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FORMULATIONS PHARMACEUTIQUES AUTO-PRECIPITANTES POUR
LA LIBÉRATION MODIFIEE DE PRINCIPE ACTIF
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne de nouvelles formulations pharmaceutiques
pour la libération prolongée de principe(s) actif(s) -PA-, en particulier
protéinique(s) et
peptidique(s). La demande concerne également les applications, notamment
thérapeutiques, de ces formulations pharmaceutiques. Ces formulations
pharmaceutiques
actives concernent aussi bien la thérapeutique humaine que vétérinaire.
L'abréviation PA utilisée dans tout le présent exposé vise au moins un
principe
actif.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Dans le domaine de la libération prolongée des PA pharmaceutiques, notamment
des peptides/protéines thérapeutiques, on cherche très souvent à reproduire au
mieux chez
le patient une concentration plasmatique en peptide ou en protéine proche de
la valeur
observée chez le sujet sain.
Cet objectif se heurte à la faible durée de vie des protéines dans le plasma,
qui
conduit à injecter de façon répétée la protéine thérapeutique. La
concentration plasmatique
en protéine thérapeutique présente alors un profil "en dents de scie"
caractérisé par des pics
élevés de concentration et des minima de concentration très bas. Les pics de
concentration,
très supérieurs à la concentration basale chez le sujet sain, ont des effets
nocifs très
marqués du fait de la toxicité élevée des protéines thérapeutiques telles que
certaines
cytokines. Par ailleurs, les minima de concentration sont inférieurs à la
concentration
nécessaire pour avoir un effet thérapeutique, ce qui entraîne une mauvaise
couverture
thérapeutique du patient et des conséquences graves à long terme.
Aussi, pour reproduire chez le patient une concentration plasmatique en
protéine
thérapeutique proche de la valeur idéale pour le traitement du patient, il
importe que la
formulation pharmaceutique considérée permette de libérer la protéine
thérapeutique sur
une durée prolongée, de façon à limiter les variations de concentration
plasmatique au
cours du temps.
Par ailleurs, cette formulation active doit, de préférence, satisfaire au
cahier des
charges suivant, déjà connu de l'homme de l'art :
1 - libération prolongée d'une protéine thérapeutique active et non dénaturée,
par
exemple humaine ou synthétique, de sorte que la concentration plasmatique est
maintenue au niveau thérapeutique ;
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2 - viscosité à l'injection suffisamment basse pour être aisément injectable ;
3 - forme biocompatible et biodégradable présentant un excellent profil de
toxicité
et de tolérance.
Pour tenter d'atteindre ces objectifs, l'une des meilleures approches
proposées dans
l'art antérieur fut de développer des formes à libération prolongée de
protéine(s)
thérapeutique(s) constituées par des suspensions, liquides et peu visqueuses
de
nanoparticules chargées en protéines thérapeutiques. Ces suspensions ont
permis
l'administration aisée de protéines thérapeutiques natives.
Ainsi, la société Flamel Technologies a proposé une voie, dans laquelle la
protéine
thérapeutique est associée à des nanoparticules d'un copolyaminoacide
comprenant des
groupements hydrophobes et des groupements hydrophiles.
La demande de brevet US 2006/0099264 divulgue des polyaminoacides amphiphiles
comprenant des résidus aspartiques et/ou des résidus glutamiques, au moins une
partie de
ces résidus étant porteuse de greffons comportant au moins un motif alpha-
tocophérol, e.g.
polyglutamate ou polyaspartate greffé par l'alpha tocophérol d'origine
synthétique ou
naturelle. Ces homopolyaminoacides "modifiés hydrophobes" forment spontanément
dans
l'eau une suspension colloïdale de nanoparticules, lesquelles sont aptes à
s'associer
aisément en suspension aqueuse à pH 7,4, avec au moins une protéine active
(insuline).
La durée de libération in vivo de la (ou des) protéine(s) active(s) (e.g.
insuline)
"vectorisée" par les suspensions selon US 2006/0099264 gagnerait à être
augmentée.
L'augmentation de la durée de libération a été partiellement obtenue par les
formes
pharmaceutiques décrites dans la demande PCT WO-A-05/051416. Dans cette
demande,
est divulguée une suspension colloïdale de nanoparticules (0,001 - 0,5 m) de
poly(L-
glutamate de sodium) modifié hydrophobe auxquelles est associé un PA, par
exemple une
protéine thérapeutique ; cette suspension, injectée par voie sous-cutanée à
une
concentration suffisamment élevée, forme in situ chez le patient un gel au
contact de
l'albumine endogène. La protéine thérapeutique est alors lentement libérée sur
une période
typique d'une semaine. Cependant, lorsque la concentration en protéine
thérapeutique à
administrer est relativement élevée, comme c'est le cas par exemple pour
l'hormone de
croissance humaine, la durée de libération est limitée à quelques jours.
La durée de libération de ces formes gagnerait à être encore augmentée.
Une autre voie également suivie pour prolonger la durée de libération in vivo
du PA
après injection sous-cutanée est d'utiliser une formulation liquide à la
température
d'injection, mais qui gélifie lorsque la température s'élève à 37 C.
Ainsi les demandes PCT WO-A-99/18142 & WO-A-00/18821 concernent des solutions
aqueuses de polymères qui contiennent un PA sous forme dissoute ou colloïdale,
qui sont
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administrables à des animaux à sang chaud, notamment par injection, et qui
forment un
dépôt gélifié in vivo, car la température physiologique est supérieure à leur
température de
gélification. Le gel ainsi formé libère le PA de façon prolongée. Ces
polymères
biodégradables particuliers sont des triblocs ABA ou BAB avec A = polylactique-
coglycolique (PLAGA) ou polylactique (PLA) et B= PolyEthylèneGlycol. Les
températures de transformation liquide => gel de ces polymères triblocs sont
par exemple
de 36, 34, 30 et 26 C. A l'instar des polymères (A) selon l'US-B-6 143 314,
l'hydrolyse in
vivo de ces polymères triblocs ABA ou BAB conduit à des acides qui peuvent ne
pas être
bien tolérés localement.
La demande de brevet PCT/FR2006/002443, de la demanderesse, décrit des
polyglutamates modifiés par des dérivés de l'histidine et par des groupements
hydrophobes, et
leurs applications. Notamment, il est décrit que ces polymères sont solubles à
pH acide et
précipitent à pH neutre. Ils permettent de préparer des formulations pour la
libération d'un
principe actif tel qu'une protéine thérapeutique. Dans le cadre de la mise au
point d'une
formulation liquide aqueuse auto-précipitante pour la libération prolongée
utilisant de tels
polymères, il a été trouvé de façon inattendue qu'une formulation satisfaisant
le cahier des
charges exigeant ne peut être obtenue que sous certaines conditions
particulières. Par
exemple, le polymère pGluHisOEt alpha-tocophérol décrit dans la demande
PCT/FR2006/002443, formulé à pH 5,5 et à 45 mg/mL de polymère, ne conduit pas
au
résultat attendu.
Ce n'est qu'après de longues études que la demanderesse a eu le mérite i)
d'identifier des formulations de polymères cationiques (PO) qui permettent de
satisfaire au
cahier des charges d'un système auto-précipitant et ii) de proposer des
conditions
particulières pour les sélectionner. Ces polymères (PO) sont sélectionnés soit
parmi les
polymères décrits dans la demande PCT/FR2006/002443, soit parmi une nouvelle
famille
de polymères comportant des groupements cationiques et porteurs de groupements
hydrophobes.
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
L'un des objectifs de l'invention est de proposer de nouvelles formulations à
base de
polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et
porteurs
de groupements latéraux hydrophobes, chargées en principe actif (PA) et
libérant le
principe actif (PA) sur une durée prolongée de plusieurs jours, voire
plusieurs semaines.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations
liquides à
base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides
cationiques et
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porteurs de groupements latéraux hydrophobes, chargées en principe actif (PA),
dont la
composition et la concentration permettent de maximiser la durée de libération
du principe
actif (PA) après administration sous-cutanée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations
liquides à
base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides
cationiques et
porteurs de groupements latéraux hydrophobes, chargées en principe actif (PA),
dont la
composition est telle qu'elle permet de libérer le principe actif (PA) sur
plusieurs jours,
voire plusieurs semaines, avec la concentration la plus faible possible en
polymère.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations
liquides à
base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides
cationiques et
porteurs de groupements latéraux hydrophobes, chargées en principe actif (PA),
dont la
composition et la concentration permettent de l'injecter facilement à travers
une aiguille de
petite dimension.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations
liquides,
à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides
cationiques et
porteurs de groupements latéraux hydrophobes, stables en solution aqueuse.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations, à
base
de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques
et
porteurs de groupements latéraux hydrophobes, aptes à être conservées sous
forme
lyophilisée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations, à
base de
polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et
porteurs de
groupements latéraux hydrophobes, facilement redispersibles après
lyophilisation.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations, à
base de
polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et
porteurs de
groupements latéraux hydrophobes, chargées en principe actif (PA) et stables
sous forme
lyophilisée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations, à
base
de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques
et
porteurs de groupements latéraux hydrophobes, libérant une protéine ayant
préservé son
activité biologique.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation
pharmaceutique
solide pour la libération prolongée de principe actif (PA), en particulier une
forme poudre
sèche, par exemple pour inhalation et administration pulmonaire.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de
préparation
d'une formulation pour la libération prolongée d'au moins un principe actif
(PA), cette
formulation étant en particulier une des formulations décrites ci-dessus.
