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HEPARINES COMPRENANT AU MOINS UNE LIAISON COVALENTE AVEC LA
BIOTINE OU UN DERIVE DE LA BIOTINE, LEUR PROCEDE DE
PREPARATION ET LEUR UTILISATION
La présente invention concerne des héparines présentant au moins une liaison
covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine, ainsi que leur procédé
de
préparation, des compositions pharmaceutiques les contenant et leur
utilisation en
thérapeutique.
L'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale,
d'un poids moléculaire voisin de 15 000 Daltons (Da). On parlera dans ce qui
suit
de l'héparine ou des héparines : les structures, masses moléculaires moyennes
et
polydispersité des chaînes polysaccharidiques de l'héparine peuvent en effet
varier
selon les espèces animales et l'organe d'origine de l'héparine (exemples:
héparine
de mucus de porc, d'intestin de bceuf, etc).
L'héparine catalyse, notamment via l'antithrombine III (ATIII), l'inhibition
de deux
enzymes qui interviennent dans la cascade de la coagulation du sang, à savoir
le
facteur Xa et le facteur Ila (ou thrombine). Elle est ainsi utilisée en
thérapeutique
pour ses propriétés anticoagulantes et anti-thrombotiques.
L'héparine présente cependant des inconvénients qui limitent les conditions de
son
utilisation. En particulier, son activité anticoagulante importante (notamment
son
activité anti-facteur lla élevée) peut occasionner des hémorragies (Seminars
in
Thrombosis and Hemostasis, vol. 5, sup. 3, 1999). Les héparines sont connues
pour ces effets secondaires hémorragiques indésirables.
Dans le domaine du traitement de la thrombose, le but est de rétablir ou
maintenir
la fluidité du sang tout en évitant de provoquer une hémorragie. Il est en
effet bien
connu que, pour une cause accidentelle quelconque, une hémorragie peut se
déclencher chez un patient sous traitement. On peut également avoir besoin
d'intervenir chirurgicalement chez un malade sous traitement anti-
thrombotique. De
plus, au cours de certains actes chirurgicaux, des anticoagulants peuvent être
utilisés à forte dose de façon à empêcher la coagulation du sang, et il est
souhaitable de les neutraliser à la fin de l'intervention. Le besoin se fait
donc
ressentir d'avoir des agents antithrombotiques neutralisables pour stopper
l'activité
anticoagulante à tout moment.
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Des agents antithrombotiques neutralisables, tels que des polysaccharides de
synthèse biotinylés, ont été décrits dans les demandes de brevet WO 02/24754
et
WO 06/030104. Leur synthèse, comprenant notamment le greffage de la biotine ou
du dérivé de biotine réalisé sur des équivalents protégés des polysaccharides
mentionnés ci-dessus et non sur ces polysaccharides eux-mêmes, n'est pas
applicable aux composés de la présente invention. On souhaite en effet
effectuer
la biotinylation sur des produits finis, qui sont des mélanges de
polysaccharides et
sont donc des produits hétérogènes, sur lesquels le greffage de biotine tel
que
décrit dans les demandes de brevets sus-mentionnées ne permettrait pas
d'induire
une régio-sélectivité suffisante de la position de greffage et ne permettrait
pas la
biotinylation de l'ensemble des chaînes polysaccharidiques fonctionnalisables
des
héparines.
L'équipe de Osmond et al. décrit, dans Analytical Biochemistry, 31 (2002) 199-
207,
plusieurs techniques de biotinylation d'une héparine porcine, l'une d'elles
étant
décrite comme faisant intervenir un couplage de la biotine à l'extrémité
réductrice
d'une héparine par une amination réductrice suivie d'un couplage avec la
biotine.
Toutefois, les conditions opératoires décrites dans ce document ne permettent
pas
l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées : elles
ne
prennent pas en compte la diversité structurelle des héparines et la structure
réelle
des chaînes polysaccharidiques telles qu'elles sont présentes dans les
héparines
disponibles commercialement. Ces dernières comportent en grande partie des
chaînes polysaccharidiques qui possèdent à leur extrémité réductrice une
glycosérine dégradée, non fonctionnalisable par la biotine selon le protocole
décrit
par Osmond et al. Ainsi, les conditions opératoires décrites dans cette
publication
pour la biotinylation de l'héparine porcine ne permettent pas l'obtention de
façon
complète et reproductible d'héparines biotinylées avec des caractéristiques
attendues, comme un taux de biotinylation suffisant pour permettre une
neutralisation efficace.
