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ACIDES POLYGLUTAMIQUES FONCTIONNALISES PAR DES
GROUPEMENTS CATIONIQUES ET DES GROUPEMENTS HYDROPHOBES
ET LEURS APPLICATIONS, NOTAMMENT THERAPEUTIQUES
La présente invention concerne des nouveaux matériaux biodégradables à base de
copolyaminoacides, utiles notamment pour la vectorisation de principe(s)
actif(s) (PA).
L'invention vise aussi de nouvelles compositions pharmaceutiques, cosmétiques,
diététiques ou phytosanitaires à base de ces polyaminoacides modifiés. Ces
compositions
peuvent être du type de celles permettant la vectorisation de PA et se
présentant, de
préférence, sous forme d'émulsions, de micelles, de nanoparticules, de
microparticules, de
gels, d'implants ou de films.
Les PA considérés sont, avantageusement, des composés biologiquement actifs et
qui
peuvent être administrés à un organisme animal ou humain par voie orale,
parentérale,
nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire,
intradermique,
intrapéritonéale, intracérébrale, buccale, etc.
Les PA plus particulièrement, mais non limitativement, concernés par
l'invention sont des
protéines, des glycoprotéines, des peptides, des polysaccharides, des
lipopolysaccharides,
des oligo ou des polynucléotides, et des molécules organiques. Mais il peut
aussi s'agir de
produits cosmétiques ou de produits phytosanitaires, tels que des herbicides,
des
insecticides, des fongicides, etc.
Dans le domaine de la vectorisation des principes actifs notamment
médicamenteux, il
existe un besoin, dans beaucoup de cas :
= de les protéger contre la dégradation (hydrolyse, digestion enzymatique
etc.),
= et/ou de contrôler leur vitesse de libération afin de maintenir un niveau
thérapeutique sur une durée définie,
= et/ou de les véhiculer (en les protégeant) au site d'action.
A ces fins, plusieurs types de polymères ont été étudiés et certains sont même
disponibles
commercialement. On peut citer, par exemple, les polymères du type
polylactique,
polylactique-glycolique, polyoxyéthylène-oxypropylène, polyaminoacide ou
encore
polysaccharide. Ces polymères constituent des matières premières permettant de
fabriquer,
par exemple, des implants massiques, des microparticules, des nanoparticules,
des
vésicules, des micelles ou des gels. Outre le fait que ces polymères doivent
être adaptés à
la fabrication de tels systèmes, ils doivent également être biocompatibles,
non-toxiques,
non-immunogènes, économiques et ils doivent pouvoir être facilement éliminés
du corps
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et/ou être biodégradables. Sur ce dernier aspect, il est de surcroît essentiel
que la
biodégradation dans l'organisme génère des produits non-toxiques.
A titre d'illustration de l'art antérieur concernant des polymères employés
comme matières
premières pour la réalisation de systèmes de vectorisation de PA, divers
brevets ou
demandes de brevet ou articles scientifiques sont cités ci-après.
Le brevet US-B-4,652,441 décrit des microcapsules de polylactide encapsulant
l'hormone
LH-RH. Ces microcapsules sont produites en préparant une émulsion eau-dans-
huile-dans-
eau et comprennent une couche interne aqueuse contenant l'hormone, une
substance
(gélatine) fixant cette dernière, une couche huileuse de polylactide, ainsi
qu'une couche
externe aqueuse (alcool polyvinylique). La libération du PA peut se faire sur
une période
de plus de deux semaines après injection sous-cutanée.
Le brevet US-B-6,153,193 décrit des compositions à base de micelles de
poly(oxyéthylène)-poly(oxypropylène) amphiphiles, pour la vectorisation
d'anticancéreux
tels que la doxorubicine.
Akiyoshi et al. (J. Controlled Release, 1998, 54, 313-320) décrivent des
pullulanes qui
sont rendus hydrophobes par greffage de cholestérol et qui forment des
nanoparticules
dans l'eau. Ces nanoparticules, aptes à se complexer de manière réversible
avec l'insuline,
forment des suspensions colloïdales stables.
Le brevet US-B-4,351,337 décrit des copolyaminoacides amphiphiles, à base de
leucine et
de glutamate, utilisables sous forme d'implants ou de microparticules pour la
libération
contrôlée de principes actifs. La libération de ces derniers peut se faire sur
une durée très
longue dépendant de la vitesse de dégradation du polymère.
Le brevet US-B-4,888,398 décrit des polymères à base de polyglutamate ou
polyaspartate,
et éventuellement polyleucine, avec des groupements pendants de type
alkyloxycarbonyl-
méthyle, placés de façon aléatoire sur la chaîne polyaminoacide. Ces
polyaminoacides,
greffés par des groupements latéraux e.g. méthoxycarbonylméthyle, sont
utilisables sous
forme d'implants biodégradables contenant un PA à libération prolongée.
Le brevet US-B-5,904,936 décrit des nanoparticules obtenues à partir d'un
polymère bloc
polyleucine-polyglutamate, aptes à former des suspensions colloïdales stables
et capables
de s'associer spontanément avec des protéines biologiquement actives sans les
dénaturer.
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Ces dernières peuvent ensuite être libérées in vivo de manière contrôlée, sur
une longue
période.
Le brevet US-B-5,449,513 décrit des copolymères bloc amphiphiles comprenant un
bloc
polyoxyéthylène et un bloc polyaminoacide, par exemple poly(bêta-benzyl-L-
aspartate).
Ces polymères polyoxyéthylène-polybenzylaspartate forment des micelles qui
sont aptes à
encapsuler des molécules actives hydrophobes telles que la doxorubicine ou
l'indométhacine.
La demande de brevet WO-A-99/61512 décrit des polylysines et des
polyornithines
fonctionnalisées par un groupe hydrophobe (acide palmitique relié à la
polylysine ou
ornithine) et un groupe hydrophile (polyoxyéthylène). Ces polymères, par
exemple la
polylysine greffée avec des chaînes polyoxyéthylène et palmitoyle, forment, en
présence
de cholestérol, des vésicules capables d'encapsuler la doxorubicine ou l'ADN.
Ces
polymères à base de polylysines sont cationiques en milieu physiologique.
La demande de brevet EP-A-963 758 décrit des polyaminoacides fonctionnalisés
par un
groupement cationique. Ces polymères sont capables de former des complexes
avec un
acide nucléique et sont utilisables en thérapie génique. Les groupements
cationiques sont
des dérivés amines qui ne sont pas dérivés des acides aminés et les
polyaminoacides ne
comportent pas de groupements hydrophobes.
Yang et al. (Biotechnology Letters, 2005, 27, 977-982) décrivent des
polyaspartates
fonctionnalisés par des groupements alkyles linéaires et des oligoarginines.
Ces polymères
forment des nanoparticules de 8 à 40 nm dans l'eau et sont capables d'être
internalisés par
des cellules. Il est suggéré que ces particules peuvent être utilisées pour la
vectorisation de
molécules hydrophobes.
Dans le même domaine, la demanderesse a décrit, dans plusieurs demandes de
brevets, des
polymères à base de polyglutamate (anioniques) avec des concepts apparentés.
La demande WO-A-03/104303 décrit des polyaminoacides anioniques
fonctionnalisés par
de l'alpha-tocophérol.
La demande WO-A-2004/013206 décrit des polyaminoacides anioniques comportant
des
groupements hydrophobes et caractérisés en ce que ces groupements sont reliés
au
polymère par l'intermédiaire d'une rotule contenant deux fonctions amides, et
plus
précisément via un espaceur de type lysine ou ornithine.