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Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de
préparation
de médicaments mettant en oeuvre ces formulations pharmaceutiques.
Pour atteindre ces objectifs, il est du mérite de la demanderesse d'avoir su,
après de
longues et coûteuses recherches, identifier les formulations, à base de
polymères
5 polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et
porteurs de
groupements latéraux hydrophobes, qui optimisent la libération prolongée de
protéines et
de peptides thérapeutiques.
D'où il s'ensuit que l'invention concerne tout d'abord une formulation
pharmaceutique liquide aqueuse pour la libération prolongée d'au moins un
principe actif
(PA), aisément injectable, par exemple par voie parentérale, comprenant au
moins un
principe actif (PA) et une suspension aqueuse, à base de particules
colloïdales d'un
polymère (PO) ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables, caractérisée en
ce qu'elle
satisfait aux quatre conditions suivantes :
(a) le polymère (PO) est un polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques,
- certains résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement cationique (GC)
pendant, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre
eux,
- d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement hydrophobe (GH)
pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents
entre
eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement
neutre
(GN) pendant, les groupements neutres (GN) étant identiques ou différents
entre
eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant non modifiés ;
(b) le pH de ladite formulation (pHf) est compris entre 3,0 et 6,5 ;
(c) pour la valeur pHf du pH, le polymère (PO) forme une solution colloïdale
de particules
auxquelles s'associe spontanément et de façon non covalente le principe actif
(PA) ;
(d) 1 ml de ladite formulation précipite lors d'un mélange avec un volume de 1
ml d'une
solution tampon test Tp.
De préférence, une telle formulation présente un facteur de précipitation Fp
supérieur à 200, de préférence supérieur à 400, de préférence supérieur à 800,
et plus
préférentiellement encore, supérieur à 1500.
L'invention concerne donc également une formulation pharmaceutique liquide
aqueuse
pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), aisément
injectable, par
exemple par voie parentérale, comprenant au moins un principe actif (PA) et
une
suspension aqueuse, à base de particules colloïdales d'un polyrnére (PO) ou de
ses sels
pharmaceutiquement acceptables, caractérisée en ce qu'elle satisfait aux
quatre conditions
suivantes:
(a) le polymère (PO) est un polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques,
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- certains résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement cationique (GC)
pendant, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre
eux,
- d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement hydrophobe (GH)
pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents
entre
eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement
neutre
(GN) pendant, les groupements neutres (GN) étant identiques ou différents
entre
eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant non modifiés ;
(b) le pH de ladite formulation pHf) est compris entre 3,0 et 6,5 ;
(c) pour la valeur pHf du pH, le polymére (PO) forme une solution colloïdale
de particules
auxquelles s'associe spontanément et de façon non covalente le principe actif
(PA) ;
(d) ladite formulation présente un facteur de précipitation Fp supérieur à
200, de préférence
supérieur à 400, et de préférence supérieur à 800, et plus préférentiellement
encore,
supérieur à 1500.
De plus, cette formulation est de préférence caractérisée en ce que son
facteur de
rétention Qr est supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, et de préférence
supérieur à 15,
et plus préférentiellement encore, supérieur à 20.
Il a été montré que pour une concentration donnée en polymère, la cinétique de
libération du principe actif (PA) dépend de façon notable de la composition du
polymére,
c'est-à-dire des fractions molaires respectives en groupements cationiques, en
greffons
latéraux hydrophobes, et éventuellement en groupements neutres et en
groupements
glutamates.
L'invention concerne également un procédé de préparation de formulations pour
la
libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces formulations étant
en particulier
celles décrites ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
1) la préparation d'une solution colloïdale aqueuse, de pH compris entre 3 et
6,5, d'un polymére (PO) polyaminoacide comprenant des résidus
glutamiques,
- certains résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement
cationique (GC) pendant, lesdits groupements cationiques étant
identiques ou différents entre eux,
- d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement
hydrophobe (GH) pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH)
étant identiques ou différents entre eux,
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- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un
groupement neutre (GN) pendant, les groupements neutres (GN)
étant identiques ou différents entre eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant non modifiés ;
les fractions molaires respectives en groupement cationique (GC), en
groupements hydrophobes (GH), éventuellement en groupements neutres
(GN) et éventuellement en glutamate, étant telles que 1 ml de ladite
formulation précipite lors d'un mélange avec un volume de 1 ml d'une
solution tampon test Tp ; et
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au polymère (PO) obtenu à
l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux
particules de la solution colloïdale dudit polymère, ledit ajout pouvant être
réalisé juste avant l'utilisation thérapeutique finale de la formulation (30
min
avant par exemple).
L'invention concerne également un procédé de préparation de médicaments, en
particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-cutanée,
intramusculaire,
intradermique, transdermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une
tumeur, voire
par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, consistant
essentiellement à mettre
en oeuvre au moins une formulation telle que décrite ci-dessus.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Définitions
Dans la présente description, on entend par "groupement cationique" (GC) un
groupement greffé de façon covalente sur un résidu glutamique, et comprenant
une ou
plusieurs fonctions amines ou un ou plusieurs ammoniums quaternaires. Dans le
cas d'une
fonction amine, le groupement sera principalement ionisé à tout pH au-dessous
de son
pKa, dans le cas d'un ammonium quaternaire, le groupement sera ionisé à tout
pH.
Sauf mention contraire, les radicaux alkyles ont de 1 à 10 atomes de carbone.
Dans la présente description, on entend par "groupement neutre" un groupement
ne
portant pas de charge pour tout pH compris entre 3 et 10, par exemple les
groupements
obtenus par condensation sur le carboxyle d'un résidu glutamique de
l'éthanolamine (liée
par l'azote), d'un alkyléne glycol ou d'un polyoxyalkylène glycol.
On entend par "sels pharmaceutiquement acceptables" du polymère selon
l'invention l'ensemble des polymères avec les contre-ions associés aux
fonctions ionisées
du polymére.
Dans la présente description, on entend par solution un mélange homogène
solvant
et polymère sous forme de chaîne individuelle.
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Dans la présente description, on entend par solution colloïdale une suspension
de
particules dont le diamètre moyen mesuré par le test T' est inférieur ou égal
à 0,5 m.
Dans la présente description, on entend par "formulation aisément injectable"
(par
exemple par voie parentérale), une formulation présentant une viscosité
dynamique à 20 C
inférieure ou égale à 1000 mPa.s. De préférence, la viscosité dynamique de la
formulation,
mesurée à 20 C, pour un gradient de cisaillement de 1000 s , est
préférablement
inférieure ou égale à 500 mPa.s., de préférence comprise entre 2 et 200 mPa.s.
par
exemple, comprise entre 1,0 et 100 mPa.s, voire entre 1,0 et 50 mPa.s.
Dans la présente description, une petite molécule est une molécule ayant un
poids
moléculaire inférieur à 1 kDa, notamment une molécule non protéinique.
Dans la présente description, on entend par pHf le pH de la formulation selon
l'invention.
Dans la présente description, on entend par pH*, le pH de précipitation de la
formulation à base de polymère PO déterminé selon le test P
Test P de mesure du pH de précipitation pH* par mesure de l'absorbance à
500 nm :
Une solution de polymère PO concentrée à 1 ou 2 mg/ml et contenant 0,15 M de
chlorure
de sodium est portée à pH 4 par ajout d'acide acétique ou de soude 1 M et est
laissée sous
agitation pendant 24 h. Cette solution est ensuite filtrée sur 0,8 - 0,2 m.
On procède
ensuite à la titration de cette solution par une solution 0,1 M de soude en
enregistrant
l'évolution de l'absorbance à 500 nm de la solution de polymère PO en fonction
du pH de
ladite solution sur un spectromètre UV (type Lambda 35, Perkin Elmer). Le pH
de
précipitation, pH*, correspond à la valeur du pH pour laquelle l'absorbance
augmente
brutalement pour atteindre une valeur supérieure à 1.
Dans la présente description, on entend par solution tampon test Tp un
milieu
aqueux contenant 30 mg/g d'albumine (BSA fraction V, Aldrich), 0,01 M de
tampon
phosphate, 0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium
(PBS,
Aldrich) et 0,015 M d'acétate d'ammonium (Aldrich).
Dans la présente description, on entend par An, le nombre de moles de soude,
nécessaires pour amener 0,5 ml de la solution colloïdale contenant 1 mg de
polymère PO
de pHf à pH*, obtenu par la méthode classique de titration acido-basique MT :
Une solution de polyélectrolyte concentrée à 2 mg/ml et contenant 0,15 M de
chlorure de sodium est portée à pH 4 par ajout d'acide acétique ou de soude 1
M. On
procède ensuite à la titration de cette solution par une solution 0,05 M de
soude en
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enregistrant l'évolution du pH en fonction du volume de soude ajouté. La
détermination de
An s'effectue par simple lecture du volume de soude ajouté pour passer de pHf
à pH*.