L'équipe de Tseng et al. décrit, dans Biomaterials, 27 (2006), 2627-2636, une
technique d'immobilisation d'héparine sur des films par interaction avec
l'avidine,
suite à la fonctionnalisation de l'héparine par la biotine. La biotinylation
de
l'héparine est effectuée par une oxydation à l'aide d'iode, suivie de la
formation
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d'une lactone, puis du couplage avec un dérivé 2-(4-aminophényl)-éthylamine de
biotine. Les conditions opératoires présentées par Tseng et al. ne présument
toutefois pas de l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines
biotinylées au niveau de l'extrémité réductrice : en effet, rien n'indique que
l'étape
d'oxydation puisse être sélective au niveau de l'extrémité réductrice, ni que
l'activité biologique de l'héparine soit conservée après un tel traitement.
L'équipe de Kett et al. décrit, dans Biochimica et Biophysica Acta, 1620
(2003),
225-234, des études d'affinité entre l'avidine et divers glycosaminoglycanes
et
démontre que l'avidine présente une forte affinité envers l'héparine. Dans ces
études d'affinité, l'héparine peut être dérivatisée par la biotine, mais rien
n'indique
quel est le site de biotinylation dans les chaînes polysaccharidiques de
l'héparine.
La Demanderesse s'est donc donné pour but de pourvoir à de nouvelles héparines
neutralisables par l'avidine ou la streptavidine et qui possèdent des
propriétés
biologiques comparables aux héparines natives.
La présente invention a pour objet de nouvelles héparines modifiées, ci-après
appelées "héparines biotinylées", caractérisées en ce que les polysaccharides
constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une
liaison
covalente avec un groupe -(R1)i-Biot et répondent à la formule générale (I) :
COONa OX OSO3Na
COONa
O O O OH
OH OX to OX H-(Ri)-Blot
O
OSO3Na NHY OX NHY
n
(I)
dans laquelle:
-iestégalà0ou1,
- R1 représente un enchaînement de formule (a) ou (b) :
0
H
N-
CHZ j
(a)
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4
)CH2.NCH2
UL k H
H
O
(b)
dans lesquelles j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant
prendre
toute valeur de 1 à 10,
- Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine,
- n représente un nombre entier ayant une valeur moyenne de l'ordre de 25 pour
une héparine de masse moléculaire moyenne de 15 000 Da,
- X représente H ou SO3Na,
- Y représente COCH3 ou SO3Na,
- le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus
du plan
du cycle pyranosique auquel elle est rattachée,
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
De manière surprenante, l'introduction de biotine ou d'un dérivé de biotine au
niveau de l'extrémité réductrice des chaînes polysaccharidiques ne modifie pas
l'activité pharmacologique des héparines. En effet, les nouvelles héparines
biotinylées, objet de l'invention, ont des activités anti-thrombotiques
comparables
aux héparines natives, c'est-à-dire avant biotinylation.
Elles possèdent un avantage considérable par rapport aux héparines natives :
elles peuvent être rapidement neutralisées par un antidote spécifique, en
situation
d'urgence. Cet antidote spécifique est l'avidine, sous forme tétramérique ou
monomérique, ou la streptavidine, de masses respectives égales à environ 66
000,
16 400 et 60 000 Da (The Merck Index, Twelfth edition, 1996, M.N. 920, pages
151-152; Revue Pierce Avidin-Biotin Handbook).
Elles possèdent également l'avantage de pouvoir être utiles dans des
indications
thérapeutiques pour lesquelles les doses utilisées sont plus élevées, tout en
diminuant le risque hémorragique; elles peuvent ainsi être utiles en
thérapeutique
dans le domaine artériel.
