la masse
moléculaire de la margaucine est de 210 Da.
25 La RMN du 13C montre 5 signaux (40.4, 71.6, 95.6, 105.0 et
170.2) et la RMN du'H montre deux groupements de signaux (Tableau 1) :
- un premier groupe avec 3 signaux 'H(à 2.66, 3.63 et 5.81 ppm)
correspondant à des protons liés à des carbones avec une
résonance visible sur le spectre 13C, tous ces signaux sont des
singulets, et
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- un second groupe avec 2 signaux 'H avec un shift chimique
presque identique au premier groupe, liés à des carbones avec une
résonance non visible sur le spectre du 13C. Ils correspondent à une
forme alcool de la margaucine.
Un groupement méthylène non protégé a 3.63 ppm peut être
attribué à la présence en position a d'un atome d'oxygène et d'un
groupement carbonyle.
Le spectre COSY ne montre aucune corrélation alors que les
protons sont en position a d'un carbone quaternaire ou d'un hétéroatome.
La présence de deux carbones quaternaires (170.2 et 105
ppm), un methine (95.6 ppm), un méthylène (71.6 ppm) et deux
groupements méthyl équivalents (40.4 ppm) a été déduite du spectre DEPT
(Tableau 1).
L'attribution des protons liés à ces carbones par une liaison
13C-IH est obtenue grâce au spectre HMQC. La structure de la margaucine
est confirmée par le spectre HMBC et ses interactions scalaires longues
distances avec des pics liés C1/H3, C2/H3 et C2/H5 (Tableau 1).
Carbone n 513C/ppm DEPT/HMQC S 1H/ppm I* HMBC
1 170,2 C - - C1/H3
2 105,0 C - - C2/H3;
3 95,6 CH 5,81 S -
5,79
4 71,6 CH2 3,63 S C4/H4
3,62
5 40,4 CH3 2,66 S C5/H5
6 33 CH3 2,63 S
Tableau 1: Données 'H et 13C NMR, DEPT, HMQC et HMBC de la
margaucine dans CD3OD
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La combinaison des données de RMN et des informations de
masse suggère une molécule symétrique. Les expériences de MS/MS
réalisées sur l'ion moléculaire à m/z 211 permettent l'obtention d'un
ensemble de fragments en parfaite adéquation avec la structure proposée
figurel. (ions obtenus : 193, 175, 169, 165, 153, 151, 147, 141, 133, 129,
123, 119, 111, 109, 105, 95, 93, 91, 85, 83, 81, 79, 71, 69, 67, 65, 57, 55,
43). Le spectre d'absorption UV montre deux maximum - Amax: 269 et 330.
La structure de la margaucine est divulguée à la Figure 1, et
est dénommée 1,1'-Oxybis [4-méthylpent-3-en-2-on].
Concentrations minimales inhibitrices (CMI)
Les CMI de la margaucine vis à vis de différentes bactéries
gram-positives ou gram négatives, ainsi que de levures ont été
déterminées et reprises dans le Tableau 2.
Ainsi, la margaucine est active uniquement contre les
bactéries gram positives, mais ne présente pas d'activité antibiotique vis-à-
vis des bactéries gram négatives ni d'activité antifongique vis-à-vis de
Candida albicans (levure). De façon tout à fait intéressante, la présente
expérience démontre également que la souche E. coli tolC (bactérie gram
négative) est sensible à la margaucine. Cette souche toiC est déficiente au
niveau d'un système de pompes à efflux, ce qui permet de faire l'hypothèse
que la cause de l'inactivité de la margaucine vis-à-vis des bactéries gram
négatives est liée au problème de la pénétration de la paroi bactérienne
(composée de plusieurs couches dont une lipidique chez les bactéries
gram-négatives alors qu'elle est composée d'une seule couche épaisse de
muréine ou peptidoglycane chez les bactéries gram-positives). De plus, le
Tableau 2 montre que la molécule est efficace contre des bactéries à
Gram+, à des concentrations aussi faibles que 3,125 pg/mI, voire
0,05 pg/ml pour Clostridium difficile.
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ORGANISME GRAM CMI (pg/mi)
Bactérie
Clostridum difficile DSM1296 + 0,05
Staphylococcus aureus CIP 76.25 + 3,125
Staphylococcus epidermidis CIP 68.21 + 3,125
Staphylococcus aureus H1 + 3,125
Staphylococcus aureus H3 + 3,125
Staphylococcus aureus H4 + 1,563
Staphylococcus aureus H7 + 3,125
Staphylococcus aureus H9 + 3,125
Staphylococcus aureus H16 + 3,125
Staphyiococcus aureus H18 + 3,125
Enterococcus faecalis H + 3,125
Bacillus anthracis + 3,125
Bacillus subtilis ATCC 27370 + 6,25
Escherichia coli CIP 76.24 - > 100
Escherichia coli To1C - 3,125
Salmonella typhi - > 100
Serratia marcescens - > 100
Pseudomonas aeruginosa CIP 76.110 - > 100
Levure
Candida albicans n.a. > 100
Tableau 2. Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) de la margaucine vis-
à-vis de différentes souches bactériennes gram positives (+) ou gram
négatives (-) et de Candida albicans. (n.a: non-applicable ; CIP: Collection
Institut Pasteur ; ATCC : American Type Culture Collection).