Dans la présente description, on définit le pH physiologique comme étant égal
à 7,2
0,4.
Dans la présente description, on entend par polyélectrolyte un polymère
porteur de
groupements capables de s'ioniser dans l'eau, ce qui crée une charge sur le
polymère.
Test O de mesure du facteur de rétention Or :
Un volume V de la préparation selon l'invention prête à être administrée est
versé à
25 C dans 200 l d'un pool de sérum de rat. Après précipitation des
nanoparticules, la
concentration en protéine libre dans le surnageant est mesurée par test ELISA.
En
reprenant le même essai pour des valeurs croissantes du volume V, on détermine
la valeur
V* du volume de préparation pour laquelle on trouve une fraction molaire de
protéine libre
dans le surnageant égale à 10 %. Le facteur de rétention, Qr, est donné par le
rapport du
volume V* aux 200 gl de sérum de rat. Par exemple, pour V* = 1 ml, on a: Qr =
5
Pour évaluer la taille des particules de la solution colloïdale du polymère PO
on utilise de
préférence le test T'. Le résultat du test T' est un diamètre hydrodynamique
moyen.
Test T' de mesure de la taille des nanoparticules par diffusion quasi-
élastique
de la lumière :
Le diamètre hydrodynamique moyen des particules de polymère selon l'invention
est mesuré selon le mode opératoire Md défini ci-après :
Les solutions de polymère sont préparées à des concentrations de 1 ou 2 mg/ml
en
milieu NaCI 0,15 M et laissées sous agitation pendant 24 h. Ces solutions sont
ensuite
filtrées sur 0,8 - 0,2 gm, avant de les analyser en diffusion dynamique de la
lumière grâce à
un appareil de type Malvern Compact Goniometer System, fonctionnant avec un
faisceau
laser He-Ne de longueur d'onde 632,8 nm et polarisé verticalement. Le diamètre
hydrodynamique des nanoparticules de polymère est calculé à partir de la
fonction
d'autocorrélation du champ électrique par la méthode des cumulants, comme
décrit dans
Surfactant Science Series volume 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana,
chap. 3,
Marcel Dekker, 1984.
Dans la présente description, on appelle nanoparticules les particules qui ont
un
diamètre moyen compris entre 2 et 500 nm, selon le test T.
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Test L de mesure de la libération du principe actif :
Injecter 50 l de formulation dans un cube de 1,5 cm de côté de mousse
polyuréthane-
polyéther baigné par un flux de 2,83 ml/h d'un milieu aqueux contenant 30 mg/g
5 d'albumine (BSA fraction V, Aldrich), 0,01 M de tampon phosphate, 0,0027 M
de chlorure
de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium (PBS, Aldrich) et 0,015 M
d'acétate
d'ammonium (Aldrich). On prélève régulièrement de la phase continue dont la
teneur en
protéine est analysée par ELISA.
On peut alors tracer le flux de protéine en divisant la concentration mesurée
par le
10 débit imposé, et la masse totale de protéine libérée en sommant celle
trouvée dans chacun
des prélèvements.
Au sens de l'invention, le terme "protéine" désigne aussi bien une protéine
qu'un
peptide, qu'il s'agisse d'un oligo ou d'un polypeptide. Cette protéine ou ce
peptide peuvent
être modifié ou non, par exemple, par greffage d'un ou de plusieurs
groupements
polyoxyéthyléniques.
Au sens de l'invention, l'expression être porteur signifie que le
groupement
porté est pendant, c'est-à-dire que ledit groupement est un groupement latéral
par rapport
aux résidus glutamiques et est un substituant de la fonction carbonyle en y du
résidu
glutamique qui le porte.
Le polyglutamate est également porteur de groupements cationiques. Ces
groupements sont greffés aux résidus glutamiques, de préférence par
l'intermédiaire d'une
liaison amide ou ester.
De préférence, le polymère PO présente une structure
pG1u(X)GH(y)GC(z)GN(t_X_y_z)
avec un degré de polymérisation totale (DP) compris entre 50 et 300, de
préférence
compris entre 100 et 250, et plus préférentiellement encore compris entre 150
et 250.
Selon une variante de l'invention, les groupements cationiques (GC) peuvent
être
choisis parmi les bases faibles dont le pH de demi-neutralisation est
inférieur à 7,0.
De tels groupements cationiques (GC) sont par exemple obtenus à partir de
précurseurs dérivés de l'histidine choisis dans le groupe comprenant les
esters d'histidine,
de préférence esters méthylique et éthylique ; l'histidinol, l'histamine,
l'histidinamide, le
dérivé N-monométhyle de l'histidinamide et le dérivé N,N'-diméthyle de
l'histidinamide.
Dans ce cas, les valeurs x, y et z peuvent être telles que x est compris entre
0 et
45 %, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 40 et 98 %, et 1-x-y-
z est compris
entre 0 et 50 %.
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On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 0
et 45
%, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 40 et 60 %, et 1-x-y-z
est compris
entre 0 et 58 %.
On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 0
et
45 %, y est compris entre 15 et 30 %, z est compris entre 40 et 60 %, et 1-x-y-
z est compris
entre 0 et 45 %.
Si le polymère PO ne comporte pas de groupements neutres (GN), on peut avoir
les
valeurs x, y et z telles que x est compris entre 0 et 45 %, y est compris
entre 2 et 30 %, et z
est compris entre 40 et 98 %.
Selon une autre variante de l'invention, les groupements cationiques (GC)
peuvent
être choisis parmi ceux qui comprennent au moins un ammonium quaternaire ou au
moins
une base forte dont le pH de demi-neutralisation est supérieur à 8,0.
De tels groupements cationiques (GC) peuvent être obtenus à partir des
composés
précurseurs suivants :
- une diamine linéaire de 2 à 6 carbones, de préférence la putrescine,
- l'agmatine,
- l'éthanolamine liée par l'oxygène,
- la choline liée par l'oxygène,
- un dérivé ester ou amide d'un acide aminé dont la chaîne latérale est
chargée positivement à pH neutre, i.e. la lysine, l'arginine, l'ornithine, lié
par la fonction amine en position alpha.
Dans ce cas, les valeurs x, y, et z peuvent être telles que :
- x est compris entre 10 et 55 %,
- y est compris entre 2 et 30 %,
- z est supérieur ou égal à 10 % et est compris entre (x-10) % et (x+15) %,
le nombre de groupements neutres correspondant au pourcentage complémentaire
pour
atteindre 100 %, et pouvant éventuellement être égal à 0.
On peut également avoir les valeurs x, y et z telles que :
- x est compris entre 20 et 55 %,
- y est compris entre 2 et 7,5 %,
- z est supérieur ou égal à 20 % et est compris entre (x-10) % et (x+15) %,
le nombre de groupements neutres correspondant au pourcentage complémentaire
pour
atteindre 100 %, et pouvant éventuellement être égal à 0.
On peut également choisir les valeurs x, y et z telles que x est compris entre
10 et
55 %, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 10 et 55 %, et 1-x-y-
z est compris
entre 0 et 60 %.
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On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre
10 et 20
%, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 10 et 30 %, et 1-x-y-z
est compris
entre 20 et 78 %.
On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre
10 et 20
%, y est compris entre 15 et 30 %, z est compris entre 10 et 30 %, et 1-x-y-z
est compris
entre 20 et 65 %.
Si le polymère PO ne comporte pas de groupements neutres (GN), on peut avoir
les
valeurs x, y et z telles que x est compris entre 10 et 55 %, y est compris
entre 2 et 30 %, et
z est compris entre 40 et 60 %.
Avantageusement, les polyaminoacides selon l'invention sont, e.g., des
homopolymères d'alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-glutamique.
Les groupements cationiques utilisables pour fonctionnaliser les résidus
glutamates
sont identiques ou différents entre eux et correspondent à:
= un dérivé de l'histidine choisis dans le groupe comprenant les esters
d'histidine, de préférence l'ester méthylique et l'ester éthylique,
l'histidinol, l'histamine, l'histidinamide, le dérivé N-monométhyle de
l'histidinamide et le dérivé N,N'-diméthyle de l'histidinamide
ou à:
= la formule générale suivante :
L
x1--I~ rvY3+Z
dans laquelle :
X = O, NH,
Y = indépendamment un H ou un CH3,
Z- = un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate,
L = un aikylène linéaire (C2 à C6) et éventuellement substitué par un groupe
fonctionnel de type carboxyle ou dérivé.
Ainsi, les groupements cationiques utilisables dans la présente invention sont
choisis dans le groupe de radicaux ayant les formules suivantes :
--NH-(CHz)wNH3+, Z- avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est
égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z",
- -0-(CH2)2-NH3+, Z ,
- -0-(CH2)2-N+(CH3)3, Z ,
- un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
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0 R1
-N R13
H
dans laquelle :
- Ri est alcoxy, de préférence -OMe ou -OEt, ou -R' est -NH2 5 alkylamino, de
préférence -NH-CH3 ou -N(CH3)2 ;
R13 est -(CHz)4-NH3+, Z-, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3}, Z ,
-(CHz)3-NH3+, Z ;
où Z- est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence
un chlorure.
