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WO 2009/098404 PCT/FR2008/001661
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Procédé de préparation de nanoparticules à base de molécules ou
macromolécules amphiphiles fonctionnelles et leur utilisation
L'invention concerne un procédé de préparation de nanoparticules
à base de molécules ou macromolécules amphiphiles fonctionnelles et leur
utilisation pour le transport ou la vectorisation d'agents thérapeutiques, en
particulier d'agents anti-tumoraux.
Parmi les agents anti-tumoraux, le cis-platine est un agent anti-
tumoral largement utilisé, notamment pour le traitement de tumeurs solides.
Cependant, son utilisation se trouve limitée par sa toxicité ainsi que
l'apparition
d'une résistance acquise.
Pour pallier ces inconvénients, différentes formulations ont été
proposées dans l'art antérieur: par exemple, le brevet US 5 178 876 décrit des
dérivés de platine sous forme de complexe hydrophobe destinés à une
encapsulation dans des liposomes.
Le brevet US 6 001 817 décrit des compostions contenant du cis-
platine et un vecteur comprenant au moins un nucléoside ou déoxynucléoside.
Le brevet US 7 908 160 concerne des dérivés de cis-platine liés
à des ligands, dont l'activité est réversible en fonction de la liaison au
ligand.
La demande WO01/32139 décrit des compositions de cis-platine
encapsulé dans des nanoparticules lipophiles obtenues par cycles répétés de
chauffage et congélation, à base de lipides naturels chargés négativement, en
particulier la dioléylphosphatidylsérine. Il est indiqué dans cette demande
que le
cis-platine forme, dans l'eau, des agrégats chargés positivement présentant
une solubilité dans plus élevée que les espèces non chargées, ce qui permet
leur interaction avec les membranes lipidiques chargées négativement et la
réorganisation des membranes lipidiques autour des agrégats de cis-platine.
Cependant, il existe encore un besoin pour résoudre les
problèmes liés à la vectorisation des agents thérapeutiques, en particulier
les
agents anti-tumoraux.
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Notamment, il est recherché un moyen de permettre un transport
des agents thérapeutiques (notamment le cis-platine et/ou ses dérivés)
rapidement à l'intérieur des cellules tumorales avec une activité
pharmacologique élevée, tout en préservant les cellules saines, c'est-à-dire
en
diminuant la toxicité neurologique, rénale, auditive, digestive, etc., en
limitant
simultanément les phénomènes d'apparition de résistance à cet agent
thérapeutique.
Il est également recherché de fournir un vecteur présentant une
stabilité dans le temps suffisante pour éviter la libération précoce de
l'agent
thérapeutique et les inconvénients liés à la présence de l'agent thérapeutique
libre dans le milieu biologique, notamment en termes de perte d'activité et de
toxicité.
On a maintenant trouvé que l'utilisation de nanoparticules formées
à partir de molécules ou macromolécules amphiphiles fonctionnelles permettait
la délivrance intracellulaire efficace et rapide d'agents thérapeutiques et
présentaient des propriétés de stabilité améliorées, en particulier à 37 C,
permettant une vectorisation prolongée dans le temps desdits agents
thérapeutiques.
Par agents thérapeutiques , on entend, par exemple, une
molécule naturelle ou synthétique utilisée pour la prévention ou le traitement
d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in vitro ou in
vivo,
en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des
cellules
isolées, à l'exception des acides nucléiques ou de leurs fragments.
Une telle molécule peut être choisie, par exemple, parmi les
principes actifs de médicaments, en particulier parmi les agents anti-tumoraux
tels que, par exemple :
- les complexes de platine, parmi lesquels on peut notamment
citer le cis-platine, le carboplatine, l'oxaliplatine, le nédaplatine, le
lobaplatine,
etc.,ou
- le ruthénium capable de se lier à des complexes de platines, ou
encore
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- les complexes inorganiques sans platine à base de ruthénium Il
et/ou III, de titane, par exemple le dichlorure de titanocène, ou de gallium,
par
exemple les sels de gallium tels que le nitrate de gallium, le chlorure de
gallium,
le KP46, ou
- les dérivés du fer, tels que, par exemple, les sels de ferrocenium,
les analogues nucléosidiques contenant du fer, les complexes de fer (II)
contenant des ligands pyridyl-pentadéntate, ou
- les dérivés du cobalt, tels que, par exemple, les complexes
d'hexacarbonyl-dicobalt, les complexes d'alkyne-cobalt, le complexe de Co(lll)
contenant un ligand azote motarde, ou
- les dérivés de l'or tels que, par exemple, l'Auranofin, les
complexes d'or (I), (III) et (III), l'aurothioglucose, etc.
Avantageusement, l'utilisation de nanoparticules formées à partir
de molécules ou macromolécules amphiphiles fonctionnelles de formule (I) pour
encapsuler ces composés et assurer leur délivrance intracellulaire permet de
limiter les phénomènes de résistance à ces composés.
Les complexes de platine, en particulier le cis-platine, sont des
agents thérapeutiques préférés aux fins de l'invention.
Des complexes inorganiques à base de ruthénium Il et/ou III,
peuvent être, par exemple, les complexes dénommés NAMI-A, RAPTA-C,
KP1019. De tels complexes non platinés sont décrits dans Ott I. et Gust R.,
Arch. Pharm. Chem. Life Sei. 2007, 340, 117-126 ; Reedijk J., Curr Opin Chem
Biol., 1999, 3, 236-40 ; Haimei Chen et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 173-
186.
Des analogues nucléosidiques contenant du fer sont décrits dans
Schlawe D. et al, Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 1731-1734.
L'invention concerne donc, selon un premier aspect, un procédé
d'encapsulation d'un agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral,
comprenant les étapes consistant à :
a) préparer un mélange d'au moins un composé amphiphile
fonctionnel de formule (I)
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X B
R3
(I)
LI L2
!1
RI R2
dans laquelle
- X représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupe méthylène,
- B représente une base purique ou pyrimidique telle que uracile, adénine,
guanine, cytosine, thymine, hypoxanthine, ou leurs dérivés, ou encore une
base hétérocylique mono-ou bi-cyclique non naturelle dont chaque cycle
comporte 4 à 7 chaînons, éventuellement substituée ;
- L1 et L2, identiques ou différents, représentent l'hydrogène, un groupe
oxycarbonyl -O-C(O)-, un groupe thiocarbamate -O-C(S)-NH-, un groupe
carbonate -O-C(O)-O-, un groupe carbamate -O-C(O)-NH-, un atome
d'oxygène, un groupe phosphate, un groupe phosphonate ou un groupe
hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, substitué ou non substitué par
une chaîne hydrocarbonée, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée en C2-
C30,
ou encore, L1 et L2, ensemble, forment un groupement cétal de formule
O O
ou encore L, ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe
hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, non
substitué ou substitué par une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30;
- RI et R2, identiques ou différents, représentent
- une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée en C2-C30, de préférence en
C6-C25, notamment en C8-C25, saturée ou partiellement insaturée,
éventuellement totalement ou partiellement fluorée, non substituée ou
substituée sur le carbone d'extrémité de chaîne par un atome de fluor ou par
un ester ou un éther benzylique ou naphtylique, ou
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- une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne acyle en C2-C30, ou
- un groupe diacylglycérol, sphingosine ou céramide, ou
- lorsque L, ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe
hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, R1 et R2
n'existent pas ;
R3 représente
- un groupement hydroxy, amino, phosphate, phosphonate,
phosphatidylcholine, O-alkyl phosphatidylcholine, thiophosphate,
phosphonium, NH2-R4, NHR4R5 ou NR4R5R6 dans lesquels R4, R5 et R6,
identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne
alkyle linéaire ou ramifiée en C1-C5 ou hydroxyalkyle linéaire ou ramifié en
Ci-
C5, ou
- une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30 éventuellement substituée
par un groupe hydroxy , ou
- un reste cyclodextrine, ou
- un reste
R7
H -(-CH2-C-)n-H
1
CO-V-
dans lequel V représente une liaison -O-,-S-, ou -NH-, R7 représente H ou
CH3, et n= 1 à 500 , ou
un groupe -(CH2)r,-V-R8, dans lequel R8 représente un alkyle en C2-C30, et
n = 1 à 500, ou
- un groupe hétéroaryle renfermant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou
substitué par un alkyle en C2-C30, ou par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9
dans lequel m = 1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal
cyclique renfermant 5 à 7 atomes de carbone, non substitué ou substitué
par au moins un alkyle linéaire ou ramifié en C2-C30 ou par un reste stérol,
ou encore
- R3 est lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique ou
différent,
d'un autre composé de formule (I), identique ou différent, pour former un
composé de formule (I) sous forme de dimère,
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et
- un agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral,
b) soumettre ledit mélange à des cycles répétés de chauffage et
congélation, de manière à obtenir des nanoparticules contenant ledit agent
thérapeutique, et
c) récupérer les nanoparticules contenant ledit agent
thérapeutique ainsi obtenues.
