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HEPARINES DE BAS POIDS MOLECULAIRE COMPRENANT AU MOINS UNE LIAISON COVALENTE
AVEC LA BIOTINE OU UN DERIVE DE LA BIOTINE, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET
LEUR UTILISATION
La présente invention concerne des héparines de bas poids moléculaire, plus
généralement des mélanges de polysaccharides dérivés d'héparinoïdes, qui
présentent au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la
biotine, ainsi que leur procédé de préparation, des compositions
pharmaceutiques
les contenant et leur utilisation en thérapeutique.
L'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale,
d'un poids moléculaire voisin de 15 000 Daltons (Da), utilisée notamment pour
ses
propriétés anticoagulantes et anti-thrombotiques. L'héparine présente
cependant
des inconvénients qui limitent les conditions de son utilisation. En
particulier, son
activité anticoagulante importante (notamment son activité anti-facteur Ila
élevée)
peut occasionner des hémorragies (Seminars in Thrombosis and Hemostasis,
vol. 5, sup. 3, 1999).
Des héparines de bas poids moléculaire, compris par exemple entre 3000 et
7000 Da et plus particulièrement entre 3500 et 5500 Daltons, notamment
obtenues
par dépolymérisation basique d'esters d'héparine et actuellement
commercialisées,
telle que l'enoxaparine, présentent également une activité anti-facteur IIa
importante.
Les dérivés d'héparines sont connus pour ces effets secondaires hémorragiques
indésirables. Or, dans le domaine du traitement de la thrombose avec les
produits
ci-dessus, le but est de rétablir ou maintenir la fluidité du sang tout en
évitant de
provoquer une hémorragie. Il est en effet bien connu que, pour une cause
accidentelle quelconque, une hémorragie peut se déclencher chez un patient
sous
traitement. On peut également avoir besoin d'intervenir chirurgicalement chez
un
malade sous traitement antithrombotique. De plus, au cours de certains actes
chirurgicaux, des anticoagulants peuvent être utilisés à forte dose de façon à
empêcher la coagulation du sang, et il serait utile de pouvoir les neutraliser
à la fin
de l'intervention. Le besoin se fait donc ressentir d'avoir des agents
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antithrombotiques neutralisables pour stopper l'activité anticoagulante à tout
moment.
Des agents antithrombotiques neutralisables, tels que des polysaccharides de
synthèse biotinylés, ont été décrits dans les demandes de brevet WO 02/24754
et
WO 06/030104. Leur synthèse, comprenant notamment le greffage de la biotine ou
du dérivé de biotine réalisé sur des équivalents protégés des polysaccharides
mentionnés ci-dessus et non sur ces polysaccharides eux-mêmes, n'est pas
applicable aux composés de la présente invention. On souhaite en effet
effectuer
la biotinylation sur des produits finis, qui sont des mélanges de
polysaccharides
dérivés d'héparine et sont donc des produits hétérogènes, sur lesquels le
greffage
de biotine tel que décrit dans les demandes de brevets sus-mentionnées ne
permettrait pas d'induire une régio-sélectivité suffisante de la position de
greffage
et ne permettrait pas la biotinylation de l'ensemble des chaînes
polysaccharidiques
fonctionnalisables des héparines de bas poids moléculaire.
L'équipe de Osmond et al. décrit, dans Analytical Biochemistry, 31 (2002) 199-
207,
plusieurs techniques de biotinylation d'une héparine porcine, l'une d'elles
étant
décrite comme faisant intervenir un couplage de la biotine à l'extrémité
réductrice
d'une héparine par une amination réductrice suivie d'un couplage avec la
biotine.
Toutefois, les conditions opératoires décrites dans ce document ne permettent
pas
l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées : elles
ne
prennent pas en compte la diversité structurelle des héparines et la structure
réelle
des chaînes polysaccharidiques telles qu'elles sont présentes dans les
héparines
disponibles commercialement. Ces dernières comportent en grande partie des
chaînes polysaccharidiques qui possèdent à leur extrémité réductrice une
glycosérine dégradée, non fonctionnalisable par la biotine selon le protocole
décrit
par Osmond et al. Ainsi, les conditions opératoires décrites dans cette
publication
pour la biotinylation de l'héparine porcine ne permettent pas l'obtention de
façon
complète et reproductible d'héparines biotinylées avec des caractéristiques
attendues, comme un taux de biotinylation suffisant pour permettre une
neutralisation efficace.
L'équipe de Tseng et al. décrit, dans Biomaterials, 27 (2006), 2627-2636, une
technique d'immobilisation d'héparine sur des films par interaction avec
l'avidine,
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suite à la fonctionnalisation de l'héparine par la biotine. La biotinylation
de
l'héparine est effectuée par une oxydation à l'aide d'iode, suivie de la
formation
d'une lactone, puis du couplage avec un dérivé 2-(4-aminophényl)-éthylamine de
biotine. Les conditions opératoires présentées par Tseng et al. ne présument
toutefois pas de l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines
biotinylées au niveau de l'extrémité réductrice : en effet, rien n'indique que
l'étape
d'oxydation puisse être sélective au niveau de l'extrémité réductrice, ni que
l'activité biologique de l'héparine soit conservée après un tel traitement.
La Demanderesse s'est donc donné pour but de pourvoir à de nouvelles héparines
de bas poids moléculaires neutralisables par l'avidine ou la streptavidine et
qui
possèdent des propriétés biologiques, notamment des activités anti-facteur Xa
et
anti-facteur Ila, comparables aux héparines de bas poids moléculaires de
départ.
La présente invention a pour objet de nouvelles héparines de bas poids
moléculaire modifiées, ci-après appelées "héparines de bas poids moléculaire
biotinylées", caractérisées en ce qu'elles présentent un poids moléculaire
moyen
compris entre 3000 et 7000 Da et en ce que leurs polysaccharides constitutifs
sont
liés de façon covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine à leur
extrémité
réductrice.
De manière surprenante, l'introduction de biotine ou d'un dérivé de la biotine
au
niveau de l'extrémité réductrice des chaînes polysaccharidiques ne modifie pas
l'activité pharmacologique des héparines de bas poids moléculaire. En effet,
les
nouvelles héparines de bas poids moléculaire biotinylées, objet de
l'invention, ont
des activités anti-thrombotiques comparables aux héparines de bas poids
moléculaire natives, c'est-à-dire avant la biotinylation.
Elles possèdent un avantage considérable par rapport aux héparines de bas
poids
moléculaire natives : elles peuvent être rapidement neutralisées par un
antidote
spécifique, en situation d'urgence. Cet antidote spécifique est l'avidine,
sous forme
tétramérique ou monomérique, ou la streptavidine, de masses respectives égales
à environ 66 000, 16 400 et 60 000 Da (The Merck Index, Twelfth edition, 1996,
M.N. 920, pages 151-152; Revue Pierce Avidin-Biotin Handbook).
Elles possèdent également l'avantage de pouvoir être utiles dans des
indications
thérapeutiques pour lesquelles les doses utilisées sont plus élevées, tout en
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diminuant le risque hémorragique; elles peuvent ainsi être utiles en
thérapeutique
dans le domaine artériel.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par "héparines de bas poids
moléculaire" des mélanges de polysaccharides sulfatés qui possèdent la
structure
générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine, qui présentent un
poids
moléculaire moyen de 3000 à 7000 Da et qui sont obtenus par dépolymérisation
d'héparine. Dans ce qui suit, le terme "héparines de bas poids moléculaire" ou
"héparines de bas poids moléculaire natives" désigne les mélanges
polysaccharidiques avant biotinylation, par contraste avec le terme "héparines
de
bas poids moléculaire biotinylées", qui désigne les composés selon
l'invention,
comprenant une liaison covalente avec la biotine ou l'un de ses dérivés.