Le groupe biotine (Biot) mentionné ci-dessus est un radical issu de l'acide
hexahydro-2-oxo-1 H-thiéno[3,4-d]imidazole-4-pentanoïque. Avantageusement, le
groupe Biot dans la formule générale (I) selon l'invention répond à la formule
(c) :
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s
-iI-(CHZ)â'.õ
O H H
HNYNH
O (c)
Les dérivés de biotine sont disponibles commercialement (catalogue "Pierce"
5 Biotin-avidin products, 2005, pp. 7-11) ou peuvent être préparés en
utilisant des
méthodes classiques connues de l'Homme de l'art. On peut citer notamment les
dérivés de biotine mentionnés dans la demande de brevet WO 02/24754.
Dans les héparines biotinylées selon l'invention, l'indice i peut être égal à
0, auquel
cas la liaison avec la biotine ou le dérivé de biotine s'effectue directement
sur la
fonction amine portée par l'unité saccharidique au niveau de l'extrémité
réductrice
des chaînes polysaccharidiques.
Alternativement, i peut être égal à 1 et la liaison avec le groupe biotine ou
dérivé
de biotine peut consister par exemple en un enchaînement de formule (a)
ci-dessus dans laquelle j est égal à 5, ou en un enchaînement de formule (b)
ci-dessus dans laquelle j et k sont identiques et sont égaux à 5. Ainsi, dans
la
formule (I) ci-dessus, R1 peut représenter par exemple un enchaînement de
formule -CO-(CH2)5-NH ou -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par "extrémité réductrice"
l'extrémité de la chaîne polysaccharidique dans lequelle la glucosamine ou la
mannosamine terminale (la mannosamine résultant d'une épimérisation en milieu
basique de la glucosamine) possède une fonction hémi-acétale cyclique,
répondant à la formule (II) ci-dessous:
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ox
O
OX OH
NHY
(II)
dans laquelle:
- X représente H ou SO3Na,
- Y représente COCH3 ou SO3Na, et
- le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus
du plan
du cycle pyranosique auquel elle est rattachée (au-dessous : glucosamine,
au-dessus : mannosamine).
On entend par "polysaccharides constitutifs de l'héparine" des polysaccharides
caractérisés par la répétition d'un motif disaccharidique contenant un résidu
d'acide
uronique (acide D-glucuronique ou acide L-iduronique) et d'une D-glucosamine,
qui
peut être N-sulfatée ou N-acétylée. L'unité disaccharidique peut également
être
O-sulfatée en positions C6 et/ou C3 de la D-glucosamine et en position C2 de
l'acide uronique (Heparin-binding proteins, H. Edward Conrad, 1998, p. 1).
Comme indiqué plus haut, l'héparine est un mélange de mucopolysaccharides
sulfatés d'origine animale. Les héparines natives, c'est à dire les héparines
de
départ avant la biotinylation, sont dénommées "héparines ".
Les héparines utilisées dans la présente invention peuvent être notamment
d'origine bovine, ovine ou porcine ; plus précisément, elles peuvent être
issues de
poumons de bceufs, de muqueuses intestinales de bceuf, de muqueuses
intestinales de porc ou de muqueuses intestinales de mouton. Avantageusement,
les héparines utilisées dans la présente invention sont d'origine porcine, par
exemple issues de muqueuses intestinales de porc.
Les héparines biotinylées selon la présente invention sont telles que au moins
60%, avantageusement au moins 64%, des polysaccharides constitutifs desdites
héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un
groupe -(R1); Biot et répondent à la fomule (I) telle que définie
précédemment, et
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ce quelle que soit la structure originelle de l'héparine ; avantageusement, au
moins
80% des polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur
extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1);-Biot.
L'invention englobe les héparines biotinylées sous la forme de l'un quelconque
de
leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
La présente invention a également pour objet un procédé pour la préparation
des
héparines biotinylées mentionnées plus haut, caractérisé en ce que :
a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3,
b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment
obtenu
en présence d'un sel d'amine et d'un agent réducteur, à une température
comprise
entre 20 et 80 C,
c) enfin on effectue une acylation avec un groupe -(R1)i-Biot activé, où R1, i
et Biot
sont tels que définis en rapport avec la formule (I) ci-dessus, en présence
d'une
base en milieu aqueux ou en milieu organique.