De manière avantageuse, on a trouvé que les structures
moléculaires et/ou macromoléculaires qui constituent les composés de formule
(I), comprenant au moins un ligand de l'agent thérapeutique (nucléobase,
nucléoside, nucléoside modifié, nucléotides, oligonucléotide, hétérocycle,
etc)
repésenté par le substituant B, et présentant un caractère amphiphile du fait
de
la présence d'au moins une partie hydrophile (phosphate, carboxylate, etc), et
d'au moins une partie hydrophobe (segments hydrophobes monocaténaires,
bicaténaires et parties polaires dérivées de synthons d'origine biologique,
etc),
permettaient de former avec l'agent thérapeutique des nanoparticules stables.
Par la combinaison des propriétés amphiphiles des composés de
formule (1), de la présence de ligands de l'agent thérapeutique (principe
actif)
dans ces composés et des éventuelles interactions électrostatiques entre les
agents thérapeutiques et ces composés, les nanoparticules ainsi obtenues
présentent une structure permettant une délivrance intra-cellulaire efficace
et
rapide des principes actifs encapsulés, en particulier des agents anti-
tumoraux.
Sans vouloir lier l'invention à une théorie, on peut émettre
l'hypothèse selon laquelle les interactions intermoléculaires des composés de
formule (I) induisent une augmentation des forces de cohésion à la surface des
nanoparticules, ce qui se traduit par une plus grande stabilité dans le temps,
dans les conditions d'utilisation.
Avantageusement, lesdites nanoparticules présentent également
une durée de vie compatible avec leur utilisation comme vecteur d'agent
thérapeutique.
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Dans la formule (I) ci-dessus, n est avantageusement compris entre
1 et 500, de préférence compris entre 1 et 100, notamment compris entre 1 et
50 ,
tout particulièrement compris entre 1 et 10.
Par alkyle linéaire ou ramifié en CI-C5 , on entend par exemple
un radical méthyle, éthyle, propyle, i-propyle, n-butyle, i-butyle, tert-
butyle, de
préférence méthyle ou éthyle.
Egalement, dans la formule (I) ci-dessus, la base purique ou
pyrimidique, ou la base hétérocyclique non naturelle peut être substituée par
au
moins un substituant choisi, par exemple, parmi un halogène, un groupe amino,
un groupe carboxy , un groupe carbonyl, un groupe carbonylamino, un groupe
hydroxy, azido, cyano, alkyle, cycloalkyl, perfluoroalkyl, alkyloxy (par
exemple,
méthoxy), oxycarbonyl, vinyl, ethynyl, propynyl, acyl etc.
On entend par base hétérocyclique non naturelle une base
autre que uracile, adénine, guanine, cytosine, thymine ou hypoxanthine, qui
n'existe pas dans la nature.
Par groupe hétéroaryle renfermant 1 à 4 atomes d'azote , on
entend un groupement carbocyclique monocyclique ou bycyclique, aromatique
ou partiellement insaturé, renfermant 5 à 12 atomes, interrompu par 1 à 4
atomes d'azote, en particulier les groupes pyrazole, triazole, tétrazole ou
imidazole.
Pour la préparation des composés de formule (I), on peut se
référer à la demande WO 2005/116043, qui décrit différentes voies d'accès à ce
type de composés (voir notamment p. 8-17 et exemples).
Le procédé selon l'invention peut comprendre les étapes mises en
oeuvre dans les conditions générales suivantes :
- le composé de formule (I), est mis en solution dans un solvant
organique pour former un mélange lipidique, puis, après prélèvement, on
évapore pour former un film ;
- parallèlement, la quantité voulue d'agent thérapeutique, de
préférence un agent anti-tumoral, est mise en solution dans de l'eau distillée
;
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- le film lipidique est réhydraté dans la solution d'agent
thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral. Une solution limpide est
obtenue par sonification et chauffage ;
- la solution est refroidie rapidement, par exemple par immersion
dans l'azote liquide. Ce cycle chauffage / refroidissement est effectué de
préférence de 1 à 10 fois, en particulier de 5 à 10 fois, notamment 10 fois.
La solution obtenue est centrifugée. Le surnageant est écarté.
Après plusieurs centrifugations, le culot est séché.
Le solvant organique peut être choisi, par exemple, parmi les
solvants organiques usuels dans le domaine, tels que, par exemple, le
chloroforme, un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol, etc.
Le chauffage est effectué, de préférence, à une température de
l'ordre de 20 C à 80 C, et le refroidissement à une température de l'ordre de -
190 C (azote liquide) à 0 C (glace). Un cycle chauffage/refroidissement
approprié peut, par exemple, être de 45 C pour le chauffage et de -78 C pour
le
refroidissement.
De préférence, l'agent thérapeutique est choisi parmi les
complexes de platine (cis-platine, carboplatine, ... ), le cis-platine étant
particulièrement préféré, ou bien le ruthénium capable de se lier à des
complexes de platines, ou encore les complexes inorganiques sans platine à
base de ruthénium II ou III, de titane de gallium, de cobalt, de fer ou d'or
mentionnés plus haut.
Le rapport molaire R du composé de formule (I) / agent
thérapeutique peut être compris, par exemple, entre 0,01 à 50, en particulier
R = 0,2.
Les nanoparticules obtenues peuvent être éventuellement
extrudées sur filtre polycarbonate ayant, par exemple, un diamètre de pores de
l'ordre de 100 ou 200 nm.
On obtient ainsi des nanoparticules solides qui sont constituées
d'un coeur riche en agent thérapeutique (principe actif) entouré par une ou
plusieurs couches lipidiques constituées de composé amphiphile fonctionnel de
formule (1) telle que définie plus haut, avec ou sans co-lipide.
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Lesdites nanoparticules, solides, constituées d'un coeur riche en
agent thérapeutique, de préférence un agent antitumoral, en particulier un
complexe de platine, entouré par une ou plusieurs couches lipidiques
constituées de composé amphiphile fonctionnel de formule (I) telle que définie
plus haut, avec ou sans co-lipide, représentent un objet ultérieur de
l'invention.
Dans le cas d'un entourage multi-couches, toutes les couches
lipidiques sont constituées des mêmes lipides (composé de formule (I) avec ou
sans co-lipide).
Selon un aspect de l'invention, on utilisera dans le mélange
lipidique, en complément du composé de formule (I), au moins un un colipide.
Par colipide , on entend un composé utilisé en association avec
le composé de formule (I), qui participe à l'élaboration de la structure de là
ou
des couche(s) lipidique(s) de la nanoparticule.
On utilisera, de préférence, un colipide zwitterionique.
Ledit colipide peut être, par exemple, choisi parmi la
dioléylphosphatidylcholine (DOPC) ou la dioléylphosphatidyluridine
phosphatidylcholine (DOUPC), en combinaison avec le composé de formule (I)
pour former la ou les couche(s) lipidiques de la nanoparticule.
Ces composés peuvent jouer le rôle de colipide lorsqu'ils sont
utilisés en mélange avec un composé de formule (I). Alternativement, ils
peuvent être compris dans la formule (I), comme, par exemple, la
dioléylphosphatidyluridinephosphatidylcholine (DOUPC). Dans ce cas, ils
joueront, soit le rôle de composé de formule (I), soit, en combinaison avec un
autre composé de formule (I), le rôle de colipide.
Selon un aspect préféré du procédé, ledit mélange lipidique
contient uniquement au moins un composé de formule (I) et ne contient pas de
colipide.