On entend par "extrémité réductrice" l'extrémité de la chaîne
polysaccharidique
dans lequelle la glucosamine ou la mannosamine terminale (la mannosamine
résultant d'une épimérisation en milieu basique de la glucosamine) possède une
fonction hémi-acétale cyclique, répondant à la formule (II) ci-dessous:
ox
O
OX OH
NHY
(II)
dans laquelle:
- X représente H ou SO3Na,
- Y représente COCH3 ou SO3Na, et
- le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus
du plan
du cycle pyranosique auquel elle est rattachée (au-dessous : glucosamine,
au-dessus : mannosamine).
Parmi les héparines de bas poids moléculaire utilisables dans la présente
invention, certaines d'entre elles peuvent être telles qu'au moins 75% de
leurs
chaînes polysaccharidiques comportent à leur extrémité réductrice une
glucosamine sous forme hémi-acétale ; il s'agit des polysaccharides
fonctionnalisables du mélange. Certaines chaînes polysaccharidiques présentes
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dans le mélange peuvent se trouver sous forme 1,6-anhydro, à une teneur
inférieure ou égale à 25% ; de tels polysaccharides ne sont pas
fonctionnalisables
par la biotine ou le dérivé de biotine.
On entend par "polysaccharides fonctionnalisables" constitutifs du mélange les
5 polysaccharides comportant à leur extrémité réductrice une glucosamine sous
forme hémi-acétale telle que définie dans la formule (II).
On entend par "polysaccharides constitutifs de l'héparine" des polysaccharides
caractérisés par la répétition d'un motif disaccharidique contenant un résidu
d'acide
uronique (acide D-glucuronique ou acide L-iduronique) et d'une D-glucosamine,
qui
peut être N-sulfatée ou N-acétylée. L'unité disaccharidique peut également
être
O-sulfatée en positions C6 et/ou C3 de la D-glucosamine et en position C2 de
l'acide uronique (Heparin-binding proteins, H. Edward Conrad, 1998, p. 1).
Les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention sont
avantageusement caractérisées en ce que leurs polysaccharides constitutifs
répondent à la formule générale (I) :
OX
OH
p OX H--(-R1 ) ~-Biot
JNHY (I)
dans laquelle :
- i est égal à 0 ou 1,
- R1 représente un enchaînement de formule (a) ou (b) :
O
H
N
CHZ j
(a)
O
N 4CH2~
CHj, k H
~ ~ (b)
dans lesquelles j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant
prendre
toute valeur de 1 à 10,
- Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine,
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- PE représente une chaîne polysaccharidique ayant la structure générale des
polysaccharides constitutifs de l'héparine,
- X représente H ou SO3Na,
- Y représente SO3Na ou COCH3,
- le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus
du plan
du cycle pyranosique auquel elle est rattachée,
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
Le groupe biotine (Biot) mentionné ci-dessus est un radical issu de l'acide
hexahydro-2-oxo-1 H-thiéno[3,4-d]imidazole-4-pentanoïque. Avantageusement, le
groupe Biot dans la formule générale (I) selon l'invention répond à la formule
(c) :
S
-il-(CHz)â',,,
0 H H
HNyNH
O (c)
Les dérivés de biotine sont disponibles commercialement (catalogue "Pierce"
Biotin-avidin products, 2005, pp. 7-11) ou peuvent être préparés en utilisant
des
méthodes classiques connues de l'Homme de l'art. On peut citer notamment les
dérivés de biotine mentionnés dans la demande de brevet WO 02/24754.
Dans les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention,
l'indice i
peut être égal à 0, auquel cas la liaison avec la biotine ou le dérivé de
biotine
s'effectue directement sur la fonction amine portée par l'unité saccharidique
au
niveau de l'extrémité réductrice des chaînes polysaccharidiques.
Alternativement, i peut être égal à 1 et la liaison avec le groupe biotine ou
dérivé
de biotine peut consister par exemple en un enchaînement de formule (a)
ci-dessus dans laquelle j est égal à 5, ou en un enchaînement de formule (b)
ci-dessus dans laquelle j et k sont identiques et sont égaux à 5. Ainsi, dans
la
formule (I) ci-dessus, R1 peut représenter par exemple un enchaînement de
formule -CO-(CH2)5-NH ou -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-.
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Les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la présente invention
sont telles qu'au moins 60%, avantageusement au moins 80%, de façon encore
plus avantageuse au moins 90% de leurs polysaccharides constitutifs possèdent
à
leur extrémité réductrice une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé
de
biotine.
Les héparines de bas poids moléculaire utilisées dans la présente invention
peuvent être choisies par exemple parmi l'enoxaparine, l'ardeparine, la
bémiparine,
la parnaparine et la tinzaparine.
Comme défini dans les brevets US 5,389,618 et US RE38,743, les héparines de
bas poids moléculaire utilisées dans la présente invention peuvent notamment
être
telles que :
. de 9% à 20% de leurs polysaccharides constitutifs ont un poids moléculaire
moyen inférieur à 2000 Da,
. de 5% à 20% de leurs polysaccharides constitutifs ont un poids moléculaire
moyen supérieur à 8000 Da,
. de 60 à 86% de leurs polysaccharides constitutifs ont un poids moléculaire
moyen compris entre 2000 et 8000 Da,
. le ratio entre la masse moléculaire en masse et la masse moléculaire en
nombre
est compris entre 1,3 et 1,6 et
. lesdites héparines de bas poids moléculaire montrent une biodisponibilité et
une
activité anti-thrombotique meilleure que celle de l'héparine et possèdent un
poids
moléculaire moyen entre approximativement 3500 et 5500 Da.
L'invention englobe les héparines de bas poids moléculaire biotinylées sous la
forme de l'un quelconque de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
La présente invention a également pour objet un procédé pour la préparation
des
héparines de bas poids moléculaire biotinylées mentionnées plus haut,
caractérisé
enceque:
a) on effectue une amination réductrice, en présence d'un sel d'amine et d'un
agent réducteur et à une température comprise entre 20 et 80 C, sur une
héparine
de bas poids moléculaire telle que définie précédemment,
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b) puis on effectue une acylation avec un groupe -(R1); Biot activé, où R1, i
et Biot
sont tels que définis en rapport avec la formule (I) ci-dessus, en présence
d'une
base en milieu aqueux ou en milieu organique.
Les étapes du procédé de préparation ci-dessus peuvent être contrôlées par un
suivi analytique HPLC, notamment de type SAX, en utilisant par exemple la
méthode décrite dans la demande de brevet WO 2004/027087, ou éventuellement
par LC-MS, en utilisant par exemple la méthode décrite par Robert J. Linhardt
dans J. Biol. Chem., 2004, 279 (4), p. 2608-2615.
Les héparines de bas poids moléculaire biotinylées peuvent être également
analysées et caractérisées par chromatographie d'affinité sur avidine
monomérique
supportée, commercialisée par la société Pierce, selon les conditions
d'analyses
décrites par le fournisseur.
On vérifie notamment, après l'étape d'amination réductrice a), qu'au moins 90%
des polysaccharides constitutifs desdites héparines de bas poids moléculaire
portent à leur extrémité réductrice une fonction -NH2 (polysaccharides amino-
réduits).
On vérifie notamment, après l'étape d'acylation b), qu'au moins 90% desdits
polysaccharides amino-réduits sont biotinylés.
Le rendement global du procédé de préparation des héparines de bas poids
moléculaire biotinylées selon l'invention est donc d'au moins 80%,
avantageusement d'au moins 90%.
