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Patent 2719152 Summary

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Claims and Abstract availability

Any discrepancies in the text and image of the Claims and Abstract are due to differing posting times. Text of the Claims and Abstract are posted:

  • At the time the application is open to public inspection;
  • At the time of issue of the patent (grant).
(12) Patent Application: (11) CA 2719152
(54) English Title: METHOD OF DETECTION AND/OR TITRATION IN VITRO OF AN UNCONVENTIONAL TRANSMISSIBLE AGENT
(54) French Title: METHODE DE DETECTION ET/OU DE TITRAGE IN VITRO D'UN AGENT TRANSMISSIBLE NON CONVENTIONNEL
Status: Dead
Bibliographic Data
(51) International Patent Classification (IPC):
  • G01N 33/68 (2006.01)
(72) Inventors :
  • FLAN, BENOIT (France)
  • YOU, BRUNO (France)
(73) Owners :
  • LFB-BIOTECHNOLOGIES (France)
  • INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (France)
(71) Applicants :
  • LFB-BIOTECHNOLOGIES (France)
  • INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (France)
(74) Agent: FETHERSTONHAUGH & CO.
(74) Associate agent:
(45) Issued:
(86) PCT Filing Date: 2009-03-25
(87) Open to Public Inspection: 2009-10-15
Examination requested: 2011-08-09
Availability of licence: N/A
(25) Language of filing: French

Patent Cooperation Treaty (PCT): Yes
(86) PCT Filing Number: PCT/FR2009/050520
(87) International Publication Number: WO2009/125139
(85) National Entry: 2010-09-21

(30) Application Priority Data:
Application No. Country/Territory Date
0851998 France 2008-03-27

Abstracts

English Abstract

The invention relates to an in vitro method for detection and/or titration in vitro of an unconventional transmissible agent (UTA) or of a pathological conformational protein, a marker of infectivity linked to the UTA, in a sample, comprising: the replication or propagation, in cells in culture, of the UTA present in the sample, and then the repeated incubation with a substrate allowing the amplification of the UTA or of the pathological conformational protein, a non-pathological conformer of the UTA, before the determination of the presence and/or of the quantity of the UTA or of the pathological conformational protein in the sample.


French Abstract



L'invention concerne une méthode in vitro de détection et/ou titrage in vitro
d'un agent transmissible non
conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique, marqueur
de l'infectiosité liée à l'ATNC, dans un
échantillon, comprenant : la réplication ou la propagation dans des cellules
en culture de l'ATNC présent dans l'échantillon, puis
l'incubation répétée avec un substrat permettant l'amplification de l'ATNC ou
de la protéine de conformation pathologique,
conformère non-pathologique de l'ATNC, avant la détermination de la présence
et/ou de la quantité de l'ATNC ou de la protéine
de conformation pathologique dans l'échantillon.

Claims

Note: Claims are shown in the official language in which they were submitted.



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Revendications


1. Méthode in vitro de détection et/ou titrage d'un agent transmissible non
conventionnel
(ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique marqueur de
l'infectiosité de
l'ATNC, dans un échantillon, comportant les étapes consistant à:
i) mettre ledit échantillon en contact avec des cellules supportant la
réplication ou la
propagation de l'ATNC,
ii) cultiver lesdites cellules pour répliquer ou propager l'ATNC présent dans
ledit
échantillon,
iii) mettre en contact et incuber l'ATNC avec une source de substrat pour la
protéine de conformation pathologique et/ou l'ATNC, par ce en quoi la quantité
de protéine
de conformation pathologique et/ou d'ATNC est amplifiée,

iv) désagréger les agrégats éventuellement formés,
v) déterminer la présence et/ou la quantité de protéine de conformation
pathologique
et/ou d'ATNC dans l'échantillon,
les étapes (iii) et (iv) constituant un cycle d'opérations qui est répété au
moins deux fois
avant l'étape (v).


2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la protéine de conformation

pathologique, marqueur de l'ATNC, est la protéine prion PrP sc


3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle les cellules de l'étape (i)
sont des
cellules dans lesquelles le gène codant pour le conformère non-pathologique de
la protéine
prion PrP a été intégré.


4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans
laquelle la
détermination de la présence et/ou de la quantité de la protéine de
conformation
pathologique à l'étape (v) est réalisée par immunochimie ou immunocytochimie.


5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle les
cellules sont
des cellules épithéliales de lapin, en particulier des cellules de la lignée
Rov9.