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La demande WO-A-2004/060968 décrit des polyaminoacides fonctionnalisés par au
moins
un groupement oligoaminoacide à base de leucine et/ou isoleucine et/ou valine
et/ou
phénylalanine.
L'article de W. C. Shen, "Acid-sensitive dissociation between poly(lysine) and
histamine-
modified poly(glutamate) as a model for drug-releasing from carriers in
endosomes"
Biochim Biophys Acta 1034 (1):122-124, 1990, décrit un polyglutamate
fonctionnalisé par
40 % d'histamine. Cependant, aucun squelette polyglutamate hydrophobisé n'est
décrit.
De plus, le polymère développé précipite entre pH 4 et 5 et est soluble à pH
physiologique. Seule l'application visant à former des complexes avec une
polylysine
sensible au pH est développée. Ces complexes sont basés sur des interactions
électro-
statiques. En effet, à pH physiologique, le complexe polyglutamatehistamine-
polylysine
est formé, alors qu'il se décompose à pH 4 - 5, valeur du pH dans l'endosome.
Ainsi, même si de très nombreuses solutions techniques sont développées et
proposées
dans l'art antérieur pour la vectorisation des principes actifs médicamenteux,
la réponse à
l'ensemble des exigences est difficile à obtenir et demeure perfectible. Plus
spécifiquement, l'invention concerne des polyaminoacides biodégradables,
transformables
en nano- ou micro-particules colloïdales de vectorisation aptes à s'associer
réversiblement
à des principes actifs.
Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est
de fournir de
nouveaux copolyglutamates amphiphiles comportant à la fois des charges
positives à pH
neutre ou proche de la neutralité et des groupements hydrophobes pendants.
Ces polymères représentent un perfectionnement par rapport à ceux décrits dans
les
brevets ou demandes de brevets cités plus haut en termes de vectorisation d'un
principe
actif tel qu'un peptide ou une protéine thérapeutique, un ADN, un ARN ou une
petite
molécule.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est que ces polymères
soient aptes à
être utilisés pour la vectorisation de principe actif PA et permettent de
satisfaire de
manière optimale à toutes les spécifications du cahier des charges, à savoir
notamment :
o capacité :
^ à former aisément et économiquement des suspensions colloïdales aqueuses
stables,
^ à s'associer facilement avec de nombreux principes actifs,
= et à libérer ces principes actifs in vivo,
o biocompatibilité,
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o biodégradabilité,
o stabilité à l'hydrolyse.
Cet objectif, parmi d'autres, est atteint par la présente invention, qui
concerne des
5 polyaminoacides, ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables, comprenant
des résidus
glutamiques, caractérisés en ce que certains des résidus glutamiques sont
porteurs d'un
groupement cationique pendant, qui, s'il est déprotonable, présente un pKa
supérieur ou
égal à 7, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre
eux, et en ce
que d'autres résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement hydrophobe (GH)
pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents
entre eux.
Dans la description qui suit, sauf précision contraire, le terme "groupement
cationique"
désignera d'une manière générale les groupements cationiques qui ne sont pas
déprotonables, et les groupements cationiques qui sont déprotonables et qui
présentent un
pKa supérieur ou égal à 7.
On entend par "sels pharmaceutiquement acceptables" d'un polyaminoacide selon
l'invention l'ensemble des polyaminoacides avec les contre-ions associés aux
fonctions
ionisées du polymère.
Dans la description qui suit, le terme "petite molécule" désigne une molécule
de poids
moléculaire inférieur à 1 kDa.
Sauf mention contraire, les radicaux alkyles ont de 1 à 10 atomes de carbone.
Chaque polyglutamate selon l'invention est donc fonctionnalisé par une
multiplicité de
groupements cationiques et de groupements hydrophobes (GH), pendants et
respectivement identiques ou différents entre eux.
Au sens de l'invention, le terme "multiplicité" signifie que le polyglutamate
est
fonctionnalisé par :
* au moins 1 % de groupements cationiques (% molaire par rapport aux résidus
acide glutamique) et jusqu'à 99 %,
* en moyenne, au moins deux groupements hydrophobes (GH) pendants par
molécule. Il est possible conformément à l'invention que le polyacide
glutamique présente,
en plus des groupements hydrophobes (GH) pendants, des groupements hydrophobes
(GH) fixés sur au moins l'une des extrémités des chaînes de copolymère.
Au sens de l'invention, l'expression être porteur signifie que le groupement
porté est
pendant, c'est-à-dire que ledit groupement est un groupement latéral par
rapport aux
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résidus glutamiques et est un substituant de la fonction carbonyle en y du
résidu
glutamique qui le porte.
Le polyglutamate est également porteur de groupements cationiques. Ces groupes
sont, de
préférence, greffés aux résidus glutamiques par l'intermédiaire d'une liaison
amide ou
ester.
Selon une variante de l'invention, encore d'autres résidus glutamiques peuvent
être
porteurs d'un groupement non ionisable pendant, différent des groupements
hydrophobes
(GH), lesdits groupements non ionisables étant identiques ou différents entre
eux.
Un tel groupement non ionisable pendant peut être par exemple le radical
hydroxyéthylamino- .
Selon une autre variante de l'invention, encore d'autres résidus glutamiques
peuvent être
porteurs, également sur leur carbonyle en y, d'un groupement non ionisé à pH
neutre,
différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisés à
pH
neutre étant identiques ou différents entre eux. Un tel groupement non ionisé
à pH neutre
peut par exemple répondre à la formule suivante :
N
NH
-N-C
1
Rlo
où -R10 est -H, -CO2H, ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -
CHzOH,
-C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2.
Le polyglutamate, porteur à la fois des groupements cationiques et des
groupements
hydrophobes, et également éventuellement de groupements non ioniques (non
ionisables
ou non ionisés à pH neutre) peut également comporter des charges négatives
(toujours à
pH neutre) résultant de l'ionisation des groupes pendants de l'acide
polyglutamique qui
n'ont pas été fonctionnalisés.
Il est du mérite de la demanderesse d'avoir mis au point une nouvelle famille
de polymères
à base de polyglutamate, porteurs de groupements cationiques, et
fonctionnalisés par une
multiplicité de groupements hydrophobes, lesquels polymères sont aptes à
former des
systèmes colloïdaux stables. La capacité de moduler la charge du polymère en
fonction du
taux de fonctionnalisation peut s'avérer très efficace pour :
- abaisser la viscosité du polymère pour une injection plus facile ou une mise
en
oeuvre plus aisée lors de l'étape de formulation.
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- assurer une bonne association avec des principes actifs neutres, anioniques
ou
cationiques.
Ainsi, les polymères de l'invention peuvent être :
= anioniques, cationiques, neutres et aptes à associer des principes actifs
chargés ou
des PA non chargés ;
= cationiques à pH modérément acide (pH = 4 - 5) et neutres ou faiblement
chargés à
pH neutre. Dans ce cas, cette dépendance au pH leur permet, après association
avec le principe actif en solution à pH = 4 - 5, de former un dépôt en milieu
physiologique.
De plus, ils sont facilement dégradés, en présence d'enzymes, en
catabolites/métabolites
non toxiques (acides aminés).
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes
"association" ou
"associer" employés pour qualifier les relations entre un ou plusieurs
principes actifs et les
polyglutamates modifiés, signifient, en particulier, que le ou les principes
actifs sont liés
au(x) polyglutamate(s) notamment par une interaction hydrophobe, et/ou sont
encapsulés
par le ou les polyglutamates.