Les étapes du procédé de préparation ci-dessus peuvent être contrôlées par un
suivi analytique HPLC, notamment de type SAX, et plus particulièrement de type
CTA-SAX, après dépolymérisation des constituants du mélange dérivé d'héparine
en présence d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3. Un tel suivi analytique peut
par
exemple être effectué en utilisant la méthode décrite dans la demande de
brevet
US2005/0186679 Al.
On vérifie notamment, après l'étape d'amination réductrice b), qu'au moins
80%,
avantageusement au moins 90%, des polysaccharides constitutifs desdites
héparines portent à leur extrémité réductrice une fonction -NH2
(polysaccharides
amino-réduits).
On vérifie notamment, après l'étape d'acylation c), qu'au moins 80%,
avantageusement au moins 90%, desdits polysaccharides amino-réduits sont
biotinylés.
Le rendement global du procédé de préparation des héparines biotinylées selon
l'invention est donc d'au moins 60%, avantageusement d'au moins 64%.
Avantageusement, ce rendement est d'au moins 80%.
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On entend par :
- héparinase 1 : l'enzyme héparine lyase I(EC 4.2.2.7) de Flavobacterium
heparinum,
- héparinase 2: l'enzyme héparine lyase II de Flavobacterium heparinum,
- héparinase 3: l'enzyme héparine lyase III (EC 4.2.2.8) de Flavobacterium
heparinum.
L'héparinase 3 permet d'éliminer la zone de liaison aux protéines
(glycosérine)
dans les chaînes polysaccharidiques des héparines et d'obtenir des chaînes
dont
les extrémités réductrices sont exemptes de résidus de glycosérine. Les
héparinases 1 et 2 permettent le clivage des chaînes polysaccharidiques en
fragments de bas poids moléculaires (réactions de dépolymérisation de
l'héparine).
Le procédé de préparation des composés selon l'invention utilise comme
héparines de départ (héparines "natives") des héparines préparées comme
précédemment rapporté dans la littérature. On se réfèrera notamment à
l'ouvrage
"L'héparine, fabrication, structure, propriétés, analyses", J.P. Duclos, Ed.
Masson,
1984. Les héparines peuvent notamment être préparées selon le procédé décrit
dans la demande de brevet US 2005/0215519 Al.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, le
sel
d'amine peut être un sel d'amine quaternaire; il s'agit avantageusement d'un
sel
d'halogénure d'ammonium répondant à la formule NH4Z, où Z représente un atome
d'halogène, tel qu'un atome de chlore, fluor, brome ou iode.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus,
l'agent
réducteur peut être un sel de borohydrure, par exemple un sel de
cyanobohydrure.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, la
température est avantageusement comprise entre 50 et 80 C.
Dans l'étape c) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, la base peut
être
un sel de carbonate ou d'hydrogénocarbonate, notamment sous forme de sel de
sodium ou de potassium, ou encore toute autre base organique hydrosoluble ou
soluble en milieu organique connue de l'Homme de l'art.
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Dans l'étape c) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, on entend par
milieu organique par exemple le dichlorométhane ou le diméthylformamide.
Le procédé de préparation des héparines biotinylées selon l'invention comprend
avantageusement les étapes suivantes :
a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3,
b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment
obtenu
en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure, à une
température comprise entre 50 et 80 C,
c) enfin on effectue une acylation avec un un groupe -(R1)i-Biot tel que
défini
précédemment sous forme d'ester activé, en présence d'une base en milieu
aqueux.
Les dérivés biotinylés -(R1)i-Biot tels que définis plus haut peuvent être mis
en jeu
dans la réaction d'acylation directement sous forme d'esters activés,
préformés ou
générés in situ en utilisant des conditions classiques de couplage connues de
l'Homme de l'art. On peut notamment utiliser des esters activés sous forme de
dérivés N-hydroxy-succinimide ou de dérivés 3-suifo-N-hydroxy-succinimide.
Le procédé de préparation selon l'invention est illustré dans le schéma 1.