~
Enfin, il a été démontré que la margaucine était également
active contre des souches gram positives multirésistantes, telles que
différentes souches de Staphylococcus aureus (H1, H3, H4, H7, H9, H16 et
H18) (Tableau 3).
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Staphylococcus aureus
Hi H3 H4 H7 H9 H16 H18
Pénicilline G R R R R R R R
Amoxicilline R R R R R R R
Piperacilline R R R R R R R
Oxacilline S S R S S R R
Cefazoline S S R S S R R
Tobramycine S S R S S R R
Amikacine S S R S S R R
Gentamicien S S S S S R S
Tetracycline S S S - - R -
Doxycycline S S S S S L S
Erythromycine S R S R R R R
Clindamycine S R S R S R R
Pristinamycine S S S S S L S
Co-trimoxazole S S S S S S S
Pefloxacine - - R R S - R
Ofloxacine S R R R S R R
Norfloxacine S R R R S R R
Ciprofloxacine - - R R S - R
Rifampicine S S S S S R S
Acide fusidique S S S S R S S
Fosfomycin S S S S S R R
Vancomycine S S S S S S R
Teicoplanine S S S S S L R
Margaucine* 3,125 3,125 3,125 1,563 3,125 3,125 3,125
Tableau 3: Susceptibilité de différentes souches de Staphylococcus
aureus à divers antibiotiques dont la margaucine.
(R : souche résistante à l'antibiotique concerné ; S: souche sensible à
l'antibiotique concernée ; L: souche dont la résistance est intermédiaire à
l'antibiotique concerné ;-: non testé ;*: CMI déterminée selon la méthode
décrite
ci-dessus).
II n'a été observé aucune résistance croisée avec des
antibiotiques commerciaux ; de plus, aucune souche résistante spontanée
n'a été isolée, même après mutagenèse aléatoire.
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Toxicité in vitro et in vivo
Avant d'envisager l'utilisation de la margaucine in vivo pour
lutter contres les bactéries gram positives, des tests de toxicité aussi bien
in vitro (culture cellulaire) qu'in vivo (animal) ont été réalisés.
5 Dans un premier temps et comme démontré au tableau 4
aucune cytotoxicité n'a été mesurée sur une culture cellulaire de cellules
MCF7 traitée avec la margaucine à une concentration variant de 1 jusqu'à
100 mg/ml. En effet, le nombre de cellules dans une culture traitée par la
margaucine est identique à celui d'une culture contrôle (n'ayant pas reçu
10 d'antibiotique).
OD
Contrôle (sans margaucine) 1,4 0,1
Margaucine 1 mg/ml 1,3 0,2
Margaucine 10 mg/ml 1,2 0,2
Margaucine 100 mg/ml 1,3 0,1
Tableau 4: Cytotoxicité de la margaucine sur une culture de cellules
MCF7.
De plus, l'injection de margaucine à une dose de 100 mg/kg
d'animal n'a entraîné aucune toxicité sur les 3 souris, qui étaient vivantes à
15 96 heures. Ces résultats confirment donc l'innocuité de la margaucine in
vivo.
Par conséquent, la margaucine n'est pas toxique sur des
cellules eucaryotes, aussi bien in vitro qu'in vivo, à des concentrations
20 aussi élevées que 100 mg/kg.
Efficacité in vivo
L'efficacité de la margaucine a enfin été évaluée in vivo sur
un modèle murin de septicémie à Staphylococcus aureus. Les résultats
'25 sont repris dans le tableau 5.
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Souris Souris ayant Nombre Survie
infectées reçu de la
margaucine de souris à 24 h à 48 h
- - 3 3 souris vivantes 3 souris vivantes
+ - 3 3 souris mortes /
+ + 5 3 souris vivantes 3 souris vivantes
2 mortes 2 mortes
Tableau 5: Survie des souris à 24 et 48 heures post-infection (- : non ;+:
oui).
Ces résultats démontrent que l'infection par Staphylococcus
aureus est fatale chez 100% des souris n'ayant pas reçu d'antibiotique. En
revanche, 3 des 5 souris ayant reçu 100 mg/kg de margaucine ont survécu
à l'infection.
Par conséquent, ces résultats confirment, d'une part les tests
de CMI réalisés in vitro, et d'autre part que la margaucine a une activité
antibiotique in vivo contre des bactéries gram positives, telles que
Staphylococcus.
Comparaison de la CMI de guelgues molécules sur C. difficile
Le tableau 6, ci-après, résume la concentration minimale
inhibitrice (en pg/ml) déterminée sur C. difficile, d'autres molécules
actuellement utilisées ou en cours d'essai clinique (phase III).
Molécule CMI Remarque
Margaucine 0,05 cette demande
Metronidazole 1 Bishara et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2006
Feb;54(2):141-4)
Nitazoxanide 0,1 Catherine et al. Antimicrob Agents Chemother.