25

6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle les
cellules sont
des cellules gliales murines, en particulier des cellules de la lignée MovS2
ou MovS6.


7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans
laquelle ledit
cycle des étapes (iii) et (iv) est répété de 5 à 60 fois avant l'étape (v).


8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans
laquelle en ce que
l'échantillon est choisi dans le groupe constitué par les produits sanguins et
leurs dérivés,
les aliments, et les produits cosmétiques.


9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans
laquelle le substrat
pour la forme pathologique de la protéine et/ou pour l'ATNC est apporté sous
la forme
d'un homogénat de cerveau sain.


10. Méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention
ou de
traitement d'un produit biologique ou d'un matériel susceptible d'être
contaminé par un
ATNC, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel,
(A) en
amont et (B) en aval dudit procédé, une méthode de titrage selon l'une
quelconque des
revendications 1 à 9, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de
titre obtenues.

11. Méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de
décontamination
d'un produit biologique ou d'un matériel, méthode dans laquelle on applique
audit produit
biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval de ladite procédure, une
méthode de
titrage selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et en ce que l'on
compare les deux
valeurs (A) et (B) de titre obtenues.


12. Méthode in vitro d'évaluation de la capacité d'un composé à moduler
l'infectiosité d'un
produit biologique infectieux, méthode dans laquelle on applique audit produit
biologique
infectieux, (A) en présence et (B) en absence dudit composé à évaluer, une
méthode de
titrage selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et en ce que l'on
compare les deux
valeurs (A) et (B) de titre obtenues.




26



13. Méthode in vitro de diagnostic d'une encéphalopathie spongiforme
transmissible chez
un sujet humain ou animal non-humain, comprenant la détection de la présence
dans un
échantillon biologique dudit sujet, d'un agent transmissible non conventionnel
(ATNC) ou
d'une protéine de conformation pathologique, marqueur de l'infectiosité de
1'ATNC, par la
méthode telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 9.

Description

Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.



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Méthode de détection et/ou de titrage in vitro d'un agent transmissible non
conventionnel
La présente invention concerne une méthode de détermination in vitro de
l'infectiosité liée
aux agents transmissibles non conventionnels (ATNC), son application,
notamment à une
méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro de l'efficacité d'un procédé
d'obtention ou de
traitement d'un produit biologique ou à une méthode d'évaluation et/ou de
contrôle in vitro
d'une procédure de décontamination ou à une méthode d'évaluation in vitro de
la capacité
d'un composé à moduler l'infectiosité liée aux ATNC.

Etat de la technique :

Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) regroupent un ensemble
de
maladies génétiques ou acquises caractérisées par une dégénérescence du
système nerveux
central (SNC). La forme la plus fréquente chez l'homme est la maladie de
Creutzfeldt-
Jakob (MCJ), mais il existe également des EST chez de nombreux mammifères
(notamment la tremblante du mouton et l'encéphalopathie spongiforme bovine).
L'agent
étiologique de ces maladies est classé dans la catégorie des "agents
transmissibles non
conventionnels" (ATNC). La signature de la maladie est la présence d'une
protéine
extracellulaire, appelée protéine prion (PrP), qui est transformée au cours de
la maladie en
une forme insoluble, résistante aux protéases telles que la protéinase K, et
qui s'accumule
dans le système nerveux central. Cette forme anormale pathologique de la PrP,
appelée
PrPsc, est co-purifiée avec l'infectiosité et son accumulation précède
l'apparition des
lésions histologiques. Elle résulte d'une modification de la conformation de
la protéine
prion PrP. Il n'a pas été mis en évidence de modification de l'expression du
gène codant
pour la PrP, ni d'altération de sa traduction (Prusiner, Biochemistry 1992 ;
31 :12277-88 ).
Les données actuellement disponibles ne permettent pas de démontrer que
l'agent
transmissible responsable des EST se trouve sous une forme infectante dans les
dérivés
sanguins (Brown et al., 2001, Semin Hematol.;38(4 Suppl 9):2-6).

Toutefois, on ne peut conclure à son absence, cette incertitude résultant,
d'une part, de la
probable concentration très faible dans le sang et, d'autre part, de la très
longue période


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d'incubation cliniquement silencieuse caractéristique de ces maladies, qui
précède
l'apparition des signes cliniques.