Avantageusement, les polyaminoacides selon l'invention sont des homopolymères
fonctionnalisés de L-glutamate ou d'acide L-glutamique ; de préférence ces
résidus sont
liés dans le polyaminoacide par leur carboxyle en position alpha.
Les groupements cationiques utilisables pour fonctionnaliser les résidus
glutamates sont
identiques ou différents entre eux et correspondent à la formule générale
suivante :
L
x~ ~ Mr3+z
dans laquelle :
X = O, NH,
Y = indépendamment un H ou un CH3,
Z- =un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate,
L = un alkylène linéaire (C2 à C6) et éventuellement substitué par un groupe
fonctionnel de type carboxyle ou dérivé.
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Suivant une caractéristique préférée, les groupements cationiques sont obtenus
à partir de
précurseurs choisis parmi le groupe comprenant : la lysine, l'ornithine,
l'arginine et leurs
dérivés, la choline, l'éthanolamine (liée par l'oxygène), la putrescine et
l'agmatine.
Les dérivés de la lysine, de l'ornithine, et de l'arginine peuvent être par
exemple des esters
éthyliques et méthyliques, des amides, et des amides méthylés.
Ainsi, des groupements cationiques utilisables dans la présente invention
peuvent être
choisis dans le groupe de radicaux suivants :
H H
-N-C-CORa
~ CH2)4
1
NH3+ Z
H H
-N-C-CORa
(CH2)3
1
NH
~ +
HN NH3 ,Z
H H
-N-C-CORa
( CH2)3
(
NH3+,Z
où Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino,
de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NHCH3 ou
-N(CH3)2, et Z- représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou
un acétate, de préférence un chlorure,
ou
-NH-(CH2)4-NH3+, Z ,
-NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z-,
-O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z ,
-O-(CH2)2-NH3+, Z-
où Z- représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un
acétate, de préférence un chlorure.
Par exemple, les groupements cationiques pendants peuvent présenter les
formules
suivantes (où le nom du précurseur est indiqué sous chaque radical) :
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I ~ H~ HI HI HI HI
O O
CORa CORa CORa
NH3`,CP NWie3',q'
Efhanolamine Choline NH3',q' Ni NH3,q' NH
~ ~ Omithine -
Putrcsclne ~ C~~~ estaYOU amlde HN~
NHs ,CI Lysine NH3' q
esiex ou amide
Agmadne Arghlne
ester ou amlde
dans lesquelles Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino, de
préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NH-CH3 ou -N(CH3)2.
Suivant une caractéristique préférée, les polyaminoacides de l'invention
comportent en
moyenne au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne de polymère.
Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans
un
greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement
("spacer")
permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne de polyglutamate
(par
exemple une chaîne principale - squelette-polyglutamate). Cette rotule peut
comprendre,
e.g. au moins une liaison covalente directe et/ou au moins une liaison amide
et/ou au
moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles
appartenant au
groupe comportant notamment : les résidus acide aminé différents de l'unité
monomérique
constitutive du polyglutamate, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des
polyamines
(par exemple les diamines), les dérivés des polyols (par exemple les diols) et
les dérivés
des hydroxyacides.
Le greffage des GH sur la chaîne polyglutamate peut passer par la mise en
oeuvre de
précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne polyglutamate.
Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif,
choisis dans le
groupe comprenant les alcools et les amines, ces composés pouvant être
fonctionnalisés
facilement par l'homme de l'art. Le greffage des GH est explicité plus en
détails ci-après
dans la description du procédé d'obtention des polyaminoacides modifiés selon
l'invention.
Suivant une caractéristique préférée, le groupement hydrophobe GH du greffon
hydrophobe comporte de 8 à 30 atomes de carbone.
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Ces groupements hydrophobes GH sont avantageusement et judicieusement
sélectionnés
dans le groupe comprenant :
= les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter
éventuellement au
5 moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
= les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement
au
moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
= et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins
une
insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
Les rotules formant avec les GH des greffons hydrophobes, peuvent être di-,
tri- ou
tétravalentes (voire pentavalentes et plus). Dans le cas d'une rotule
divalente, le greffon
hydrophobe comporte un seul groupement GH, tandis qu'une rotule trivalente
confère au
greffon hydrophobe un caractère bifide, c'est-à-dire que le greffon présente
deux "pattes"
GH. A titre d'exemple de rotule trivalente, on peut citer, entre autres, des
résidus "acide
aminé", par exemple "acide glutamique" ou des restes polyols, par exemple
glycérol.
Ainsi, deux exemples avantageux mais non limitatifs de greffons hydrophobes
comprenant
des GH bifides sont les dialkyl-glycérols et les dialkyl-glutamates.
Les groupements hydrophobes GH peuvent être, par exemple, dérivés de
groupements
choisis dans le groupe suivant : octanol, dodécanol, tétradécanol,
hexadécanol,
octadécanol, oléylalcool, tocophérol ou cholestérol.
Selon une autre variante, les polyglutamates selon l'invention peuvent être
également
porteurs d'au moins un greffon de type polyalkylène (de préférence
éthylène)glycol lié à
un résidu glutamate.
De préférence, le squelette du polyglutamate selon la présente invention
comprend des
résidus d'alpha-L-glutamate et/ou d'alpha-L-glutamique acide.
De manière plus préférée encore, les polyglutamates selon l'invention
répondent à la
formule (I) suivante :
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O Ri O ZOH
O
N N D
H H
L O r O
q s
p
O B O R3
I
GH
(I)
dans laquelle :
^ A représente indépendamment :
- RNH- dans lequel R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à C10,
un alkyle ramifié en C3 à C10 ou un benzyle,
- un résidu acide aminé terminal de formule :
H
-NH-C COR7
I8
dans laquelle
-R7 est -OH, -OR9 ou -NHR10, et
R8, R9 et R10 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire
en C2 à C10, un alkyle ramifié en C3 à Ct0 ou un benzyle ;
^ B est une liaison directe, un groupement de liaison divalent, trivalent ou
tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :
-0-, -NH-, N(C t_5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de préférence
naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou
d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone ;
^ D représente un H, un acyle linéaire en C2 à C10, acyle ramifié en C3 à C10,
ou un pyroglutamate ;
^ les groupements hydrophobes GH représentent chacun indépendamment les
uns des autres un radical choisi parmi :
= les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter
éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un
hétéroatome (de préférence 0 et/ou N et/ou S), ou
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= les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter
éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un
hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou
= les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au
moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence
O et/ou N et/ou S) ;
^ de préférence, ce radical est choisi dans le groupe suivant :
octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-,
octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou
cholestéryloxy-, B étant alors une liaison directe;
^ R' représente un radical choisi dans le groupe ayant les formules suivantes
:
--NH-(CH2)w NH3+, Z- avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w
est égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z-,
- -O-(CH2)2-NH3+, Z-,
- -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z ,
- un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
0 XR12
-N R13
H
dans laquelle :
X est un atome d'oxygène ou un -NH-,
Rl2 est H, alkyle linéaire en C2 à Cto, alkyle ramifié en C3 à C10
ou benzyle,
-R13 est -(CH2)4-NH3+, Z-, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3+, Z ,
-(CH2)3-NH3+, Z ;
dans lesquelles le contre-anion Z- est un chlorure, un sulfate, un phosphate
ou
un acétate, de préférence un chlorure ;
^ R3 représente un hydroxyéthylamino-, un alkylène glycol, un
polyalkylène glycol ou un radical de formule :
NNH
H H
-N-C
1
R'o
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où -R10 représente -H, -CO2H, un ester d'alkyle (de préférence
-COOMe ou -COOEt), -CHzOH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou
-C(=O)-N(CH3)2 ;
^ p, q, r et s sont des entiers positifs
^(p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des
groupements hydrophobes GH et varie de 2 à 99 % molaire, et de
préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de copolymère
possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes ;
^(q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des
groupements cationiques et varie de 1 à 99 % molaire ;
^(p+q+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ;
^(r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
^(s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables
De préférence, les groupements hydrophobes GH et les groupements cationiques
sont
disposés de façon aléatoire en groupements pendants.
