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PARTICULES A BASE DE POLYELECTROLYTES ET DE PRINCIPE
ACTIF A LIBÉRATION MODIFIEE ET FORMULATIONS
PHARMACEUTIQUES CONTENANT CES PARTICULES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne de nouveaux transporteurs de principe(s)
actif(s) -PA-, en particulier protéinique(s) et peptidique(s), ainsi que de
nouvelles
formulations pharmaceutiques à libération modifiée contenant lesdits
transporteurs de PA.
La demande concerne également les applications, notamment thérapeutiques, de
ces
formulations pharmaceutiques. Ces formulations pharmaceutiques actives
concernent aussi
bien la thérapeutique humaine que vétérinaire.
L'abréviation PA utilisée dans tout le présent exposé vise au moins un
principe
actif.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Dans le domaine de la libération prolongée des PA pharmaceutiques notamment
des peptides/protéines thérapeutiques, on cherche très souvent à reproduire au
mieux chez
le patient une concentration plasmatique en peptide ou en protéine proche de
la valeur
observée chez le sujet sain.
Cet objectif se heurte à la faible durée de vie des protéines dans le plasma
qui
conduit à injecter de façon répétée la protéine thérapeutique. La
concentration plasmatique
en protéine thérapeutique présente alors un profil "en dents de scie"
caractérisé par des pics
élevés de concentration et des minima de concentration très bas. Les pics de
concentration,
très supérieurs à la concentration basale chez le sujet sain, ont des effets
nocifs très
marqués du fait de la toxicité élevée des protéines thérapeutiques telles que
certaines
cytokines. Par ailleurs, les minima de concentration sont inférieurs à la
concentration
nécessaire pour avoir un effet thérapeutique, ce qui entraîne une mauvaise
couverture
thérapeutique du patient et des effets secondaires graves à long terme.
Aussi, pour reproduire chez le patient une concentration plasmatique en
protéine
thérapeutique proche de la valeur idéale pour le traitement du patient, il
importe que la
formulation pharmaceutique considérée permette de libérer la protéine
thérapeutique sur
une durée prolongée, de façon à limiter les variations de concentration
plasmatique au
cours du temps.
Par ailleurs, cette formulation active doit, de préférence, satisfaire au
cahier des
charges suivant, déjà connu de l'homme de l'art:
1 - libération prolongée d'une protéine thérapeutique active et non dénaturée,
par
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exemple humaine ou synthétique, de sorte que la concentration plasmatique est
maintenue au niveau thérapeutique ;
2 - viscosité à l'injection suffisamment basse pour être aisément injectable;
3 - forme biocompatible et biodégradable présentant un excellent profil de
toxicité
et de tolérance.
Pour tenter d'atteindre ces objectifs, l'une des meilleures approches
proposées dans
l'art antérieur fut de développer des formes à libération prolongée de
protéine(s)
thérapeutique(s) constituées par des suspensions, liquides et peu visqueuses
de
nanoparticules chargées en protéines thérapeutiques. Ces suspensions ont
permis
l'administration aisée de protéines thérapeutiques natives.
Ainsi, la société Flamel Technologies a proposé une voie, dans laquelle la
protéine
thérapeutique est associée à des nanoparticules d'un copolyaminoacide
comprenant des
groupements hydrophobes et des groupements hydrophiles.
La demande de brevet US 2006/0099264 divulgue des polyaminoacides amphiphiles
comprenant des résidus acide aspartique et/ou des résidus glutamiques, au
moins une partie
de ces résidus étant porteuses de greffons comportant au moins un motif alpha-
tocophérol,
e.g. :(polyglutamate ou polyaspartate greffé par l'alpha tocophérol d'origine
synthétique ou
naturelle). Ces homopolyaminoacides "modifiés hydrophobes" forment
spontanément dans
l'eau une suspension colloïdale de nanoparticules, lesquelles sont aptes à
s'associer
aisément en suspension aqueuse à pH 7,4, avec au moins une protéine active
(insuline).
La durée de libération in vivo de la (ou les) protéine(s) active(s) (e.g.
insuline)
"vectorisée" par les suspensions selon US 2006/0099264 gagnerait à être
augmentée.
L'augmentation de la durée de libération a été partiellement obtenue par les
formes
pharmaceutiques décrites dans la demande PCT WO-A-05/051416. Dans cette
demande,
est divulguée une suspension colloïdale de nanoparticules (0,001-0,5 m) de
poly(L-
glutamate de sodium) modifiée hydrophobe et injectée à une concentration telle
qu'après
injection sous-cutanée, il se forme in situ chez le patient un gel au contact
de l'albumine
endogène. La protéine est alors lentement libérée sur une période typique
d'une semaine.
Cependant, lorsque la concentration en protéine thérapeutique à administrer
est
relativement élevée, comme c'est le cas par exemple pour l'hormone de
croissance
humaine, la durée de libération est limitée à quelques jours.
La durée de libération de ces formes gagnerait à être encore augmentée.
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BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
L'un des objectifs de l'invention est de proposer de nouvelles particules
chargées en
PA, libérant le PA sur une durée prolongée de plusieurs jours, voire plusieurs
semaines.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules
formant une
suspension stable en solution aqueuse.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules
chargées en
PA et stables sous forme lyophilisée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules aptes
à être
conservées sous forme lyophilisée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules
facilement
redispersibles après lyophilisation.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules
libérant une
protéine ayant préservé son activité biologique.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de
préparation
de ces microparticules.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation
pharmaceutique
solide pour la libération prolongée de PA en particulier une forme poudre
sèche pour
inhalation et administration pulmonaire.
Pour atteindre ces objectifs, parmi d'autres, les inventeurs ont eu le mérite
de
découvrir, après de longues et laborieuses recherches, que, de façon tout à
fait surprenante
et inattendue, le mélange dans des conditions spécifiques de deux polymères
(par exemple
de copolyaminoacides) polyélectrolytes de polarité opposée, l'un au moins
étant porteur de
groupements hydrophobes, associés à au moins un PA, conduit à des particules
de taille
comprise entre 1 et 100 m capables de libérer in vitro ou in vivo une
protéine ou un
peptide sur une durée prolongée.
D'où il s'ensuit que l'invention concerne tout d'abord des particules pour la
libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), caractérisées en ce
qu'elles
comprennent:
a) un premier polymère polyélectrolyte (PEl), de préférence un alpha
polyaminoacide linéaire, à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes
(GH)
latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PE1) formant spontanément
dans
l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH
comprise entre 3 et 8;
b) un second polymère polyélectrolyte (PE2), de préférence un alpha
polyaminoacide linéaire, de polarité opposée à celle du premier polymère
polyélectrolyte (PEl), ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant
dans
l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du
pH; à
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la condition que, si le premier polymère électrolyte (PEI) est un
polyaminoacide,
alors le second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la
polyéthylène imine;
c) au moins un principe actif (PA) associé de façon non covalente aux
particules de
la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEI);
lesdites particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif
(PA) étant
obtenues par mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte
(PEI) sous
forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA)
avec le second
polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution
colloïdale.
L'invention concerne également un procédé de préparation de particules pour la
libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules étant
en particulier
celles décrites ci-dessus, comprenant les étapes suivantes:
1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une
solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PE1) à
l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit
premier polymère polyélectrolyte (PE1) étant capable de former
spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une
valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8;
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère
polyélectrolyte (PEI) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de
façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier
polymère polyélectrolyte (PE1);
3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité
opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PE1), ledit second
polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une
solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH; à la condition que,
si le premier polymère électrolyte (PEI) est un polyaminoacide, alors le
second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la
polyéthylène imine;
4) le mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEI)
sous forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif
(PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous
forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3).
L'invention concerne également des particules pour la libération prolongée
d'au
moins un principe actif (PA), caractérisées en ce qu'elles comprennent :
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a) un premier polymére polyélectrolyte (PEI), de préférence un alpha
polyaminoacide linéaire, à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes
(GH)
latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PE1) formant spontanément
dans
l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH
5 comprise entre 3 et 8;
b) un second polymère polyélectrolyte (PE2), de préférence un alpha
polyaminoacide linéaire, de polarité opposée à celle du premier polymère
polyélectrolyte (PEI), porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit
second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une
solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH ;
c) au moins un principe actif (PA) associé de façon non covalente aux
particules de
la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PE1) ;
lesdites particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif
(PA) étant
obtenues par mélange à pH égal à pHm du premier polymère polyélectrolyte (PE1)
sous
forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA)
avec le second
polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution
colloïdale.
L'invention concerne également un procédé de préparation de particules pour la
libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules étant
en particulier
celles décrites ci-avant, comprenant les étapes suivantes :
1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une
solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl ) à
l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit
premier polymère polyélectrolyte (PEI) étant capable de former
spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une
valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8;
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère
polyélectrolyte (PEI) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de
façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier
polymère polyélectrolyte (PE 1) ;
3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité
opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEI), porteur de
groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit second polymère
polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution
colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH ;
4) le mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEI)
sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le
principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectro-
lyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape
3).
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L'invention concerne également une formulation pharmaceutique pour la
libération
prolongée d'au moins un principe actif (PA), ladite formulation comprenant des
particules
telles que décrites ci-dessus.
L'invention concerne également un procédé de préparation de médicaments, en
particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-cutanée,
intramusculaire,
intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, voire par
voie orale,
nasale, pulmonaire, vaginale, transdermique ou oculaire, consistant
essentiellement à
mettre en oeuvre au moins une formulation telle que décrite ci-dessus.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Défmitions
Dans la présente description, on entend par solution un mélange homogène
solvant
et polymère sous forme de chaîne individuelle.
Dans la présente description, on entend par solution colloïdale une suspension
de
particules dont le diamètre moyen mesuré par le test T' est inférieur ou égal
à 0,5 m.
Dans la présente description, on entend par pH de demi-neutralisation, le pH
auquel
la moitié des groupements ionisables est ionisée.
Dans la présente description, on entend par pHm le pH auquel s'effectue le
mélange du premier polymére polyélectrolyte (PE1) auquel est associé le
principe actif
(PA) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2).
Dans la présente description, on définit le pH physiologique comme étant par
exemple égal à 7,2 0,4.