Le procédé de préparation des composés selon l'invention utilise comme
héparines de bas poids moléculaire de départ (héparines de bas poids
moléculaire
"natives") des héparines de bas poids moléculaire préparées comme
précédemment rapporté dans la littérature. On se réfèrera notamment aux
brevets
US RE38,743 pour l'enoxaparine, US 4,757,057 pour l'ardeparine, EP 0 293 539
pour la bémiparine, US 4,791,195 pour la parnaparine et US 5,106,734 pour la
tinzaparine.
Dans l'étape a) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, le
sel
d'amine peut être un sel d'amine quaternaire; il s'agit avantageusement d'un
sel
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d'halogénure d'ammonium répondant à la formule NH4Z, où Z représente un
atome d'halogène, tel qu'un atome de chlore, fluor, brome ou iode.
Dans l'étape a) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus,
l'agent
réducteur peut être un sel de borohydrure, par exemple un sel de
cyanobohydrure.
Dans l'étape a) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, la
température est avantageusement comprise entre 50 et 80 C.
Dans l'étape b) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, la base peut
être
un sel de carbonate ou d'hydrogénocarbonate, notamment sous forme de sel de
sodium ou de potassium, ou encore toute autre base organique hydrosoluble ou
soluble en milieu organique connue de l'Homme de l'art.
Dans l'étape b) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, on entend par
milieu organique par exemple le dichlorométhane ou le diméthylformamide.
Le procédé de préparation des héparines de bas poids moléculaire biotinylées
selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) on effectue une amination réductrice sur une héparine de bas poids
moléculaire
en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure, à une
température comprise entre 50 et 80 C,
b) puis on effectue une acylation avec un un groupe -(R1)i-Biot tel que défini
précédemment sous forme d'ester activé, en présence d'une base en milieu
aqueux.
Les dérivés biotinylés -(R1)i-Biot tels que définis plus haut peuvent être mis
en jeu
dans la réaction d'acylation directement sous forme d'esters activés,
préformés ou
générés in situ en utilisant des conditions classiques de couplage connues de
l'Homme de l'art. On peut notamment utiliser des esters activés sous forme de
dérivés N-hydroxy-succinimide ou de dérivés 3-sulfo-N-hydroxy-succinimide.
Le procédé de préparation selon l'invention est illustré dans le schéma 1.
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Schéma 1
ox ox o
NHaZ / Agent Su1foNHS(R,)iBiot OX HNxNH
O réducteur OH Base H H
PE pX OH P OX C NH2 PE OH
OX H~R1 )~ S
O
NHY NHY NHY
X = H or SO3Na
Y= SO3Na, COCH3 A B
Selon le schéma 1, l'héparine de bas poids moléculaire est soumise à une
5 amination réductrice pour fournir le dérivé A, présentant une fonction amine
libre
au niveau de l'extrémité réductrice, en présence d'un sel d'amine et d'un
agent
réducteur tel qu'un sel de borohydrure.
Ce dérivé peut alors être acylé pour fournir le dérivé biotinylé B, par
réaction avec
un dérivé activé de biotine -(R1)i-Biot, tel que défini précédemment, en
présence
10 d'une base. Cette réaction peut par exemple être effectuée avec le sel de
sodium
de l'ester de 6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl lorsque
R1
représente l'enchaînement -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-, ou avec le sel de
sodium de l'ester de 6-biotinamido hexanoate de 3-suifosuccinimidyl lorsque R1
représente l'enchaînement -CO-(CH2)5-NH-, ou encore avec le sel de sodium de
l'ester de biotinoyl-3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 n'est pas présent (i = 0).
Dans le schéma 1, il est entendu que les dérivés A et B sont une
représentation
théorique, puisqu'il s'agit en réalité, en tant que dérivés d'héparines de bas
poids
moléculaire, de mélanges de chaînes polysaccharidiques.
Dans ce qui suit, des exemples de synthèse des héparines de bas poids
moléculaire biotinylées selon l'invention et de différents intermédiaires
utiles à leur
obtention sont détaillés à titre d'illustration.
Les abréviations suivantes sont utilisées :
HPLC : "High Performance Liquid Chromatography" ;
SAX : "Strong anion exchange chromatography" ;
LC-MS : "Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy", désignant le couplage
chromatographie liquide - spectroscopie de masse ;
Q.S.P. : "Quantité Suffisante Pour" ;
LC : "Long Chain", correspondant à l'enchaînement 6-amino-hexanoyl ;
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LC-LC : représente deux enchaînements LC et correspond à l'enchaînement
amido-hexanoyl-6-amino-hexanoyl ;
Sulfo-NHS : sel de sodium de l'ester 3-suifo-succinimidyl ;
Héparinase 1: enzyme héparine lyase I(EC 4.2.2.7) de Flavobacterium
heparinum.
La figure 1 illustre le suivi réactionnel par HPLC SAX de la transformation de
l'enoxaparine selon l'exemple 1.
Les figures 2, 3 et 4 illustrent les analyses par HPLC SAX des fractions
biotinylées
et non biotinylées obtenues après passage sur une colonne d'avidine
monomérique supportée des produit obtenus selon les exemples 1, 2 et 3,
respectivement.
Exemple 1: Enoxaparine NH LC Biotinoyl
L'enoxaparine est une héparine de bas poids moléculaire obtenue selon le
procédé décrit dans le brevet US RE38,743. Elle est convertie en dérivé
biotinylé
selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma 2: l'enoxaparine est
transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 1 présentant
une
fonction amino sur son extrémité réductrice, puis ce dérivé est converti en
composé biotinylé 2 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de
3-suifosuccinmidyl, sel de sodium.
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Schéma 2
OX OSONa OX OSO,Na
Na00C COONa NaOOC COONa
~ o 0 o NH4CI / NaBH3CN t o 0 0 OH O% OH OH OH OX OH OH NH
x
OSO. NHY OX NHY OSO,N NHY O% NHY
n o
X= H or SO.Na X= H or SO3Na
Y = SO3Na, COCH3 Y= SO3Na, COCH3
Enoxaparine sodique Composé 1
SuIFoNHSLCBiotin
NaHCO3
OH
N
/>5
H
N
O
OX OSONa
NaOOC COONa
O O O OH
OH OX OH OH
OSO~Na NHY OX NHY
X = H or SO3Na
Y = SO~Na, COCH3
Composé 2
1.1: Enoxaparine 1- amino
1 g d'enoxaparine est mis en solution dans 40 ml d'une solution aqueuse 5 M de
chlorure d'ammonium. 1 g de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la
solution obtenue. Le mélange est porté à 60 C pendant 24 heures. La solution
est
ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (Q.S.P. 100 ml). Le
filtrat obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On
obtient 824 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 82%. Le
produit est contrôlé par HPLC SAX (voir figure 1) et engagé tel que dans
l'étape de
biotinylation.
1.2: Enoxaparine NH LC Biotinoyl
A une température voisine de 20 C, 200 mg d'enoxaparine 1-amino sont mis en
solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 136 mg de
Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est
agitée à
une température proche de 20 C pendant 1 heure. La suspension obtenue est
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diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 136 mg de
Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 18
heures. 136 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange
réactionnel est agité pendant 1 heure. 70 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont
ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 3 heures. Le
milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 200 ml), filtré sur
membrane
0,45 pm, puis déssalé sur une colonne de Séphadex G10. La fraction obtenue est
injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis
avec un
gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est déssalée sur une
colonne de Séphadex G10. Le produit obtenu est de nouveau purifié par passage
sur une colonne de Q-Sépharose et dessalage sur Séphadex G10. La fraction
finale récoltée est lyophilisée. On obtient 190 mg d'un lyophilisat blanc. Le
rendement observé est de 87%.