2000 September; 44(9): 2254-2258
Vancomycine 1 couramment utilisée
Rifaximin 0,08-0,2 aussi connue sous Xifaxan ; phase III
aussi connue sous OPT-80 ; phase III
Lipiarmycin 0,06 - 2 Finegold et al. Antimicrob Agents Chemother.
2004 Dec;48(12):4898-902).
Tableau 6: comparaison de l'activité de différentes molécules sur C. difficile
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Efficacité in vivo de la margaucine sur les infections par C.
difficile
La molécule a été testée sur un modèle d'infection par
Clostridium difficile, après injection sous-cutanée de clindamycine (10
mg/kg de masse corporelle) pour induire une colite, chez des hamsters de
Syrie dorés de 60 à 80g (lots de 20 animaux). Simultanément à l'injection
de clindamycine ou 24 heures après cette injection, les hamsters ont été
inoculés par voie orale avec une souche clinique virulente de C. difficile
(105 souches par animal). Alternativement, la souche virulente de C. difficile
est la souche ATCC 43255.
Une heure après l'inoculation de C. difficile, les hamsters ont
été traités avec la margaucine par gavage (10 à 200 mg/kg de masse
corporelle). Ce traitement a été répété pendant 3 jours, à raison d'une fois
par jour et avec la même quantité de margaucine.
Des contrôles avec des lots de 20 animaux, non infectés par
C. difficile et/ou non traités avec la margaucine ont été effectués, dans les
mêmes conditions.
Les expériences sont actuellement en cours ; les animaux
sont observés sur une période de 30 jours, et les animaux moribonds sont
comptés puis sacrifiés.
Conclusion
Un nouveau composé possédant une activité antibiotique, la
margaucine, produit par une souche bactérienne a été identifié. Ce
composé est caractérisé d'un point de vue structural et est de faible poids
moléculaire. De plus, la margaucine est à large spectre Gram positif, est
non toxique, efficace sur des modèles d'infection animaux et ne croise avec
aucune résistance connue. D'autres composés de structure analogue, et
présentant une activité antibiotique, sont également proposés dans la
présente demande, pour illustrer l'intérêt de cette classe de composés à
des fins d'application antibiotique.
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Du fait de son action particulièrement efficace sur les
bactéries du genre Clostridium telle que Clostridium difficile, à de faibles
concentrations (CMI de l'ordre de 0,05 pg/ml), les composés ou
compositions de l'invention, et plus particulièrement la margaucine,
représentent un fort potentiel thérapeutique contre les infections digestives
liées à C. difficile, et plus particulièrement les infections intestinales
consécutives à une antibiothérapie et dues à C. difficile. De plus et
contrairement aux antibiotiques commerciaux, le composé ou la
composition de l'invention est 30 fois plus actif sur les bactéries C.
difficile
que sur les autres bactéries de la flore intestinale. Ces résultats font des
composés ou compositions de l'invention un antibiotique de choix dans le
traitement des infections par C. difficile par rapport aux antibiotiques
commerciaux.
A titre de comparaison, les molécules utilisées actuellement
pour traiter les infections par C. difficile sont :
(a) la vancomycine utilisée pour traiter les cas les plus graves
(CMI de l'ordre de 1 pg/ml sur C. difficile) ; cependant, la vancomycine est
déjà utilisée pour traiter d'autres infections bactériennes, notamment à
Staphylocoque, les plus graves, et a entraîné l'apparition de nombreuses
souches résistances ; son utilisation est limitée au maximum par la
communauté médicale afin d'éviter la dissémination des résistances et
l'émergence de nouvelles souches résistantes ; et
(b) le métronidazole utilisée en première intention mais qui est
inactif sur 25% des patients et pour lequel on enregistre de fréquentes
rechutes (25% des cas) ; de plus bien que le métronidazole soit moins
chère que la vancomycine, il présente plus d'effets secondaires.
D'autres molécules actuellement en essai clinique peuvent
également être comparées au composé de l'invention :
(a) le Nitazoxanide (phase III Romark Laboratories L.C.) qui
est une molécule proche dans son mécanisme d'action du metronidazole ;
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cependant, cette molécule est déconseillée à la femme enceinte ou
allaitante ;
(b) la rifaximin (Xifaxan) (phase III Salix Pharmaceuticais),
une molécule dérivée de la rifampicine ; sa concentration minimale
inhibitrice (CMI) est de l'ordre de 0,08 à 0,2 pg/ml sur C. difficile, et
cette
molécule génère de nombreux résistants spontanés ; et
(c) la lipiarmycin (OPT-80) (phase III Optimer
Pharmaceuticals), dont la concentration minimale inhibitrice (CMI) est de
l'ordre de 0,06 à 2 pg/mi sur C. difficile (Antimicrob Agents Chemother.
2004 Dec; 48(12):4898-902).
Par conséquent, le composé de l'invention ou une
composition le comprenant, et particulièrement la margaucine, constitue
une proposition alternative séduisante aux molécules thérapeutiques déjà
sur le marché ou à celles en cours d'essais cliniques, dans le traitement
des infections digestives liées à C. difficile (ICD).