D'une manière générale, la formule générale (I) décrite ci-dessus ne doit pas
être
interprétée comme représentant uniquement des copolymères séquencés (ou
blocs), mais
également des copolymères aléatoires ou des copolymères multiblocs.
Il est par ailleurs préférable que le taux de greffage molaire en groupements
hydrophobes
des polyglutamates selon l'invention soit compris entre 2 et 99 %, et de
préférence entre 5
et 50 %, sous condition que chaque chaîne de polymère possède en moyenne au
moins 3
greffons hydrophobes.
Le rapport (q)/(p+q+r+s) des polyglutamates selon l'invention signifie qu'ils
peuvent
contenir de 1 à environ 97 % molaire de groupements contenant une charge
cationique.
Le rapport (s)/(p+q+r+s) des polyglutamates selon l'invention signifie qu'ils
peuvent être
anioniques, neutres ou cationiques à pH neutre.
Selon une autre caractéristique de l'invention, les polymères selon
l'invention ont une
masse molaire qui se situe entre 2 000 et 200 000 g/mol, et de préférence
entre 5 000 et
100 000 g/mol.
Naturellement, l'invention couvre également des mélanges de polyaminoacides
modifiés
tels que définis ci-dessus.
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De manière remarquable, les polyglutamates de l'invention sont susceptibles
d'être utilisés
de plusieurs façons selon la nature des groupements hydrophobes et des
groupements
cationiques, la charge et le degré de polymérisation du polyglutamate. Les
méthodes de
mise en forme d'un polymère pour l'encapsulation d'un principe actif sous les
diverses
formes visées par l'invention sont connues de l'homme de l'art. Pour plus de
détails, on
peut se référer, par exemple à ces quelques références particulièrement
pertinentes :
"Microspheres, Microcapsules and Liposomes ; vol 1. Preparation and chemical
applications" Ed. R. Arshady, Citus Books 1999. ISBN : 0-9532187-1-6.
"Sustained-Release Injectable Products" Ed. J. Senior et M. Radomsky,
Interpharm
Press 2000. ISBN : 1-57491-101-5.
"Colloidal Drug Delivery Systems" Ed. J. Kreuter, Marcel Dekker, Inc. 1994.
ISBN :
0-8247-9214-9.
"Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology" Ed. D.L. Wise,
Marcel
Dekker, Inc. 2000. ISBN : 0-8247-0369-3.
Ces polyglutamates (sous forme de particules ou non) peuvent encapsuler ou
associer
aisément des principes actifs tels que des protéines, peptides, ADN, ARN ou
petites
molécules. La mise en forme préférée est celle décrite dans le brevet US
6,630,171 et qui
consiste à disperser le copolymère dans l'eau et à incuber la solution en
présence d'un
principe actif (PA). Cette solution colloïdale de particules de vectorisation,
constituées des
polyglutamates selon l'invention, peut ensuite être filtrée sous 0,2 m puis
directement
injectée à un patient.
Dans le cas où le polymère est cationique et soluble à pH acide du fait d'un
excès de
charge cationique et que cette charge se trouve partiellement ou totalement
neutralisée à
pH neutre, un tel polymère est dit dépendant du pH. Ce type de polymère peut
donc être
utilisé pour former un dépôt après administration, par exemple dans le tissu
sous-cutané.
Il convient de comprendre que les fonctions résiduelles carboxyliques du
polyglutamate
modifié sont soit neutres (forme COOH), soit ionisées (anion COO ), selon le
pH et la
composition. On parlera donc indifféremment i) de résidu glutamate ou de
résidu acide
glutamique, ii) d'acide polyglutamique ou de polyglutamate. En solution
aqueuse, le
contre-cation peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou
le
magnésium, ou un cation organique tel que la triéthanolamine, le
tris(hydroxyméthyl)-
aminométhane ou une polyamine tel que la polyéthylèneimine. S'il est divalent,
un contre-
cation peut salifier deux groupements cationiques monovalents proches.
Le contre-anion des groupements cationiques est de préférence choisi parmi le
groupe
comprenant un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate. S'il est
divalent, un
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contre-anion peut salifier deux groupements cationiques monovalents proches.
Par suite,
dans la présente description, on entend par "sels pharmaceutiquement
acceptables" du
polymère selon l'invention l'ensemble des polymères avec les contre-ions
associés aux
fonctions ionisées du polymère. Il est aussi envisageable, pour certaines
structures où il y a
5 co-existence des charges positives et négatives qu'il y ait une
neutralisation totale ou
partielle des charges. Un polymère ayant un nombre équivalent de charges
positives et de
charges négatives (point isoélectrique) peut exister sans présence ni de
contre-anion ni de
contre-cation.
10 Les copolymères de l'invention sont par exemple obtenus par des méthodes
connues de
l'homme de l'art. Tout d'abord, rappelons que pour l'obtention de
polyaminoacides de type
alpha, la technique la plus courante est basée sur la polymérisation
d'anhydrides de N-
carboxy-aminoacides (NCA), décrite, par exemple, dans Biopolymers, 1976, 15,
1869 et
dans H.R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related
Heterocycles"
15 Springer Verlag (1987). Le dérivé de NCA est de préférence NCA-Glu-O-R3 (R3
=
méthyle, éthyle ou benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolysés dans des
conditions
appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont
inspirées de
la description donnée dans le brevet FR 2 801226.
Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de
type
poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique), poly(alpha-D,L-glutamate)
et
poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement.
De préférence, on synthétise les copolymères de l'invention selon 2 voies.
Dans la
première, on greffe tout d'abord simultanément ou en séquence le groupement
cationique
(par exemple l'argininamide) et le groupement B-GH (par exemple la
dodécylamine) sur
un poly(acide-L-glutamique). Cette réaction peut se faire dans un solvant tel
que le DMF,
le DMSO ou la NMP selon le schéma suivant.
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H
q ND
p
O OH
O
CI~O~
NH
N-) H2NOC
~_O H NH3+,CI-
0 NH
O H HB-GH H O
A p D H2N m O H p q D
N N N
CONH2
O ~ O O R,
~H
O O~ NH
HN~
NH3+,CP
Dans le mécanisme ci-dessus, lorsque q n'est pas nul, le précurseur du groupe
Ri, tel que
l'éthanolamine liée par l'azote, est introduit au cours de la synthèse en même
temps que le
groupement cationique.
Dans le cas où le groupement cationique contient deux fonctions amines non
différenciées
chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme
dans laquelle
une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du
groupement
protecteur est alors ajoutée au schéma ci-dessus.