En outre, l'exceptionnelle résistance des ATNC empêche le recours à des
procédés
d'inactivation classiquement mis en oeuvre, tels que le traitement
solvant/détergent Tween-
TNBP, qui ont fait la preuve de leur efficacité pour réduire la charge virale
des dérivés
sanguins, tels que les protéines cryoprécipitables du plasma (facteur VIII,
facteur von
Willebrand, etc.). Etant donné que l'obtention ou le traitement de produits
biologiques, tels
que les protéines plasmatiques de la coagulation, doit incorporer des étapes
d'élimination/inactivation virales en vue d'un usage thérapeutique,
l'industrie
pharmaceutique des médicaments dérivés du sang cherche aujourd'hui à évaluer
le risque
théorique de transmission du variant de la MCJ par les produits dérivés du
sang.
Actuellement, la méthode de titrage de l'infectiosité liée aux ATNC
classiquement mise en
oeuvre utilise une méthode de titrage in vivo (par exemple le hamster doré
pour titrer
l'infectiosité liée à la souche 263k), par injection intracérébrale de
différentes dilutions d'un
produit à tester chargé en ATNC. Selon le nombre d'animaux atteints dans les
différents
groupes correspondant aux dilutions effectuées, on peut calculer un titre
infectieux et
établir le facteur de réduction d'un procédé donné à partir d'une référence
non traitée.
Cependant, cette méthode présente l'inconvénient d'être longue (environ un
an), coûteuse et
peu compatible avec un développement à l'échelle industrielle qui requiert un
résultat sur
l'efficacité de l'élimination du prion, le plus rapidement possible.

En outre, il est souvent nécessaire d'introduire une étape de concentration de
l'agent
infectieux de façon à augmenter la sensibilité des méthodes de titrage. Toutes
les
procédures de concentration d'agents infectieux responsables de l'EST passent
aujourd'hui
par une purification de la PrPsc.

D'autres méthodes ont été proposées pour le titrage in vitro des agents
infectieux des EST.
Les techniques de détection de la PrPsc par Western-Blot (Mac Gregor,
Transfusion J.
Medecine 2001 ; 11, 3-14) ou par ELISA nécessitent généralement une digestion
préalable


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de l'échantillon à analyser par la Protéinase K, ou une dénaturation par des
agents
chaotropiques pour distinguer la protéine pathologique (PrPsc) de la protéine
normale
(PrP).

Une autre méthode de titrage a récemment été développée basée sur
l'utilisation des
anticorps spécifiques de la PrPsc ne reconnaissant pas la PrP (Korth et al,
Nature 1997
Nov6, 390 (6655) : 74-7).

Le brevet US 6,150,583 décrit quant à lui la production d'animaux
transgéniques exprimant
une PrP marquée par un épitope hétérologue exposé ou non à la surface de la
protéine
prion, selon la conformation de cette dernière.

Le document WO 2005/022148 décrit une méthode de titrage in vitro, appelée
TCIA
("tissue culture infectivity assay"), d'un ATNC dans un produit biologique, au
moyen de la
mise en contact de cellules transgéniques stables supportant la réplication
dudit ATNC avec
le produit biologique, puis la culture de ces cellules pendant un ou plusieurs
passages pour
amplifier la quantité d'ATNC présente dans le produit biologique par
réplication de
1ATNC. Plus précisément, le TCIA consiste à mettre en contact des dilutions
successives
d'un homogénat infectieux (souche de tremblante 127-S) avec des cellules en
culture sur
plaque multi-puits, à raison de 5 puits par dilution. Le nombre de puits
positifs est alors
évalué par détection de la PrPsc (marqueur indissociable de l'infectiosité) au
bout de 8 à 10
passages, et le titre déterminé par la méthode de Spearman - Karber.

Le procédé appelé PMCA (Protein misfolding cyclic amplification), décrit
dans le
document Saborio et al. (Nature ; 2001, 411, 810-3) prévoit de son côté la
mise en contact
de formes pathologiques provenant d'un tissu ou d'un fluide issu d'un animal
contaminé
avec une forme non pathologique de la protéine d'ATNC, afin de convertir cette
dernière
en une forme pathologique.