Dans la présente description, on entend par polyélectrolyte un polymère
porteur de
groupements capables de s'ioniser dans l'eau, ce qui crée une charge sur le
polymère.
Dans la présente description, on entend par polyampholyte un polyélectrolyte
porteur d'au moins deux types de groupements qui se dissocient respectivement
en
groupements anioniques et cationiques.
Dans la présente description, l'expression être porteur signifie que le
groupement porté est pendant, c'est-à-dire que ledit groupement est un
groupement latéral
par rapport à la chaîne principale du polymère. En particulier, lorsque le
polymère est un
polyaminoacide comprenant des résidus "acide aminé", ledit groupement pendant
est un
groupement latéral par rapport aux résidus "acide aminé" et est un substituant
de la
fonction carbonyle en y du résidu "acide aminé" qui le porte.
Dans la présente description, on entend par polarité d'un polyélectrolyte, la
polarité
de la charge globale portée par ce polyélectrolyte à la valeur pHm du pH.
Dans la présente description, on entend par densité apparente le volume occupé
par
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1 g de particules. La densité apparente est mesurée par toute méthode connue
de l'homme
du métier, telle que la méthode de gradient de densité.
Dans la présente description, on entend par petite molécule, une molécule
ayant un
poids moléculaire inférieur à 1 kDa.
Pour mesurer la taille des particules selon l'invention, résultant de
l'association du
premier polymère polyélectrolyte (PEl) et du second polymère polyélectrolyte
(PE2), on
utilise le test T. Pour évaluer la taille des particules de la solution
colloïdale du premier
polymère polyélectrolyte (PEl), on utilise de préférence le test V.
Le résultat du test T est un diamètre médian D50, tel que 50% de particules
présentes dans l'échantillon ont une taille inférieure ou égale à cette valeur
(D50).
Le résultat du test T' est un diamètre hydrodynamique moyen.
Test T de mesure de la taille des microparticules par diffraction laser:
On obtient les données relatives au D50 qui est le diamètre en dessous duquel
se
trouvent 50 % des objets analysés. Ce diamètre des particules selon
l'invention est mesuré
selon le mode opératoire défini ci-après :
Les solutions de particules sont préparées en diluant 400 l de l'échantillon
à
analyser dans un tube à essai de 5 ml avec 600 l d'eau déminéralisée, puis en
passant la
préparation au vortex pendant 10 s (10 5). Ces solutions sont ensuite
introduites au
goutte à goutte dans la cellule de mesure jusqu'à ce que l'obscuration soit
comprise entre
5 % et 20 %, puis elles sont analysées par diffraction de la lumière grâce à
un appareil de
type Malvern Mastersizer 2000, fonctionnant avec deux longueurs d'onde 466 et
632 nm.
Le D50 des particules est calculé à partir de la théorie de Mie en utilisant
les indices de
réfraction suivants :
nfluide = 1.33 + i.0,
npolyinère = 1.59 + i.0
et les approximations de Fraunhofer, comme décrit dans la norme ISO 13320.
Test T' de mesure de la taille des nanoparticules par diffusion guasi-
élastigue de la
lumière:
Le diamètre hydrodynamique moyen des particules de polymère selon l'invention
est mesuré selon le mode opératoire Md défini ci-après :
Les solutions de polymère sont préparées à des concentrations de 1 ou 2 mg/ml
en
milieu NaCI 0,15 M et laissées sous agitation pendant 24 h. Ces solutions sont
ensuite
filtrées sur 0,8-0,2 m, avant de les analyser en diffusion dynamique de la
lumière grâce à
un appareil de type Malvern Compact Goniometer System, fonctionnant avec un
faisceau
laser He-Ne de longueur d'onde 632,8 nm et polarisé verticalement. Le diamètre
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hydrodynamique des nanoparticules de polymère est calculé à partir de la
fonction
d'autocorrélation du champ électrique par la méthode des cumulants, comme
décrit dans
l'ouvrage Surfactant Science Series volume 22, Surfactant Solutions, Ed.
R. Zana,
chap. 3, M. Dekker, 1984.
Test L de mesure de la libération du principe actif:
On injecte 50 l de formulation dans un cube de 1,5 cm de côté de mousse
polyuréthane-polyéther (PU-PE) baigné par un flux de 2,83 ml/h d'un milieu
aqueux
contenant 30 mg/g d'albumine bovine fraction V (Aldrich), 0,01 M de tampon
phosphate,
0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium (PBS de
Aldrich) et
0,015 M d'acétate d'ammonium (Aldrich). On prélève régulièrement de la phase
continue
dont la teneur en protéine est analysée par ELISA (kit Immunotech IM3193).
On peut alors tracer la masse totale de protéine libérée en sommant celle
trouvée
dans chacun des prélèvements et la rapporter à la quantité totale injectée.
Au sens de l'invention, le terme "protéine" désigne aussi bien une protéine
qu'un
peptide, qu'il s'agisse d'un oligo ou d'un polypeptide. Cette protéine ou ce
peptide peuvent
être modifiés ou non, par exemple, par greffage d'un ou de plusieurs
groupements
polyoxyéthyléniques.
Les premier et second polymères polyélectrolytes (PE1) et (PE2) sont des
polymères linéaires, biocompatibles et biodégradables, porteurs de groupements
ionisables
anioniques et/ou cationiques, par exemple des fonctions amines ou acides
carboxyliques.
De préférence, le polymère PE1 ou PE2 est porteur de groupements ionisables
d'une
polarité donnée (anionique ou cationique).
De tels polymères sont par exemples des polyaminoacides, des polysaccharides
anioniques tels que le sulfate de dextran, la carboxyméthylcellulose, la gomme
arabique,
l'acide hyaluronique et ses dérivés, les polygalacturoniques, les
polyglucuroniques, ou des
polysaccharides cationiques tels que le chitosan, ou également du collagène et
ses dérivés
de type gélatine.
I1 n'est pas exclu qu'un polymère porteur de groupements ionisables d'une
polarité
donnée, soit également porteur d'une petite fraction de 1 à 30 % molaire de
groupements
ionisables de la polarité opposée. En plus des groupements ionisables
anioniques ou
cationiques et des groupements hydrophobes, le premier ou second polymère
polyélectrolyte (PE 1) ou (PE2) peut éventuellement être également porteur de
groupements
non ionisables, tels que des radicaux choisis parmi un radical
hydroxyéthylamino-, un
alkylène glycol ou un polyalkylène glycol;
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La charge nette du polymère dépend de la valeur du pH par rapport au pH de
demi-
neutralisation du polymère. Ainsi pour un polyélectrolyte porteur de fonctions
anioniques
carboxyliques, la charge nette du polymère sera voisine de zéro à un pH deux
unités au
dessous du pH de demi-neutralisation. Quasiment toutes les fonctions
anioniques seront
ionisées deux unités de pH au dessus du pH de demi-neutralisation.
Inversement, pour un
polymère porteur de fonctions cationiques, la charge nette s'annule lorsque le
pH dépasse
de deux unités environ le pH de demi-neutralisation.
Dans la présente invention, le nombre de charges portées par le premier ou
second
polymère polyélectrolyte (PEl, PE2) dans les conditions de mélange à la valeur
pHm du
pH, est obtenue par la méthode classique de titration acido-basique :
Une solution de polyélectrolyte concentrée à 2 mg/ml et contenant 0,15 M de
chlorure de sodium est portée à pH 3 par ajout d'acide acétique 1 M ou de
soude 1 M. On
procède ensuite à la titration de cette solution par une solution de soude
0,05 M en
enregistrant l'évolution du pH en fonction du volume de soude ajouté. La
détection du
point d'équivalence (volume et pH), par exemple par la méthode de la double
tangente,
permet de détecter le pH pour lequel tous les groupements ionisables sont
ionisés, c'est-à
dire où le degré d'ionisation est égal à 1. On peut alors, à partir de ce
point remonter au
degré d'ionisation du polyélectrolyte pour toute valeur du pH. On peut alors
définir le pH
de demi-neutralisation, c'est-à-dire le pH pour lequel le degré d'ionisation
est égal à 0,5.
On peut aussi définir le degré d'ionisation du polyélectrolyte pour la valeur
pHm du pH.
Dans le cas particulier où le point d'équivalence est hors d'une gamme de pH
compris entre
3 et 9, on considère que tous les groupements ionisables sont ionisés sur
cette gamme de
pH, c'est-à dire que le degré d'ionisation est égal à 1 pour des pH compris
entre 3 et 9.
D'une manière avantageuse, les premier et second polymères polyélectrolytes
(PEl, PE2) peuvent être des alpha polyaminoacides linéaires, en rappelant que
si PEl est
un polyaminoacide linéaire, PE2 n'est pas la polylysine ni la polyéthylène
imine.
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, le terme
polyaminoacide
couvre aussi bien les polyaminoacides naturels que les polyaminoacides
synthétiques, ainsi
que les oligoaminoacides comprenant de 2 à 20 résidus "acide aminé" au même
titre que
les polyaminoacides comprenant plus de 20 résidus "acide aminé".
De préférence, les polyaminoacides utilisés dans la présente invention sont
des
oligomères ou des homopolymères comprenant des unités récurrentes acide
glutamique ou
aspartique ou des copolymères comprenant un mélange de ces deux types de
résidus "acide
aminé". Les résidus considérés dans ces polymères sont des acides aminés ayant
la
configuration D ou L ou D/L et sont liées par leurs positions alpha ou gamma
pour le
résidu glutamate ou glutamique et alpha ou bêta pour le résidu aspartique ou
aspartate.
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Les résidus "acide aminé" préférées de la chaîne polyaminoacide principale
sont
celles ayant la configuration L et une liaison de type alpha.
Suivant un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, les premier
et
second polymères polyélectrolytes (PEI, PE2) sont des polyaminoacides, ou l'un
de leurs
5 sels pharmaceutiquement acceptables, dont la chaîne principale est formée
par des résidus
choisis dans le groupe comprenant les résidus aspartiques, les résidus
glutamiques et leurs
combinaisons, au moins une partie de ces résidus étant modifiée par greffage
d'au moins un
groupement hydrophobe (GH) pour au moins le premier polymère polyélectrolyte
(PE I).