Spectre RMN 'H du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25 C, ô en ppm) :
entre 1,3 et 1,8 (12H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (2CH2CO biotine, m), 2,80
(1H, d,
12Hz), 3,03 (1H, dd, 12 et 5Hz), entre 3,15 et 5,65 (protons polysaccharides),
5,99
(1 H, d, 4Hz).
Le produit obtenu est contrôlé par HPLC SAX : la figure 1 (dessin 1/4)
illustre le
suivi réactionnel par HPLC SAX de la transformation de l'enoxaparine par une
réaction d'amination réductrice en dérivé 1 présentant une fonction amino sur
son
extrémité réductrice (cf. schéma 2). Ce dérivé est ensuite converti en dérivé
biotinylé 2 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-
sulfosuccinmidyl, sel
de sodium. La méthode d'analyse employée est décrite dans la demande de
brevet WO 2004/027087. La figure 1 montre que les espèces présentant une
glucosamine fonctionnalisable sont transformées en dérivé présentant une
fonction
amino sur leur extrémité réductrice avec un taux de conversion supérieur à 90%
pour fournir l'enoxaparine 1-amino. La figure 1 montre également que les
espèces
présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées
en
dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de
3-sulfosuccinimidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90%
pour fournir l'enoxaparine NH LC biotinoyl.
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A titre d'exemple, la figure 1 indique les pics correspondant aux principaux
composés présents dans les mélanges oligosaccharidiques obtenus selon
l'exemple 1, dont la structure est représentée ci-après (la nomenclature
utilisée
correspond à celle de la demande de brevet WO 2004/027087).
L'analyse LC-MS permet de confirmer la structure de ces composés par les
spectres de masse correspondants aux produits sous forme acide : AISISId M/Z
= 1154 AISISIdISId m/z = 1731 ; AISISIdISIdISid m/z = 2308 ; OISISld,,6-
anhydro M/Z
= 1056 ; DISISidISld1,6-anhydro m/z = 1633 ; AISISIdISIdISld1,6-anhydro m/z =
2210 ; AISISId
NH2 M/Z = 1155 ; AISIS,dIS,d NH2 M/Z = 1732 ; AISIS,dIS,dlS,d NH2 M/Z = 2309 ;
AISISId
NH LC Biot m/z = 1494 ; DISIs,dlS,d NH LC Biot m/z = 2071 ; DISISIdIsIdlSId NH
LC
Biot m/z = 2648.
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Na OSO,w psO,w OSO,Na
OSO,Ne OSO4
Na00C COONa Na00C COOw COOw
O O
H p O O ~p p ' O p
H H OH OH H OH H ON OH OH
OH rJl/~I/~J/-\
OSO,Na NHSONa OSO,Na OSO,w NHSO,Na OSO,w OSO,Na
NHSO,Na NHSO,Na NHSO,Na
DISISId AIsISIdIsId
p50,w OSO,w OSO,Na OSO,w
Nappp COOw COOw COOw
/ O O ~p p O p O O
OH H -J~/O~H I/J~ OH OH OH OH OH OH
OSO,w NHSO,Na OSp,w OSO,Na OSO,w
NHSp,w NHSO,w NHSO,Na
DISIsIdISIdISId
OSONa 0=0w oSO,w
wooc COOw p wooC cooNa COONa o
OHO O O O O p O O
H OH OH OH H OH pH OH OH
OSO,w NHSOw OSO,Na O~~ NHSO,w OSO,w NHSO,Na OSO,w NHSOw
NHSO,Nz
àISISId1,6anhydiu àISISltlISldl,6anhytlro
050,w OSO,w OSO,Na
Na00C C_OOw COOw COONa p
O O p p O p O O
OH H OH OH OH H OH OH
OSO,N NHSO,Na OSO,w OSO,w OSO,w
NHSO,w NHSO,Na NHSO,Na
DISISId ISIdI SId1,6anhydiv
OSpw OSO,w OSO,Na OSO,Na OSO,Na
Na00C COOw NappC COOw COOw
O O O OH O O O O 0 OH
H OH OH NH, tr~~
H
OH OH OH OH OH NH,
OSO,Na NHSO,Na OSO,Na NHSO,Na OSO,w NHSO,w OSO,w NHSO,w OSO,Na
NHSO Na
4lslsidNH2 AIsIsidlsIdNH2
OSO,Na pSO,Na p5p,w OSO,Na
NaOpC COOw COONa COOw
/HO O O O O O p OH
H OH OH OH OH OH OH NH,
OSO,w NHSO,w OSO,w NI{SO,Na OSO,w NHSO,Na OSO,Na NHSO,w
eISISIdIS,dIS,dNHZ 0
>--N
HN ,,H
H
5
OSO,w OSp,w H
NapOC COOw N
tr O O O pH O
H H OH N
H p
OSO,Na NHSO,w OSO,w NHSO,w
4ISIsidNH LC Biot
HN ".H
H
S
NaOpC OSO,Na OSO,Na ÇOONa OSO,w NÇOOw
O O O p O OH
OH H OH OH OH OH N O
O O
~O,w NHSO,w OSO,Na NHSO,Na O~'w NHSO,Na ~N
HN ,H
4IsIsidlsidNH LC Biot H""
S
OSO,Na OSO,w OSO,Na OSO,w N
NaOOC ÇOOw ÇOONe ÇOOw
O O O p 0 O O OH O
tr~~ H OH pH OH OH OH OH N
H p
OSO,w NHSO,Na OSO,w NHSONa OSO,Na NHSOw OSO,Na NHSO,Na
àIslsidlsidlSidNH LC Biot
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Par ailleurs, le produit obtenu selon l'exemple 1 peut être injecté sur une
colonne
d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions
décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à
l'avidine) et
non biotinylées (non affines à l'avidine) ainsi obtenues sont ensuite
injectées sur
HPLC SAX (voir figure 2, dessin 2/4) : la figure 2 illustre l'analyse HPLC SAX
des
fractions biotinylées et non biotinylées obtenues après passage sur la colonne
d'avidine monomérique supportée. La figure 2 montre que les espèces présentant
une glucosamine fonctionnalisable ont été converties en espèces biotinylées
correspondantes avec un taux de conversation supérieur à 90%. La fraction non
affine est constituée principalement des dérivés 1,6-anhydro qui, de par leur
nature, ne peuvent pas être convertis en dérivés biotinylés. Les structures de
certains des pics majoritaires sont fournies à titre d'exemple pour
caractériser le
produit obtenu (cf. structures illustrées précédemment).
Exemple 2: Enoxaparine NH Biotinoyl
L'enoxaparine, héparine de bas poids moléculaire obtenue selon le procédé
décrit
dans le brevet US RE38,743, est convertie en dérivé biotinylé selon la
séquence
réactionnelle décrite dans le schéma 3: l'enoxaparine est transformée par une
réaction d'amination réductrice en composé 1 présentant une fonction amino sur
son extrémité réductrice, puis ce dérivé est converti en composé biotinylé 3
par
réaction avec l'ester de biotinoyl-3-sulfosuccinimidyl, sel de sodium
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Schéma 3
OX OSONa Na00C OX COONa
NaOOC COONa OSOzNa
O o p NH4CI / NaBH3CN o o O OH
OH rq pX OH rq OH OH OH OX OH OH NH
z
OSO, NHY oX NHY OSOz NHY OX NHY
n
X= H or SO3Na X= H or SO3Na
Y = SO3Na, COCH3 Y So3Na, COCH3
Enoxaparine sodique Composé 1
SuIFoNHSBiotin
NaHCO,
OX OSOzNa O
Na00C COONa x
HN H
O O O OH OH OX HmH
OH OH S
OSO3Na NHY OX NHY p
n
X = H or SO3Na
Y = SO3Na, COCH3
Composé 3
A une température voisine de 20 C, 200 mg d'enoxaparine 1-amino sont mis en
solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 107 mg de
Sulfo-NHS-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à
une
température proche de 20 C pendant 1 heure 30. La suspension obtenue est
diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 107 mg de
Sulfo-NHS- Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 3
heures.
Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 150 ml), filtré sur
membrane
0,45 Nm, puis est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué
à
l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée
est
déssalée sur une colonne de Séphadex G10 La fraction récoltée est lyophilisée.
On obtient 190 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est d'environ
90%.
Le produit obtenu est contrôlé par HPLC SAX (voir figure 3, dessin 3/4, graphe
Global ) et l'on confirme que les espèces présentant une fonction amino sur
leur
extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec
l'ester
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de biotinoyl-3-sulfo-succinimidyl, sel de sodium, avec un taux de conversion
supérieur à 90%.
Spectre RMN 'H du mélange d'oligosaccharides dans D20 (25 C, S en ppm) :
entre 1,4 et 1,8 (6H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,3 (CH2CO biotine, m), 2,80 (1H,
dd, 12
et 7Hz), 3,03 (1 H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1
H, d,
4Hz).
Le produit obtenu selon l'exemple 2 est injecté sur une colonne d'avidine
monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites
par le
fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non
biotinylées
(non affines à l'avidine) obtenues sont ensuite injectées sur HPLC SAX (voir
figure
3, dessin 3/4). La fraction non affine est constituée principalement des
dérivés 1,6-
anhydro qui, de par leur nature, ne peuvent pas être convertis en dérivés
biotinylés.
A titre d'exemples, la figure 3 décrit la structure de certains composés
principaux
du mélange oligosaccharidiques. Les structures référencées sont représentées
ci-après.
L'analyse LC-Ms permet de confirmer la structure de ces composés par les
spectres de masse correspondants aux produits sous forme d'acide : Dlsls,d,,s-
anhydro m/z = 1056 ; DISISIdISld1,6-anhydro m/z = 1633 ; DISISIdISIdISld1,6-
anhydro m/z = 2210 ;
AISIS,d NH Biot m/z = 1381 ; Dlsls,dls,d NH Biot m/z = 1958 ; AIsls,dls,dls,d
NH Biot
m/z = 2535.
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OSO'Na OSO~Na OSO3Na
NaO0C COONa p NaOOC COONa ÇOONa p
O O O p O O
O p
âH O H O OH OH OH OH OH OH OH OH
OSO~Na NHSO,Na OSO~Na OSO,Na NHSO,Na OSO3Na OSONa
NHSO~Na NHSO~Na NHSO,Na
AI S I SId1,6anhydro AI S I SId I S 1d1,6anhydro
OSO~Na OSO3Na OSO.Na
NaOOC COONa COONa COONa
O O O O O O O O
OH H OH OH OH OH OH OH
OSO3Na NHSpma OSO~Na OSONa OSO~Na
NHSO~Na NHSONa NHSO.Na
àISISldISIdISldl,6anhydro
O\\
%- N
HN ,. H
OSO3Na OSOINa H"^
Na00C COONa
= S
O O O OH
OH pH OH OH H
O
OSO,Na NHSO.Na OSO,Na
NHSO,Na
DISISidNH Biot
0
~-N
HN H
OSO~Na OSO~Na OSO3Na H""
NaOOC COONa COONa S
O O O p O OH
OH OH OH OH OH OH H
O
OSO,Na NHSONa OSOma NHSO.Na OSO3Na NHSO.Na
4ISISidISidNH Biot
0
~-N
HN ,,H
OSO~Wa OSO~Na <03Na OSO'Na H~~~=
NaOOC COONa COONa COONa
S
O O O p O O OH
OH H OH OH OH OH OH OH H
O
OSO.Na NHSO,Na OSO~Na NHSO,Na OSONa NHSO,Na OSO.Na NHSO~Na
AISISldISldISidNH Biot
Exemple 3: Enoxaparine NH-LC-LC Biotinoyl
L'enoxaparine, héparine de bas poids moléculaire obtenue selon le procédé
décrit
dans le brevet US RE38,743, peut également être convertie en dérivé biotinylé
selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma 4: l'enoxaparine est
transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 1 présentant
une
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fonction amino sur son extrémité réductrice, puis ce dérivé est converti en
composé biotinylé 4 par réaction avec l'ester de 6-biotinamidohexanoyl
hexanoate
de 3-sulfo-succinimidyl, sel de sodium.
Schéma 4
5
NaOOC ox COONa OSO.Na NaOOC ox COONa OSO"a
o o NH4C1 / NaBH3CN o 0 0 oH
OH OX OH OH H OH OX
t0- pH NHz
OSO'Na NHY OX NHY O30 NF{Y ox
n ~ NHY
X= H or SO3Na X= H or SO3Na
Y = SO,Na, COCH~ Y SO3Na, COCH3
Enoxaparine sodique Composé 1
Su1FoNHS-LC-LC-Biotin
NaHC03
ox OSO,Na
Na00C COONa x
O O p HN H
H Q H.aH
OH X OH OH C N,7~ N
II H S
OSO~Na NHY OX NHY O
n
X=HorSO,Na
Y = SO3Na, COCH3
Composé 4
A une température voisine de 20 C, 200 mg d'enoxaparine 1-amino sont mis en
solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 164 mg de
10 Sulfo-NHS-LC-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est
agitée
à une température proche de 20 C pendant 2 heures. La suspension obtenue est
diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 164 mg de
Sulfo-NHS-LC-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 5
heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 150 ml), filtré
sur
15 membrane 0,45 pm, puis est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le
produit
est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction
récoltée est déssalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction récoltée
est
lyophilisée. On obtient 210 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé
est
d'environ 92%.
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Le produit obtenu est contrôlé par HPLC SAX (voir figure 4, dessin 4/4, graphe
Global ) et l'on confirme que les espèces présentant une fonction amino sur
leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction
avec le
6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfo-succinimidyl, sel de sodium avec un
taux de conversion supérieur à 90%.
Spectre RMN 'H du mélange d'oligosaccharides dans D20 (25 C, S en ppm) :
entre 1,3 et 1,8 (16H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (6H, m), 2,80 (1H, dd, 12 et
7Hz),
3,03 (1 H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1 H, d,
4Hz).
Le produit obtenu selon l'exemple 3 est injecté sur une colonne d'avidine
monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites
par le
fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non
biotinylées
(non affines à l'avidine) obtenues sont ensuite injectées sur HPLC SAX (voir
figure 4). La fraction non affine est constituée principalement des dérivés
1,6-
anhydro qui, de par leur nature, ne peuvent pas être convertis en dérivés
biotinylés.
La structure des composés principaux est confirmée par un couplage LC-MS.
A titre d'exemple, la figure 4 décrit la structure de certains composés
principaux du
mélange oligosaccharidiques. Les structures référencées sont représentées
ci-après.
L'analyse LC-MS permet de confirmer la structure des composés ci-dessus par
les
spectres de masse correspondants aux produits sous forme d'acide : AIsls,d,,s_
anhydro m/Z = 1056 ; DISISIdISld1,6-anhydro m/z = 1633 ; DISISIdISIdISId1,6-
anhydro m/z = 2210 ;
AISIs,d NH LC LC Biot m/z = 1607 ; 4ISIs,dlS,d NH LC LC Biot m/z = 2184
DISIs,dls,dls,d NH LC LC Biot m/z = 2761.