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Schéma 1
Na OX OSO,Na
CbONa
Héparinase 3 o p o 0
HEPARINE ox X H ox
OH
OSO,Na Nx2= OX
rY
Composé 1 NH4Z / Agent réducteur
ONa OX OSO,Na
COONa
O O OH
OH X H A NHx
OSO,Na NHY OX
n NHy
Composé 2
o Su1FoNHS(RI)iBiot
ONa oX OSO,Na x Base
COOxa HN NH
O O OH H n. mp
O H X x H H-( Rl)I O
S
OSO,Na NHy OX
O NHY
Composé 3
5 Selon le schéma 1, l'héparine est traitée par l'héparinase 3 pour éliminer
la liaison
protéique restante (c'est-à-dire les glycosérines, natives ou dégradées) et
obtenir
un composé 1 comportant une extrémité réductrice exempte de résidu de
glycosérine. Cette héparine (composé 1) peut alors être soumise à une
amination
réductrice pour fournir le composé 2, présentant une fonction amine libre au
niveau
10 de l'extrémité réductrice, en présence d'un sel d'amine et d'un agent
réducteur tel
qu'un sel de borohydrure.
Ce composé peut alors être acylé pour fournir le composé biotinylé 3, par
réaction
avec un dérivé activé de biotine -(R1)i-Biot, tel que défini précédemment, en
présence d'une base. Cette réaction peut par exemple être effectuée avec le
sel de
sodium de l'ester de 6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl
lorsque R1 représente l'enchaînement -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-, ou avec le
sel de sodium de l'ester de 6-biotinamido hexanoate de 3-suifosuccinimidyl
lorsque
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R1 représente l'enchaînement -CO-(CH2)5-NH-, ou encore avec le sel de sodium
de l'ester de biotinoyl-3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 n'est pas présent (i =
0).
Dans le schéma 1, il est entendu que les composés 1, 2 et 3 sont une
représentation théorique, puisqu'il s'agit en réalité, en tant que dérivés
d'héparine,
de mélanges de chaînes polysaccharidiques.
Dans ce qui suit, des exemples de synthèse des héparines biotinylées selon
l'invention et de différents intermédiaires utiles à leur obtention sont
détaillés à titre
d'illustration.
Les abréviations suivantes sont utilisées :
Héparine EPB : héparine commercialisée par la société Bioibérica ;
HPLC : "High Performance Liquid Chromatography" ;
SAX : "Strong anion exchange chromatography" ;
CTA : "Cetyl Trimethyl Ammonium" ;
Q.S.P. : "Quantité Suffisante Pour" ;
LC :"Long Chain" (correspond à l'enchaînement 6-amino-hexanoyl) ;
Sulfo-NHS : sel de sodium de l'ester 3-sulfo-succinimidyl ;
Héparinase 1: enzyme héparine lyase I(EC 4.2.2.7) de Flavobacterium
heparinum ;
Héparinase 2: enzyme héparine lyase Il de Flavobacterium heparinum ;
Héparinase 3: enzyme héparine lyase III (EC 4.2.2.8) de Flavobacterium
heparinum.
Exemple 1
1.1 Héparine EPB purifiée par dépolymérisation avec l'héparinase 3:
A une température proche de 20 C, 1 g d'héparine brute EPB est mis en solution
dans 15 ml de la solution aqueuse de 5 mM de phosphate de sodium ajustée à
pH = 7,0 0,1, 20 mM de chlorure de sodium et 1mg/ml de BSA. 0,5 UI
d'héparinase 3 sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange réactionnel
obtenu est agité pendant 5 jours. 1 g de chlorure de sodium et 45 ml de
méthanol
sont ajoutés au mélange réactionnel. La suspension obtenue est filtrée sur
membrane 0,45 Nm. Le gâteau est lavé au méthanol, à l'éther diéthylique, puis
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séché sous vide. On obtient 0,98 g d'un solide blanc. Le rendement observé est
de
98 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange
d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode
décrite
dans la demande de brevet US2005/0186679 Al. Les résultats montrent une
disparition d'au moins 80% des espèces glycosérines présentes dans l'héparine
de
départ.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm),
principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m),
4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s),
4,42
(CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
1.2 Héparine dépolymérisée par héparinase 3 amino-réduite :
0,5 g d'héparine purifiée par héparinase 3 sont mis en solution dans une
solution
aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 0,5 g de cyanoborohydrure de sodium sont
ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange est porté à 70 C pendant 24
heures.