Il est possible que le polymère PE2 soit également porteur de groupes
hydrophobes
10 latéraux.
Selon une première variante, ces polyaminoacides sont du type de ceux décrits
dans
la demande de brevet PCT WO-A-00/30618, selon laquelle les groupements
hydrophobes
(GH) sont identiques ou différents entre eux et sont sélectionnés dans le
groupe
comprenant :
(i) les alkyles, les acyles ou les alcényles linéaires ou ramifiés, de
préférence
linéaires en CI-C20 et, plus préférentiellement encore en C2-C18 ;
(ii) les groupements hydrocarbonés contenant un ou plusieurs hétéroatomes, de
préférence ceux contenant de l'oxygène et/ou du soufre et, plus
préférentiellement
encore, ceux de formule suivante:
H H
--Ç-CH2O-q Ç-CH2OR62
R60 R61
dans laquelle:
- R60 est un radical alkyle, acyle ou alcényle linéaire ou ramifié, de
préférence linéaire en C1 -C20 et, plus préférentiellement encore en C2-C 18,
- R61 et R62 sont identiques ou différents entre eux et correspondent à
l'hydrogène ou à un radical alkyle, acyle ou alcényle linéaire ou ramifié, de
préférence linéaire en C1 -C20 et, plus préférentiellement encore en C2-C 18,
- q= 1 à 100;
(iii) les aryles, les aralkyles ou les alkylaryles, de préférence les aryles ;
(iv) les dérivés hydrophobes, de préférence, le radical
phosphatidyléthanolamino-
ou les radicaux choisis parmi octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-,
hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou
cholestéryloxy-.
Par "groupements hydrocarbonés", on entend au sens de la présente invention,
des
groupements comprenant notamment des atomes d'hydrogène et de carbone.
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De préférence, dans cette variante, les groupements hydrophobes sont
sélectionnés
dans le groupe de radicaux suivants : méthyle, éthyle, propyle, docédyle,
hexadécyle,
octadécyle.
D'une manière particulièrement préférée, les groupements hydrophobes (GH) sont
choisis dans le groupe suivant :
= les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter
éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
= les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement
au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
= et les (poly)cycliques en Cg à C30 pouvant comporter éventuellement au
moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
Plus précisément, au moins l'un des groupements hydrophobes (GH) est obtenu
par
greffage, à partir d'un précurseur choisi dans le groupe comprenant:
l'octanol, le
dodécanol, le tétradécanol, l'héxadécanol, l'octadécanol, l'oléylalcool, le
tocophérol ou le
cholestérol.
Selon une variante de l'invention, l'un des polymères polyélectrolytes (PE1,
PE2),
ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, répond à la formule (I)
suivante :
H O A2COH
N NH R'
R2 N
n 1 m
OvA H O
[GH]
(I)
dans laquelle :
^ R' représente H, un alkyle linéaire en C2 à Cio, un alkyle ramifié en C3 à
Cio, un benzyle, -R4-[GH], ou R' forme avec NH un résidu acide aminé
terminal;
= R2 représente H, un acyle linéaire en C2 à CIo, un acyle ramifié en C3 à
CI o, un pyroglutamate ou -R4-[GH] ;
^ R4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 résidus
acide aminé ;
^ AI et A2 représentent indépendamment -CH2- (résidu aspartique) ou -CH2-
CH2- (résidu glutamique) ;
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^ n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est
suffisamment basse pour que le polymère mis en solution dans l'eau à pH
7 et à 25 C, forme une suspension colloïdale de particules de polymère;
^ n + m varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300 ;
= GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de
carbone ou est choisi dans le groupe comprenant les radicaux tels que
définis ci-dessus dans les paragraphes (i), (ii), (iii) et (iv).
Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de
formule
(I), on se reportera utilement aux demandes de brevet FR 02 07008 et FR 03
50190.
Selon une autre possibilité, le polymère polyélectrolyte PE2, ou l'un de ses
sels
pharmaceutiquement acceptables, répond à l'une des formules (II), (III) et
(IV) suivantes :
~1COOH ~COOH
O A' H H AZ O
[GH] ~N ,[GH]
Ra N RsO N Ra
I m (
(II) H O O H
1~1COOH ~COOH
H A' O O A2 H
[GH] 1~I i ,[GH]
R4
if, N R50 N R4
( n m
(IlI) O H H O
" COOH
H A" O
[GH] N J~ /[GH]
. R4 N R4
I n.,
(I~l) O H
dans lesquelles :
^ GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de
carbone ;
^ R30 est un groupement alkyle linéaire en Cz à C6 ;
^ R50 est un alkyle, un dialcoxy ou un diamino en C2 à C6 ;
^ R4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 résidus
acide aminé ;
^ A1 et A2 représentent indépendamment un radical -CH2- (résidu
aspartique) ou -CH2-CH2- (résidu glutamique) ;
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^ n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à
1000, de préférence entre 50 et 300.
Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de
formule
(I), (11) et (IV), on se reportera utilement à la demande de brevet FR 03
50641.
Selon une autre possibilité, l'un des polymères polyélectrolytes (PE1, PE2),
ou l'un
de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, répond à la formule (V) suivante
:
O R70
O OH
O O
H H D
N N
E H
7 H
O r O
q s
P
O B O R9o
1
GH
V
dans laquelle :
^ E- représente indépendamment :
- un -NHR dans lequel R représente H, un alkyle linéaire en C2 à C10,
un alkyle ramifié en C3 à C10 ou un benzyle,
- un résidu acide aminé ou un dérivé d'acide aminé terminal de
formule :
-NH-C-COR~
R$
dans laquelle
R' est OH, OR9 ou NHR10,
et R8, R9 et R10 représentent indépendamment H, un alkyle linéaire en
C2 à C10, un alkyle ramifié en C3 à C10 ou un benzyle;
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^ B est une liaison directe ou un groupement de liaison divalent, trivalent ou
tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :
-0-, -NH-, -N(-C1_5 alkyle)- , un résidu d'acide aminé (de
préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool
ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone,
^ D représente H, un acyle linéaire en C2 à Cio, un acyle ramifié en C3 à Clo,
ou un pyroglutamate;
^ GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de
carbone;
^ R70 représente un radical choisi dans le groupe suivant :
--NH-(CHz),-NH3+ avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est
égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+,
- -O-(CH2)2-NH3+,
- -O-(CH2)2-N+(CH3)3,
R11 N~
NH2+
H
où -R1 1 représente -H, -CO2H, un ester d'alkyle (de préférence -COOMe et
;
-COOEt), -CHzOH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2
- un résidu d'acide aminé ou dérivé d'acide aminé de formule :
0 ::1 XR12
-N R13
H
dans laquelle :
X est un atome d'oxygène ou -NH-,
R12 est H, alkyle linéaire en C2 à Cio, alkyle ramifié en C3 à CIo ou
benzyle,
-R13 est -(CH2)4NH3+, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3+, -(CH2)3NH3+;
le contre-anion de R70 est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un
acétate, de préférence un chlorure;
^ R90 représente un hydroxyéthylamino-, un résidu d'alkylène glycol ou un
polyoxyalkylène ;
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^ p, q, r et s sont des entiers positifs;
^(p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements
hydrophobes GH varie de 2 à 99 % molaire, et de préférence entre 5 et 50 %
sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au
5 moins 3 greffons hydrophobes;
^(q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements
cationiques et varie de 1 à 99 % molaire;
~(p+q+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ;
^(r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire;
10 ^(s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire.
Les dérivés de la lysine, de l'ornithine, et de l'arginine peuvent être par
exemple des
esters éthyliques et méthyliques, des amides, et des amides méthylés.
De préférence selon cette variante, les groupements hydrophobes GH et les
15 groupements cationiques sont disposés de façon aléatoire en groupements
pendants.
Il est par ailleurs préférable que le taux de greffage molaire en motif
hydrophobe
des polyglutamates soit compris entre 2 et 99 %, et de préférence entre 5 et
50 % sous
condition que chaque chaîne de polymère possède en moyenne au moins 3 greffons
hydrophobes.
Le rapport (q)/(p+q+r+s) des polyglutamates signifie qu'ils peuvent contenir
de 1 à
environ 97 % molaire de groupements contenant une charge cationique.
Le rapport (s)/(p+q+r+s) des polyglutamates signifie qu'ils peuvent être
anioniques,
neutres ou cationiques à pH neutre.
Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de
formule
(V) dérivés de l'histidine, on se reportera utilement à la demande de brevet
FR 05 53302.
Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de
formule (V)
autres que ceux dérivés de l'histidine, on se reportera utilement à la demande
de brevet
FR 07 03185.
Suivant une variante intéressante, le groupement R4 ou B représenté dans les
formules précédentes représente une liaison directe.
Selon une autre possibilité, l'un des polymères polyélectrolytes (PE1, PE2)
comprend des résidus hydroxyalkyl (de préférence éthyl) glutamine et une
multiplicité de
groupements hydrophobes (GH) pendants et identiques ou différents entre eux.
Les résidus
hydroxyalkylglutamine sont également porteurs de groupements
hydroxyalkylamine. Ces
groupements hydroxyalkylamine sont, de préférence, liés au copolymère par
l'intermédiaire d'une liaison amide. Les groupements hydroxyalkylamine
utilisables pour
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fonctionnaliser les résidus glutamates de ces résidus hydroxyalkylglutamine
sont
identiques ou différents entre eux et sont par exemple choisis parmi les
groupements
suivants: 2-hydroxyéthylamino, 3-hydroxypropylamino, 2,3-dihydroxypropylamino,
tris(hydroxyméthyl)méthylamino et 6-hydroxyhexylamino.
Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH utilisé dans la
présente invention est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins
une rotule
(ou motif) d'espacement ("spacer") permettant de relier le groupement
hydrophobe GH à
une chaîne de copolyglutamates (par exemple une chaîne principale - squelette-
copolyglutamates). Cette rotule peut comprendre, e.g. au moins une liaison
covalente
directe et/ou au moins une liaison amide et/ou au moins une liaison ester. Par
exemple, la
rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment:
les résidus
"acide aminé" différents de l'unité monomérique constitutive du
copolyglutamate, les
dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple les
diamines), les
dérivés des polyols (par exemple les diols) et les dérivés des hydroxyacides.