Le poly(acide-L-glutamique) peut être synthétisé selon la voie décrite dans la
demande de
brevet FR 2 801226. Dans le cas où le groupement HB-GH est lié via une
fonction ester, il
est plus aisé de greffer d'abord le groupement B-GH par une réaction de
couplage
classique en utilisant un carbodiimide avant de greffer le groupement
cationique.
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0
H
A N~
p D
O OH
HB-GH NH
Carbodiimide H2NOC\
O Y v H NH3`,CI'
O OH CI11 O-Y O H
O N~ O O
H ~O H H
N LD N N
%+ m H1~ H A m H p 9 D
0 2N O
CONH2
0 I 0 B
1 O R
GH GH
NH
HN=~
NH3',CI-
Dans le mécanisme ci-dessus, lorsque q n'est pas nul, le précurseur du groupe
Rl, tel que
l'éthanolamine liée par l'azote, est introduit au cours de la synthèse en même
temps que le
groupement cationique.
Dans le cas où le groupement cationique contient deux fonctions amines non
différenciées
chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme
dans laquelle
une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du
groupement
protecteur est alors ajoutée au schéma ci-dessus.
La chimie de polymérisation et les réactions de couplage des groupements sont
classiques
et bien connues de l'homme de l'art (voir par exemples les brevets ou demandes
de brevet
de la demanderesse cités précédemment).
Ces méthodes seront mieux comprises à travers la description des exemples.
Il doit être observé que le degré de polymérisation est défini par le rapport
molaire de
l'initiateur sur celui du monomère.
Le couplage du greffon hydrophobe GH avec une fonction acide du polymère est
réalisé
aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme
agent de
couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine
et dans un
solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-méthyl pyrrolidone
(NMP)
ou le diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le
dicyclohexylcarbo-
diimide ou le diisopropylcarbodiimide. Les réactifs de couplage tels que les
chloro-
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formiates peuvent également être utilisés pour la formation de liaisons amides
(voir par
exemple Bodanszky : Principles of Peptide Synthesis Springer Verlag, 1984).
Le taux
de greffage est contrôlé par la stoechiométrie des constituants et réactifs ou
le temps de
réaction. Les greffons hydrophobes fonctionnalisés par un acide aminé autre
que celui du
polymère sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation
directe par
catalyse acide. Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art.
Selon un autre de ses aspects, l'invention vise une composition
pharmaceutique,
cosmétique, diététique ou phytosanitaire comprenant au moins un polyglutamate
tel que
défini ci-dessus et éventuellement au moins un principe actif, qui peut être
thérapeutique,
cosmétique, diététique ou phytosanitaire.
Suivant une disposition intéressante de l'invention, le principe actif est
associé au(x)
polyaminoacide(s) modifiés par un groupement cationique par une ou plusieurs
liaisons
autre(s) qu'une (ou que des) liaison(s) chimique(s) covalente(s).
Les techniques d'association d'un ou de plusieurs PA aux polyaminoacides
modifiés selon
l'invention sont similaires à celles décrites notamment dans le brevet US
6,630,171. Elles
consistent à incorporer au moins un principe actif dans le milieu liquide
contenant des
Particules de Vectorisation (PV), de manière à obtenir une suspension
colloïdale de PV
chargées en ou associées avec un ou plusieurs principe(s) actif(s) PA. Cette
incorporation,
qui conduit à un piégeage de PA par les PV, peut être réalisée de la manière
suivante :
= mise en solution aqueuse de PA, puis ajout des PV, soit sous forme de
suspension colloïdale, soit sous forme de PV isolées (lyophilisat ou
précipité) ;
= ou ajout de PA, soit en solution, soit à l'état pur ou préformulé, à une
suspension colloïdale de particules PV, éventuellement préparée
extemporanément par la dispersion de PV sèches dans un solvant approprié,
tel que l'eau.
De préférence, le principe actif est choisi dans le groupe comprenant : les
protéines, les
glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes
polyalkylèneglycol [de
préférence polyéthylèneglycol (PEG): "protéines-PEGylées"], les peptides, les
polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les
polynucléotides et leurs
mélanges,
et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe des érythropoïétines,
telles que
l'époétine alpha, l'époétine bêta, la darbépoétine, le raffimère
d'hémoglobine, leurs
analogues ou leurs dérivés ; ocytocine, vasopressine, hormone
adrénocorticotropique,
facteur de croissance épidermique, facteur de croissance dérivé des plaquettes
(PDGF), les
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facteurs stimulants de l'hématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs
sanguins, tels que
alteplase, tenecteplase, facteur VII(a), facteur VII ; hémoglobine, les
cytochromes, les
albumines, prolactine, lulibérine, hormone de libération de l'hormone
lutéinisante (LHRH)
et analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buseréline,
nafaréline ;
antagonistes de la LHRH, les agonistes de la LHRH, les hormones de croissance
(GH)
humaine, porcine ou bovine, le facteur de libération de l'hormone de
croissance,
l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges
(IL-2, IL-11,
IL-12), les interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta-la,
ou ^^ la
gastrine, la tétragastrine, la pentagastrine, 1'urogastrone, la sécrétine, la
calcitonine, les
enképhalines, les endomorphines, les angiotensines, l'hormone de libération de
la
thyrotropine (TRH), le facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de
croissance des
nerfs (NGF), les facteurs de croissance tels que beclapermine, trafermine,
ancestime, le
facteur de croissance des kératinocytes, le facteur de croissance
hématopoïétique des
granulocytes (G-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des
granulocytes
macrophages (GM-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des macrophages
(M-
CSF), l'héparinase, les protéines morphogéniques de l'os (BMP), le facteur
natriurétique
auriculaire humain (hANP), le peptide ressemblant au glucagon (GLP-1), le
facteur de
croissance endothélial vasculaire (VEGF), l'antigène recombinant de l'hépatite
B
(rHBsAg), la rénine, les cytokines, la bradykinine, les bacitracines, les
polymyxines, les
colistines, la tyrocidine, les gramicidines, l'étanercept, l'imiglucérase, la
drotrécogine
alpha, les cyclosporines et analogues synthétiques, les modifications et
fragments actifs
pharmaceutiquement d' enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de
vaccins, les
anticorps tels que rituximab, infliximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab,
tositumomab, efalizumab, et cetuximab.
D'autres principes actifs sont les polysaccharides (par exemple, l'héparine)
et les oligo- ou
polynucléotides, ADN, ARN, iARN, antibiotiques, et cellules vivantes. Une
autre classe
de principes actifs comprend les substances pharmaceutiques agissant sur le
système
nerveux central, par exemple, rispéridone, zuclopenthixol, fluphénazine,
perphénazine,
flupentixol, halopéridol, fluspirilène, quétiapine, clozapine, amisulprid,
sulpiride,
ziprasidone, etc.
Selon une variante, le principe actif est une petite molécule organique
hydrophobe,
hydrophile ou amphiphile. Au sens du présent exposé, une "petite" molécule est
notamment une petite molécule non protéinique.
Comme exemples de PA susceptibles d'être associés aux polyaminoacides selon
l'invention, qu'ils soient ou non sous forme de (nano ou micro)particules, on
peut citer :
o les protéines telles que l'insuline, les interférons, les hormones de
croissance, les interleukines, l'érythropoïétine ou les cytokines ;
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o les peptides tels que le leuprolide ou la cyclosporine ;
o les petites molécules telles que celles appartenant à la famille des
anthracyclines, des taxoïdes ou des camptothécines ;
o et leurs mélanges.