On utilisera de préférence l'agent thérapeutique à une
concentration de l'ordre de 0,1 ng/mL à 10 mg/mL dans la phase aqueuse, de
manière à ce que la délivrance intracellulaire du principe actif soit
importante.
Des composés préférés de formule (I) sont ceux dans lesquels X
représente l'oxygène.
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Les composés de formule (I) dans lesquels B représente la
thymine ou l'adénine sont également des composés préférés.
Parmi les composés de formule (I) particulièrement avantageux
aux fins de l'invention, on peut citer les composés de formule (I) dans
lesquels :
5 - X et B sont tels que définis ci-dessus ;
- Li représente un groupe phosphate, L2 représente l'hydrogène, RI
représente un groupe alkyle en C2-C30 ou un groupe diacyl dans lequel
chaque chaîne acyle est en C2-C30, et R3 est un groupe hydroxy ; ou
- LI et L2 représentent un atome d'oxygène, RI et R2 représentent l'hydrogène
10 et R3 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole
substitué par un groupe alkyle en C2-C30, ou
- Li représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole, L2
représente l'hydrogène, RI représente un groupe alkyle en C2-C30 et R3 est
un groupe hydroxy , ou
- LI représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un
groupe triazole substitué par une chaîne alkyle en C2-C30, éventuellement
substituée par un groupe hydroxy, ou R3 est un groupe ou un groupe -
(CH2)n-V-R8, dans lequel V représente -O- ou -NH- et R8 représente un
alkyle en C2-C30, ou
- LI représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un
groupe triazole substitué par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m =
1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à
7 atomes de carbone, non substitué ou substitué par au moins un groupe
alkyle linéaire ou ramifié en C2-C30 ou par un reste stérol , ou
- LI représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un
groupe triazole substitué par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m =
1 à 6 et p = 0 à 10 lié par liaison covalente à un autre substituant R3,
identique, d'un autre composé de formule (I), identique, pour former un
composé de formule (I) sous forme de dimère , ou
- LI représente un groupe phosphate, L2 représente l'hydrogène RI représente
une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne diacyle est en C2-C30 , et R3
est un groupement hydroxy,
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qui sont des composés nouveaux.
Les composés de formule (I) dans lesquels le substituant Li ou le
substituant R3 est constitué de ou comporte un groupe triazole, non substitué
ou substitué, sont également des composés nouveaux préférés aux fins du
procédé selon l'invention.
Les composés ci-dessus sont des composés nouveaux qui
représentent un objet de l'invention, ainsi que les nanoparticules comprenant
ces composés et un agent thérapeutique, en particulier un agent anti-tumoral,
en particulier les complexes de platine (tels que, par exemple le cis-platine,
le
carboplatine, l'oxaliplatine, le nédaplatine, le lobaplatine,), ou le
ruthénium
capable de se lier à des complexes de platines, ou encore des complexes
inorganiques sans platine à base de ruthénium, de titane, de gallium, de
cobalt,
de fer ou d'or mentionnés plus haut . Le cis-platine est un agent anti-tumoral
préféré aux fins de l'invention.
Les composés de formule (I) peuvent comporter des dérivés de
base purique ou pyrimidique ayant une activité antinéoplasique, tels que, par
exemple, l'aracytosine (AraC), le 5-fluorouracile (5-FU), l'lododéoxyuridine
(IdU), la 2'-déoxy-2'-méthylidènecytidine (DMDC) ou la 5-chloro-6-azido-5,6-
dihydro-2'-déoxyuridine.
L'invention a également pour objet l'utilisation des nanoparticules
susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus, pour le
transport
ou la vectorisation d'agent thérapeutiques, en particulier d'agents anti-
tumoraux.
En particulier, l'invention concerne l'utilisation des nanoparticules
susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus, pour la
délivrance
intracellulaire d'agents thérapeutiques, en particulier d'agents anti-
tumoraux.
L'invention concerne également l'utilisation des nanoparticules
susceptibles d'être obtenues par le procédé ci-dessus, pour la préparation de
médicaments anti-tumoraux.
L'invention concerne également les nanoparticules susceptibles
d'être obtenues par le procédé ci-dessus, pour le traitement de maladies
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tumorales, en particulier de cancers, tels que, par exemple, les cancers de
l'ovaire, du testicule, du colon, du col de l'utérus, du poumon, ou
l'adénosarcome etc.
L'invention est illustrée de manière non limitative par les exemples
ci-dessous.
L'ensemble des produits de départ proviennent de fournisseurs de
produits chimiques (Aldrich, Alfa Aesar et Avanti Polar Lipid) et sont
utilisés
sans purification ultérieure. Les solvants ont été utilisés sans distillation
supplémentaire. Les composés synthétisés ont été caractérisés à l'aide de
méthodes analytiques spectroscopiques standard telles que les RMN 1H à
300,13 MHz, 13C à 75,46 MHz et 3'P à 121,49 MHz) et la spectroscopie de
masse (Caractéristiques). Les déplacements chimiques (8) en RMN sont
exprimés en ppm et relativement au TMS. Les constantes de couplage J en
RMN du 1H sont exprimées en Hz. Des plaques Merck RP-18 F254s ont été
utilisées pour la chromatographie sur couche mince (CCM). De la silice
SEPHADEX LH-20 (25-100 pm) a été utilisée pour les purifications par
chromatographies quantitatives.
Les exemples ci-dessous, intitulés Préparation décrivent la
préparation d'intermédiaires de synthèse utilisés pour préparer les composés
de formule (I). La préparation des composés de formule (1) est décrite ensuite
dans les exemples de synthèse intitulés Exemple .
Préparation 1
5'- paratoluènesulfonylthymidine
o
CINZ
O=S=O O
O
OH
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Dans un ballon bi-col sous atmosphère d'azote anhydre, on
introduit 2 g de thymidine (8,26 mmol) en solution 0,1 M dans la pyridine
anhydre. La solution est alors refroidie à 0 C et 3,935 g de chlorure d'acide
paratoluène sulfonique (2,5 équivalents, 20,6 mmol) sont additionnés par
petites fractions. On laisse revenir le milieu réactionnel à température
ambiante,
puis on agite pendant 10 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL
de
méthanol, l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50
mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 20 mL d'une solution à 5% de
NaHCO3, 20 mL d'une solution saturée de NaCl et 20 mL d'une solution à 5%
de NaHCO3. Le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu
est obtenu pur par recristallisation dans le méthanol.
RF : 0,47 (AcOEt/MeOH 9/1)
Rendement : 75%
RMN 1H (300,13 MHz, DMSO d6) : S 1,77 (s, 3H, CH3), $ 2,11 (m,
2H, CH2), S 2,42 (s, 3H, CH3), b 3,52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), b 4,18 (m, 1 H,
CH),
ô 4,25 (m, 3H, CH, CH2), 6 5,42 (s, 1H, OH), b 6,15 (t, j = 6 Hz, H, CH), 8
7,38
(s, 1 H, CH), b 7,46 (s, 1 H, CH), â 7,49 (s, 1 H, CH), 8 7,78 (s, 1 H, CH), ô
7,81 (s,
1H, CH), 3 11,28 (s, 1H, NH).
RMN 13C (75,47 MHz, DMSO d6) : 5 12,5 (CH3),6 21,6 (CH3), b
38,9 (CH2), ô 70,4 (CH2), b 70,6 (CH),S 83,7 (CH), â 84,5 (CH), ô 110,3 (C), ô
128,1 (CH ar), 3 130,6 (2 CH ar), â 132,6 (C ar), ô 136,4 (C ar), â 145,6 (C),
ô
150,8 (C=O), 6 164,1 (C=O).
SM Haute [M+H]+ : 397,1
Préparation 2
2'-déoxy-5'-toluènesulfonyladénosine
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14
NH2
N
N
</
0=S=O N (N%
OH
Dans un ballon bi-col sous atmosphère d'azote anhydre, on
introduit 2 g de 2'-déoxyadénosine (8 mmol) en solution 0,1 M dans la pyridine
anhydre. La solution est alors refroidie à 0 C et 3,793 g de chlorure d'acide
paratoluène sulfonique (2,5 équivalents, 20 mmol) sont additionnés par petites
fractions. On laisse revenir le milieu réactionnel à température ambiante,
puis
on agite pendant 10 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de
méthanol, l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange
50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 20 mL d'une solution à 5%
de NaHCO3, 20 mL d'une solution saturée de NaCI et 20 mL d'une solution à
5% de NaHCO3. Le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé
attendu est obtenu pur par recristallisation dans le méthanol. 2,1 g d'un
produit
blanc sont ainsi isolés.