Le greffage
des GH sur la chaîne copolyglutamate ou polyalkylglutamine peut passer par la
mise en
oeuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne copolyglutamates ou
aux résidus
hydroxyalkylglutamines. Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que
cela ne soit
limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les amines, ces
composés
pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art. Pour plus de
détails sur ces
résidus hydroxyalkyl- (de préférence hydroxyéthyl-) glutamine, on se référera
au
FR 2.881.140.
Suivant une variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des
différentes
possibilités susvisées, tout ou partie des groupements hydrophobes (GH)
utilisés dans la
présente invention sont choisis de façon indépendante dans le groupe de
radicaux
comportant :
^ un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et
pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N
et/ou S) et/ou au moins une insaturation,
^ un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs
carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insatu-
ration et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S),
^ un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et
pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéro-
atome (de préférence O et/ou N et/ou S).
Suivant une autre variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des
différentes possibilités susvisées, le groupement hydrophobe (GH) est issu
d'un précurseur
alcoolique choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le
tétradécanol,
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l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oléylalcool, le tocophérol ou le cholestérol,
et R4 représente
une liaison directe.
Suivant une autre variante avantageuse, les groupements hydrophobes (GH),
notamment selon au moins l'une des différentes possibilités susvisées,
représentent chacun
indépendamment les uns des autres un radical monovalent de formule suivante :
I ~
N
R s
R5
(GH)
dans laquelle :
- R 5 représente un méthyle (alanine), isopropyle (valine), isobutyle
(leucine), secbutyle (isoleucine), benzyle (phénylalanine) ;
- R6 représente un radical hydrophobe comportant de 6 à 30 atomes de
carbone;
- lvariede0à6.
Selon une caractéristique remarquable de l'invention, tout ou partie des
radicaux
hydrophobes R6 des groupements hydrophobes (GH) sont choisis de façon
indépendante
dans le groupe de radicaux comportant :
^ un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et
pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N
et/ou S) et/ou au moins une insaturation,
^ un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs
carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insatu-
ration et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S),
^ un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et
pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéro-
atome (de préférence O et/ou N et/ou S).
En pratique et sans que cela ne soit limitatif, ledit radical hydrophobe R6
est issu
d'un précurseur alcoolique choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le
dodécanol, le
tétradécanol, l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oléylalcool, le tocophérol ou le
cholestérol.
Avantageusement, la chaîne principale des polyaminoacides polyélectrolytes
(PE1,
PE2) utilisés dans l'invention est choisie parmi le groupe comprenant les
homopolymères
d'alpha-L-glutamate, les homopolymères d'alpha-L-glutamique, les homopolymères
d'alpha-L-
aspartate, les homopolymères d'alpha-L-aspartique, les copolymères d'alpha-L-
aspartate/
alpha-L-glutamate et les copolymères d'alpha-L-aspartique/alpha-L-glutamique.
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De manière remarquable, la distribution des résidus aspartiques et/ou
glutamiques
de la chaîne polyaminoacide principale du polymère polyélectrolyte PEl ou PE2
est telle
que le polymère ainsi constitué est soit aléatoire, soit de type bloc, soit de
type multibloc.
Selon un autre mode de définition, le polymère polyélectrolyte PE1 ou PE2 a
une
masse molaire qui se situe entre 2 000 et 100 000 g/mole, et de préférence
entre 5 000 et
40 000 g/mole.
Le degré de polymérisation des premier et second polymères polyélectrolytes
(PE1,
PE2) est compris entre 50 et 500, de préférence entre 70 et 300.
La fraction molaire des chaînons de la chaîne principale substitués par des
groupements hydrophobes est comprise entre 1 et 40 % molaire, de préférence
entre 3 et
30 % molaire.
Les polymères utilisés dans la présente invention sont choisis parmi les
différentes
familles décrites ci-dessus de sorte qu'ils sont globalement cationiques ou
anioniques à la
valeur de pH égale à pHm.
Une caractéristique essentielle du premier polymère polyélectrolyte (PEl)
porteur
de groupements hydrophobes latéraux, est de pouvoir former spontanément dans
l'eau une
solution colloïdale.
Sans vouloir être lié par la théorie, on peut avancer que l'association
supramoléculaire des groupements hydrophobes pour former des domaines
hydrophobes,
conduit à la formation de nanoparticules. Chaque nanoparticule est constituée
par une ou
plusieurs chaînes de polymères PEI plus ou moins condensées autour de ses
domaines
hydrophobes. Il convient de comprendre que les polymères utilisés dans
l'invention
contiennent des fonctions ionisables qui sont, selon le pH et la composition,
soit neutres
(par exemple -COOH, -NH2), soit ionisées (par exemple -COO-, -NH3+). Pour
cette raison,
la solubilité dans une phase aqueuse est directement fonction du taux de
fonctions ionisées
et donc du pH. En solution aqueuse, dans le cas de fonctions carboxyliques, le
contre-ion
peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium,
ou un cation
organique tel que la triéthanolamine, le tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou
une
polyamine telle que la polyéthylèneimine. Le contre-anion des groupements
cationiques est
de préférence choisi parmi le groupe comprenant un chlorure, un sulfate, un
phosphate ou
un acétate.
Connaissant le pH de demi-neutralisation, l'homme de l'art sait ajuster le pH
afin
que le degré d'ionisation du polymère soit suffisamment élevé et assure la
stabilité de la
solution colloïdale.
Les polyélectrolytes de type polyaminoacide susceptibles d'être utilisés dans
la
présente invention sont obtenus, par exemple, par des méthodes connues de
l'homme de
l'art. Les polyaminoacides statistiques peuvent être obtenus par greffage du
greffon
hydrophobe, préalablement fonctionnalisé par "l'espaceur", directement sur le
polymère
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par une réaction classique de couplage. Les polyélectrolytes polyaminoacides
blocs ou
multiblocs peuvent être obtenus par polymérisation séquentielle des anhydrides
de N-
carboxy-aminoacides (NCA) correspondants.
On prépare par exemple un polyaminoacide, homopolyglutamate,
homopolyaspartate ou un copolymère glutamate/aspartate, bloc, multibloc ou
aléatoire
selon des méthodes classiques.
Pour l'obtention de polyaminoacide de type alpha, la technique la plus
courante est
basée sur la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA),
décrite, par
exemple, dans l'article "Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de H.R.
Kricheldorf
"alpha-Aminoacid-N-Carboxy Anhydrides and related Heterocycles" Springer
Verlag
(1987). Les dérivés de NCA sont de préférence des dérivés NCA-O-Me, NCA-O-Et
ou
NCA-O-Bz (Me = Méthyl, Et = Ethyle et Bz = Benzyle). Les polymères sont
ensuite
hydrolysés dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa
forme acide.
Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans le brevet FR 2 801
226 de la
demanderesse. Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention,
par exemple,
de type poly(alpha-L-aspartique), poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-
glutamique) et
poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement.
Le
polyaspartique de type alpha-bêta est obtenu par condensation de l'acide
aspartique (pour
obtenir un polysuccinimide) suivie d'une hydrolyse basique (cf. Tomida et al.
Polymer
1997, 38, 4733-36).
Le couplage du greffon hydrophobe GH avec une fonction acide du polymère est
réalisé aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide
comme
agent de couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-
diméthylaminopyridine et
dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-
méthylpyrrolidone
(NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le
dicyclohexylcarbodiimide ou le diisopropylcarbodiimide. Le taux de greffage
est contrôlé
chimiquement par la storchiométrie des constituants et réactifs ou le temps de
réaction. Les
greffons hydrophobes fonctionnalisés par un "espaceur" sont obtenus par
couplage
peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide.
Le couplage des groupes cationiques et éventuellement neutres avec une
fonction
acide du polymère est réalisé simultanément dans une deuxième étape en
présence d'un
chloroformiate comme agent de couplage et dans un solvant approprié tel que le
diméthylformamide, la N-méthylpyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide
(DMSO).
Dans le cas où le groupe cationique contient deux fonctions amines non
différenciées chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit
sous une forme
dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de
clivage du
groupement protecteur est alors ajoutée.
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La chimie de polymérisation et les réactions de couplage des groupements sont
classiques et bien connues de l'homme de l'art (voir par exemples les brevets
ou demandes
de brevet de la demanderesse cités précédemment).
5 Pour la synthèse de copolymère bloc ou multibloc, on utilise des dérivés NCA
préalablement synthétisé avec le greffon hydrophobe. Par exemple, le dérivé
NCA-
hydrophobe est copolymérisé avec le NCA-O-Benzyl puis on enlève par hydrolyse
sélectivement les groupements benzyliques.
Des exemples d'associations particulièrement préférées de polymères
10 polyélectrolytes (PE1 et PE2) selon l'invention sont décrits dans les
exemples ci-après.
Une caractéristique essentielle des polymères utilisés dans l'invention est
que le
premier polymère polyélectrolyte (PEl) est sous forme de solution colloïdale,
et que le
second polymère polyélectrolyte (PE2) est sous forme de solution ou de
solution colloïdale
pour au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8.
15 Afin de remplir cette condition, le pH de demi-neutralisation du polymère
cationique sera suffisamment élevé, par exemple supérieur à 5,5, de préférence
supérieur à
6, ou encore supérieur à 8; et le pH de demi-neutralisation du polymère
anionique sera
suffisamment faible, par exemple inférieur à 6,5, de préférence inférieur à
6,0 ou encore
inférieur à 5,5.
20 Plus particulièrement, dans une variante selon laquelle le premier polymère
polyélectrolyte (PE1) est anionique, ce dernier est choisi de sorte qu'il
présente un pH de
demi-neutralisation compris entre 3 et 6,5, et de préférence entre 4,5 et 6,5.
Selon cette
variante, le premier polymère polyélectrolyte (PEl) forme une solution
colloïdale pour une
valeur pHm du pH comprise entre 6 et 8.
Un tel polymère PE1 est notamment décrit dans l'exemple la).
Dans ce cas, et selon une première possibilité, le second polymère électrolyte
(PE2)
est cationique et forme une solution colloïdale à pH inférieur à 8. De
préférence, le second
polymère polyélectrolyte (PE2) est choisi de sorte que son pH de demi-
neutralisation est
supérieur à 8. Un tel polymère PE2 est notamment décrit dans l'exemple ld).