5
D'une manière avantageuse, le principe actif est choisi panni au moins l'une
des familles
de substances actives suivantes : les agents de traitement de l'abus d'alcool,
les agents de
traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les agents de
traitement de
l'acromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les agents de
traitement des
10 allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires, les
anticoagulants et
antithrombotiques, les anticonvulsivants, les antiépileptiques, les
antidiabétiques, les
antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques, les antiparasitaires,
les
antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les antiparkinsoniens, les
anti-
cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique,
les agents
15 cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les
vasodilatateurs, les
antiangineux, les anti-hypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de
cholinestérase,
les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les
stimulants du
système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les
inducteurs et
inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose,
les agonistes des
20 récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les
agents de
traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la
fertilité, les
agents de traitement des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et
les
immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les
antimigraineux, les myorelaxants, les analogues de nucléosides, les agents de
traitement de
l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents
psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les
neuroleptiques,
les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de
traitements
dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les
anorexiques, les
anti-douleurs non analgésiques, les anti-épileptiques, les barbituriques, les
benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les
associations
de ces produits.
Selon un mode de réalisation, la composition de l'invention est sous forme
d'un gel, d'une
solution, d'une suspension, d'une émulsion, de micelles, de nanoparticules, de
microparticules, d'un implant, d'une poudre, d'une suspension ou d'un film.
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Suivant l'une de ses formes particulièrement préférées, la composition,
chargée ou non en
principe actif(s), est une suspension colloïdale stable de nanoparticules
et/ou de
microparticules et/ou de micelles polyaminoacides, dans une phase aqueuse ou
huileuse.
Des microparticules peuvent être obtenues par diverses méthodes telles que la
coacervation en présence d'un agent d'agrégation (ions divalents ou trivalents
ou
polyélectrolytes), précipitation par changement de pH ou de la force ionique,
extraction/évaporation ou par atomisation.
En particulier, la composition selon l'invention peut être une solution
colloïdale de
nanoparticules dans une phase aqueuse à pH acide et qui précipite à pH
physiologique.
Avantageusement, un polyaminoacide de l'invention présentant un excès de
charge
cationiques peut condenser un principe actif anionique tel que l'ADN, un
fragment
d'ADN, un ARN ou un oligo ARN sous forme de nano- ou microparticules et ces
particules peuvent être internalisées dans une cellule.
Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention est sous
forme de
solution dans un solvant biocompatible et peut être injectée par voie sous-
cutanée,
intramusculaire ou dans une tumeur.
La composition selon l'invention, dès lors qu'elle est pharmaceutique, peut
être
administrée par voie orale, pulmonaire, parentérale, nasale, vaginale,
oculaire, sous-
cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale,
intracérébrale ou
buccale.
Il est également envisageable que la composition soit sous forme de solution
dans un
solvant ou un mélange de solvants biocompatibles, susceptible d'être injectée
en sous-
cutané, intramusculaire ou dans une tumeur.
Selon un autre mode de réalisation, la composition peut contenir un excipient
pour
l'ajustement du pH et/ou de l'osmolarité et/ou pour améliorer la stabilité
(antioxydants)
et/ou comme agent antimicrobiens. Ces excipients sont bien connus de l'homme
de l'art
(C Injectable Drug Development, P.K. Gupta et al. Interpharm Press, Denver,
1999).
L'invention vise aussi un procédé de préparation
= de médicaments, en particulier pour administration orale, nasale, vaginale,
oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique,
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intrapéritonéale ou intracérébrale, les principes actifs de ces médicaments
pouvant être, notamment, des protéines, des glycoprotéines, des protéines
liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol {par exemple
PolyEthylèneGlycol (PEG), on parle alors de protéines "PEGylées"}, des
peptides, des polysaccharides, des liposaccharides, des oligonucléotides,
des polynucléotides et des petites molécules organiques hydrophobes,
hydrophiles ou amphiphiles ;
= etlou des nutriments ;
= et/ou de produits cosmétiques ou phytosanitaires ;
ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en
oeuvre au moins
l'un des polyaminoacides tels que définis ci-dessus et/ou la composition
décrite ci-dessus.
L'invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique
consistant
essentiellement à administrer la composition telle que décrite dans le présent
exposé, par
voie orale, pulmonaire, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée,
intraveineuse,
intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou buccale.
Suivant une variante particulière de l'invention, cette méthode de traitement
thérapeutique
consiste essentiellement à mettre en oeuvre la composition telle que décrite
supra sous
forme de solution dans un solvant biocompatible puis à l'injecter en sous-
cutané,
intramusculaire ou dans une tumeur, de préférence de manière à ce qu'elle
forme un dépôt
sur le site d'injection.
L'invention sera mieux comprise et ses avantages et variantes de mise en
oeuvre
ressortiront bien des exemples qui suivent et qui décrivent la synthèse des
polymères de
l'invention, leur transformation en système de vectorisation de PA (suspension
colloïdale
aqueuse stable) et la démonstration de la capacité d'un tel système de
s'associer à une
protéine ou à un acide nucléique pour former des compositions pharmaceutiques.
EXEMPLES :
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Exemple 1 synthèse du polymère (1)
NH
HNNH3+,CI'
CONH2
O NH
O 0
H H
N N
H2 N H H
P O 4 s
O T O ONa
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = s 11 , q 198
Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon
statistique
avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 C.
Cette
solution est refroidie à 0 C, et 8,7 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis
7,35 mL de N-
méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 C.
En
parallèle, 24,67 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 308 mL
de NMP
et 14,7 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée
quelques
minutes à 20 C puis refroidie à 0 C. La suspension laiteuse de polymère
activé est alors
additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2
h à 0 C, puis
une nuit à 20 C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 100 mL
d'eau, le
mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 1,6 L d'eau. La solution
obtenue est
diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et
concentrée
jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Le pourcentage d'argininamide greffé,
déterminé
par RMN du proton dans D20, est de 90 %.
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Exemple 2 synthèse du polymère (2)
NH3+,C1'
O NH
O 0
H H
N N
H2N r7N H
P O q s
O T O ONa
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p= s 6, q = 108
Trois grammes et demi d'un poly(acide glutamique) de DP 120 greffé à 5 de
façon
statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 70 mL de
NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 3,2 g de chloroformiate d'iso-butyle
puis 2,37 g de
N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 10 min à 0
C. En
parallèle, 4,62 g de N-tert-butyloxycarbonyl-1,4-butanediamine (BOC-
putrescine) sont
solubilisés dans 9 mL de NMP puis refroidis à 0 C. La suspension laiteuse de
polymère
activé est alors additionnée à cette solution, et le mélange réactionnel est
agité pendant 2 h
à 0 C, puis une nuit à 20 C. Après ajout de 0,7 mL d'une solution d'HCl 35 %,
le
mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 317 mL d'eau. La solution
obtenue est
ajustée à pH = 7,4 avec de la soude 1N, puis dialysée contre de l'eau salée
(0,9 %) puis de
l'eau. La suspension obtenue est lyophilisée pour donner 4,1 g d'une poudre
blanche.
Cette poudre est remise en solution dans le TFA, agitée 2 h à 20 C, puis
versée goutte à
goutte dans un pied d'eau en ajustant le pH vers 7 avec une solution de soude
1 N. La
solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4
volumes d'eau,
et concentrée jusqu'à un volume d'environ 50 mL. Le pourcentage de BOC-
putrescine
greffée, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 90 %.