RF: 0,37 (AcOEt/MeOH 9/1)
Rendement : 63%
Préparation 3
5'azido-5'-déoxythymidine
o
N O
N3
OH
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Dans un ballon bi-col muni d'un réfrigérant et sous atmosphère
d'azote anhydre, on introduit 2 g de 5'-paratoluènesulfonylthymidine (5 mmol)
telle que décrite dans la préparation 1 en solution 0,1 M dans le DMF. 1,3 g
d'azidure de sodium (4 équivalents, 20 mmol) sont ajoutés. La solution est
alors
5 agitée et chauffée à 110 C pendant 10 h. Le mélange est refroidi à
température
ambiante. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement
par 2 fois 15 mL d'eau puis par 15 mL d'une solution aqueuse saturée de NaCI.
La phase organique est séchée sur sulfate de sodium puis le solvant est
éliminé
sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur par recristallisation
10 dans le méthanol. On obtient ainsi 0,8 g d'un solide blanc.
RF : 0,47 (AcOEt/MeOH 9/1)
Rendement : 60%
SM [M+H]+ : 268.1
15 Préparation 4
5'-azido-5',2'-didéoxyadénosine
<x5
N3
O
OH
Dans un ballon bi-col muni d'un réfrigérant et sous atmosphère
d'azote anhydre, on introduit 2 g de 2'-déoxy-5'-paratoluènesulfonyladénosine
telle que décrite dans la préparation 2 (5 mmol) en solution 0,1 M dans le
DMF.
1,3 g d'azidure de sodium (4 équivalents, 20 mmol) sont ajoutés. La solution
est
alors agitée et chauffée à 110 C pendant 10 h. Le mélange est refroidi à
température ambiante. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave
successivement par 2 fois 15 mL d'eau puis par 15 mL d'une solution aqueuse
saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium puis le
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solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur
par recristallisation dans le méthanol. On obtient ainsi 0,8 g d'un solide
blanc.
RF : 0,37 (AcOEt/MeOH 9/1)
Rendement : 60%
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 277,1161 , masse
mesurée : 277,1157
Préparation 5
1-propargyloxyoctadécane
Dans un ballon propre et sec, sous atmosphère d'azote anhydre,
sont introduits 673 mg d'alcool propargylique (12 mmol) en solution 0,5 M dans
le DMF. La solution est alors refroidie à 0 C et 180 mg d'hydrure de sodium
(0,625 équivalent, 7,5 mmol) sont additionnés par petites fractions. Le milieu
réactionnel est laissé revenir à température ambiante. 2 g de 1-bromo-
octadecane (0,5 équivalent, 6 mmol) sont ajoutés. L'agitation est maintenue
pendant 5 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de méthanol et
l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de
CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 20 mL et 20 mL d'une solution
saturée de NaCi. La phase organique est alors séchée sur Na2SO4 puis le
solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur
après séparation sur colonne chromatographique (hexane). 1,2 g d'un produit
blanc sont ainsi isolés.
RF : 0,82 (Hexane)
Rendement : 65 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : S 0,90 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), S
1,28 (s, 30H, CH2), S 1,61 (m, 2H, CH2),S 2,43 (t, j = 3 Hz, 1 H, CH), ô 3,53
(t,
j = 6 Hz, 2H, CH2), 8 4,15 (d, j = 3 Hz, 2H, CH2).
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RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3) : RMN '3C (75,47 MHz, CDCI3) : 8
14,2 (CH2), 8 22,7 (CH2),8 26,1 (CH2),8 29,4 (CH2),8 29,5 (CH2), 8 29,6 (CH2
), 8
32,0 (CH2), 8 58,0 (CH2), ô 70,4 (CH2), 8 74,1 (CH), 6 80,1 (C).
Préparation 6
1,12-propargyloxydodécane
12-propargyloxydodécan-1-ol
Dans un ballon propre et sec, sous atmosphère d'azote anhydre,
on introduit 1 g de dodécan-1,12-diol (5 mmol) en solution 0,5 M dans le DMF.
La solution est alors refroidie à 0 C et 360 mg d'hydrure d'hydrogène (3
équivalents, 15 mmol) sont additionnés par petites fractions. On laisse
revenir
le milieu réactionnel à température ambiante. 1,49 g de bromure de propargyle
(2,5 équivalents, 12,5 mmol) sont ajoutés. L'agitation est maintenue pendant
5 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de méthanol, l'agitation
est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on
lave successivement par 2 fois 20 mL et 20 mL d'une solution saturée de NaCI.
La phase organique est alors séchée sur Na2SO4 puis le solvant est éliminé
sous pression réduite. Les produits obtenus sont alors séparés sur colonne
chromatographique (Hex/ActEth 9/1). Deux produits sont isolés, à savoir
370 mg d'une huile brune correspondant au 1,12-Propargyloxydodécane et 430
mg d'un solide brun correspondant au 12-propargyloxydodécan-1-ol.
1, 1 2-propargyloxydodécane
RF : 0,53 (Hexane/AcOtEt 9/1)
Rendement : 27 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 8 1,31 (m, 16H, CH2), 8 1,61 (m,
4H, CH2), 8 2,43 (t, j = 3 Hz, 1 H, CH), 8 3,52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), 8 4,15
(d, j =
3 Hz, 4H, CH2).
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RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3) : 8 26,1 (CH2), 6 29,4 (CH2), 8 29,5
(CH2), 8 29,6 (CH2), 3 58,0 (CH2), 8 70,3 (CH2), 8 74,1 (CH), 6 80,1 (C).
12-propargyloxydodécan-1-ol
OH
RF : 0,10 (Hexane/AcOtEt 9/1)
Rendement : 36 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 6 1,32 (m, 16H, CH2), 6 1,59 (m,
4H, CH2), 8 2,43 (t, j = 3 Hz, 2H, CH), ô 3,52 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 6 3,65
(t, j =
6 Hz, 2H, CH2), 6 4,15 (d, j = 3 Hz, 2H, CH2).
RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3) :ô 25,8 (CH2), 8 26,0 (CH2), 8 29,4
(2 CH2), 8 29,5 (2 CH2), 8 29,6 (CH2), 8 32,7 (CH2), 8 57,9 (CH2), 6 62,7
(CH2),
6 70,2 (CH2), 8 74,2 (CH), 8 79,9 (C).
Préparation 7
o-propargylcholestérol
Dans un ballon propre et sec, sous atmosphère d'azote anhydre,
on introduit 500 mg de cholestérol (1,3 mmol) en solution 0,5 M dans le DMF.
La solution est alors refroidie à 0 C et 47 mg d'hydrure de sodium
(1,5 équivalents, 2 mmol) sont additionnés par petites fractions.
On laisse revenir le milieu réactionnel à température ambiante 238 mg de
bromure de propargyle (1,5 équivalents, 2 mmol) sont ajoutés. L'agitation est
maintenue pendant 5 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de
méthanol et l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50
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mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 20 mL et 20 mL d'une
solution saturée de NaCI. La phase organique est alors séchée sur Na2SO4
puis le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est
obtenu après purification sur colonne chromatographique (Hexane/AcOEt 8/2).
215 mg d'un produit blanc sont ainsi isolés.
RF : 0,83 (Hexane/AcOEt 8/2)
Rendement : 39
Exemple 1
Thymidine 3'-(1,2-d imyristoyl-sn-glycéro-3-phosphate) (di cl4dT)
o
NH
N 0
O
"O
0
O-P=0
O O O O
( ) 11 ( ) 11
De la 5'-0-(4,4'-diméthoxytrityl)-2'-déoxythymidine,3'-[(2-cyano-
éthyl)-N,N-diisopropyl)] phosphoramidite (0,500 g, 1 éq, 0,67 mmol), du 1,2-
dimyristoyl-sn-glycérol (0,447 g, 1,3 éq, 0,87 mmol) et une solution de
tétrazole
0,45 M dans l'acétonitrile (2 mL, 1,3 éq, 0,87 mmol) sont dissous dans 4 mL
d'acétonitrile anhydre sous azote. Le milieu réactionnel est mis sous
agitation
magnétique pendant 24h00 à température ambiante. Le mélange est ensuite
oxydé par ajout de 43 mL d'une solution de diiode 0,02M dans THF/Pyr/H20.