Ainsi selon cette première possibilité, le premier polymère polyélectrolyte
(PE1)
forme une solution colloïdale et le second polymère polyélectrolyte (PE2)
forme une
solution ou une solution colloïdale pour la valeur pHm du pH comprise entre 6
et 8.
Dans ce cas, selon une caractéristique importante de l'invention, le rapport
de la
masse du premier polymère polyélectrolyte (PEl) à la masse du second polymère
polyélectrolyte (PE2) est choisi afin que le rapport de charge Z, rapport du
nombre de
moles de groupements ionisés cationiques au nombre de moles de groupements
ionisés
anioniques, mesurés à pHm, soit compris entre 0,25 et 3, et de préférence
compris entre
0,25 et 1,5.
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Selon une deuxième possibilité, le second polymère polyélectrolyte (PE2) est
cationique et forme une solution colloïdale à pH inférieur à 6 et un précipité
à pH supérieur
à 6,5. De préférence, le second polymère polyélectrolyte (PE2) est choisi de
sorte que son
pH de demi-neutralisation est compris entre 5,5 et 7. Un tel polymère PE2 est
notamment
décrit dans l'exemple 1 c). Dans ce cas, selon une caractéristique importante
de l'invention,
le premier polymère polyélectrolyte (PE 1) forme une solution colloïdale et le
second
polymère polyélectrolyte (PE2) forme une solution ou une solution colloïdale
pour une
valeur du pH, pHm, comprise entre 3 et 6. Le rapport de la masse du premier
polymère
polyélectrolyte (PE 1) à la masse du second polymère polyélectrolyte (PE2) est
choisi afin
que le rapport de charge Z, mesuré à pHm, soit compris entre 3,5 et 30, de
préférence
compris entre 5 et 15, et plus préférentiellement encore compris entre 8 et
12.
Dans une autre variante selon laquelle le premier polymère polyélectrolyte
(PE1)
est cationique, ce dernier est choisi de sorte que son pH de demi-
neutralisation est
supérieur à 5. Dans ce cas, le second polymère électrolyte (PE2) est anionique
et est choisi
de sorte que son pH de demi-neutralisation est compris entre 3 et 6,5, et de
préférence entre
4,5 et 6,5.
Les particules selon l'invention présentent, à pH physiologique, une taille,
mesurée
dans un test T, comprise entre 1 et 100 m.
D'une manière avantageuse, les particules selon l'invention ne sont pas
réticulées
chimiquement.
Dans une réalisation particulière de l'invention, les particules ont, à pH
physiologique, une densité apparente en polymère élevée, comprise entre 0,15
et 1,1, de
préférence comprise entre 0,3 et 1,0, et plus préférentiellement encore
comprise entre 0,5
et 1,0. Une densité en polymère élevée traduit l'existence au sein des
particules d'un réseau
dense de chaînes polymères. Sans vouloir être lié par la théorie, on peut
supposer que ce
réseau dense ralentit la diffusion du principe actif (PA) contenu dans les
particules selon
l'invention vers le milieu extérieur et contribue ainsi à ralentir sa
libération. Un aspect
surprenant des particules denses selon l'invention est que le réseau de
chaînes de
polymères qui les constitue permet de ralentir la libération du PA sans pour
autant piéger
ce même PA au coeur des particules. Ainsi le transporteur selon l'invention
permet
d'obtenir à la fois une libération prolongée du PA et une bonne
biodisponibilité.
Dans certains cas, et en particulier dans le cas de peptides ou de protéines
présentant une forte affinité avec les microparticules selon l'invention, il
peut être
avantageux de moduler la vitesse de libération du principe actif, pour en
accélérer la
libération, et/ou afin d'améliorer sa biodisponibilité. Après de nombreux
essais, il a été
démontré par la Demanderesse que la libération de la protéine ou du peptide
peut être
facilitée lorsque le polymère PEl ou PE2, d'une polarité donnée, est également
porteur de
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groupements ionisables de la polarité opposée et/ou de groupements non
ionisables tels que
des groupements substitués par un radical hydroxyéthylamino-.
Ainsi, dans une réalisation particulière de l'invention, l'un des deux
polymères PE1 ou
PE2 comprend simultanément :
- de 15 à 50 % molaire de monomères glutamate ;
- de 20 à 55 % molaire de monomères non ionisables tels que des groupements
substitués par un radical hydroxyéthylamino- ;
- de 10 à 40 % molaire de monomères porteurs de groupements cationiques de pH
de
neutralisation supérieur à 8 ;
- de 3 à 15 % molaire de monomères non ionisables substitués par un groupement
hydrophobe.
Dans une autre réalisation particulière de l'invention, le polymère PEI ou PE2
est
cationique et comprend simultanément :
- de 0 à 5 % molaire de monomères glutamate ;
- de 50 à 85 % molaire de monomères non ionisables tels que des groupements
substitués par un radical hydroxyéthylamino- ;
- de 10 à 40 % molaire de monomères porteurs de groupements cationiques de pH
de
neutralisation supérieur à 8 ;
- de 3 à 15 % molaire de monomères non ionisables substitués par un groupement
hydrophobe.
Dans une réalisation particulière de l'invention, la concentration totale en
polymère
(PE 1+ PE2) contenue dans la formulation est comprise entre 4 et 15 mg/ml,
notamment
lorsque le principe actif est une protéine thérapeutique. Dans cette gamme de
concentration, la formulation est aisément injectable par une aiguille de
faible diamètre,
par exemple une aiguille de Gauge 27, voire 29, et même 31. Les exemples 3 et
4 décrivent
en détails de telles formulations.
Concernant le principe actif, il est de préférence choisi dans le groupe
comprenant:
les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs
chaînes
polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG) : "protéines-
PEGylées"], les
peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les
polynucléotides
et leurs mélanges,
et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe des érythroproïétines,
telles
que l'époétine alpha, l'époétine bêta, la darbépoétine, le raffimère
d'hémoglobine, leurs
analogues ou leurs dérivés; ocytocine, vasopressine, hormone
adrénocorticotropique,
facteur de croissance épidermique, facteur de croissance des plaquettes
(PDGF), les
facteurs stimulants de l'hématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs
sanguins, tels que
alteplase, tenecteplase, facteur VII(a), facteur VII; hémoglobine, les
cytochromes, les
albumines prolactine, lulibérine (hormone libération de l'hormone lutéinisante
ou LHRH)
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ou analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buséréline,
nafaréline;
antagonistes de la LHRH, les concurrents de la LHRH, les hormones de
croissance (GH)
humaine, porcine ou bovine, l'hormone de libération de l'hormone de
croissance,
l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges
(IL-2, IL-11,
IL-12), les interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta-1
a, ou y; la gastrine,
la tétragastrine, la pentagastrine, 1'urogastrone, la sécrétine, la
calcitonine, les
enképhalines, les endomorphines, les angiotensines, le facteur de libération
de la
thyrotropine (TRH), le facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de
croissance nerveux
(NGF), les facteurs de croissance tels que béclapermine, trafermine,
ancestime, le facteur
de croissance des kératinocytes, le facteur stimulant les colonies
granulocytes (G-CSF), le
facteur stimulant les colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF), le
facteur
stimulant les colonies de macrophages (M-CSF), héparinase, la protéine
morphogénique de
l'os (BMP), hANP, le peptide ressemblant au glucagon (GLP-1), VEG-F,
l'antigène
recombinant de l'hépatite B (rHBsAg), la rénine, les cytokines, la
bradykinine, les
bacitracines, les polymixines, les colistines, la tyrocidine, les
gramicidines, l'étanercept,
l'imiglucérase, la drotrécogine alpha, les cyclosporines et analogies
synthétiques, les
modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d'enzymes, de cytokines,
d'anticorps, d'antigènes et de vaccins, les anticorps tels que rituximab,
infliximab,
trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab, efalizumab, et cetuximab.
D'autres principes actifs sont les polysaccharides (par exemple, l'héparine)
et les
oligo- ou polynucléotides, ADN, ARN, iARN, antibiotiques, et cellules
vivantes. Une autre
classe de principes actifs comprend les substances pharmaceutiques agissant
sur le système
nerveux central, par exemple, rispéridone, zuclopenthixol, fluphénazine,
perphénazine,
flupentixol, halopéridol, fluspirilene, quétiapine, clozapine, amisulprid,
sulpirid,
ziprasidone, etc.
Selon une variante, le principe actif est une petite molécule organique
hydrophobe,
hydrophile ou amphiphile du type de celles appartenant à la famille des
anthracyclines, des
taxoïdes ou des camptothécines ou du type de celles appartenant à la famille
des peptides
telles que la leuprolide ou la cyclosporine et leurs mélanges.
Au sens du présent exposé, une petite molécule est notamment une petite
molécule
non protéinique, par exemple exempte d'acides aminés.
Selon une autre variante, le principe actif est avantageusement choisi parmi
au
moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de
traitement de l'abus
d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les
anesthésiques, les agents
de traitement de l'acromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les
agents de
traitement des allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires,
les
anticoagulants et antithrombotiques, les anti-convulsivants, les
antiépileptiques, les
antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques,
les anti-
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infectieux, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les
antiparkinsoniens, les
anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de l'anhydrase
carbonique, les agents
cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les
vasodilatateurs, les
antiangineux, les anti-hypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de
cholinestérase,
les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les
stimulants du
système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les
inducteurs et
inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose,
les agonistes des
récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les
agents de
traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la
fertilité, les
agents de traitements des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs
et les
immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les
antimigraineux, les relaxants des muscles, les analogues de nucléosides, les
agents de
traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines,
les agents
psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les
neuroleptiques, les
anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de
traitements
dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les
anorexiques, les
anti-douleurs non analgésiques, les anti-épileptiques, les barbituriques, les
benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les
associations de
ces produits.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de
préparation de
particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif, ces
particules étant en
particulier celles décrites ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes
suivantes:
1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une
solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PE1) à
l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit
premier polymère polyélectrolyte (PE1) étant capable de former
spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une
valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8;
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère
polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de
façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier
polymère polyélectrolyte (PEI);
3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité
opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PE1), ledit second
polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une
solution colloïdale à au moins ladite valeur, pHm, du pH; à la condition que,
si le premier polymère électrolyte (PE1) est un polyaminoacide, alors le
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second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la
polyéthylène imine;
4) le mélange à pH égal à pHm du premier polymère polyélectrolyte (PE1)
sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le
5 principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère
polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale
obtenu à l'étape 3).