Par exemple, les groupements cationiques peuvent présenter les formules
suivantes :
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HI HI H!
I
R2
NH+,CI-
NH3+,Ci- NMe3+,Cl- 1
Ethanolamine Choline NH3+,CI- NH H,
HN dérivés
Putrescine de I'histidine
NH3+,CI-
Agmatine
I ( (
HN HN HN
CORi CORi COR,
NH3+,CI- NH
NH ` CI Ornithine HN
3 ' ester ou amide
Lysine NH3+,CI-
ester ou amide
Arginine
ester ou amide
dans lesquelles -RI représente un groupement alcoxy ou alkylamino, de
préférence un
groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NHCH3 ou -N(CH3)2, et -R2 représente hydrogène,
-CH2OH ou -C(=O)-Ri.
Suivant une caractéristique préférée, les polyaminoacides comportent en
moyenne
au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne de polymère.
Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans
un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement
("spacer")
permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne de polyglutamate
(par
exemple une chaîne principale - squelette-polyglutamate). Cette rotule peut
comprendre,
e.g. au moins une liaison covalente directe et/ou au moins une liaison amide
et/ou au moins
une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles
appartenant au groupe
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comportant notamment : les résidus "acide aminé" différents de l'unité
monomérique
constitutive du polyglutamate, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des
polyamines
(par exemple les diamines), les dérivés des polyols (par exemple les diols) et
les dérivés
des hydroxyacides.
5
Le greffage des GH sur la chaîne polyglutamate peut passer par la mise en
oeuvre
de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne polyglutamate.
Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif,
choisis
10 dans le groupe comprenant les alcools et les amines, ces composés pouvant
être
fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art.
Suivant une caractéristique préférée, le groupement hydrophobe GH du greffon
hydrophobe comporte de 8 à 30 atomes de carbone.
Ces groupements hydrophobes GH sont avantageusement et judicieusement
sélectionnés dans le groupe suivant :
= les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter
éventuellement au
moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
= les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement
au
moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
= et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins
une
insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
Les rotules formant avec les GH des greffons hydrophobes, peuvent être di-,
tri- ou
tétravalentes (voire pentavalentes et plus). Dans le cas d'une rotule
divalente, le greffon
hydrophobe comporte un seul groupement GH, tandis qu'une rotule trivalente
confère au
greffon hydrophobe un caractère bifide, c'est-à-dire que le greffon présente
deux "pattes"
GH. A titre d'exemple de rotule trivalente, on peut citer, entre autres, des
résidus "acide
aminé", par exemple "acide glutamique" ou des restes polyols, par exemple
glycérol. Ainsi,
deux exemples avantageux mais non limitatifs de greffons hydrophobes
comprenant des
GH bifides sont les dialkyl-glycérols et les dialkyl-glutamates.
Les groupements hydrophobes GH peuvent être, par exemple, dérivés de
précurseurs choisis dans le groupe suivant : octanol, dodécanol, tétradécanol,
hexadécanol,
octadécanol, oléylalcool, tocophérol ou cholestérol.
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Tel que cela a été défini ci-dessus, les groupements neutres (GN) peuvent être
choisis dans le groupe suivant : un radical hydroxyéthylamino-,
hydroxyalkyloxy- ou
polyoxyalkylène
Selon une autre variante, les polyglutamates utilisés dans la présente
invention
peuvent être également porteurs d'au moins un greffon de type polyalkylène (de
préférence
éthylène)glycol lié à un résidu glutamate.
De préférence, le squelette du polyglutamate selon la présente invention
comprend
des résidus L-glutamate et/ou acide L-glutamique ; de préférence ces résidus
sont liés dans
le polypeptide par leur carboxyle en position alpha.
De manière plus préférée encore, les polyglutamates utilisés dans la présente
invention répondent à la formule (I) suivante :
O R70 O OH
O O
H H D
N N
A H H
O r O
q s
P
O B O R9o
1
GH
dans laquelle :
^ A représente indépendamment :
- un NHR dans lequel R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à CIo,
un alkyle ramifié en C3 à CIo ou un benzyle,
- un résidu acide aminé ou un dérivé d'acide aminé terminal de
formule :
H
-N H-C -COR'
I
R$
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dans laquelle
R7 est OH, OR9 ou NHR10,
et Rg, R9 et R10 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire
en C2 à C10, alkyle ramifié en C3 à C10 ou un benzyle ;
^ B est une liaison directe ou un groupement de liaison divalent, trivalent ou
tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :
-0-, -NH-, N(C1_5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de
préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine,
d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de
carbone ;
^ D représente un H, un acyle linéaire en C2 à C10, acyle ramifié en C3 à C10,
ou un pyroglutamate ;
^ les groupements hydrophobes (GH) représentent chacun indépendamment
les uns des autres un radical choisi parmi :
= les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter
éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un
hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou
= les alkylaryles ou arylalkyle en Cg à C30 pouvant comporter
éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un
hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou
= les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au
moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence
O etlou N et/ou S) ;
et de préférence au moins l'un des groupements hydrophobes (GH) étant obtenu
par greffage, à partir d'un précurseur choisi dans le groupe suivant :
octanol,
dodécanol, tétradécanol, hexadécanol, octadécanol, oléylalcool, tocophérol ou
cholestérol, et B représentant alors une liaison directe ;
^ R70 représente un radical choisi dans le groupe suivant :
--NH-(CHz)wNH3+ avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est
égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+,
- -O-(CH2)2-NH3+,
- -O-(CH2)2-N+(CH3)3,
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- un radical de formule :
R"
NH2+
-N
H
où -RI 1 représente -H, -CO2H, un ester d'alkyle (de préférence
-COOMe et -COOEt), -CHzOH, -C(=O)-NHz, -C(=O)-NH-CH3 ou
-C(=O)-N(CH3)2 ;
- un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
)12
R13
dans laquelle :
X est -O- ou -NH-,
R12 est H, alkyle linéaire en C2 à C10, alkyle ramifié en C3 à C10 ou
benzyle,
-R13 est -(CH2)4NH3+, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3+, -(CH2)3NH3+ ;
le contre-anion de R70 est un anion convenable, notamment choisi parmi un
chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure ;
^ R90 représente un hydroxyéthylamino-, un hydroxyalkyloxy- ou un
polyoxyalkylène ;
^ p, q, r et s sont des entiers positifs
^(p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements
hydrophobes GH varie de 2 à 30 % molaire, sous condition que chaque
chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons
hydrophobes;
^(q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements
cationiques et varie de 10 à 98 % molaire ;
^(p+q+r+s) varie de 50 à 300, de préférence entre 100 et 250 ;
^(r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 78 % molaire ;
^(s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 55 % molaire.
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de
formule
(I) dérivés de 1`histidine, on se reportera utilement à la demande de brevet
FR 05 53302.
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Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de
formule (I)
autres que ceux dérivés de l'histidine, on se reportera utilement à la demande
de brevet
FR0703185.
De préférence, les groupements hydrophobes GH et les groupements cationiques
sont disposés de façon aléatoire en groupements pendants.
D'une manière générale, la formule générale (I) décrite ci-dessus ne doit pas
être
interprétée comme représentant uniquement des copolymères séquencés (ou
blocs), mais
également des copolymères aléatoires ou des copolymères multiblocs.
De préférence, la concentration en polymère (PO) dans la formulation selon
l'invention peut être comprise entre 4 et 50 mg/ml, en particulier lorsque le
principe actif
(PA) est une protéine thérapeutique. Dans cette gamme de concentration, la
formulation est
aisément injectable par une aiguille de faible diamètre, par exemple une
aiguille de Gauge
27, et même 29. Les exemples 2, 3 et 4 décrivent en détails de telles
formulations.
De préférence, la concentration en polymère (PO) dans la formulation selon
l'invention peut être comprise entre 5 et 30 mg/ml, et plus préférentiellement
encore
comprise entre 5 et 15 mg/ml.
Avantageusement, le rapport R de la concentration en principe actif (PA) à la
concentration en polymère (PO) peut être compris entre 0,0001 et 1,5. Ce
rapport R peut
être également compris entre 0,01 et 1,2.
Selon une variante, la formulation selon l'invention peut contenir des cations
divalents Zn++ dans une proportion comprise entre 0,05 et 2 équivalents
molaires par
rapport à la concentration molaire en groupements cationiques (GC).
Notamment, la formulation selon l'invention peut contenir des cations
divalents
Zn++ ajoutés dans la proportion comprise entre 0,25 et 0,75 équivalents
molaires par
rapport à la concentration molaire en groupements cationiques (GC), et de
préférence égale
à 0,5 éq, plus particulièrement lorsque les groupements cationiques (GC) sont
obtenus à
partir de dérivés de l'histidine choisis dans le groupe comprenant les esters
d'histidine, de
préférence l'ester méthylique et l'ester éthylique ; l'histidinol,
l'histamine, l'histidinamide,
le dérivé N-monométhyle de l'histidinamide et le dérivé N,N'-diméthyle de
l'histidinamide.