Après 12 h à température ambiante, le solvant est évaporé sous vide. Le résidu
est dissous dans 8 mL de dichlorométhane. Ensuite, 0,2 mL de 1,5-
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diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène (DBU) (1,3 éq, 0,87 mmol) sont ajoutés au
milieu réactionnel pendant 5 h. Le milieu réactionnel est lavé avec une
solution
de HCI 0,IN puis avec une solution saturée de Na2S2O7. La phase organique
est concentrée sous vide. Le composé est obtenu après purification par
5 chromatographie flash (381 mg) en utilisant un gradient d'élution (MeOH/DCM
9:1 jusqu'à 1:1).
Rendement : 69%
Rf : 0,34 (DCM/MeOH 9 :1)
10 RMN 1H (300 MHz, CDC13) : b en ppm 0,84 (t, 6H, J=6,92 Hz,
2*CH3), 1,21 (m, 40H, 20*CH2), 1,42 (dd, 4H, J1=8,45 Hz, J2=15,68 Hz,
2*CH2), 1,89 (s, 3H, Me), 2,30 (dd, 4H, J1=7,43 Hz, J2=15,92 Hz, 2*CH2), 2,83
(t, 2H, J=5,84, H2'), 3,84 (m, I H, H3'), 4,09-4,35 (m, 7H, 2*CH2(glycerol),
H4',
H5'), 5,27 (s, 1 H, CHglycérol), 6,22 (t, 1 H, J=6,81 Hz, H1'), 7,61 (s,1 H,
Hbase).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) : 8 en ppm 19,29 (CH3), 23,71 (CH2),
26,57 (CH2), 28,73 (CH2), 32,76 (CH2), 37,85 (CH2), 48,90 (CH2), 166,15
(C=O).
RMN 31P (121 MHz, CDC13) : 8 en ppm 0,61.
Masse Haute Résolution FAB- théorique m/z = 815,4823 observé
m/z = 815,4794.
Exemple 2
Thymidine 3'-(1,2-dipalmitoyi-sn-glycéro-3-phosphate) (di cl6dT)
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21
0
NH
NZ
HO
0
O-P=0
0
0 0 0 0
13 13
De la 5'-0-(4,4'-diméthoxytrityl)-2'-déoxythymidine,3'-[(2-cyano-
éthyl)-N,N-diisopropyl)] phosphoramidite (0,500 g, 1 éq, 0,67 mmol), du 1,2-
dipalmitoyl-sn-glycérol (0,496 g, 1,3 éq, 0,87 mmol / solubilisé dans 3 mL de
THF) et une solution de tétrazole 0,45 M dans l'acétonitrile (2 mL, 1,3 éq,
0,87
mmol) sont dissous dans 3 mL d'acétonitrile anhydre sous azote. Le milieu
réactionnel est mis sous agitation magnétique pendant 24h00 à température
ambiante et sous azote. Le mélange est ensuite oxydé par ajout de 43 mL
d'une solution de diiode 0,02M dans THF/Pyr/H20. Après 12 h à température
ambiante, le solvant est évaporé sous vide et séché à la pompe sous P205
pendant une nuit. Le résidu est dissous dans 8 mL de dichlorométhane.
Ensuite, 0,2 mL de 1,5-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène (DBU) (1,3 éq,
0,87 mmol) sont ajoutés au milieu réactionnel pendant 5 h. Le milieu
réactionnel
est lavé avec une solution de HCI 0,1N puis avec une solution saturée de
Na2S2O3. La phase organique est concentrée sous vide. Le composé est
obtenu après purification par chromatographie flash (180 mg) en utilisant un
gradient d'élution (MeOH/DCM 98:2 jusqu'à 1:1).
Rendement : 24%
Rf : 0,3 (DCM/MeOH 8:2)
RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 6 en ppm 0,88 (t, 6H, J=6,9 Hz,
2*CH3), 1,25 (m, 48H, 24*CH2), 1,42 (dd, 4H, J1=8,4 Hz, J2=15,6 Hz, 2*CH2),
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1,90 (s, 3H, Me), 2,33 (m, 4H, 2*CH2), 2,83 (t, 2H, J=5,6 Hz, H2'), 3,84 (m,
1H,
H3'), 4,09-4,35 (m, 7H, 2*CH2(glycerol), H4', H5'), 5,27 (s, 1 H, CH
glycérol), 6,21
(t, 1 H, J=6,7 Hz, H1'), 7,54 (s,1 H, H base).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) : S en ppm 12,4 (CH3 base), 14,1 (CH3
chaîne), 19,6 (CH2), 19,7 (CH2), 22,6 (CH2), 24,8 (CH2), 29,1-29,6 (CH2), 31,9
(CH2), 33,9 (CH2), 34,1 (CH2), 61,5 (CH2), 61,7 (CH2), 62,5 (CH2), 62,6 (CH2),
66,1 (CH2), 66,2 (CH2), 69,1 (CH), 78,8 (CH), 85,5 (CH), 86,1 (CH), 111,3 (C
base), 136,8 (CH base), 150,5 (C=O base), 164,1 (C=O base), 173,0 (C=O
chaîne), 173,5 (C=O chaîne).
RMN 31P (121 MHz, CDC13) : 8 en ppm 2,1.
Masse ESI- : théorique m/z = 872,5 observé m/z = 871,3.
Exemple 3
5'-(4-Hexadécyloxyméthyl-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine
O
CINH
N~O
NN
N'N k-O
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine
telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 231 mg de 1-
propargyloxyoctadécane telle que décrit dans la préparation 5 (1 équivalent)
en
solution 0,1 M dans un mélange de THF et d'eau (1/1). On ajoute alors,
successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalents, 0,15 mmol)
et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu
réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors
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refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement
adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. 180 mg d'un solide
blanc sont obtenus après chromatographie sur colonne de silice (AcOEt/MeOH
8/2).
RF : 0,72 (AcOEt/MeOH 8/2)
Rendement : 42 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse
mesurée : 576,4120
Exemple 4
5'-(4-Hexadécyloxyméthyl-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'-didéoxyadénosine
O NH2
i
N N
NNN N N
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5',2'-
didéoxyadénosine telle que décrite dans la préparation 4 (0,72 mmol) et 223 mg
de 1-propargyloxyoctadécane telle que décrite dans la préparation 5
(1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange de THF et d'eau (1/1). On
ajoute alors, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium
(0,2 équivalents, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate. de cuivre (0,1 équivalent,
0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h,
puis
le mélange est refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est
immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. 150 mg
d'un solide blanc sont obtenus après chromatographie sur colonne
(AcOEt/MeOH 8/2).
RF : 0,65 (AcOEt/MeOH 8/2)
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Rendement : 35 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 8 0,89 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 6 1,26
(m, 30H, CH2), 8 1,55 (m, 2H, CH2), 6 2,54 (m, 1 H, CH2), 6 3,06 (m, 1 H,
CH2), 6
3,45 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 8 4,50 (m, 4H, CH2, CH), 6 4,89 (m, ???), 6 5,88
(s,
2H, NH2), 8 6,40 (t, j = 6 Hz, 1 H, CH), 6 7,42 (s, 1 H, CH), 6 7,81 (s, 1 H,
CH), 6 8,35 (s, 1 H, CH).