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OSO,Na OSONa OSO,Na
NaOOC COONa p NaOOC COONa COONa p
O O O\^ O O O O p O
OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH
OSO,Na NHSO~Na O'O'Ne OSO~Na NHSO.Na OSO.Na NHSO,Na OSO,Na
NHSO~Na NHSO,Na
DISISId1,6anhydro àISISIdISldl,6anhydro
050,Na OSO~Na OSO,Na
NaOOC COONa COONa COONa
OH O O p O p O O
H OH OH OH OH OH OH
OSO~Na NHSO~Na OSO,Na NHSO,Na OSO'Na NHSO~Na OSO~Na
NHSO,Na
AI$I$ I$ IS p
Id Id Id1,6anhydro ~1-N
MN H
H
S
H
N
O
OSO,Na OSO~Na H
NaOOC COONa p O OH O
OH OH OH OH N
H O
OSOma NHSO~Na OSO,Na 2NHSO,Na
AIsIsIdNH LC LC Biot
0\\
%N
HN H
H
S
N
OSOma O50~Na OSO~Na p
NaOOC COONa COONa H
~ ~FOn, / OHO _/~VOH-I(/ OH O OH p O OH O
N
O
OSO~Na NHSO,Na OSO,Na NHSO,Na OSONa NHSO,Na
4IsIsIalsIdNH LC LC Biot
0
H
N
HN H
H"
S
H
N
OSO,Na p3p.Na OSO.Na OSO~Na H
Na00C COONa COONa COONa _7fJ
- ~=N
O O O O O p OH ~ O
O
OH OH OH OH OH OH OH OH N
OSO~Na NHSO,Na OSO~Na O~~ NHSO.Na OSO,Na NHSO
NHSO~Na >Na
41sIsIdIsIdIsIdNH LC LC Biot
Exemple 4: Tinzaparine NH LC Biotinoyl
La tinzaparine, héparine de bas poids moléculaire d'environ 6000 Daltons
obtenue
par traitement avec l'héparinase 1, peut également être convertie en dérivé
biotinylé selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma 5: la
tinzaparine
est transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 5
présentant
une fonction amino sur son extrémité réductrice, puis ce dérivé est converti
en
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composé biotinylé 6 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de
3-sulfosuccinimidyl, sel de sodium.
Schéma 5
OX OSONa Na00C OX COONa
Na00C COONa OSONa
o NH4CI / NaBH3CN o 0 o OH
H X OH rl- OH t-- OX OH H NH=
OSO'N NHY X NHY OSO~Na NHY X NF.Y
a
X= H or SO~Na X= H or SO,Na Y = SO,Na, COCH, Y= SO.Na, COCH3
Tinzaparine Composé 5
Su1FoNHSLCBiotin
NaHCO3
OyN
/ ki
HN
H S
H
N
OX OSONa
NaOOC COONa O
O O OH
OH X OH OH H
OSO,Na NHY X NHY
X = H or SO3Na
Y = SONa, COCH,
Composé 6
4.1 Tinzaparine 1- amino
250 mg de tinzaparine sont mis en solution dans 10 ml d'une solution aqueuse 5
M
de chlorure d'ammonium. 250 mg de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à
la solution obtenue. Le mélange est porté à 70 C pendant 20 heures. La
solution
est ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (Q.S.P. 20 ml).
Le
filtrat obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On
obtient 215 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 86%.
Spectre RMN'H du mélange d'oligosaccharides dans D20 (25 C, S en ppm) : 2,05
(CH3CO, s), 3,10 et 3,40 (1H chacun, m, CH2NH2), entre 3,20 et 5,65 (protons
polysaccharides), 5,98 (1 H, d, 4Hz).
Le composé peut être contrôlé par HPLC SAX, en utilisant la méthode exposée
précédemment dans l'exemple 1.
Le produit est engagé tel que dans l'étape de biotinylation.
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4.2: Tinzaparine NH LC Biotinoyl
A une température voisine de 20 C, 100 mg de tinzaparine 1-amino sont mis en
solution dans 2,5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbônate de sodium. 47 mg
de
Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est
agitée à
une température proche de 20 C pendant 1 heure 45 minutes. La suspension
obtenue est diluée par 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium.
47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité
pendant 6 heures. 47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le
mélange réactionnel est agité pendant 20 heures. La suspension est encore
diluée
par 1 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium et 47 mg de Sulfo-
NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau. Le mélange réactionnel est agité
pendant 20 heures. La suspension est de nouveau diluée par 6,5 ml de solution
0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium et 47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont
ajoutés de nouveau. Le mélange réactionnel est agité pendant 22 heures puis
est
dilué à l'eau (Q.S.P. 100 ml), filtré sur membrane 0,45 pm, est injecté sur
une
colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en
perchlorate de sodium. La fraction récoltée est déssalée sur une colonne de
Séphadex G10. La fraction finale récoltée est lyophilisée. On obtient 110 mg
d'un
lyophilisat blanc. Le rendement observé est quantitatif.
Spectre RMN 'H du mélange d'oligosaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm) :
entre 1,3 et 1,8 (12H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (4H, m), 2,80 (1H, dd, 12 et
7Hz),
3,03 (1 H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1 H, d,
4Hz).
Les composés tinzaparine 1-amino et tinzaparine NH LC Biotinoyl obtenus
peuvent
également être caractérisés par les méthodes HPLC SAX précédemment utilisées
dans l'exemple 1. Ce contrôle HPLC montre que les espèces présentant une
glucosamine fonctionnalisable sont transformées en dérivé présentant une
fonction
amino sur leur extrémité réductrice avec un taux de conversion supérieur à 90%
pour fournir la tinzaparine 1-amino. Il montre également que les espèces
présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées
en
dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-
sulfosuccinimidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90%
pour
fournir la tinzaparine NH LC Biotinoyl.
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WO 2008/113919 PCT/FR2008/000173
De la même façon que dans l'exemple 1, les structures des composés principaux
peuvent être confirmées par analyse LC-MS.
Le produit obtenu peut également être injecté sur une colonne d'avidine
monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites
par le
5 fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non
biotinylées
(non affines à l'avidine) obtenues peuvent être contrôlées par HPLC SAX.
Exemple 5: Bémiparine NH LC Biotinoyl
10 La bémiparine, héparine de bas poids moléculaire d'environ 3500 Daltons
obtenue
par dépolymérisation alcaline, peut également être convertie en dérivé
biotinylé
selon la séquence réactionnelle décrit dans le schéma suivant 6: la bémiparine
est
transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 7 présentant
une
fonction amino sur son extrémité réductrice, puis ce dérivé est converti en
15 composé biotinylé 8 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfo-
succinimidyl, sel de sodium.
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Schéma 6
OX OSONa OX OSON
NaOOC COONa NaOOC COONa
o 0 o O NH4CI / NaBH3CN o 0 o OH
OH fLX OH OH OH oH OX
OH OH N
OSO~Na NHY OX NHY OSO~N NHY OX NHY
n
X= H or SO3Na X= H or SO3Na
Y= SO.Na, COCH~ Y= SO3Na, COCH3
Bémiparine Composé 7
SuIFoNHSLCBiotiu
NaHCO3
Fi
O~-N
HN
H S
H
N
O
OX OSO,Na
NaOOC COONa 0
O O OH
OH OH
X OH N
H
OSO,N NHY OX NHY
a
X = H or SO3Na
Y = SO.Na, COCH,
Composé 8
5.1 : Bémiparine 1-amino:
250 mg de bémiparine sont mis en solution dans 10 ml d'une solution aqueuse 5
M
de chlorure d'ammonium. 250 mg de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à
la solution obtenue. Le mélange est porté à 70 C pendant 20 heures. La
solution
est ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (Q.S.P. 20 ml).