Les procédés TCIA et PMCA présentent néanmoins des désavantages. Ainsi la
méthode de
titrage TCIA in vitro s'avère encore longue (10 semaines) pour un usage de
routine. En


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outre elle est à ce jour légèrement moins sensible que la méthode de bioessai
impliquant
l'infection d'un animal de laboratoire.
La méthode de la PMCA, bien qu'encore en développement, s'avère au moins aussi
sensible que le bioessai. Cependant elle ne fournit aucune preuve sur
l'infectiosité associée
à la PrPsc détectée et s'avère difficile à mettre en oeuvre avec des matrices
plasmatiques.
En outre il a été rapporté une reproductibilité incertaine ainsi que des
résultats faussement
positifs (TSE meeting, Cambridge Healthtech Institute's 12th annual, 2008 Feb
11-12). Il
existe donc encore un fort besoin de mettre au point une méthode de
détermination de
l'infectiosité applicable à l'échelle industrielle, c'est-à-dire notamment :
reproductible,
compatible avec diverses matrices (par exemple les dérivés du sang), sensible
(avec une
sensibilité équivalente au bio-essai), et relativement rapide.

Résumé de l'invention :

L'invention fournit maintenant une méthode in vitro améliorée pour la
détection et/ou le
titrage in vitro d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une
protéine de
conformation pathologique, marqueur de l'infectiosité liée à 1'ATNC, dans un
échantillon.
La méthode de l'invention comprend dans un système cellulaire en culture in
vitro, la
réplication ou la propagation, dans des cellules en culture ou à leur surface,
de 1'ATNC
présent dans l'échantillon, puis l'incubation répétée avec un substrat
permettant
l'amplification de 1'ATNC ou de la protéine de conformation pathologique,
avant la
détermination de la présence et/ou de la quantité de 1'ATNC ou de la protéine
de
conformation pathologique dans l'échantillon..

Les inventeurs ont en effet mis en évidence qu'il est possible, en associant
le produit
résultant de la mise en culture des cellules à une source de substrat pour la
protéine de
conformation pathologique (le substrat pouvant contenir par exemple la PrP)
et/ou 1'ATNC,
de convertir ce substrat en protéine de conformation pathologique (PrPsc) et /
ou en ATNC
détectable et quantifiable.


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Plus précisément, l'invention vise une méthode in vitro de détection et/ou
titrage d'un agent
transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation
pathologique
marqueur de l'infectiosité de lATNC, dans un échantillon, comportant les
étapes consistant
à:
5 i) mettre ledit échantillon en contact avec des cellules supportant la
réplication ou la
propagation de lATNC,
ii) cultiver lesdites cellules pour répliquer ou propager lATNC présent dans
ledit
échantillon,
iii) mettre en contact et incuber lATNC avec une source de substrat pour la
protéine de conformation pathologique et/ou lATNC, par ce en quoi la quantité
de protéine
de conformation pathologique et/ou d'ATNC est amplifiée,
iv) désagréger les agrégats éventuellement formés,
v) déterminer la présence et/ou la quantité de protéine de conformation
pathologique
et/ou d'ATNC dans l'échantillon,
les étapes (iii) et (iv) constituant un cycle d'opérations qui est répété au
moins deux fois
avant l'étape (v).

De préférence l'échantillon est choisi dans le groupe constitué par les
produits sanguins et
leurs dérivés, les aliments, et les produits cosmétiques

L'invention vise également une méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle
d'un
procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou d'un matériel
susceptible
d'être contaminé par un ATNC, méthode dans laquelle on applique audit produit
biologique
ou matériel, (A) en amont et (B) en aval dudit procédé, une méthode de titrage
telle que
définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de
titre obtenues.

Un autre objet de l'invention concerne une méthode in vitro d'évaluation et/ou
de contrôle
d'une procédure de décontamination d'un produit biologique ou d'un matériel,
méthode
dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont
et (B) en aval
de ladite procédure, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en
ce que l'on
compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.


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Encore un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de diagnostic
d'une
encéphalopathie spongiforme transmissible chez un sujet humain ou animal non-
humain,
comprenant la détection de la présence dans un échantillon biologique dudit
sujet, d'un
agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation
pathologique, marqueur de l'infectiosité de 1ATNC, par la méthode telle que
définie ci-
dessus.

Enfin un autre objet de l'invention est une méthode in vitro d'évaluation de
la capacité d'un
composé à moduler (c'est à dire inhiber ou augmenter) l'infectiosité ou la
réplication ou la
propagation d'un ATNC.