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 585,4241 , masse
mesurée : 585,4254
Exemple 5
5'-(4-(1 -hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'didéoxythymidine
O
\OHNH
N O
N-N
OH
Dans un ballon sont introduits 215 mg de 5'-azido-5'-
déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,8 mmol) et 101 mg du
mélange racémique de oct-1-yn-3-ol (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un
mélange THF eau (1/1). On ajoute alors, successivement : 31,5 mg de
d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 13 mg de sulfate de
cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et
chauffé à
60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le
milieu réactionnel est alors immédiatement adsorbé sur silice et le solvant
éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur
colonne (AcEt/MeOH 85/15). 255 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,48 (AcOEt/MeOH 85/15)
Rendement : 78 %
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WO 2009/098404 PCT/FR2008/001661
RMN 1H (300,13 MHz, DMSO d6) : 6 0,83 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 6
1,24 (m, 6H, CH2)0 6 1,68 (m, 2H, CH2), 6 1,81 (s, 3H, CH3)0 6 4,06 (m, 1H,
CH), 6 4,27 (m, 1 H, CH), 6 4,62 (m, 3H, CH2, CH), 6 5,2 (d, j = 6 Hz, 1 H,
OH), 5
5,5 (s, 1 H, OH), 6 6,17 (t, j = 6 Hz, 1 H, CH), 6 7,37 (s, 1 H, CH), 8 7,89
(s, 1 H,
5 CH).
RMN 13C (75,47 MHz, DMSO d6) : b 12,5 (CH3), 6 014,4 (CH3), 6
22,6 (CH2), 6 25,1, 6 31,7 (CH2), b 38,4 (CH2), 6 51,6 (CH2-N), 6 66,0 (CH-O),
6
71,3 (C), 6 84,4, 6 84,5, 6 110,3 (=C-N), 6 122,8, 6 136,4, 6 150,9, 6 152,4,
b
164,1.
10 SM Haute résolution [M+Na]+ : masse calculée : 416,1910, masse
mesurée : 416,1897
Exemple 6
5'-(4-(hexyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine
O
\NM N O
N_N O
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine
telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 82,65 mg de non-1-yne
(1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute,
successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol)
et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu
réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors
refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement
adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est
obtenu
CA 02706812 2010-05-26
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26
pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2). 130 mg d'un solide
blanc sont obtenus.
RF : 0,62 (AcOEt/MeOH 8/2)
Rendement : 46 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse
mesurée : 576,4120
Exemple 7
5'-(4-(heptyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine
O
N O
N%% , N
iço-J
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine
telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 93 mg de non-1-yne (1
équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute,
successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol)
et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu
réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors
refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement
adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est
obtenu
pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 85/15). 120 mg d'un solide
blanc sont obtenus.
RF : (AcOEt/MeOH 85/15)
Rendement : 41 %
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RMN 1H (300,13 MHz, CDC13) : 5 0,83 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 8 1,25
(m, 8H, CH2), 5 1,55 (m, 2H, CH2), 8 1,79 (s, 3H, CH3), 5 2,10 (t, j = 6 Hz,
2H,
CH2), 5 2,61 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), ô 4,06 (s, I H, CH),. 5 4,27 (s, I H,
CH),
4,59 (m, 2H, CH2), 5 5,5 (s, 1 H, OH), 5 6,16 (t, j = 6 Hz, 1 H, CH),, 5 7,29
5 (s, 1H, CH), 5 7,82 (s, 1H, CH), 8 11,31 (s, I H, NH).
RMN 13C (75,47 MHz, DMSO d6) : 8 12,6 (CH3), ô 14,4 (CH3),
5 22,5 (CH2), 6 25,4 (CH2), 5 28,9 (CH2), 5 29,0 (CH2), 5 29,4 (CH2),. 8 31,7
(CH2), 5 38,4 (CH2), 5 51,5 (CH2), 5 71,1 (CH), 5 84,4 (CH), 5 110 (C), 5
123,1
(CH), 5 136,5 (CH)6 5 147,4 (C), 8 150,9 (C=O), 5 164,1 (C=O).
Exemple 8
5'-(4-(2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolan-4-ylméthoxyméthyl)-[1,2,3]triazol-
1-yl)-5',2'didéoxythymidine
C13H27
0/~I C13H27
O
O
O NH
NO
N
%N, N
O
OH
Dans un ballon, on introduit 264 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine
telle que décrite dans la préparation 3 (1 mmol) et 500 mg de 4-Prop-2-
ynyloxyméthyl-2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolane (1 équivalent) en solution 0,1 M
dans un mélange THF eau (111). On ajoute, successivement : 39,5 mg de
d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,2 mmol) et 16 mg de sulfate de cuivre
(0,1 équivalent, 0,1 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C
pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu
réactionnel est alors immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé
par
évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne
(AcEt/MeOH 8/2). 550 mg d'un solide blanc sont obtenus.
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Rendement : 72
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 774,5745 , masse
mesurée : 774,5739
Exemple 9
5'-(4-(2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolan-4-ylbutoxyméthyl)-[1,2,3]triazol-1-
yl)-5',2'didéoxythymidine
C13H27
C13H27-J O
O
O
O NH
'4.0
N%% , N
JO
OH
Dans un ballon, on introduit 195 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine
telle que décrite dans la préparation 3 (0,73 mmol) et 400 mg de 4-(4-Prop-2-
ynyloxy-butyl)-2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolane (1 équivalent) en solution 0,1 M
dans
un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 30 mg de d'ascorbate
de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1
équivalent, 0,073 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C
pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu
réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et ' le solvant éliminé par
évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne
(AcOEt/MeOH 9/1). 180 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,43 (AcOEt/MeOH 9/1)
Rendement : 30
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Exemple 10
5'-(4-((O-cholestéryl)-méthyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-
5',2'didéoxythymidine
s
O
O %,-e NH
N )O
NNN.N
0
J
OH
Dans un ballon, on introduit 170 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine
telle que décrite dans la préparation 3 (0,63 mmol) et 270 mg de o-
propargylcholestérol telle que décrit dans la préparation 7 (1 équivalent) en
solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement :
mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,13 mmol) et 10 mg de
sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,063 mmol). Le milieu réactionnel est
agité et
chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est refroidi à température ambiante.
15 Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant
éliminé
par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne
(AcOEt/MeOH 8/2). 260 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,57 (AcOEt/MeOH 8/2)
Rendement : 59 %
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SM [M+H]+ : 692,3
Exemple 11
1,1 2-bis-[5'-(4-(méthyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'd idéoxythymidine]-
5 oxydodécane
OH O
NH
O N~O O I
N N O
O NON Np N
0
HN N'
I~ J
O OH
10 Dans un ballon, on introduit 100 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine
telle que décrite dans la préparation 3 (0,375 mmol) et 52 mg de 1,12-
dipropargyloxydodécane préparé à partir du composé décrit dans la préparation
6 (0,5 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute,
successivement : 15 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,075 mmol)
15 et 6 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,0375 mmol). Le milieu
réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors
refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement
adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est
obtenu
pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2). 90 mg d'un solide
20 blanc sont obtenus.
Rendement : 59
RMN 1H (300,13 MHz, MeOH d4) : 8 1,28 (m, 16H, CH2), 8 0,83
(m, 4H, CH2), 8 1,89 (s, 6H, CH3), 8 2,17 (s, 2H, CH2), ô 2,25 (m, 4H, CH2), 8
25 3,51 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), 8 4,18 (m, 2H, CH) 8 4,42 (m, 2H, OH) 8 4,58
(s, 4H,
CH2), 8 4,76 (qd, j = 6 Hz, 4H, CH2), 8 6,21 (t, j = 6 Hz, 2H, CH), 8 7,23 (s,
2H,
CH), 8 7,99 (s, 2H, CH).
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Exemple 12
5'-(4-(1(R)-hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine
O
OH NH
N --4O
N N
N
O
I~--J
(R) OH
Dans un ballon, on introduit 215 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine
telle que décrite dans la préparation 3 (0,8 mmol) et 101,5 mg de (R) oct-1-yn-
3-ol (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1).
On ajoute, successivement : 31,5 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent,
0,15 mmol) et 13 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le
milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est
alors
refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors immédiatement
adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est
obtenu
pur par chromatographie sur colonne (AcEt/MeOH 9/1). 240 mg d'un solide
blanc sont obtenus.
RF : 0,48 (AcEt/MeOH 9/1)
Rendement : 76 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse
mesurée : 576,4120
Exemple 13
5'-(4-(1 (S)-hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'didéoxythymidine
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0
OH NH
N -4O
NON N
(S) OH
Dans un ballon, on introduit 215 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine
telle que décrite dans la préparation 3 (0,8 mmol) et 101,5 mg de (S) oct-1-yn-
3-01 (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On
ajoute, successivement : 31,5 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent,
0,15 mmol) et 13 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le
milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est
alors
refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors immédiatement
adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est
obtenu
pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 85/15). 255 mg d'un solide
blanc sont obtenus.