La solution est ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (QSP
50 mi), puis déssalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction obtenue est
injectée sur une colonne de Q-sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis
avec un
gradient en perchlorate de sodium. Le produit obtenu est déssalé sur une
colonne
de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 444 mg d'un lyophilisat blanc. Le
rendement observé est de 89 %. Le produit est engagé tel que dans l'étape
suivante d'acylation.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, S en ppm),
principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m),
4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s),
4,42
(CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
1.3 Héparine dépolymérisée par héparinase 3, amino-réduite et biotinylée :
A une température voisine de 20 C, 200 mg d'héparine dépolymérisée amino-
réduite sont mis en solution dans 2 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate
de
sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La
solution obtenue est agitée à une température proche de 20 C pendant 1 heure.
La solution est diluée par 4 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de
sodium.
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37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange est agité pendant 2
heures. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange
réactionnel est agité pendant 16 heures. Le milieu réactionnel obtenu est
dilué à
l'eau (Q.S.P. 200 mi), filtré sur membrane 0,45 pm et injecté sur une colonne
de Q-
Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate
de
sodium. Le produit obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis
lyophilisé. On obtient 188 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est
de
94%.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange
d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX, en utilisant la méthode
décrite
dans la demande de brevet US200510186679 Al.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm),
principaux signaux: entre 1,3 et 1,8 (CH2 biotine, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25
(CH2CO biotine, t, 7Hz), 2,79 (1 H, d, 12Hz), 3,00 (1 H, dd, 12 et 5Hz), 3,20
(NCH2
biotine, m), 3,30 (CH, m), 3,68 (CH, m), 3,80 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH,
s),
4,20 (CH, s), 4,25 (CH, m), 4,35 (CH, s), 4,45 (CH, m), 4,63 (NCH biotine, m),
4,85
(CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
Exemple 2
2.1 Héparine obtenue selon US 2005/0215519 A1, dépolymérisation avec
l'héparinase 3:
A une température proche de 20 C, 1 g d'héparine selon US 2005/0215519 Al est
mis en solution dans 15 ml de la solution aqueuse de 5 mM de phosphate de
sodium ajusté à pH = 7,0 0,1, 20 mM de chlorure de sodium et 1 mg / ml de
BSA.
0,5 UI d'héparinase 3 sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange
réactionnel
obtenu est agité pendant 7 jours. 1 g de chlorure de sodium et 45 ml de
méthanol
sont ajoutés au mélange réactionnel. La suspension obtenue est filtrée sur
membrane 0,45 pm. Le gâteau est lavé au méthanol, à l'éther diéthylique, puis
séché sous vide. On obtient 0,96 g d'un solide blanc. Le rendement observé est
de
96 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange
d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode
décrite
dans la demande de brevet US 2005/0186679 Al. Les résultats montrent une
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disparition d'au moins 80 % des espèces glycosérines présentes dans l'héparine
de départ.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, S en ppm),
principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m),
4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s),
4,42
(CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
2.2 Héparine selon selon US 2005/0215519 Al dépolymérisée par héparinase 3 et
amino-réduite :
0,5 g d'héparine selon US 200510215519 Al traitée par héparinase 3 sont mis en
solution dans 20 ml d'une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 0,5 g
de
cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange
est
porté à 70 C pendant 24 heures. La solution est ramenée à une température
proche de 20 C, diluée à l'eau (Q.S.P. 50 ml), puis déssalée sur une colonne
de
Séphadex G10. La fraction récoltée est lyophilisée. On obtient 446 mg d'un
lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 89 %. Le produit est engagé tel
que
dans l'étape suivante d'acylation.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, S en ppm),
principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m),
4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s),
4,42
(CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
2.3 Héparine selon US 2005/0215519 Al dépolymérisée par héparinase 3, amino-
réduite et biotinylée :
A une température voisine de 20 C, 200 mg d'héparine dépolymérisée amino-
réduite sont mis en solution dans 2 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate
de
sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La
solution est agitée à une température proche de 20 C pendant 1 heure. La
suspension obtenue est diluée par 4 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate
de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange est agité
pendant 2 heures. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le
mélange réactionnel est agité pendant 16 heures. Le milieu réactionnel obtenu
est
dilué à l'eau (Q.S.P. 200 ml), filtré sur membrane 0,45 pm et injecté sur une
colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en
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perchlorate de sodium. Le produit obtenu est déssalé sur une colonne de
Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 188 mg d'un lyophilisat blanc. Le
rendement observé est de 94 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange
5 d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode
décrite
dans la demande de brevet US 2005/0186679 Al.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm),
principaux signaux: entre 1,3 et 1,8 (CH2 biotine, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25
(CH2CO biotine, t, 7Hz), 2,79 (1 H, d, 12Hz), 3,00 (1 H, dd, 12 et 5Hz), 3,20
(NCH2
10 biotine, m), 3,30 (CH, m), 3,68 (CH, m), 3,80 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10
(CH, s),
4,20 (CH, s), 4,25 (CH, m), 4,35 (CH, s), 4,45 (CH, m), 4,63 (NCH biotine, m),
4,85
(CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
Les composés selon l'invention ont fait l'objet d'études biochimiques et
15 pharmacologiques.