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Exemple 3 : synthèse du polymère (3)
NH
HNNH3+,CI"
CONH2
O NH
O ONa
O
H O N
H2N H N N H
--_ I - 7
P O q r H s
O
O T O N ,,/OH
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = 11, q = 88, r = 99, s 22
5 Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon
statistique
avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 C.
Cette
solution est refroidie à 0 C, et 9,1 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis
7,71 mL de N-
méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 minutes à
0 C. En
parallèle, 8,2 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 103 mL
de NMP et
10 9,31 mL de triéthylamine sont ajoutés. On ajoute encore 1,6 mL
d'éthanolamine, et la
suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0 C.
La
suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette
suspension, et le
mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C. On ajoute 1,2 mL
d'éthanolamine, puis
agite une nuit à 20 C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis
200 mL
15 d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 700 mL d'eau
tout en ajustant
le pH vers 7,4. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau
salée (0,9 %) puis
4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les
pourcentage
d'argininamide et d'éthanolamine greffées, déterminés par RIV1N du proton dans
D20, sont
respectivement de 40 et 45 %
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Exemple 4 : synthèse du polymère (4)
NH3+,CI'
O NH
O ONa
O O
H N
N Jr7 H
H2N H H s
P O p O
O T O N_~,,OH
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = 6, q = 59, r = 52, s 3
Cinq grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 120 greffé à 5 % de façon
statistique
avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 63 mL de NMP à 80 C.
Cette
solution est refroidie à 0 C, et 4,3 g de chloroformiate d'iso-butyle puis 3,
7 g de N-
méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 10 min à 0 C.
En
parallèle, 3,15 g de N-tert-butyloxycarbonyl-1,4-butanediamine (BOC-
putrescine) sont
solubilisés dans 39 mL de NMP puis refroidis à 0 C. On ajoute cette solution à
la
suspension laiteuse de polymère activé, et le mélange réactionnel est agité
pendant 2 h à
0 C. On ajoute 2 mL d'éthanolamine, puis agite une nuit à température
ambiante. Après
ajout de 1,04 mL d'une solution d'HCI 35 %, le mélange réactionnel est versé
goutte à
goutte dans 407 mL d'eau. La suspension obtenue est ajustée à pH = 7,4 avec de
la soude
1 N, puis dialysée (seuil de coupure de 1 kD) contre de l'eau salée (0,9 %)
puis de l'eau.
La suspension obtenue est lyophilisée pour donner une poudre blanche. Cette
poudre est
remise en solution dans 100 mL de TFA, agitée 1,25 h à 20 C, puis versée
goutte à goutte
dans un pied d'eau (500 mL) en ajustant le pH vers 7 avec une solution de
soude 1 N.
Après ajout de 600 mL d'éthanol, la solution obtenue est diafiltrée contre 8
volumes d'eau
salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ
100 mL.
Les pourcentages de BOC-putrescine et d'éthanolamine greffées, déterminés par
RMN du
proton dans D2O, sont respectivement de 49 et 43 %.
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Exemple 5 synthèse du polymère (5)
NH
HNNH3+,CI"
CONH2
O NH
O 0
H H
N N
H2 N I7N H
P O q s
O T O ONa
Indices et groupements : T D,L-a-tocophérol, p = 5, q = 83, s 12
Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du
polymère (1), on
obtient environ 300 mL d'une solution concentrée à 48 mg/g à partir de 10 g
d'un
poly(acide glutamique) de DP 100 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-
tocophérol
racémique, de 9,6 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 7,7 mL de N-méthyl-
morpholine,
de 24,7 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 14,7 mL de triéthylamine. Le
pourcent-
age d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 83 %.
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Exemple 6: synthèse du polymère (6)
NH
HNNH3+,CI'
CONH2
O NH
O 0
N N
H2 N
H H
-- -r 4
P O q S
O T O ONa
Indices et groupements : T= D,L-a-tocophérol, p = 11, q = 62, s 147
Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du
polymère (1), on
obtient environ 250 mL d'une solution concentrée à 43 mg/g à partir de 10 g
d'un
poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-
tocophérol
racémique, de 2,9 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 2,2 mL de N-méthyl-
morpholine,
de 4,93 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 3,3 mL de triéthylamine. Le
pourcentage
d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 28 %.
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Exemple 7 : synthèse du polymère (7)
NH
HNNH3+,G-
CON H2
O NH
O ONa
O p
H N
N H
H2N r7N--
P O q r O H s
O T O N ,-/OH
H
Indices et groupements : T= D,L-a-tocophérol, p = 5, q 40, r = 48, s 7
Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du
polymère (3), on
obtient environ 200 mL d'une solution concentrée à 41 mg/g à partir de 10 g
d'un
poly(acide glutamique) de DP 100 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-
tocophérol
racémique, de 9,58 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 7,7 mL de N-méthyl-
morpholine,
de 8,22 g de dichlorhydrate d'argininamide, de 2,86 g d'éthanolamine et de 5,1
mL de
triéthylamine. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine greffés,
déterminés par
RMN du proton dans D20, sont respectivement de 40 et 48 %.
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Exemple 8 synthèse du polymère (8)
NH
HNNH3+,CI'
CONH2
O NH
O 0
H H
N N
H2 N r7N H
P O q s
O T O ONa
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = 11, q= 139, s 70
5
Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du
polymère (1), on
obtient environ 200 mL d'une solution concentrée à 51 mg/g à partir de 10 g
d'un
poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-
tocophérol
racémique, de 6,39 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 5,1 mL de N-méthyl-
morpholine,
10 de 13,16 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 7,5 mL de triéthylamine.
Le pourcent-
age d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 63 %.
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Exemple 9 synthèse du polymère (9)
NH
HNNH3+,CI"
CONH2
O NH
O 0
H H
N N
H2 N H H
P O q s
O T O ONa
Indices et groupements : T= D,L-a-tocophérol, p = 11, q 121, s 88
Cinq grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 de façon
statistique
avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 63 mL de NMP à 80 C.
Cette
solution est refroidie à 0 C, et 2,38 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis
2,02 mL de N-
méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 C.
En
parallèle, 4,93 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 62 mL
de NMP et
2,8 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée
quelques minutes à
C puis refroidie à 0 C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors
additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2
h à 0 C, puis
4 h à 20 C. Après ajout de 1,04 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 50 mL
d'eau, le
15 mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 500 mL d'eau acide (pH =
3), en
maintenant le pH vers 3 - 4 avec une solution d'HCl 1 N. La solution obtenue
est diafiltrée
contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée
jusqu'à un
volume d'environ 250 mL. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé par
RMN du
proton dans D20, est de 55 %.
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Exemple 10 : synthèse du polymère (10)
NH
HN"k NH3+,Cl'
CONH2
O NH
O ONa
O
H p N H
H2N N jN H s
lq r O
~/OH
O T O N
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p 11, q = 88, r = 48, s 73
Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon
statistique
avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 C.
Cette
solution est refroidie à 0 C, et 5,6 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis
4,8 mL de N-
méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 C.
En
parallèle, 7,4 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 93 mL de
NMP,
puis 4,7 mL de triéthylamine et 1,2 mL d'éthanolamine sont ajoutés. La
suspension
obtenue est agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0 C. La
suspension laiteuse
de polymére activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange
réactionnel est
agité pendant 2 h à 0 C, puis une nuit à 20 C. Après ajout de 2,07 mL d'une
solution
d'HCl 35 % puis 200 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte
dans
670 mL d'eau acidifiée à pH = 3 avec HCI, en maintenant le pH vers 3 avec une
solution
d'HCl 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée
(0,9 %) puis
4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les
pourcentages
d'argininamide et d'éthanolamine greffés, déterminés par RMN du proton dans
D20, sont
respectivement de 40 et 22 %.