La
solution obtenue est déssalée sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé.
On obtient 227 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 91%.
Spectre RMN'H du mélange d'oligosaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm) : 2,05
(CH3CO, s), 3,10 et 3,40 (1H chacun, m, CH2NH2), entre 3,20 et 5,80 (protons
polysaccharides), 5,98 (1 H, d, 4Hz).
Le composé peut être contrôlé par HPLC SAX, en utilisant la méthode exposée
précédemment dans l'exemple 1.
Le produit obtenu est engagé tel que dans l'étape de biotinylation.
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5.2: Bémiparine NH LC Biotinoyl :
A une température voisine de 20 C, 100 mg de bémiparine 1-amino sont mis en
solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 80 mg de
Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est
agitée à
une température proche de 20 C pendant 2 heures. La suspension obtenue est
diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 80 mg de
Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 2
heures. 40 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange
réactionnel est agité pendant 20 heures. Le milieu réactionnel obtenu est
dilué à
l'eau (Q.S.P. 50 ml) puis déssalé sur une colonne de Séphadex G10. La fraction
obtenue est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à
l'eau,
puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est
déssalée
sur une colonne de Séphadex G10. Le produit obtenu est de nouveau purifié par
passage sur une colonne de Q-Sépharose et dessalé sur Séphadex G10. La
fraction finale récoltée est lyophilisée. On obtient 101 mg d'un lyophilisat
blanc. Le
rendement observé est de 92%.
Spectre RMN 'H du mélange d'oligosaccharides dans D20 (25 C, â en ppm) :
entre 1,3 et 1,8 (12H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (4H, m), 2,80 (1H, dd, 12 et
7Hz),
3,03 (1 H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1 H, d,
4Hz).
Les composés bémiparine 1-amino et bémiparine NH LC Biotinoyl obtenus
peuvent également être caractérisés par les méthodes HPLC SAX précédemment
utilisées dans l'exemple 1. Ce contrôle HPLC montre que les espèces présentant
une glucosamine fonctionnalisable sont transformées en dérivé présentant une
fonction amino sur leur extrémité réductrice avec un taux de conversion
supérieur
à 90% pour fournir la bémiparine 1-amino. Il montre également que les espèces
présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées
en
dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de
3-sulfosuccinimidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90%
pour fournir la bémiparine NH LC biotinoyl.
De la même façon que dans l'exemple 1, les structures des composés principaux
peuvent être confirmées par analyse LC-MS.
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Le produit obtenu peut également être injecté sur une colonne d'avidine
monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites
par le
fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non
biotinylées
(non affines à l'avidine) obtenues peuvent être contrôlées par HPLC SAX.
Les composés selon l'invention ont fait l'objet d'études biochimiques et
pharmacologiques.
1. Mesure de l'activité anti-facteur Ila et de l'activité anti-facteur Xa
L'activité anti-facteur Ila (anti-Flla) et l'activité anti-facteur Xa (anti-
FXa) dans le
plasma humain ou un système tampon sont analysés par méthode
chromogènique : l'activité anti-facteur Ila est testée au moyen du kit d'anti-
facteur
Ila d'héparine d'Actichrome (American diagnostica) contenant le substrat
chromogène S-2238, l'a-thrombine et l'ATIII humain (antithrombine III).
L'activité
anti-FXa est déterminée avec l'instrument automatisé de coagulation ACL 7000
(Instrumentation Laboratory) employant le kit Héparine (Instrumentation
Laboratory) contenant de l'ATIII, le facteur Xa et le substrat chromogène S-
2765.
Les deux analyses sont réalisées selon les instructions du fabricant.
Les standards suivants sont employés pour établir une courbe d'étalonnage
standard pour mesurer l'activité in vitro des fractions d'héparines de bas
poids
moléculaire biotinylées dans le plasma humain et le système tampon :
- 1er standard international pour les héparines de bas poids moléculaire
(National
Institute for Biological Standards and Control, Londres, R-U, établi en 1987,
code
n 85/600),
- 2ème standard intemational pour les héparines de bas poids moléculaire
(National Institute for Biological Standards and Control, Londres, R-U, établi
en
1987, code n 01/608, utilisé depuis juin 2006)
- l'enoxaparine (Clexane , sanofi-aventis, France) a été employé comme
référence interne.
Pour les déterminations d'activité anti-Flla, 10 NI d'échantillon ou de
standards
internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués au 1:16 avec
l'antithrombine dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI
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0,05 M, NaCI 0,154M, à pH 7,4. 10 NI de cette solution sont ajoutés dans une
plaque 96 puits microtitre. La mesure est reproduite en triple (sur 3 puits).
La
plaque microtitre est maintenue à 37 C en agitant à 300 t/min. 40 pI de
thrombine
sont ajoutés à chacun des puits et incubés pendant exactement 2 mn. 40 pI de
Spectrozyme sont ajoutés. Après 90 secondes, la réaction est arrêtée par ajout
de
40 NI d'acide acétique. L'absorption est mesurée à 405 nm en utilisant un
SpectraMax 340 (Molecular devices).
Pour des mesures d'activité anti-FXa, l'échantillon ou les standards
intemationaux
des héparines de bas poids moléculaire sont dilués dans le plasma humain ou le
système tampon contenant Tris HCI 0,05 M, NaCI 0,154M, pH 7,4. Les
échantillons contenant les héparinoïdes dans le plasma ou le tampon sont
encore
dilués au 1:20 avec un tampon de travail contenant I'ATIII, et placés en
double
dans le rotor de sondage. Le réactif facteur Xa et le substrat chromogène sont
versés dans les réservoirs indiqués de l'instrument automatisé de coagulation
ACL
7000.
La mesure de l'activité anti-FXa est réalisée avec le protocole "héparine"
intégrée
dans le logiciel de I'ACL 7000. Pendant l'analyse, 50 NI de l'échantillon
(dilué avec
le tampon de travail) sont mélangés à 50 NI du réactif facteur Xa. Après un
temps
d'incubation de 60 secondes à 37 C, 50 NI de substrat chromogène de
concentration 1,1 mM sont ajoutés et les changements de l'absorption en
fonction
du temps sont mesurés à la longueur d'onde de 405 nM.
Les résultats obtenus sont décrits notamment dans le tableau 1.
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Tableau 1
MM Activité anti-Fxa Activité anti-Flla
(Da) (UI / mg) (UI / mg)
mesurée corrigée mesurée corrigée
Enoxaparine 4100 121 121 28 28
Enoxaparine 1-
4100 116 116 26,5 26,5
amino
Enoxaparine NH LC
4441 101 109 21 22,7
Biotinoyl
Enoxaparine NH
4328 98 103 29 31
Biotinoyl
Enoxaparine NH LC
4653 82 93 24 27
LC Biotinoyl
Tinzaparine 6000 108 108 79 79
Tinzaparine 1-amino 6000 113 113 80 80
Tinzaparine NH LC
6341 106 112 63 67
Biotinoyl
Bémiparine 3500 138 138 17 17
Bémiparine 1-amino 3500 101 101 16 16
Bémiparine NH LC
3841 93 102 13 14
Biotinoyl
Dans ce tableau, MM désigne la masse molaire moyenne (en Daltons) et
l'activité
5 corrigée permet de corriger, dans la mesure, l'effet de dilution
massique.