RF : 0,48 (AcOEt/MeOH 85/15)
Rendement : 78 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse
mesurée : 576,4120
Exemple 14
5'-(4-(1 -hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'didéoxyadenosine
NH2
OH
N
1NNN
O
OH
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Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine
telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 95 mg du mélange
racémique d'oct-1-yn-3-ol (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange
THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium
(0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent,
0,075
mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le
mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est
immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le
composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2).
240 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF: 0,47 (AcOEt/MeOH 8/2)
Rendement : 80 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse
mesurée : 576,4120
Exemple 15 : préparation des nanoparticules
On utilise comme composé de formule (I) le composé thymidine
3'-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate) (di C16 dT) préparé à l'exemple 2
et
comme co-lipide la dioléylphosphatidylcholine (DOPC).
1) Préparation des solutions stocks
- a) Préparation de la solution de cis-platine :
15 mg de cis-platine sont solubilisés dans 10 mL d'eau milliQ
(5 mM). Cette suspension est agitée pendant 1 min (vortex), puis incubée à
37 C pendant 24 h.
- b) Préparation des solutions de lipides :
Solution A : 20 mg du diCl6dT sont solubilisés dans 2 mL de
chloroforme (10 mg/mL). Cet échantillon est stocké à -20 C.
Solution B : DOPC : solution à 20 mg/mL dans le chloroforme,
stockée à -20 C.
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2) Préparation des formulations lipidiques
Dans un tube eppendorf de 2 mL, 52,3 pL de la solution A sont
mélangés à 23,6 pL de la solution B. Ces volumes correspondent à un rapport
de 1/1 en mole.
Le chloroforme est évaporé sous l'azote de manière à obtenir un
film lipidique homogène.
3) Préparation des nanoparticules
1,2 mL de la solution de cis-platine pré-incubée à 37 C sont
utilisés pour réhydrater le film lipidique préalablement préparé. Le mélange
est
incubé à 37 C pendant 30 min. Une série de 10 cycles de chauffage (bain
marie à 45 C) et de congélation (carboglace/méthanol -78 C) est réalisée.
4) Lavage et récupération des nanoparticules
Une fois la série de 10 cycles terminée, le tube est centrifugé à
2100 rpm à 4 C pendant 5 min. Après élimination du surnageant le culot est re-
suspendu dans 1 mL d'eau milliQ. Une deuxième centrifugation est réalisée
(2100 rpm à 4 C pendant 5 min), puis le surnageant est retiré et le culot est
séché.
La concentration (ICP/Optique) du culot re-suspendu dans 1 mL
d'eau milliQ est de 2,844 mM équivalent en cis-platine (852,2 mg/L). Cette
concentration correspond à 47,4 % du cis-platine initialement utilisé.
Exemple 16 : préparation des nanocapsules
On utilise comme composé de formule (I) le composé thymidine
3'-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate) (di C16 dT) préparé à l'exemple 2
et
comme co-lipide la dioléylphosphatidylcholine (DOPC).
1) Préparation des solutions stocks
- a) Préparation de la solution de cis-platine :
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15 mg de cis-platine sont solubilisés dans 10 mL d'eau milliQ
(5 mM). Cette suspension est agitée pendant 1 min (vortex), puis incubée à
37 C pendant 24 h, avec une agitation de temps en temps.
- b) Préparation des solutions de lipides :
5 Solution A : 20 mg du diCl6dT sont solubilisés dans 2 mL de
dichlorométhane (10 mg/mL). La solution est stocké à -20 C.
Solution B : DOPC : solution à 20 mg/mL dans le
dichlorométhane, stockée à -20 C.
10 2) Préparation des formulations lipidiques
Dans un tube eppendorf de 2 mL, 52,3 pL de la solution A sont
mélangés à 47,2pL de la solution B. Ces volumes correspondent à un rapport
de 1/1 en mole.
Le dichlorométhane est évaporé avec de l'azote comprimé de
15 manière à obtenir un film lipidique homogène.
3) Préparation des nanoparticules
1,2 mL de la solution de cis-platine (5mM) sont incubés une nuit à
température ambiante avec le film lipidique préalablement préparé, sans
20 agitation. Une série de 10 cycles de chauffage (bain marie à 45 C) et de
congélation (carboglace/éthanol -78 C) est réalisée.
4) Lavage et récupération des nanoparticules
Une fois la série de 10 cycles terminée, la suspension est agitée
25 et mise dans un tube à hémolyse en verre, puis soumise à une sonication
pendant 5 min. Après la sonication, la suspension est centrifugée à
1000 rpm/2,5 min/20 C pour retirer les grosses capsules qui se retrouvent dans
le culot qui sera éliminé. Le surnageant est à nouveau centrifugé à
10000 rpm/5min/20 C. Les nanoparticules se retrouvent dans le culot. Ce
30 dernier est remis en suspension dans 1 mL d'eau milliQ et une deuxième
centrifugation est réalisée. Le culot est suspendu dans 1 mL et dosé en
Inductively Coupled Plasma (ICP)-Optique .
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Exemple 17 : test de stabilité
Les nanoparticules préparées selon le protocole de l'exemple 16
sont dosées en ICP-optique (la valeur mesurée correspond à la concentration
totale). La suspension des nanoparticules est aliquotée dans 5 tubes
eppendorf (150 pL). Ces derniers sont incubés à 37 C sous agitation
(300 rpm) pendant différents temps (0, 2.5, 5, 10 et 24 heures).
A un temps donné (x), le tube est centrifugé à 14 000
rpm/lOmin/20 C et 50 pL de surnageant (récupéré doucement pour ne pas
remettre le culot en suspension) sont dosés.
Des nanoparticules à base del,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-[phospho-
L-sérinej (DOPS) avec de la 1,2-dioléoyl-sn-glyéro-3-phosphocholine (DOPC)
comme colipide sont préparées selon le même protocole à titre de
comparaison.
Le pourcentage de libération de cis-platine est calculé selon
l'équation suivante :
% de cis-platine libéré = Cx-C0/Ct-CO
Cx : concentration trouvée à un temps donné (x).
CO : concentration trouvée dans le surnageant avant incubation.
Ct : concentration totale trouvé sans incubation et sans centrifugation.
La courbe de libération du cis-platine en fonction du temps
d'incubation représentés sur la figure 1 . Les nanoparticules de l'exemple 16
sont représentées par le symbole -O- et les nanoparticules à base de
DOPC/DOPS par le symbole - - -
Les résultats montrent que le temps de demi-vie (temps
d'incubation nécessaire pour libérer 50% du cis-platine) est supérieur à 24 h
pour les nanoparticules selon l'invention, alors qu'il est de l'ordre de 6,5 h
pour
les nanoparticules à base de DOPC/DOPS.
Exemple 18 : mesure de la taille des nanoparticules
Les nanoparticules préparées selon le protocole de l'exemple 16
ont été analysées avec un zétasizer MALVERN.
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Les nanoparticules sont mises en suspension dans 2 mL d'eau
milliQ (volume nécessaire pour la mesure de la taille). La concentration est
d'environ 0,5 mM (la suspension doit être turbide pour diffuser la lumière).
Des
cuves (1 cm/1 cm) à usage unique sont utilisées pour la mesure.
Les résultats montrent que plus de 95 % des nanoparticules ont
une taille entre 100 et 250 nm avec une polydispersité de 0,228.
Exemple 19 : dosage du cis-platine intracellulaire
Protocole
Des cellules IGROVI (lignée d'adénocarcinome ovarien) à 80 %
de confluence (boîte de 10 cm de diamètre) sont traitées avec 100 pM de cis-
platine libre ou encapsulé dans les nanoparticules de l'exemple 16 pendant 2,
4 ou 6 h. Au terme de ce traitement deux lavages au PBS sont effectués. Les
cellules sont traitées avec de la trypsine et remises en suspension dans du
PBS. Deux lavages au PBS des suspensions cellulaires sont effectués
(centrifugation 1000 rpm/lmin). Les cellules sont mises en suspension dans 1
mL de PBS et comptées.