Selon une autre variante, la formulation selon l'invention ne contient pas de
cation
divalent ajouté.
Les polymères utilisés dans la présente invention ont une masse molaire qui se
situe
entre 2 000 et 200 000 g/mol, et de préférence entre 5 000 et 100 000 g/mol.
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Selon un mode particulièrement préféré de l'invention, lorsque les groupements
cationiques (GC) sont choisis parmi les bases faibles dont le pH de demi-
neutralisation est
inférieur à 7,0, les polymères (PO) utilisés dans l'invention présentent une
structure
pGlu(,,)GH(y)GC(z)GN(t_,_y_z) telle que x est compris entre 0 et 20 %, y est
compris entre 2
5 et 30 %, z est compris entre 60 et 95 %, et 1-x-y-z est compris entre 0 et
15 %.
On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 0
et
20 %, y est compris entre 2 et 10 %, z est compris entre 75 et 95 %, et 1-x-y-
z est compris
entre 0 et 15 %.
On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 0
et
10 20 %, y est compris entre 15 et 25 %, z est compris entre 60 et 80 %, et 1-
x-y-z est compris
entre 0 et 15 %.
Si le polymère PO ne comporte pas de groupements neutres (GN), on peut avoir
les
valeurs x, y et z telles que x est compris entre 0 et 20 %, y est compris
entre 2 et 30 %, et z
est compris entre 60 et 95 %.
15 Selon un autre mode préféré de l'invention, lorsque les groupements
cationiques
(GC) sont choisis parmi ceux qui comprennent des ammoniums quaternaires ou au
moins
une base forte dont le pH de demi-neutralisation est supérieur à 8,0, les
valeurs x, y et z
peuvent être telles que x est compris entre 15 et 50 %, y est compris entre 2
et 30 %, z est
compris entre 10 et 50 %, et 1-x-y-z est compris entre 10 et 55 %.
20 On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris
entre 15 et
%, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 15 et 25 %, et 1-x-y-z
est compris
entre 40 et 55 %.
On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre
25 et
50 %, y est compri s entre 2 et 30 %, z est compri s entre 25 et 50 %, et 1-x-
y-z est compri s
25 entre 10 et 30 %.
Si le polymère PO ne comporte pas de groupements neutres (GN), on peut avoir
les
valeurs x, y et z telles que x est compris entre 10 et 55 %, y est compris
entre 2 et 30 %, et
z est compris entre 40 et 60 %.
30 Du fait d'un excès de charge cationique, le polymère PO utilisé dans
l'invention est
cationique et soluble à la valeur pHf du pH de la formulation. Cette charge se
trouve
partiellement ou totalement neutralisée à pH neutre de sorte que le polymère
précipite.
Sans être lié par la théorie, on peut supposer que ce phénomène de
précipitation induit par
une augmentation du pH résulte de la diminution de la charge globale des
polymères entre
le pH de formulation et le pH physiologique, et de la présence des groupements
latéraux
hydrophobes.
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Il convient de comprendre que les fonctions résiduelles carboxyliques du
polyglutamate modifié sont soit neutres (forme COOH), soit ionisées (anion COO-
), selon
le pH et la composition. On parlera donc indifféremment i) de résidu glutamate
ou de
résidu acide glutamique, ii) d'acide polyglutamique ou de polyglutamate.
De la même façon, les fonctions amines seront principalement ionisées à tout
pH
au-dessous de leur pKa, et les ammoniums quaternaires seront ionisés à tout
pH.
En solution aqueuse, le contre-cation peut être un cation métallique tel que
le
sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que la
triéthanolamine, le
tri s(hydroxyméthyl)-aminométhane ou une polyamine telle que la
polyéthylèneimine. S'il
est divalent, un contre-cation peut salifier deux groupements cationiques
monovalents
proches.
Le contre-anion des groupements cationiques est de préférence choisi parmi le
groupe comprenant un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate.
S'il est divalent, un contre-anion peut salifier deux groupements cationiques
monovalents proches.
Par suite, dans la présente description, on entend par "sels
pharmaceutiquement
acceptables" du polymère selon l'invention l'ensemble des polymères avec les
contre-ions
associés aux fonctions ionisées du polymère.
Les polyaminoacides susceptibles d'être utilisés dans la présente invention
sont
obtenus, par exemple, par des méthodes connues de l'homme de l'art. Tout
d'abord,
rappelons que pour l'obtention de polyaminoacide de type alpha, la technique
la plus
courante est basée sur la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides
(NCA),
décrite, par exemple, dans Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de
H.R.
Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-Carbo,,y Anhydrides and related Heterocycles"
Springer
Verlag (1987). Le dérivé de NCA est de préférence NCA-Glu-O-R3 (R3 = méthyle,
éthyle
ou benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolysés dans des conditions
appropriées pour
obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la
description
donnée dans le brevet FR 2 801 226.
Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de
type
poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique), poly(alpha-D,L-glutamate)
et
poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement.
Le couplage du greffon GH avec une fonction acide du polymère est réalisé
aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme
agent de
couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine
et dans un
solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-méthylpyrrolidone
(NMP) ou
le diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le
dicyclohexylcarbo-
diimide ou le diisopropylcarbodiimide. Le taux de greffage est contrôlé
chimiquement par
la stoechiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les
greffons hydro-
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phobes fonctionnalisés par un "espaceur" sont obtenus par couplage peptidique
classique
ou par condensation directe par catalyse acide.
Le couplage des groupements cationiques et éventuellement neutres avec une
fonction acide du polymère est réalisé simultanément dans une deuxième étape
en présence
d'un chloroformiate comme agent de couplage et dans un solvant approprié tel
que le
diméthylformamide, la N-méthylpyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide
(DMSO).
Dans le cas où le groupement cationique contient deux fonctions amines non
différenciées chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit
sous une forme
dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de
clivage du
groupement protecteur est alors ajoutée.
La chimie de polymérisation et les réactions de couplage des groupements sont
classiques et bien connues de l'homme de l'art (voir par exemples les brevets
ou demandes
de brevet de la demanderesse cités ci-dessus).
Des exemples de préparation de formulations selon l'invention sont détaillés
dans
les exemples auxquels on se reportera.
Les caractéristiques de la formulation selon l'invention énoncées ci-dessus
permettent à l'homme de l'art de sélectionner parmi toutes les formulations à
base de
polymère PO, celles qui satisfont simultanément aux conditions (a) ;(b) ; (c)
et (d) et qui
de ce fait répondent au mieux au cahier des charges défini en préambule.
Les conditions (c) et (d) sont particulièrement sélectives. Si la formulation
ne forme
pas de solution colloïdale à pHf, l'homme de l'art sélectionnera un polymère
présentant à
cette valeur du pH un nombre de monomères non ionisés plus important. Si, au
contraire,
le polymère précipite, il conviendra d'augmenter le nombre de monomères
ionisés à ce pH.
Il est important de remarquer que, de façon contre-intuitive, certaines
formulations
conduisant à des solutions colloïdales à pHf et précipitant à pH physiologique
devront
cependant être écartées car ne satisfaisant pas à la condition (d). Ainsi la
condition (d) est
un moyen commode pour l'homme de l'art de sélectionner les formulations selon
l'invention.
Il est important de remarquer que la condition (d) implique que la formulation
selon
l'invention précipite pour une valeur du pH inférieure ou égale au pH
physiologique. En
effet, après mélange de 1 ml de la formulation acide selon l'invention et de 1
ml de la
solution tampon Tp, on doit observer une précipitation à une valeur du pH
inférieure ou
égale au pH de la solution tampon c'est-à-dire < 7,2.
Un deuxième mode de sélection des formulations selon l'invention est de les
sélectionner selon leur facteur de précipitation, Fp.
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Ce facteur est défini expérimentalement de la façon suivante :
a) mesure du pH de précipitation, noté pH*
A pHf acide compris entre 3 et 6,5, la solution colloïdale chargée en PA se
présente
comme un liquide limpide contenant des nanoparticules, dont le diamètre
hydrodynamique
moyen, mesuré par diffusion dynamique de la lumière, selon le test T', est
inférieur ou
égale à 0,5 m, de préférence compris entre 5 et 500 nm, de préférence encore,
compris
entre 10 et 80 nm. Lorsque l'on élève le pH, la solution selon l'invention
doit précipiter
pour une valeur de pH inférieure ou égale au pH physiologique. Cette valeur
est mesurée
selon le test P.
pH* est la valeur de pH auquel la solution précipite dans ces conditions.
b) détermination de Fp
On mesure On, nombre de moles de soude nécessaires pour amener 0,5 ml de la
solution
colloïdale contenant 1 mg de polymère PO de pHf à pH* selon la méthode MT.
Le facteur de précipitation, Fp, de la formulation est défini par la formule :
Y
Fp=
An.C
dans laquelle :
C est la concentration en polymère PO dans la formulation (exprimée en mg/g),
y est la fraction molaire de monomères de PO portant un greffon hydrophobe.