CA 02683741 2009-10-13
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Exemple comparatif 11 : le composé Cl non fonctionnalisé par un groupement
cationique
Le composé comparatif C1 est le précurseur (sous sa forme anionique) du
polyglutamate
modifié par un groupement cationique, soit le polyglutamate de DP 220 greffé à
5% de
façon statistique avec de la alpha-tocophérol racémique. Ce composé est obtenu
par la
méthode décrite dans la demande WO-A-03/104303.
Exemple 12 : Étude d'association de l'insuline
On prépare une solution aqueuse contenant 10 mg de polymére par millilitre à
pH 7,4 et
200 UI d'insuline (7,4 mg). On laisse incuber les solutions pendant 2 h à
température
ambiante et on sépare l'insuline libre de l'insuline associée par
ultrafiltration (seuil à
100 kDa, 15 min sous 10000G à 18 C). L'insuline libre récupérée dans le
filtrat est
ensuite dosée par CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) et l'on
déduit la
quantité d'insuline associée. Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-
dessous.
TABLEAU 1
Polymère % association
3 100%
6 96%
8 100%
C1 99%
Les résultats démontrent que les polymères de l'invention sont capables
d'associer
fortement l'insuline pour donner des suspensions colloïdales de taille
supérieure à
100 kDa et les taux d'association avec l'insuline sont très élevés. En
comparaison avec le
polymère C1, on constate que la présence de charges cationiques ne diminue pas
le taux
d'insuline associé.
Exemple 13 : mesure de la viscosité (mPa/s) sous cisaillement d'une solution
aqueuse
à 29 mg/g avec un gradient de vitesse de 10 s I
Exemple C 1 3 6 8 10
Viscosité 4720 6,6 4,5 5,8 4,7
CA 02683741 2009-10-13
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Les résultats démontrent que les polymères de l'invention sont nettement moins
visqueux
que la référence C1 qui ne contient pas de groupements cationiques pendants.
Exemple 14 : Étude de solubilité en fonction du pH
Les résultats montrent que certains polymères de l'invention (exemples 9 et
10) présentent
des propriétés de solubilité dépendantes du pH qui, contrairement au composé
Cl, leur
permettent d'être formulés avec un principe actif à pH modérément acide (pH =
4) et de
former un dépôt à pH physiologique (pH autour de 7).
Polymère pH = 4 pH physiologique
1 soluble soluble
2 soluble soluble
3 soluble soluble
4 soluble soluble
5 soluble soluble
6 insoluble soluble
7 soluble soluble
8 soluble soluble
9 soluble insoluble
soluble insoluble
C1 insoluble soluble
Exemple 15 : Étude d'association d'un ARN thérapeutique
On réalise des associations polymère/ARN en solution aqueuse en ajoutant des
quantités
croissantes de polymères (1), (3) (deux exemples de polymères de l'invention
qui sont
globalement cationiques à pH = 7,4) ou C1 à des quantités fixes d'un ARN
thérapeutique
de 1433 nucléotides. Ces mélanges sont incubés 2 h à 37 C, puis analysés par
électrophorèse sur gel d'agarose 1 % en conditions dénaturantes (révélation
des ARN au
bromure d'éthidium). De l'ARN seul sert de contrôle positif d'intégrité. De
l'ARN incubé
avec des RNAses commerciales sert de contrôle d'ARN dégradé.
CA 02683741 2009-10-13
WO 2008/135563 PCT/EP2008/055507
Les résultats montrent que lorsque l'ARN étudié a été incubé avec les
polymères (1) ou
(3), la quantité d'ARN qui migre à la taille attendue en électrophorèse
diminue
progressivement avec la quantité de polymère utilisé pour l'association et
disparaît au delà
d'une certaine valeur sans apparition d'autres bandes. Au contraire, dans le
mélange
5 réalisé avec le composé C1, la quantité d'ARN qui migre est inchangée, même
en
présence d'un large excès de polymère.
Dans un 2e temps, on ajoute sur l'ARN la quantité de polymère (1) ou (3)
permettant de
l'associer totalement (conditions où l'ARN n'est plus visible à la taille
attendue sur gel) et
on laisse ces mélanges incuber 2 h à 37 C. Après 2 h à 37 C, on ajoute sur
ces mélanges
10 des quantités croissantes de composé C1 et on réalise une nouvelle
incubation de 16 h à
37 C. Les mélanges obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose
1 % en
conditions dénaturantes (révélation des ARN au bromure d'éthidium).
Les résultats montrent que l'on observe à la taille attendue des quantités
croissantes d'ARN
en corrélation avec la quantité de polymère C 1 ajouté sur le mélange
ARN/polymère (1) ou
15 (3).
Ces résultats montrent que certains polymères de l'invention, globalement
cationiques à
pH = 7,4, permettent d'associer un ARN modèle de 1433 nucléotides et que cette
association est réversible en présence d'un polymère globalement anionique. De
plus,
l'ARN formulé n'est pas dégradé.
Exemple 16: Étude du franchissement de la membrane cellulaire d'un
oligonucléotide modèle
On mélange dans du milieu Opti-MEM sans sérum de veau foetal un
oligonucléotide
d'ARN de 30 bases marqué au Cy3 à une quantité de polymère (3) ou (7) proche
de la
quantité minimale pour associer la totalité de l'oligonucléotide. Ce mélange
est mis en
contact sur des cellules d'hépatocarcinome humain Huh-7 cultivées en plaque 24
puits à
raison de 25 000 cellules/puits. Après 4 h d'incubation à 37 C, 5 % C02, on
ajoute du
milieu D-MEM à 20 % de sérum de veau foetal (SVF) de telle sorte que la
concentration
finale de SVF soit de 10 %. Après 24 h d'incubation des cellules en présence
des
mélanges oligonucléotide/polymère, les cellules sont lavées, marquées au
niveau
membranaire à la concanavaline biotinylée puis fixées 3 min avec du
paraformaldéhyde à
3,7 %. Après 2 lavages avec du tampon PBS, les cellules sont incubées avec du
DAPI
(ADN nucléaire) pendant 10 min, lavées 3 fois avec du PBS, puis incubées avec
la
streptavidine marquée avec l'Alexa Fluor 488 qui révèle la concanavaline
biotinylée. Les
cellules sont observées en microscopie confocale. La localisation des cellules
est possible
par observation de leur membrane marquée à l'Alexa Fluor 488 et de leur noyau
marqué
CA 02683741 2009-10-13
WO 2008/135563 PCT/EP2008/055507
36
au DAPI. L'entrée de l'oligonucléotide marqué au Cy3 dans la cellule est
visualisée par
observation de la fluorescence du Cy3 (excitation à 550 nm, émission à 570
nm).
Les résultats montrent que l'on retrouve de l'oligonucléotide marqué au Cy3
dans le
cytoplasme des cellules Huh-7 quand l'oligonucléotide a été incubé sur les
cellules en
présence des polymères (3) ou (7).
En comparaison, quand on incube l'oligonucléotide seul, ou en présence du
polymère C1,
sur les cellules Huh-7, on n'observe pas la présence de l'oligonucléotide
marqué dans les
cellules.