Dosage en ICP-optique
106 cellules sont lysées avec 500 pL de la solution de lyse
cellulaire (lysis buffer de chez SIGMA). Le volume est complété avec de l'eau
milliQ à 1% d'acide HNO3 pour atteindre 5 mL.
Résultats
Les résultats sont représentés sur la figure 2, qui montre la
concentration en cis-platine libéré après lyse cellulaire en fonction du
temps,
correspondant à la concentration en cis-platine internalisé dans les cellules
traitées .
Pour chaque temps, la colonne hachurée (à gauche) correspond
au cis-platine libre et la colonne en pointillés (à droite) aux nanoparticules
contenant du cis-platine.
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Les résultats montrent que l'internalisation de cis-platine est
nettement plus efficace en présence des nanoparticules. Par exemple, dans
des conditions identiques (106 cellules, 100 pM, 2 h) 0,5 nanomole de cis-
platine est internalisé dans le cas du cis-platine libre alors que
l'internalisation
est 4,5 fois plus importante dans le cas des nanoparticules (2,3 nanomoles).
Exemple 20 : Etude des effets cytotoxiques des nanoparticules
préparées selon l'invention
Les nanoparticules ont été préparées selon le procédé décrit dans
l'exemple 15. On a utilisé comme composé de formule (I) le composé C20dT de
formule
o
NH
N
HO
O
HO-P=O
()
n
dans laquelle n=18,
décrit dans Nathalie Campins et al., New J. Chem., 2007, 31,
1928-1934).
Protocole
Le test mis en oeuvre utilise la lignée de cellules cancéreuses
humaines HCT8 (adénocarcinome colorectal), connue pour sa résistance
intrinsèque aux dérivés du platine.
Le protocole est le suivant :
- A J-3, les cellules sont implantées en plaques 96 puits à la
densité de 50 000 cellules par puits.
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- A JO, les cellules sont traitées par la formulation test, soit pour
une courte durée d'exposition (30 min) dans du sérum physiologique, soit pour
une longue durée d'exposition (72 h) dans du milieu de culture. La gamme de
concentrations réalisée comporte les points 0 - 0,4 - 0,8 - 1,5 - 3 - 6,25 -
12,5 - 25 - 50 et 100 mg/L. Des contrôles négatifs (cellules non traitées) et
des
contrôles positifs (cispiatine) ont été réalisés simultanément.
-A J3, le milieu de culture est changé, et le traitement de 72 h
arrêté.
- A J6, le protocole est terminé, et les cellules restantes au fond
des puits sont colorées au cristal violet.
Expression des résultats
La survie des cellules a été déterminée, et le pourcentage de mort
globale (ou cytotoxicité) obtenue aux différentes concentrations de
formulation
test a été comparé à celui obtenu avec les contrôles négatifs (cellules non
traitées). Les résultats de cytotoxicité ont été présentés sous forme de
courbes
effet-dose caractérisées par leur concentration inhibitrice 50 (CI50), c'est-à-
dire
la concentration à laquelle on observe 50% de cellules mortes.
Résultats préliminaires (CI50) à 30 minutes
Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Composé (I) Colipide Rapport molaire du CI 50(mg/L)
mélange
Aucun - Non déterminée
(Cis-platine seul) 0150 > 100 mg/L
C20dT DOPC DOPC/ C20dT 33 mg/L
1 :1
Les résultats montrent que les nanoparticules selon l'invention,
contenant le composé de formule (I) C20dT présente, dans ce test, une
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cytotoxicité à 30 min exprimée par la C150 à une dose significativement
inférieure à celle du cis-platine utilisé seul.
Exemple 21 : Etude des effets cytotoxiques des nanoparticules
5 préparées selon l'invention
On a utilisé comme composé de formule (1) :
- le diCl6dT (Thymidine 3'-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-
phosphate) de l'exemple 2 et un colipide (DOPC), ou
- le 5'-(4-(1(R)-hydroxy-hexyl)-[1,2, 3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxy-
10 thymidine de l'exemple 12, mais sans ajouter de colipide.
Les nanoparticules ont été préparées selon le procédé décrit dans
l'exemple 15, mais avec un seul cycle de chauffage/refroidissement pour le
composé de l'exemple 12.
15 Protocole
1000 à 5000 cellules IGROV1 sont incubées dans 100 ML de
milieu avec sérum par puits (plaque 96 puits). Après 24 h le milieu est retiré
et
les cellules sont traitées pendant 1 à 3 jours avec les formulations selon
l'invention et/ou le cis-Pt libre (aux concentrations voulues). Les cellules
sont
20 incubées à 37 C dans 200 pL du milieu avec sérum. La viabilité cellulaire
est
révélée en colorimétrie par un test MTS à la fin du traitement.
Expression des résultats
La survie des cellules a été déterminée, et le pourcentage de mort
25 globale (ou cytotoxicité) obtenue aux différentes concentrations de
formulations
testées a été comparé à celui obtenu avec les contrôles négatifs (cellules non
traitées). Les résultats de cytotoxicité ont été présentés sous forme de
courbes
effet-dose caractérisées par leur concentration inhibitrice 50 (CI50), c'est-à-
dire
la concentration à laquelle on observe 50% de cellules mortes.
30 Les résultats sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous, dans
lequel la CI50 est exprimée soit en pM, soit en en mg/L de cis-platine (temps
d'incubation : 24h).
CA 02706812 2010-05-26
WO 2009/098404 PCT/FR2008/001661
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Tableau 2
Composé (I) Colipide CI 50 C150
Exprimée en mg/L Exprimée en pM
Aucun - 9,48 31,6
Cis-latine seul)
Exemple 2 DOPC 0,48 1,6
Exemple 12 - 0,95 3,16
Les résultats montrent que les nanoparticules selon l'invention,
contenant les composés de formule (1), préparées en présence ou en absence
de colipide, présentent dans ce test une cytotoxicité à 24 h exprimée par la
C15o
à une dose significativement inférieure à celle du cis-platine utilisé seul.
Exemple 22 : Etude des effets cytotoxiques des nanoparticules
préparées selon l'invention
Protocole
al Préparation et traitement des cellules :
Dans une plaque 96 puits, 2500 cellules (IGROVI, SKOV3,
lignées d'adénocarcinomes ovariens) par puits sont incubées dans 100 pL du
milieu avec sérum. Après 24 heures le milieu est aspiré et les cellules sont
traitées avec du cis-platine libre ou encapsulé dans les nanoparticules de
l'exemple 16 dans 100 pL du milieu sans sérum à différentes concentrations
(500, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 pM). Après 24 heures de traitement, le
milieu
est retiré et les cellules sont lavées 2 fois avec 100 pL de PBS puis incubées
avec 100 pL du milieu avec sérum.
b/ Révélation de la toxicité :
48h après les deux lavages, la viabilité cellulaire est révélée en
ajoutant 20 pL de MTS. L'absorbance à 490 nm est mesurée après 2 à 4
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WO 2009/098404 PCT/FR2008/001661
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heures d'incubation à 37 C. L'absorbance est proportionnelle à la viabilité
cellulaire.
et résultats
Les résultats sont représentés sur la figure 3, qui montre la
concentration nécessaire pour obtenir 50 % de mort cellulaire (IC50) avec du
cis-platine libre (colonne A) ou les nanoparticules contenant du cis-platine
(colonne B).
La figure 3A concerne la lignée cellulaire IGROVI et la figure 3B
concerne la lignée cellulaire SKOV3.
Les résultats montrent les nanoparticules de l'exemple 16
contenant du cis-platine sont plus efficaces que le cis-platine libre dans les
deux lignées cellulaires, IGROVI (sensible au cis-platine) et SKOV3
(résistante
au cis-platine).
Sur la lignée IGROVI, on obtient 50 % de mort cellulaire avec
0,27 pM de nanoparticules contenant du cis-platine alors qu'il faut utiliser
2,41 pM de cis-platine libre pour obtenir ce résultat. Sur la lignée SKOV3, on
obtient 50 % de mort cellulaire avec 0,54 pM de nanoparticules contenant du
cis-platine contre 4,3 pM de cis-platine libre.
Les nanoparticules contenant du cis-platine sont respectivement 9
et 8 fois plus* efficaces que le cis-platine libre sur les lignées IGROVI et
SKOV3.