Des exemples de calcul du facteur de précipitation Fp sont reportés dans les
exemples.
Dans une réalisation particulière de l'invention, les formulations selon
l'invention
sont caractérisées par un facteur de précipitation Fp supérieur à 200, de
préférence
supérieur à 400, et de préférence encore, supérieur à 800, et plus
préférentiellement encore
supérieur à 1500.
Un aspect surprenant des formulations selon l'invention est que le réseau de
chaînes
de polymères formé lors de la précipitation à pH physiologique permet de
ralentir la
libération du principe actif (PA) sans pour autant piéger ce même principe
actif (PA) au
cceur des particules. Ainsi les formulations selon l'invention permettent
d'obtenir à la fois
une libération prolongée du principe actif (PA) et une bonne biodisponibilité.
Concernant le principe actif (PA), il est de préférence choisi dans le groupe
comprenant: les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou
plusieurs chaînes
polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG) : "protéines-
PEGylées"], les
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peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les
polynucléotides
et leurs mélanges,
et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe des érythropoïétines,
telles que
l'époétine alpha, l'époétine bêta, la darbépoétine, le raffimère
d'hémoglobine, leurs
analogues ou leurs dérivés ; ocytocine, vasopressine, hormone
adrénocorticotropique,
facteur de croissance épidermique, facteur de croissance dérivé des plaquettes
(PDGF), les
facteurs stimulants de l'hématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs
sanguins, tels que
alteplase, tenecteplase, facteur VII(a), facteur VII ; hémoglobine, les
cytochromes, les
albumines, prolactine, lulibérine, hormone de libération de l'hormone
lutéinisante (LHRH)
et analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buseréline,
nafaréline ;
antagonistes de la LHRH, les agonistes de la LHRH, les hormones de croissance
(GH)
humaine, porcine ou bovine, le facteur de libération de l'hormone de
croissance, l'insuline,
la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-
11, IL-12), les
interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta-la, ou y; la
gastrine, la
tétragastrine, la pentagastrine, l'urogastrone, la sécrétine, la calcitonine,
les enképhalines,
les endomorphines, les angiotensines, l'hormone de libération de la
thyrotropine (TRH), le
facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de croissance des nerfs (NGF),
les facteurs
de croissance tels que beclapermine, trafermine, ancestime, le facteur de
croissance des
kératinocytes, le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes (G-
CSF), le
facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes macrophages (GM-CSF),
le
facteur de croissance hématopoïétique des macrophages (M-CSF), l'héparinase,
les
protéines morphogéniques de l'os (BMP), le facteur natriurétique auriculaire
humain
(hANP), le peptide ressemblant au glucagon (GLP-1), le facteur de croissance
endothélial
vasculaire (VEGF), l'antigène recombinant de l'hépatite B (rHBsAg), la rénine,
les
cytokines, la bradykinine, les bacitracines, les polymyxines, les colistines,
la tyrocidine, les
gramicidines, l'étanercept, l'imiglucérase, la drotrécogine alpha, les
cyclosporines et
analogues synthétiques, les modifications et fragments actifs
pharmaceutiquement
d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins, les anticorps
tels que
rituximab, infliximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab,
efalizumab,
et cetuximab.
D'autres principes actifs sont les polysaccharides (par exemple, l'héparine)
et les
oligo- ou polynucléotides, ADN, ARN, iARN, antibiotiques, et cellules
vivantes. Une autre
classe de principes actifs comprend les substances pharmaceutiques agissant
sur le système
nerveux central, par exemple, rispéridone, zuclopenthixol, fluphénazine,
perphénazine,
flupentixol, halopéridol, fluspirilène, quétiapine, clozapine, amisulprid,
sulpiride,
ziprasidone, etc.
Selon une variante, le principe actif est une petite molécule organique
hydrophobe,
hydrophile ou amphiphile du type de celles appartenant à la famille des
anthracyclines, des
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taxoïdes ou des camptothécines ou du type de celles appartenant à la famille
des peptides
telles que la leuprolide ou la cyclosporine et leurs mélanges.
Selon une autre variante, le principe actif est avantageusement choisi parmi
au
moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de
traitement de l'abus
5 d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les
anesthésiques, les agents
de traitement de l'acromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les
agents de
traitement des allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires,
les
anticoagulants et antithrombotiques, les anticonvulsivants, les
antiépileptiques, les
antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques,
les anti-
10 parasitaires, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les
antiparkinsoniens, les
anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de l'anhydrase
carbonique, les agents
cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les
vasodilatateurs, les
antiangineux, les anti-hypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de
cholinestérase,
les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les
stimulants du
15 système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité,
les inducteurs et
inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose,
les agonistes des
récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les
agents de
traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la
fertilité, les
agents de traitement des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et
les
20 immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire,
les
antimigraineux, les myorelaxants, les analogues de nucléosides, les agents de
traitement de
l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents
psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les
neuroleptiques, les
anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de
traitements
25 dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les
anorexiques, les
antidouleurs non analgésiques, les antiépileptiques, les barbituriques, les
benzodiazépines,
les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de
ces produits.
La formulation selon l'invention peut être administrée par voie orale,
parentérale,
nasale, topique, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse,
intramusculaire, intra-
dermique, transdermique, intra-tumorale, intrapéritonéale, intrathécale,
intracérébrale ou
buccale.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de
préparation de
formulations à base de polymére PO pour la libération prolongée d'au moins un
principe
actif, ces formulations étant en particulier celles décrites ci-dessus, ledit
procédé
comprenant les étapes suivantes :
1) la préparation, à une valeur du pH comprise entre 3 et 6,5, d'une solution
colloïdale
aqueuse d'un polymère (PO) polyaminoacide tel que défini ci-dessus, les
fractions
molaires respectives en groupements cationiques (GC), en groupements
hydrophobes
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(GH), éventuellement en groupements neutres (GN) et éventuellement en
glutamate,
étant telles que 1 ml de ladite formulation précipite lors d'un mélange avec
un volume
de 1 ml d'une solution tampon test Tp ; et
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au polymère (PO) obtenu à l'étape
1, ledit
principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la
solution colloïdale
dudit polymère (PO).
Une caractéristique essentielle du procédé selon l'invention est de former des
particules chargées d'actif à pHf compris en 3 et 6,5, spontanément, par
simple mélange
d'une solution colloïdale de particules du polymère polyélectrolyte (PO) et du
principe
actif (PA).
Les principes actifs tels que des protéines, des peptides ou des petites
molécules,
peuvent s'associer spontanément au polymère (PO) de type polyaminoacide.
Dans une réalisation particulière de l'invention, le chargement des
nanoparticules
du polymère polyélectrolyte (PO) par le principe actif (PA) s'effectue par
simple mélange
d'une solution de principe actif (PA) avec une solution colloïdale du polymère
polyélectrolyte (PO). Cette association est purement physique et n'implique
pas de création
de liaison covalente entre le principe actif (PA) et le polymère (PO). Sans
être lié par la
théorie, on peut supposer que cette association non spécifique s'effectue par
interaction
hydrophobe et/ou électrostatique entre le polymère (PO) et le principe actif
(PA). Il est à
noter qu'il n'est pas nécessaire, et souvent même non souhaitable, de lier le
PA aux
nanoparticules de PO par des récepteurs spécifiques de nature peptidique ou de
type
antigène/anticorps ou encore enzyme/substrat.
Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, il n'est pas
prévu
d'étape de réticulation chimique des particules obtenues. Les particules
obtenues ne sont
donc pas réticulées chimiquement et libèrent néanmoins le principe actif (PA)
sur une
durée prolongée. Cette absence de réticulation chimique est un avantage
décisif. En effet,
l'absence de réticulation chimique permet d'éviter la dégradation chimique du
principe
actif (PA) lors de l'étape de réticulation des particules contenant le
principe actif (PA).
Une telle réticulation chimique est en effet généralement conduite par
activation d'entités
polymérisables et met en jeu des agents potentiellement dénaturants tels que
les
rayonnements UV, ou le glutaraldéhyde.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une étape de
déshydratation, par exemple par lyophilisation, de la formulation liquide,
afin d'obtenir
une formulation sous forme de poudre sèche.
La présente invention concerne également une formulation pharmaceutique solide
pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), comprenant une
forme
poudre sèche obtenue à partir de la formulation liquide comprenant une
suspension
aqueuse décrite ci-dessus.
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Une poudre sèche peut être obtenue en amenant la formulation liquide selon
l'invention à pH égal à 7 pour la faire précipiter in vitro, puis en la
déshydratant, par
exemple par lyophilisation.
Avantageusement, une telle formulation pharmaceutique solide est utilisée pour
inhalation et administration pulmonaire.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de
préparation de
médicaments, en particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-
cutanée,
intramusculaire, intradermique, transdermique, intrapéritonéale,
intracérébrale ou intra-
tumorale, voire par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire,
ledit procédé
consistant essentiellement à mettre en oeuvre au moins l'une des formulations
décrites ci-
dessus.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1: Libération in vitro d'IFN-a à partir des formulations de l'exemple
2.1 (triangles
noirs), de l'exemple 2.3 (losanges noirs), de l'exemple 3 (carrés noirs), et
de l'exemple 5
(trait plein).