L'invention a également pour objet un procédé de préparation de particules
pour la
libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules
correspondant en
10 particulier à certaines décrites ci-dessus, comprenant les étapes
suivantes:
1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une
solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PE1) à
l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit
premier polymère polyélectrolyte (PE1) étant capable de former
15 spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins
une
valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8;
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère
polyélectrolyte (PE1) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de
façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier
20 polymère polyélectrolyte (PE1);
3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité
opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), porteur de
groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit second polymère
polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution
25 colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH;
4) le mélange à pH égal à pHm du premier polymère polyélectrolyte (PE1)
sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le
principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère
polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale
obtenu à l'étape 3).
Une caractéristique essentielle du procédé selon l'invention est de former des
particules, spontanément, par simple mélange à pHm d'une solution colloïdale
de
particules du premier polymère polyélectrolyte (PE1) chargées en principe
actif (PA) et
d'une solution ou d'une solution colloïdale du second polymère polyélectrolyte
(PE2) de
polarité opposée.
Les principes actifs tels que des protéines, des peptides ou des petites
molécules,
peuvent s'associer spontanément au premier polymère (PE 1) de type
polyaminoacides. Le
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chargement des nanoparticules du premier polymère polyélectrolyte (PEl) par le
principe
actif (PA) s'effectue par simple mélange d'une solution de principe actif (PA)
avec une
solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl). Cette
association est
purement physique et n'implique pas de création de liaison covalente entre le
principe actif
(PA) et le polymère (PEl). Sans être lié par la théorie, on peut supposer que
cette
association non spécifique s'effectue par interaction hydrophobe etlou
électrostatique entre
le polymère (PEI) et le principe actif (PA). Il est à noter qu'il n'est pas
nécessaire, et
souvent même non souhaitable, de lier le PA aux nanoparticules de PE1 par des
récepteurs
spécifiques de nature peptidique ou de type antigène/anticorps ou encore
enzyme/substrat.
Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, il n'est pas
prévu
d'étape de réticulation chimique des particules obtenues. Les particules selon
l'invention ne
sont donc pas réticulées chimiquement et libèrent néanmoins le principe actif
(PA) sur une
durée prolongée. Cette absence de réticulation chimique est un avantage
décisif des
particules selon l'invention. En effet, l'absence de réticulation chimique
permet d'éviter la
dégradation chimique du principe actif (PA) lors de l'étape de réticulation
des particules
contenant le principe actif (PA). Une telle réticulation chimique est en effet
généralement
conduite par activations d'entités polymérisables et met en jeu des agents
potentiellement
dénaturants tel que les rayonnements UV, ou le glutaraldéhyde.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une étape de
déshydratation de la suspension de particules obtenues (par exemple par
lyophilisation ou
atomisation), afin de les obtenir sous forme de poudre sèche.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet une formulation
pharmaceutique pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA),
comprenant
une suspension aqueuse de particules telles que décrites ci-dessus ou celles
obtenues par le
procédé décrit ci-dessus.
La présente invention concerne également une formulation pharmaceutique solide
pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), comprenant une
forme
poudre sèche:
= à base de particules contenant au moins un principe actif (PA), ces
particules étant
celles décrites ci-dessus ou celles obtenues par le procédé décrit ci-dessus;
= ou obtenue à partir de la formulation comprenant une suspension en solution
aqueuse évoquée ci-dessus.
Avantageusement, une telle formulation pharmaceutique solide est utilisée pour
inhalation et administration pulmonaire.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de
préparation de
médicaments, en particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-
cutanée,
intramusculaire, intradermique, transdermique, intrapéritonéale,
intracérébrale ou dans une
tumeur, voire par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, ledit
procédé
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consistant essentiellement à mettre en oeuvre au moins l'une des formulations
décrites ci-
dessus.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1: Libération in vitro d'IFN-a à partir des formulations de particules
de l'exemple 2
(ronds blancs), de l'exemple 3.1 (triangles noirs), de l'exemple 3.2 (losanges
noirs), de
l'exemple 3.3 (carrés noirs), de l'exemple 4 (ronds noirs) et de l'exemple 5
(traits).
EXEMPLES
1) Synthèses:
a) Synthèse d'un polymère po yélectrolyte PEI -A porteur de groupements
hydrophobes,
anionique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique)
On solubilise 15 g d'un acide alpha-L-polyglutamique (de masse équivalente à
environ
16 900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène et obtenu par
polymérisation de
NCA-GluOMe suivie d'une hydrolyse comme décrits dans la demande de brevet
FR-A-2 801 226) dans 288 ml de diméthylformamide (DMF) en chauffant à 80 C
jusqu'à
solubilisation du polymère. On refroidit la solution à 15 C et on ajoute
successivement
2,5 g de D, L-alpha-tocophérol (> 98 % obtenu de Fluka(k) préalablement
solubilisé dans
8 ml de DMF, 280 mg de 4-diméthylaminopyridine préalablement solubilisée dans
1 ml de
DMF et 1,6 g de diisopropylcarbodiimide préalablement solubilisé dans 6 ml de
DMF.
Après 3 h sous agitation, le milieu réactionnel est versé dans 1200 ml d'eau
contenant 15 %
de chlorure de sodium et d'acide chlorhydrique (pH = 2). Le polymère précipité
est ensuite
récupéré par filtration, lavé par de l'acide chlorhydrique 0,1 N, de l'eau et
par de l'éther
diisopropylique. Le polymère est ensuite séché à l'étuve sous vide à 40 C. On
obtient un
rendement de l'ordre de 90 %. La masse molaire mesurée par la chromatographie
d'exclusion stérique est de 15 500 par rapport à un standard polyoxyéthylène.
Le taux de
tocophérol greffé, estimé par la spectroscopie RMN du proton, est de 5,1 %
molaire.
b) Synthèse d'un polymèrepolyélectrolyte PEI-B anionique (polyglutamate de
sodium)
On adapte la synthèse d'un acide alpha-L-polyglutamique comme décrit dans la
demande de brevet FR-A-2 801 226.
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La masse molaire mesurée par la chromatographie d'exclusion stérique est de
16 900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène.
c) Synthèse d'un polymére polyélectrolyte PE2-A cationique (polyglutamate
greffé par
l'alpha-tocophérol d'origine synthétique et par de l'histidinamide)
H
~N
N /
O
H2N
O NH
O
O
E N `" ~.N.~ P N 1 D
O
O T
O ONa
Indices et groupements : m = 11, p = 209, q = 0, T = D,L-alpha-tocophéryl (T)
3 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique
avec
de l'alpha-tocophérol racémique sont solubilisés par chauffage à 80 C dans 38
ml de
NMP. A cette solution refroidie à 0 C, sont ajoutés 2,74 g d'isobutyl
chloroformiate puis
2,2 mL de N-méthyl morpholine. Le milieu réactionnel est agité 10 min en
maintenant la
température à 0 C. En parallèle, 8,65 g du dichlorhydrate d'histidinamide sont
suspendus
dans 108 mL de NMP. 10,6 ml de triéthylamine sont ensuite ajoutés et la
suspension
obtenue est agitée à 20 C pendant quelques minutes puis refroidie à 0 C. On
procède
ensuite à l'ajout de la solution de polymère activé sur la suspension
d'histidinamide. Le
milieu réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis 1 nuit à 20 C. On ajoute
ensuite
0,62 mL d'HCl 35 %, puis 83 mL d'eau. On verse ensuite la solution obtenue
dans 500 mL
d'eau à pH compris entre 3 et 4. La solution est ensuite diafiltrée contre 8
volumes d'eau
salée (0,9% NaCI) et 4 volumes d'eau. La solution de polymère est ensuite
concentrée
jusqu'à un volume de 300 mL (la concentration en polymère est de 18 mg/g). Le
pourcentage d'histidinamide greffée, déterminé par RMN 'H dans D20 est de 95
%.
d) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-B cationique (polyglutamate
greffé par
l'alpha-tocophérol d'origine synthétique et par de l'arginine)
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NH
HN NH3+,CI-
CONH2
NH ONa
O p
N D
H N
H2N H H
P O 4 r p
O T /\/OH
O N
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophéryl, p = s = 11 q = 198, r = 0
Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon
statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de
NMP à
80 C. Cette solution est refroidie à 0 C, et 8,7 mL de chloroformiate d'iso-
butyle puis
7,35 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité
minutes à 0 C. En parallèle, 24,67 g de dichlorhydrate d'argininamide sont
suspendus
dans 308 mL de NMP et 14,7 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension
obtenue est
agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0 C. La suspension laiteuse
de polymère
10 activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel
est agité pendant
2 h à 0 C, puis une nuit à 20 C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl
35 % puis
100 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 1,6 L
d'eau. La
solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4
volumes d'eau,
et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Le pourcentage
d'argininamide
15 greffée, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 90 %.
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e) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-C cationique (polyglutamate
greffé par
l'alpha-tocophérol d'origine synthétique, de l'arginine et de l'éthanolamine)
NH
HN"k NH3+,CI"
CONH2
O NH
O ONa
O O
H N
N H
H S
H2N jN iIZ
q r O
~/OH
O T O N
H
5 Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p 11, q = 88, r = 99, s 22
Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon
statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de
NMP à
80 C. Cette solution est refroidie à 0 C, et 9,1 mL de chloroformiate d'iso-
butyle puis
10 7,71 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est
agité 15 min à
0 C. En parallèle, 8,2 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans
103 mL de
NMP et 9,31 mL de triéthylamine sont ajoutés. On ajoute encore 1,6 mL
d'éthanolamine,
et la suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à
0 C. La
suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette
suspension, et le
15 mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C. On ajoute 1,2 mL
d'éthanolamine, puis
agite une nuit à 20 C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis
200 mL
d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 700 mL d'eau,
tout en ajustant
le pH vers 7,4. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau
salée (0,9 %) puis
4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les
pourcentages
20 d'argininamide et d'éthanolamine greffées, déterminés par RMN du proton
dans D2O, sont
respectivement de 40 et 45 %.