Mesure de l'activité anti-facteur Ila et de l'activité anti-facteur Xa
L'activité anti-facteur Ila (anti-Flla) et l'activité anti-facteur Xa (anti-
FXa) dans le
plasma humain ou un système tampon sont analysés par méthode
chromogènique : l'activité anti-facteur Ila est testée au moyen du kit d'anti-
facteur
Ila d'héparine d'Actichrome (American diagnostica) contenant le substrat
chromogène S-2238, l'a-thrombine et l'ATIII humain (antithrombine III).
L'activité
anti-FXa est déterminée avec l'instrument automatisé de coagulation ACL 7000
(Instrumentation Laboratory) employant le kit Héparine (Instrumentation
Laboratory) contenant de l'ATIII, le facteur Xa et le substrat chromogène S-
2765.
Les deux analyses sont réalisées exactement selon les instructions du
fabricant.
Les standards suivants sont employés pour établir une courbe d'étalonnage
standard pour mesurer l'activité in vitro des fractions d'héparines
biotinylées dans
le plasma humain et le système tampon :
- 1er standard international pour les héparines de bas poids moléculaire
(National
Institute for Biological Standards and Control, Londres, R-U, établi en 1987,
code
n 85/600),
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- 2ème standard intemational pour les héparines de bas poids moléculaire
(National Institute for Biological Standards and Controi, Londres, R-U, établi
en
1987, code n 01/608, utilisé depuis juin 2006),
- l'enoxaparine (Clexane , sanofi-aventis, France) a été employé comme
référence
interne.
Pour les déterminations d'activité anti-Flla, 10 NI d'échantillon ou de
standards
internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués au 1:16 avec
l'antithrombine dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI
0,05 M, NaCI 0,154M, à pH 7,4. 10 pl de cette solution sont ajoutés dans une
plaque 96 puits microtitre. La mesure est reproduite en triple (sur 3 puits).
La
plaque microtitre est maintenue à 37 C en agitant à 300 t/min. 40 NI de
thrombine
sont ajoutés à chacun des puits et incubés pendant exactement 2 mn. 40 NI de
Spectrozyme sont ajoutés. Après 90 secondes, la réaction est arrêtée par ajout
de
40 NI d'acide acétique. L'absorption est mesurée à 405 nm en utilisant un
SpectraMax 340 (Molecular devices).
Pour des mesures d'activité anti-FXa, l'échantillon ou les standards
internationaux
des héparines de bas poids moléculaire sont dilués dans le plasma humain ou le
système tampon contenant Tris HCI 0,05 M, NaCI 0,154M, pH 7,4. Les
échantillons contenant les héparinoïdes dans le plasma ou le tampon sont
encore
dilués au 1:20 avec un tampon de travail contenant l'ATIII, et placés en
double
dans le rotor de sondage. Le réactif facteur Xa et le substrat chromogène sont
versés dans les réservoirs indiqués de l'instrument automatisé de coagulation
ACL
7000.