EXEMPLES
1) Synthèses :
a) ComparatiF : Synthése d'un polymère polyélectrolyte PD porteur de
zroupements
hydrophobes, anionique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine
synthétique)
On solubilise 15 g d'un acide alpha-L-polyglutamique de masse équivalente à
environ
16 900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène dans 288 ml de
diméthylformamide (DMF) en chauffant à 80 C jusqu'à solubilisation du
polymère. On
refroidit la solution à 15 C et on ajoute successivement 2,5 g de D,L-alpha-
tocophérol
(> 98 %, Flukâ ) préalablement solubilisé dans 8 ml de DMF, 280 mg de 4-
diméthylaminopyridine préalablement solubilisée dans 1 ml de DMF et 1,6 g de
diisopropylcarbodiimide préalablement solubilisé dans 6 ml de DMF. Après 3 h
sous
agitation, le milieu réactionnel est versé dans 1200 ml d'eau contenant 15 %
de chlorure de
sodium et d'acide chlorhydrique (pH 2). Le polymère précipité est ensuite
récupéré par
filtration, lavé par de l'acide chlorhydrique 0,1 N, de l'eau et par de
l'éther diisopropylique.
Le polymère est ensuite séché à l'étuve sous vide à 40 C. On obtient un
rendement de
l'ordre de 90 %. La masse molaire mesurée par chromatographie d'exclusion
stérique est
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de 15 500 par rapport à un standard polyoxyéthylène. Le taux de tocophérol
greffé, estimé
par spectroscopie RMN du proton, est de 5,1 % molaire.
b) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PO-AI cationique (polyglutamate
greffé par
l'alpha-tocophérol d'origine synthétique et par de l'histidinamide)
//-NH
N
H2N O
0 NH
O 0
H H
N N
H2N m N H P H
O
O T
O ONa
Indices et groupements : m = 11, p 209, q = 0, T = D,L-alpha-tocophérol (T)
3 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique
avec de
l'alpha-tocophérol racémique sont solubilisés par chauffage à 80 C dans 38 ml
de NMP.
A cette solution refroidie à 0 C sont ajoutés 2,74 g d'isobutyl chloroformiate
puis 2,2 mL
de N-méthyl-morpholine. Le milieu réactionnel est agité 10 min en maintenant
la
température à 0 C. En parallèle, 8,65 g de dichlorhydrate d'histidinamide sont
suspendus
dans 108 mL de NMP. 10,6 ml de triéthylamine sont ensuite ajoutés et la
suspension
obtenue est agitée à 20 C pendant quelques minutes puis refroidie à 0 C. On
procède
ensuite à l'ajout de la solution de polymère activé sur la suspension
d'histidinamide. Le
milieu réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis 1 nuit à 20 C. On ajoute
ensuite 0,62
mL d'HCl 35 %, puis 83 mL d'eau. On verse ensuite la solution obtenue dans 500
mL
d'eau à pH 3 - 4. La solution est ensuite diafiltrée contre 8 volumes d'eau
salée (0,9 %
NaCI) et 4 volumes d'eau. La solution de polymère est ensuite concentrée
jusqu'à un
volume de 300 mL (la concentration en polymère est de 18 mg/g). Le pourcentage
d'histidinamide greffée, déterminé par RMN 'H dans D2O, est de 95 %.
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c) S
ynthèse d'un polymère polyélectrolyte PO-A2 cationique (polyglutamate greffé
par
l'alpha-tocophérol d'origine synthétique et par de l'histidinamide)
irNH
N
H2N O
0 NH
O 0
N N Na
HZN m H P Jq\H
O
O T
-1 Z-
0 ONa
Indices et groupements : m 44, p = 154, q = 22, T = D,L-alpha-tocophérol (T)
g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 20 % de façon statistique
avec de
10 l'alpha-tocophérol racémique sont solubilisés par chauffage à 80 C dans
125 ml de NMP.
A cette solution refroidie à 0 C sont ajoutés 5,5 g d'isobutyl chloroformiate
puis 4,4 mL
de N-méthyl-morpholine. Le milieu réactionnel est agité 10 min en maintenant
la
température à 0 C. En parallèle, 12,9 g de dichlorhydrate d'histidinamide sont
suspendus
dans 161 mL de NMP. 15,8 ml de triéthylamine sont ensuite ajoutés et la
suspension
obtenue est agitée à 20 C pendant quelques minutes puis refroidie à 0 C. On
procède
ensuite à l'ajout de la solution de polymère activé sur la suspension
d'histidinamide. Le
milieu réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis 1 nuit à 20 C. On ajoute
ensuite 1,46
mL d'HCl 35 %, puis 200 mL d'eau. On ajoute encore 200 mL d'eau, puis 650 mL
d'éthanol, et verse ensuite dans 650 mL d'eau à pH 3 - 4. La solution est
ensuite diafiltrée
contre 8 volumes d'eau salée (0,9 % NaCI) et 4 volumes d'eau. La solution de
polymère
est enfin concentrée jusqu'à un volume de 250 mL (la concentration en polymère
est de 50
mg/g). Le pourcentage d'histidinamide greffée, déterminé par RMN 'H dans D20,
est de
70 %.
d) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PO-B cationique (polyglutamate
greffé par
l'alpha-tocophérol d'origine synthétique, par l'éthanolamine, et par de
l'argininamide)
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NH
HNNH3+,CI"
CONH2
O NH
O ONa
O p
H N
N H
H2N H H S
P O q r p
O T O N -/OH
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p 11, q = 88, r = 48, s 73
5 Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon
statistique avec
de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 C. Cette
solution
est refroidie à 0 C, et 5,6 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis 4,8 mL de N-
méthyl-
morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 C. En
parallèle, 7,4 g
de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 93 mL de NMP, puis 4,7 mL
de
10 triéthylamine et 1,2 mL d'éthanolamine sont ajoutés. La suspension obtenue
est agitée
quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0 C. La suspension laiteuse de
polymère activé est
alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité
pendant 2 h à 0 C,
puis une nuit à 20 C. Après ajout de 2,07 mL d'une solution d'HCI 35 % puis
200 mL
d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 670 mL d'eau
acidifiée à pH = 3
15 avec HCI, en maintenant le pH vers 3 avec une solution d'HCl 1 N. La
solution obtenue est
diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et
concentrée jusqu'à
un volume d'environ 250 mL. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine
greffés,
déterminés par RMN du proton dans D20, sont respectivement de 40 et 22 %.
20 2) Exemple 1(comparatij): formulation à base de polymère PO ne portant pas
de dérivé
cationique (synthèse a)
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On utilise le polymère PO obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution
colloïdale de
polymère PO à 24 mg/g est obtenue en diluant 12,64 g de solution de PO avec
2,19 g d'eau.
L'osmolarité de la solution colloïdale de PO ainsi que son pH sont ensuite
ajustés à
290 mOsm et pH 6,95 en introduisant respectivement les quantités nécessaires
d'une
solution aqueuse de NaCI et d'une solution de NaOH.
Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques de la formulation obtenue:
La taille des particules est mesurée selon le test T.
[PO (mg/g) pH Osmolarité (mOsm) Taille (nm
23,14 6,95 290 40
La formulation à base de polymère PO décrite ci-dessus ne précipite pas lors
de l'ajout de
1 ml de cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp.
3) Exemple 2: formulation à base de polymére PO AI
3.1) Exemple 2.1: concentration en PO-A1 égale à 10 mg/g, contenant de l'IFN-
alpha
a) Préparation d'une solution colloïdale de PO-A1
On utilise le polymère PO-A1 obtenu selon la synthèse b) ci-dessus. On dilue
le PO-A1
dans l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité
(solution
appropriée de NaC1).
PO-A1 (mg/g) pH Osmolarité mOsm)
12,93 5,98 231
La solution colloïdale à base de polymère PO-A1 obtenue précipite lors de
l'ajout de 1 ml de
cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et est caractérisée par un
facteur de précipitation
Fp égal à 860. Le polymère PO-A1 est caractérisé par un pH* égal à 6,5.
b) Association de la protéine au polymère PO-A1
On ajoute 2,18 g de la protéine IFN-a à 2,4 mg/g à 8 g de solution colloïdale
de PO-Al, et on
ajuste la concentration finale par dilution avec une solution de NaCl
appropriée (0,18g).
c) Association une nuit à 25 C.
Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques de la formulation finale :
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La taille des particules est mesurée selon le test T'.
[polymère] [IFN-a] Osmolarité Taille
(mg/g) (m~g) pH (mOsm) (nin)
0,5 5,9 313 34
3.2) Exemple 2.2: concentration en PO-AI égale à 45 mg/g
5
On utilise le polymère PO-AI obtenu selon la synthèse b) ci-dessus. On dilue
le PO-AI
dans l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité
(solution
appropriée de NaCI).
PO-A1 (mg/g) pH Osmolarité (mOsm) Taille (nm)
45,3 5,5 299 37
La solution colloïdale à base de polymère PO-AI obtenue ne précipite pas lors
de l'ajout de
1 ml de cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et est caractérisée par
un facteur de
précipitation Fp égal à 166.