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31
t) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-D cationique (polyglutamate
greffé par
l'alpha-tocophérol d'origine synthétique, de l'arginine et de l'éthanolamine)
NH
HN"k NH3+,CI"
CONH2
O NH
O ONa
O H 0 N
N
H2N jH
H S
a
r O
~/OH
O T O N
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p 11, q = 48, r = 150, s 11
Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon
statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de
NMP à
80 C. Cette solution est refroidie à 0 C, et 8,7 mL de chloroformiate d'iso-
butyle puis
7,3 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité
15 min à
0 C. En parallèle, 4,61 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans
58 mL de
NMP et 2,9 mL de triéthylamine sont ajoutés. On ajoute encore 2,8 mL
d'éthanolamine, et
la suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0
C. La
suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette
suspension, et le
mélange réactionnel est agité pendant 4 h à 0 C. On ajoute 1,2 mL
d'éthanolamine, puis
agite une nuit à 20 C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 %, le
mélange
réactionnel est versé goutte à goutte dans 730 mL d'eau, tout en ajustant le
pH vers 7,4. La
solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4
volumes d'eau,
et concentrée jusqu'à un volume d'environ 300 mL. Les pourcentage
d'argininamide et
d'éthanolamine greffées, déterminés par RMN du proton dans D2O, sont
respectivement de
22 et 68 %
2) Exemple I(comparati~: préparation de particules avec des polyélectrolytes
ne
présentant pas de groupement hydrophobe
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(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE1-B:
On utilise le polymère PE 1-B obtenu selon la synthèse b) ci-dessus. Ce
polymère a un pH
de demi-neutralisation égal à 5,985.
Une solution colloïdale de polymère PEl-B est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 7,63 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la
solution est
ajustée à 100 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution
aqueuse de NaCI.
La concentration en polymère PEl-B est ajustée à 8,38 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-B:
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-B précédente de la protéine
IFN-a
concentrée à 2,4 mg/g. On obtient l'association ayant les caractéristiques
suivantes :
PE1-B (mg/g) IFN-a] (mg/g) pH
4,55 1,1 7,17
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 C, sous agitation.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de poly-L-arginine (Aldrich P7637):
Ce polymère a un pH de demi-neutralisation supérieur à 9.
Une solution colloïdale de poly-L-arginine est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant premièrement le pH à 0,92 avec une solution de HCI, puis en le
remontant à pH
égal à 6,91 avec une solution de NaOH et en chauffant la solution à 45 C
pendant 15 min.
La concentration en polymère poly-L-arginine est ajustée à 5,13 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules
On ajoute goutte à goutte sous agitation 1,37 g de la solution de poly-L-
arginine sur 1,06 g
de la solution de IFN-a/PE1-B, à 45 C. On agite 15 min à 45 C. Puis, on
agite une nuit à
4 C.
Le tableau I ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:
Le rapport de charge Z est le rapport du nombre de moles de groupements
ionisés
cationiques au nombre de moles de groupements ionisés anioniques, mesurés à
pHm égal à
6,95.
La taille des particules est mesurée selon le test T.
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Tableau I
[polymère] [IFN-a] Z pHm Taille
(mg/g) (mg/g) m)
4,8 0,48 1,06 6,95 15,92
(5) Quantification de l'encapsulation de la protéine
On centrifuge la suspension 15 min à 8000 rpm et on dose l'IFN-a dans le
surnageant par
la méthode décrite dans la Pharmacopée européenne (dosage colorimétrique par
absorbance UV).
[IFN-a] totale [IFN-a] libre Rendement
(mg/g) (m (%)
0,48 0,15 71
Presque un tiers de la protéine introduite n'est pas encapsulé dans les
microparticules
formées. Cette proportion ne peut conduire à une libération contrôlée.
3) Exemple 2: préparation de particules avec un seul polyélectrolyte (PE1)
présentant des
groupements hydrophobes
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A:
On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Ce
polymère a un pH
de demi-neutralisation égal à 5,445.
Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 7,53 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la
solution est
ajustée à 101 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution
aqueuse de NaCI.
La concentration en polymère PEl-B est ajustée à 8,41 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-A:
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine
IFN-a
concentrée à 2,4 mg/g. On obtient l'association ayant les caractéristiques
suivantes :
PEI-A m ) IFN-a (mg/g) pH
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L 4,58 1,1 7,17
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 C, sous agitation.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de poly-L-arginine (Aldrich P7637):
On prépare la solution de façon identique à celle décrite dans l'exemple 1.
(4) Mélange pour obtenir les particules
On ajoute goutte à goutte sous agitation 1,24 g de la solution de poly-L-
arginine sur 1,07 g
de la solution de IFN-a/PEl-A, à 45 C. On agite 15 min à 45 C. Puis, on agite
une nuit à
4 C.
Le tableau II ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules
obtenues:
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 6,88.
La taille des particules est mesurée selon le test T.
Tableau II
[polymère] [IFN-a] Z pHm Taille (mg/g) (mg/g) (gm)
4,7 0,505 1,00 6,88 18,24
(5) Quantification de l'encapsulation de la protéine
On centrifuge la suspension 15 min à 8000 rpm et on dose l'IFN-a dans le
surnageant par
la méthode décrite dans la Pharmacopée européenne (dosage colorimétrique par
absorbance UV).
[IFN-ct] total [IFN-a] libre Rendement
(mg/g) (m ) %)
0,505 0,01 98
La totalité de la protéine introduite est encapsulée dans les microparticules
formées.
4) Exemple 3: préparation de particules à base de PEI A et de PE2-A, contenant
de
l'IFN-a
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4.1) Exemple 3.1: concentration finale en polymère environ égale à 10 mg/g, Z
étant égal à
1 environ
5 (1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE1-A:
On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Ce
polymère a un pH
de demi-neutralisation égal à 5,445.
Une solution colloïdale de polymère PE1-A est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 7,45 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la
solution est
10 ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution
aqueuse de NaCI.
La concentration en polymère PE1 est ajustée à 23,88 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PE1-A:
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PE1-A précédente de la protéine
IFN-a
15 concentrée à 2,4 mg/g et du NaC1 à 89 mOsm. On obtient l'association ayant
les
caractéristiques suivantes :
PE1-A (mg/g) IFN-a (mg/g) H Osmolarité (mOsm)
13,33 1,01 6,51 322
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 C, sous agitation.
L'association est ensuite
20 ajustée à pH égal à 5,07.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-A:
On utilise le polymère PE2-A obtenu selon la synthèse c) ci-dessus. Ce
polymère a un pH
25 de demi-neutralisation égal à 6,05.
Une solution colloïdale de polymère PE2-A est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 5,17. L'osmolarité de la solution est ajustée à 289 mOsm et
la
concentration en polymère PE2-A est ajustée à 5,70 mg/g.
30 (4) Mélange pour obtenir les particules
On ajoute goutte à goutte sous agitation 4,98 g de la solution de PE2-A sur
4,61 g de la
solution de IFN-a/PE1-A. On agite une nuit à 4 C.
Le tableau III ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules
obtenues:
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 5,17.
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La taille des particules est mesurée selon le test T.
Tableau III
[polymère] [IFN-a] Z pHm Osmolarité Taille
(mg/g) (mg/g) mOsm ( m)
9,1 0,46 0,83 5,17 370 7,7
4.2) Exemple 3.2: concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z étant
égal à 10
environ
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A :
On utilise le polymère PE1-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus.
Une solution colloïdale de polymère PE1 est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la
solution est
ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution
aqueuse de NaCI.
La concentration en polymère PE1 est ajustée à 20,21 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-A :
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine
IFN-a
concentrée à 2,4 mg/g et du NaCI à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les
caractéristiques suivantes :
PE 1-A] (mg/g) [IFN-a] (mg/g) pH Osmolarité (mOsm)
1,7 0,1 5,45 324
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 C, sous agitation.
L'association est ensuite
ajustée à pH égal à 4,88.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-A :
On utilise le polymère PE2-A obtenu selon la synthèse c) ci-dessus.
Une solution colloïdale de polymère PE2-A est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 5,07. L'osmolarité de la solution est ajustée à 287 mOsm et
la
concentration en polymère PE2-A est ajustée à 8,11 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules :
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On ajoute goutte à goutte sous agitation 5,19 g de la solution de PE2-A sur
5,02 g de la
solution de IFN-a/PE1-A. On agite une nuit à 4 C.
Le tableau IV ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules
obtenues:
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 4,81.
La taille des particules est mesurée selon le test T.
Tableau IV
[polymère] [IFN-a] Z pHm Osmolarité Taille
(mg/g) (m mOsm) ( m)
5,0 0,49 13,43 4,81 306 15,1
4.3) Exemple 3.3: concentration finale en polymère égale à 10 mg/g, Z étant
égal à 10
environ
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A :
On utilise le polymère PE1-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus.
Une solution colloïdale de polymère PEI-A est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la
solution est
ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution
aqueuse de NaCI.
La concentration en polymère PE1-A est ajustée à 20,21 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PE1-A :
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PE1-A précédente de la protéine
IFN-a
concentrée à 2,4 mg/g et du NaCl à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les
caractéristiques suivantes :
PE1-A (m IFN-a (mg/g) pH Osmolarité (mOsm)
3,39 1,01 5,83 347
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 C, sous agitation.
L'association est ensuite
ajustée à pH égal à 5,07.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-A :
On utilise le polymère PE2-A obtenu selon la synthèse c) ci-dessus.
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Une solution colloïdale de polymère PE2-A est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 5,08. L'osmolarité de la solution est ajustée à 288 mOsm et
la
concentration en polymère PE2-A est ajustée à 16,37 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules :
On ajoute goutte à goutte sous agitation 5,25 g de la solution de PE2-A sur
5,19 g de la
solution de IFN-a/PEl-A. On agite une nuit à 4 C.
Le tableau V ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 4,95.
La taille des particules est mesurée selon le test T.