L'activité corrigée est calculée comme suit :
Activité corrigée = (Activité mesurée x MM composé préparé) / MM produit
de départ,
avec :
10 MM composé préparé : masse molaire moyenne théorique du composé préparé,
MM produit de départ: masse molaire moyenne de l'héparine de bas poids
moléculaire de départ.
Ces résultats montrent que les héparines de bas poids moléculaire biotinylées
15 selon l'invention conservent des activités anti-facteur Xa et anti-facteur
Ila
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comparables à celles des héparines de bas poids moléculaire natives. La
conservation de ces propriétés biologiques les rend donc utilisables en
thérapeutique.
2. Mesure de l'activité anti-FXa après neutralisation par l'avidine
Neutralisation de l'effet de produits biotinyiés par l'avidine en solution
L'activité anti-FXa ou anti-Flla antithrombine dépendante des produits est
mesurée
en présence de concentration croissante d'avidine afin de mesurer l'effet de
la
liaison de l'avidine à la biotine du produit sur cette activité.
Les produits à étudier sont mis en solution à 1 mg/ml dans eau à 0,9% NaCI. On
dilue ensuite les produits de façon à obtenir une concentration de produit
capable
d'inhiber 50 % de l'activité du facteur Xa (Factor Xa, chromogenix Milan,
Italie), ou
du facteur Ila (Factor Ila, laboratoire du sang, Strasbourg) en présence
d'antithrombine (Antithrombine humaine Milan, Italie). On mesure ensuite cette
inhibition en présence de concentration décroissante d'avidine (Avidine SIGMA
du
blanc d'oeuf, Ref A-9275, à diluer dans NaCI) :300, 30, 3, 0.3, 0.03, 0.003, 0
Ng/mi.
Le dosage de l'activité résiduelle du facteur Xa (ou facteur Ila) se fait en
ajoutant
un substrat chromogène spécifique ; S2222 (Chromogenix, Milan, Italie) pour le
facteur Xa, le substrat S2238 (Chromogenix, Milan, Italie) pour le facteur
Ila. La
lecture de la densité optique se fait à 405 nm.
Mise en évidence de la liaison des produits biotinylés à l'avidine liée à des
billes en
tampon
Afin d'évaluer la capacité des produits à lier l'avidine, les produits sont
mis en
présence d'avidine liée à des billes. Après centrifugation du mélange
l'activité anti-
FXa ou anti-Flla est déterminée dans le surnageant. Cette activité permet de
déterminer la concentration restante dans le milieu et ainsi de déterminer la
partie
de produit piégée dans le culot après centrifugation du mélange.
Les produits à étudier sont mis en solution à 1 mg/ml dans une solution NaCI
0,9%. Les produits sont dilués de façon à pouvoir inhiber 80 % de l'activité
anti-
FXa ou anti-Flla présent dans le test. La solution de billes est amenée à 1
mg/mL
en la diluant avec le tampon de lavage tris Maléate 20 mM, NaCi 150 mM, pH
7,35. La solution est bien agitée et 100 pI de la solution contenant les
billes
(1 mg/ml) sont placés dans un tube Eppendorf. On ajoute 500 NI de tampon. Les
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tubes sont centrifugés à 12000 t/mn pendant 5mn. Après élimination du
surnageant le culot est repris dans 500 pm de tampon. Après agitation une
deuxième centrifugation est pratiquée et le surnageant est à nouveau éliminé.
Les
solutions de produit sont alors mises en présence de différentes solutions
contenant les billes de façon à avoir les ratio produit/billes exprimés en pg
produit/pg avidine (Avidine SIGMA Ref A-9275, solution à environ3mg/ml selon
le
lot) de 1, 0.1, 0.01 et 0.001. Les mélanges sont ensuite agités et laissé au
repos
pendant 1 heure avant une centrifugation à 12000 t/mn pendant 5 minutes. Le
surnageant est alors repris pour doser l'activité anti-FXa afin de déterminer
la
concentration de produit restant dans le surnageant. Le dosage de l'activité
anti-
FXa ou anti-Flla se fait en suivant une méthode modifiée de celle décrite par
Teien
A.N et Lie M., Thrombosis Research, 1977, 10, 399-410. Les résultats obtenus
sont décrits notamment dans le tableau 2.
Tableau 2
Activité anti-FXa
Quantité d'avidine (pg) résiduelle
Enoxaparine NH LC o
0,034 19%
Biotinoyl
Enoxaparine NH Biotinoyl 0,0245 19%
Enoxaparine NH LC LC o
0,0276 13%
Biotinoyl
Il apparaît ainsi que les héparines de bas poids moléculaire ont bien été
fonctionnalisées par la biotine, avec un taux de biotinylation supérieur à 80%
et
sont bien aptes à être neutralisées par l'avidine.
Les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la présente invention
peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments. Elles peuvent
notamment être utilisées comme médicaments anti-thrombotiques. Ainsi, selon un
autre de ses aspects, l'invention a pour objet des médicaments qui comprennent
une héparine de bas poids moléculaire biotinylée telle que définie ci-avant.
Ces
médicaments trouvent leur emploi en thérapeutique, en particulier dans le
traitement et la prévention des thromboses veineuses, des accidents
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thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde ou
d'angor instable, des thromboses artérielles périphériques, telles que les
arthériopathies des membres inférieurs, des thromboses artérielles cérébrales
et
des accidents vasculaires cérébraux. Ils sont également utiles dans la
prévention
et le traitement de la prolifération des cellules musculaires lisses, de
l'angiogénèse,
et comme agents neuroprotecteurs de l'athérosclérose et de l'artériosclérose.
La présente invention, selon un autre de ses aspects, concerne également une
méthode de traitement des pathologies sus-mentionnées qui comprend
l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'un composé selon
l'invention,
ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. L'utilisation des héparines
de
bas poids moléculaire biotinylées telles que définies précédemment pour le
traitement et la prévention des pathologies sus-mentionnées fait donc partie
de
l'invention, ainsi que l'utilisation desdites héparines de bas poids
moléculaire
biotinylées pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou à
prévenir ces
pathologies.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une
composition
pharmaceutique conprenant, en tant que principe actif, une héparine de bas
poids
moléculaire biotinylée selon l'invention ou un de ses sels pharmaceutiquement
acceptables, ainsi qu'au moins un excipient inerte, pharmaceutiquement
acceptable. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et
le
mode d'administration souhaités, par exemple la voie orale, sublinguale, sous-
cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, transmuqueux, locale
ou
rectale.
Dans chaque unité de dosage, le principe actif est présent dans les quantités
adaptées aux doses joumalières envisagées afin d'obtenir l'effet
prophylactique ou
thérapeutique désiré. Chaque unité de dosage peut contenir de 20 à 150 mg de
principe actif, avantageusement de 40 à 100 mg. Ces doses de composés
anticoagulants peuvent être neutralisées par des doses d'avidine ou de
streptavidine allant de 0,2 g à 2 g en injection intraveineuse, bolus ou
perfusion.
Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus
faibles sont
appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la
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pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le
médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit patient.
Les composés selon l'invention peuvent également être utilisés en association
avec un ou plusieurs autres principes actifs utiles pour la thérapeutique
souhaitée,
tels que des anti-thrombotiques, des anticoagulants ou des antiagrégants
plaquettaires.
La présente invention a également pour objet un procédé mettant en ceuvre
l'avidine ou la streptavidine, caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser
les
héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention. Ainsi,
l'avidine ou
la streptavidine peuvent être utilisés pour la préparation de médicaments
destinés
à neutraliser les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la
présente
invention.