La mesure de l'activité anti-FXa est réalisée avec le protocole "héparine"
intégrée
dans le logiciel de l'ACL 7000. Pendant l'analyse, 50 NI de l'échantillon
(dilué avec
le tampon de travail) sont mélangés à 50 NI du réactif facteur Xa. Après un
temps
d'incubation de 60 secondes à 37 C, 50 NI de substrat chromogène de
concentration 1,1 mM sont ajoutés et les changements de l'absorption en
fonction
du temps sont mesurés à la longueur d'onde de 405 nM.
Les résultats obtenus sont décrits notamment dans le tableau ci-dessous.
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Activité anti-FXa (UI / mg)
Héparine EPB 235
Héparine EPB purifiée par
251
l'héparinase 3
Héparine EPB purifiée par
217
l'héparinase 3 et amino-réduite
Héparine EPB purifiée par l'héparinase
218
3, amino-réduite et biotinylée
Héparine selon US 2005/0215519 Al 214
Héparine selon US 2005/0215519 Al 257
purifiée par I'héparinase 3
Héparine selon US 2005/0215519 Al
purifiée par l'héparinase 3 et 203
amino-réduite
Héparine selon US 200510215519 Al
purifiée par l'héparinase 3, 214
amino-réduite et biotinylée
Il apparaît ainsi que l'activité anti-FXa des héparines biotinylées selon
l'invention
est conservée par comparaison avec les héparines natives de départ.
Les héparines biotinylées selon la présente invention peuvent être utilisées
pour la
préparation de médicaments. Elles peuvent notamment être utilisées comme
médicaments anti-thrombotiques. Ainsi, selon un autre de ses aspects,
l'invention
a pour objet des médicaments qui comprennent une héparine biotinylée telle que
définie ci-avant. Ces médicaments trouvent leur emploi en thérapeutique, en
particulier dans le traitement et la prévention des thromboses veineuses, des
accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du
myocarde
ou d'angor instable, des thromboses artérielles périphériques, telles que les
arthériopathies des membres inférieurs, des thromboses artérielles cérébrales
et
des accidents vasculaires cérébraux. Ils sont également utiles dans la
prévention
et le traitement de la prolifération des cellules musculaires lisses, de
l'angiogénèse,
et comme agents neuroprotecteurs de l'athérosclérose et de l'artériosclérose.
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La présente invention, selon un autre de ses aspects, concerne également une
méthode de traitement des pathologies sus-mentionnées qui comprend
l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'un composé selon
l'invention,
ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. L'utilisation des héparines
biotinylées telles que définies précédemment pour le traitement et la
prévention
des pathologies sus-mentionnées fait donc partie de l'invention, ainsi que
l'utilisation desdites héparines biotinylées pour la fabrication d'un
médicament
destiné à traiter ou à prévenir ces pathologies.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une
composition
pharmaceutique conprenant, en tant que principe actif, une héparine biotinylée
selon l'invention ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, ainsi
qu'au
moins un excipient inerte, pharmaceutiquement acceptable. Lesdits excipients
sont
choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités,
par
exemple la voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire,
intraveineuse,
transdermique, transmuqueux, locale ou rectale.
Dans chaque unité de dosage, le principe actif est présent dans les quantités
adaptées aux doses joumalières envisagées afin d'obtenir l'effet
prophylactique ou
thérapeutique désiré. Chaque unité de dosage peut contenir de 25 à 150 mg de
principe actif, avantageusement de 30 à 100 mg. Ces doses de composés
anticoagulants peuvent être neutralisées par l'avidine ou la streptavidine.
Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus
faibles sont
appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la
pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le
médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit patient.
Les composés selon l'invention peuvent également être utilisés en association
avec un ou plusieurs autres principes actifs utiles pour la thérapeutique
souhaitée,
tels que des anti-thrombotiques, des anticoagulants ou des antiagrégants
plaquettaires.
La présente invention a également pour objet un procédé mettant en oeuvre
l'avidine ou la streptavidine, caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser
les
héparines biotinylées selon l'invention. Ainsi, l'avidine ou la streptavidine
peuvent
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être utilisés pour la préparation de médicaments destinés à neutraliser les
héparines biotinylées selon la présente invention.