Tableau V
[polymère] [IFN-a] Z pHm Osmolarité Taille
(mg/g) (mg/g) mOsm) m
9,9 0,5 8,20 4,95 314 10,3
5) Exemple 4 : préparation de particules à base de PEI A et de PE2-B,
contenant de
l'IFN-c~ concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z = 1
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A :
On utilise le polymère PEI-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus.
Une solution colloïdale de polymère PE1-A est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la
solution est
ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution
aqueuse de NaCI.
La concentration en polymère PEI-A est ajustée à 20,21 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-A :
On ajoute à la solution colloïdale de polymére PE1-A précédente de la protéine
IFN-a
concentrée à 2,4 mg/g et du NaCI à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les
caractéristiques suivantes :
PE1-A (m ) IFN-a (mg/g) H Osmolarité (mOsm
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3,715 1,01 5,89 335
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 C, sous agitation.
L'association est ensuite
ajustée à pH égal à 6,89.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-B :
On utilise le polymère PE2-B obtenu selon la synthèse d) ci-dessus. Ce
polymère a un pH
de neutralisation supérieur à 9.
Une solution colloïdale de polymère PE2-B est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 6,98. L'osmolarité de la solution est ajustée à 288 mOsm et
la
concentration en polymère PE2-B est ajustée à 6,33 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules :
On ajoute goutte à goutte sous agitation 4,06 g de la solution de PE2-B sur
4,59 g de la
solution de IFN-a/PE1-A. On agite une nuit à 4 C.
Le tableau VI ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules
obtenues:
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 6,85.
La taille des particules est mesurée selon le test T.
Tableau VI
[polymère] [IFN-a] Z pHm Osmolarité Taille
(mg/g) (mg/g) (mOsm) ( m)
5 0,46 1,01 6,85 360 17,1
6) Exemple S(comparati~ : préparation de particules à base de PEI A seul,
contenant
de l'IFN-a
On utilise le polymère PE1-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus.
Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans
l'eau en
ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la
solution est
ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution
aqueuse de NaCI.
La concentration en polymère PEI-A est ajustée à 29,05 mg/g.
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEI précédente de la protéine
IFN-a
concentrée à 2,4 mg/g. L'association est réalisée pendant une nuit à 25 C,
sous agitation.
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Le tableau VII ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules
obtenues:
La taille des particules est mesurée selon le test T'.
5 Tableau VII
[PEI -A] (mg/g) [IFN-a] (mg/g) pH Osmolarité (mOsm) Taille (nm
23 0,5 7,20 300 40
7) Résultats in vitro pour les exemples 2, 3, 4 et 5
10 Pour cela, on mesure la libération du principe actif à partir des
particules selon l'invention
en utilisant le test L.
La figure 1 montre la libération dans le test L sous la forme du pourcentage
de protéine
libérée au cours du temps.
La formulation de l'exemple comparatif 2 où un seul des polymères est porteur
de
groupements hydrophobes présente un profil de libération très faible, avec 1,6
% de la
protéine libérée au bout de 23 h.
La formulation de l'exemple comparatif 5, contenant 23 mg/g de particules de
PE1 présente
un profil similaire aux particules de l'exemple 3.1 (PE1/PE2-A, Z=1 à 10 mg/g)
(respectivement 93 % en 10 h et 72 % en 48 h).
Dans le cas des particules des exemples 3.2 (PE1/PE2-A, Z = 10 et 5 mg/g) et
3.3
(PEI/PE2-A, Z = 10 et 10 mg/g), on observe la création d'un flux constant de
libération,
qui n'est pas nul à la fin de l'expérience : respectivement 65 et 19 % de la
protéine injectée
en 48 h.
Dans le cas des particules de l'exemple 4(PE1/PE2-B, Z = 1 et 5 mg/g), on
observe la
création d'un flux constant de libération, qui n'est pas nul à la fin de
l'expérience, avec une
libération de 7 % de la protéine injectée en 48 h.
8) Résultats in vivo pour les exemples 3, 4 et 5
44 rats ont été séparés en 5 groupes de 8 ou 12 animaux et ont reçu en
parallèle une
formulation à libération immédiate IR ou une formulation à libération
prolongée
correspondant à l'exemple comparatif 5 ou une des formulations des exemples de
l'invention 3 et 4, à la dose de 300 g/kg.
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Les résultats pharmacocinétiques sont regroupés dans le tableau VIII ci-
dessous:
Tableau VIII
Exemple N Cmax T,,,aX médian AUC T50%AUC RBA (%)
(ng/mL) (intervalle) (ng x h/mL) (h)
(h)
IFN IR 12 100,6 0,5 (0,25-1) 255,9 1,5 100
(0,5)
Ex 4 8 1,8 3(3-6) 13,6 9,0 5
Ex 3.1 8 7,6 3(3-6) 126,4 11,4 49
Ex 3.2 8 6,1 3(3-6 128,4 18,6 50
Ex 3.3 8 1,7 3(3-12) 74,2 30,7 > 29
Ex 5 8 3,5 12 (6-24) 95,7 18,4 62
C,,,,,x représente la concentration plasmatique maximale moyenne en protéine
sur
l'ensemble des animaux.
T,,,aX médian représente la médiane du temps pour lequel la concentration
plasmatique passe par son maximum.
AUC représente l'aire moyenne sous la courbe de la concentration plasmatique
en
fonction du temps.
T50%Auc représente le temps moyen au bout duquel l'aire sous la courbe atteint
50 % de sa valeur totale.
RBA représente le rapport de l'aire sous la courbe de la formulation
considérée à
l'aire sous la courbe de la formulation IFN IR.
Toutes les formulations présentent un profil de libération prolongée
accompagné
d'une baisse du CmaX par rapport à l'IR.
A l'exception de la formulation de l'exemple 3.1 (PEl/PE2-A, Z=1 à 10 mg/g)
dont
le profil de libération est proche de celle de la formulation de l'exemple
comparatif 5, la
pente terminale est plus faible, ce qui indique une absorption résiduelle
prolongée.
On notera pour la formulation de l'exemple 3.3 (PE1/PE2-A, Z = 10 et 10 mg/g)
une libération jusqu'à plus d'une semaine.
9) Exemple 6 : préparation de particules à base de PEI A et de PE2-C,
contenant de
l'IFN-c~ concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z = 1
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A :
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On utilise le polymère PE1-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une
solution
colloïdale de polymère PEI -A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en
ajustant le pH à
7,15 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée
à 145 mOsm
en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCI. La
concentration en
polymère PEl-A est ajustée à 3,10 mg/g.
(2) Association de la protéine thérapeutique au polymère PE1-A :
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PE1-A précédente de la protéine
IFN-a concentrée à 2,7 mg/g. On obtient l'association ayant les
caractéristiques suivantes :
[PE1-A] [IFN-a] pH Osmolarité
(mg/g) (mg/g) (mOsm)
1,94 1,01 5,6 253
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 C, sous agitation.
L'association est
ensuite ajustée à pH égal à 7,0.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-C:
On utilise le polymère PE2-C obtenu selon la synthèse e) ci-dessus. Une
solution
colloïdale de polymère PE2-C est obtenue en diluant et en ajustant le polymère
PE2-C à
pH 7,04, 288 mOsm et 7,96 mg/g dans du PBS 140 mOsm.
(4) Mélange pour obtenir les particules :
On ajoute goutte à goutte sous agitation 15,147 g de la solution de PE2-C sur
16,374 g de la solution de IFN-a/PEl-A. On agite une nuit à 4 C.
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 7. La taille des particules est
mesurée selon le test T. Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques
des particules
obtenues :
[polymère] [IFN-a] Z pHm Osmolarité Taille
(mg/g) (mg/g) (mOsm) ( m)
4,9 0,49 1,0 7,02 277 50,8
10) Exemple 7: préparation de particules à base de PEI A et de PE2-D,
contenant de
l'IFN-c~ concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z = 1
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE1-A :
On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une
solution
colloïdale de polymère PE1-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en
ajustant le pH à
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7,02 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée
à 101 mOsm
en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCI. La
concentration en
polymère PE1-A est ajustée à 2.0 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymére PE1-A :
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine
IFN-a concentrée à 2,7 mg/g. On obtient l'association ayant les
caractéristiques suivantes :
[PE1-A] [IFN-a] pH Osmolarité
(mg/g) (mg/g) (mOsm)
1,26 1,0 5,5 234
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 C, sous agitation.
L'association est
ensuite ajustée à pH égal à 7,0.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-D:
On utilise le polymère PE2-D obtenu selon la synthèse f) ci-dessus. Une
solution
colloïdale de polymère PE2-D est obtenue en diluant le polymère PE2-D dans de
l'eau et
en ajustant à pH 7avec HCl 0,1 N ou NaOH 0,1 N. La concentration en polymére
PE2-D
est ajustée 8,82 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules :
On ajoute goutte à goutte sous agitation 1,2 g de la solution de PE2-D sur 1,2
g de
la solution de IFN-a/PE1-A. On agite une nuit à 4 C.
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 7. La taille des particules est
mesurée selon le test T. Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques
des particules
obtenues :
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[polymère] [IFN-a] Z pHm Osmolarité Taille
(mg/g) (mg/g) (mOsm ( m)
5,0 0,48 1,0 7,1 286 13,6
11) Exemple 8 : (comparaison) vitesse de libération des particules à base PEI
A/PE2-D
et de PEI A/PE2-C contenant de l'IFN-a.
Les particules obtenues par les préparations décrites dans les exemples 6 et 7
ci-dessus
sont comparées dans le test L de libération en cellule à flux continu décrit
plus haut. Le tableau
ci-dessous regroupe les résultats obtenus :
Libération
(% de protéine injectée)
au tems 1 h 6 h 12 h 18 h
IFNa/PEI A/PE2-D
Z= 1 4,0 19,7 31 39
5 m
IFNa/PEI A/PE2-C
Z= 1 0,2 6,6 9,5 11,4
5 m
En conclusion, cet exemple montre qu'il est possible, notamment en
sélectionnant
un polymère cationique contenant plus ou moins de groupements neutres et/ou
anioniques,
de moduler la vitesse de libération du PA. Ainsi, à 12 h, la libération est de
9,5 % pour les
microparticules obtenues à partir du polymère PE2-C et de 31 % pour les
microparticules
obtenues à partir du PE2-D.