3.3) Exemple 2.3: concentration en PO AI égale à 10 mg/g, contenant de l'IFN-
alpha et
des cations Zn++
a) Préparation d'une solution colloïdale de PO-AI contenant 0,5 éq. Zn++
On utilise le polymère PO-Al obtenu selon la synthèse b) ci-dessus. On dilue
le PO-AI dans
l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité
(solution appropriée de
NaCI).
[PO-Al (mg/g) pH Osmolarité (mOsm
13,11 4,63 210
b) Association de la protéine au polymère PO-Al
A 2,17 g de protéine IFN-a à 2,4 mg/g on ajoute 7,96 g de solution colloïdale
de PO-Al
préparée à l'étape a), et on ajuste la concentration finale par dilution avec
une solution de
NaCI appropriée (0,18 g).
c) Association une nuit à 25 C
d) Ajout des cations Zn++
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La quantité nécessaire de solution de ZnC12 concentrée à 204 mg/g est ajoutée
à la
formulation précédente pour atteindre 0,5 équivalents molaires de cations Zn++
par dérivé
cationique présent en solution.
Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques de la formulation finale :
La taille des particules est mesurée selon le test T'.
[polymère] [IFN-a] [Zn++] pH Osmolarité Taille
(mg/g) (mg/g) (éq.) (mOsm) (nm)
10,02 0,5 0,51 4,05 337 36
La solution colloïdale à base de polymére PO-AI obtenue précipite lors de
l'ajout de 1 ml
de cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et est caractérisée par un
facteur de
précipitation Fp égal à 860. Le polymère PO-Al contenant 0,5 équivalent
molaire de
cations Zn++ par dérivé cationique est caractérisé par un pH* égal à 4,8.
4) Exemple 3: formulation à base de polymère PO-A2 à 30 mg/g contenant de
l'IFN-
alpha
a) Préparation d'une solution colloïdale de PO-A2
On utilise le polymère PO-A2 obtenu selon la synthèse c) ci-dessus. On dilue
le PO-A2
dans l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité
(solution
appropriée de NaCI).
[PO-A2] (mg/g) pH Osmo (mOsm
38,52 6,04 237
La solution colloïdale à base de polymère PO-A2 obtenue précipite lors de
l'ajout de 1 ml de
cette derniére sur 1 ml de solution tampon Tp, et est caractérisée par un
facteur de précipitation
Fp égal à 840. Le polymère PO-A2 est caractérisé par un pH* égal à 6,5.
b) Association de la protéine au polymère PO-A2
A 2,18 g de protéine IFN-a à 2,4 mg/g on ajoute 8 g de solution colloïdale de
PO-A2, et on
ajuste la concentration finale par dilution avec une solution de NaCI
appropriée (0,18 g).
c) Association une nuit à 25 C.
Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques de la formulation finale :
La taille des particules est mesurée selon le test T'.
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WO 2008/135562 PCT/EP2008/055506
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ol ère m IFN-a (mg/g) pH Osmolarité (mOsm) Taille (nm)
29,8 0,5 5,8 320 35
5) Exemple 4: formulation à base de polymère PO-B contenant ou non de l'IFN-a
5.1) Exemple 4.1: formulation à base de polymère PO-B à 10 mg/g contenant de
l'IFN-a
a) Préparation d'une solution colloïdale de PO-B
On utilise le polymère PO-B obtenu selon la synthèse d) ci-dessus. On dilue PO-
B dans l'eau,
et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité (solution
appropriée de NaCI).
PO-B (mg/g) pH Osmolarité (mOsm)
11,2 4,17 275
La solution colloïdale à base de polymère PO-B obtenue précipite lors de
l'ajout de 1 ml de
cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et est caractérisée par un
facteur de
précipitation Fp égal à 1150. Le polymère PO-B est caractérisé par un pH* égal
à 5.
b) Association de la protéine au polymère PO-B
A 1,8 g de protéine IFN-a à 2,7 mg/g on ajoute 8,6 g de solution colloïdale de
PO-B, et on
ajuste la concentration finale par dilution avec une solution de NaC1
appropriée.
c) Association une nuit à 25 C
La taille des particules est mesurée selon le test T'. Le tableau ci-dessous
regroupe les
caractéristiques de la formulation finale :
[polymère] [IFN-a] pH Osmolarité
(m ) (mg/g) (mOsm)
9,3 0,5 4,2 293
La formulation ainsi constituée est caractérisée dans le test Q par un facteur
de rétention Qr
supérieur à 5 (dosage ELISA du % d'IFN-a libre pour Qr = 5: 8%).
5.2) Exemple 4.2: concentration en PO-B égale à 45 mg/g
On utilise le polymère PO-B obtenu selon la synthèse d) ci-dessus. On dilue PO-
B dans
l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité
(solution appropriée
de NaCI).
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WO 2008/135562 PCT/EP2008/055506
[PO-B] pH Osmolarité Taille
(mg/g) (mOsm) (nm)
4 294 35
La solution colloïdale à base de polymère PO-B obtenue précipite lors de
l'ajout de 1 ml de
cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et elle est caractérisée par un
facteur de
5 précipitation Fp égal à 256. Le polymère PO-B est caractérisé par un pH*
égal à 5.
6) Exemple S(comparati~ : préparation de particules à base de PO contenant de
l'IFN-a
10 On utilise le polymère PO obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une
solution colloïdale de
polymère PO est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,52
par ajout
d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en
introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaC1. La
concentration en
polymère PO est ajustée à 29,05 mg/g.
15 On ajoute à la solution colloïdale de polymère PO précédente de la protéine
IFN-a
concentrée à 2,4 mg/g. L'association est réalisée pendant une nuit à 25 C.
La taille des particules est mesurée selon le test T'. Le tableau ci-dessous
regroupe les
caractéristiques des particules obtenues :
[PO] [IFN-a] pH Osmolarité Taille
(mg/g) (mg/g) (mOsm) (nm)
23 0,5 7,20 300 40
7) Résultats in vitro pour les exemples 2, 3 et 5
Pour cela, on mesure la libération du principe actif à partir des formulations
selon
l'invention en utilisant le test L.
La figure 1 montre la libération du principe actif dans le test L sous la
forme du
pourcentage de protéine libérée au cours du temps.
La formulation de l'exemple comparatif 5, contenant 23 mg/g de particules de
PO présente
un profil de libération caractérisé par 93 % de protéine libérée en 10 h.
Les formulations des exemples 2.1 et 3 présentent des profils de libération
retardés avec
des libérations respectivement de 67 et 65% de la protéine injectée en 48 h.
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Dans le cas des particules de l'exemple 2.3, on observe la création d'un flux
de libération qui
n'est pas nul en fin d'expérience, avec une libération de 59 % de la protéine
injectée en 48 h.
8) Résultats in vivo pour les exemples 2, 3 et 5
44 rats ont été séparés en 5 groupes de 8 ou 12 animaux et ont reçu en
paralléle :
- une formulation à libération immédiate IR, ou
-la formulation à libération prolongée de l'exemple comparatif 5, ou
- une des formulations des exemples de l'invention 2 et 3, à la dose de 300
g/kg.
Les résultats pharmacocinétiques sont regroupés dans le tableau ci-dessous
Exemple N Cmax Tmax médian AUC T50%AUC RBA
(ng/mL) (intervalle) (ng x h/mL) (h) (%)
(h)
IFN IR 12 100,6 0,5 (0,25 - 1) 255,9 1,5 100
(0,5)
Ex 2.1 8 3,6 3 (3 - 24) 135,4 24,7 57
Ex 2.3 8 1,1 3 3- 24 28,3 19,4 12
Ex 3 8 26,2 3 (3-6) 264,8 7,1 111
Ex 5 8 3,5 12 (6 - 24) 95,7 18,4 62
C,,,ax représente la concentration plasmatique maximale moyenne en protéine
sur
l'ensemble des animaux.
Tmax médian représente la médiane du temps pour lequel la concentration
plasmatique
passe par son maximum.
AUC représente l'aire moyenne sous la courbe de la concentration plasmatique
en fonction
du temps.
T50%Auc représente le temps moyen au bout duquel l'aire sous la courbe atteint
50% de sa
valeur totale.
RBA représente le rapport de l'aire sous la courbe de la formulation
considérée à l'aire sous
la courbe de la formulation IFN IR.
Par rapport à la formulation IR, toutes les autres formulations ont montré un
profil de
libération prolongée, accompagné d'une baisse du Cmax=
En comparaison avec l'exemple comparatif 5, la pente terminale de toutes les
formulations
selon la présente invention était plus faible, ce qui indique une absorption
résiduelle
prolongée.
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On a noté pour les formulations des exemples 2.1 et 3(PO-A1 à 10 mg/g, et PO-
A2 à
30 mg/g) des libérations prolongées sur plus de 5 jours (comparé à environ 3
jours pour la
formulation de l'exemple comparatif 5). Ces formulations des exemples 2.1 et 3
présentaient des RBA de 57 % et environ 100 % respectivement.