La méthode de détection de l'invention permet de détecter des quantités d'ATNC
au moins
équivalentes à celles détectées par les procédés connus de l'art antérieur,
dont la méthode
du bioessai, considérée comme la méthode de référence. Par ailleurs, elle
permet d'obtenir
des résultats plus rapidement que les méthodes connues de l'art antérieur.

Légende de la Figure :
La Figure est une autoradiographie d'un gel montrant la détection de la PrPS
par la
méthode de l'invention. Les pistes sont les suivantes
1 : marqueur de Poids Moléculaire
2 à 12 : Lysats de cellules inoculées par LN-3326 et récoltées respectivement
de passage 1
â 10
13 : Lysat de cellules inoculées par LN-3777 (homogénat de cerveau sain)
14 : Homogénat de cerveau infecté (LN-3326) dilué 106 fois

Description détaillée de l'invention

Définitions
Dans le cadre de l'invention, le terme "ATNC" représente tout agent
transmissible non
conventionnel, tels que ceux responsables chez l'être humain de la MCJ
familiale ou
sporadique, de la maladie du Kuru ou du variant MCJ, ou bien encore ceux
responsables


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chez les animaux d'EST naturelles, telles que la tremblante ovine,
l'encéphalopathie
spongiforme bovine ou féline, le dépérissement chronique des cervidés ou
l'encéphalopathie spongiforme du vison, ou enfin de souches d'EST
expérimentalement
adaptées à l'animal de laboratoire. On désigne ici par PrPsc la protéine prion
de
conformation pathologique (ou conformère pathologique). La forme dite
pathologique
de la PrP est la forme de la protéine dont la conformation est corrélée à
l'apparition d'une
EST chez l'animal humain ou non-humain infecté.
Dans le contexte de l'invention, lATNC est également désigné par le terme
agent
infectieux . L'ATNC titré par la méthode selon l'invention est de préférence
d'origine
ovine, bovine, murine, cricétidienne, cervidée, primate ou humaine. De manière
préférentielle, lATNC peut être la protéine de conformation pathologique elle-
même.

Par échantillon , on désigne toute source de matière susceptible d'être
contaminée par un
ATNC. Une telle source de matière peut par exemple être un liquide, un produit
alimentaire, une boisson, un produit cosmétique ou un produit issu du génie
génétique, une
molécule susceptible d'inhiber l'infectiosité d'un ATNC, cette liste n'étant
pas limitative.
De préférence il s'agit d'un échantillon biologique, par exemple un liquide
biologique ou
un tissu ou extrait de tissu. Dans le cas d'un tissu, la méthode de
l'invention peut être
réalisée sur des homogénats ou directement sur des échantillons ex vivo. Un
tel tissu peut
être un tissu du cerveau, de colonne vertébrale, ou tissu tonscillaire, cette
liste n'étant pas
limitative. L'échantillon peut également être une composition dérivée d'une
source
humaine ou animale, comme les hormones de croissance ou les extraits
cellulaires, comme
les extraits pituitaires. Une telle composition peut en effet être contaminée
par un ATNC.
Dans le cas d'un liquide biologique, celui-ci peut être le sang, la lymphe,
l'urine ou le lait,
cette liste n'étant pas limitative. De manière préférentielle, l'échantillon
est un produit

sanguin ou un dérivé, par exemple un dérivé plasmatique ou un concentré de
protéine
plasmatique.

Par cellules supportant la réplication ou la propagation de lATNC , telles
qu'utilisées à
l'étape (i), on désigne toute cellule capable d'être infectée par un ATNC, de
répliquer ou
propager cet ATNC et de produire de la PrPsc et/ou de l'infectiosité. Il
s'agit de préférence


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de cellules dans lesquelles le gène codant pour le conformère non-pathologique
de la
protéine prion PrP a été intégré et / ou sur-exprimé. De préférence encore,
ces cellules sont
des cellules transgéniques stables, qui sont capables d'exprimer la PrP.

Un "passage" est généralement le repiquage d'une partie des cellules d'une
boîte de culture
dans une autre boîte contenant du milieu de culture neuf Chaque passage permet
donc de
diluer les cellules qui n'ont plus la place pour se diviser dans une autre
boîte et le temps de
culture dans une boîte permet à l'ATNC de se répliquer.

Par source de substrat pour l'ATNC , on désigne toute matrice non
infectieuse
susceptible de supporter la réplication des ATNC par des cycles
d'amplification in vitro.
Par source de substrat pour la protéine de conformation pathologique , on
désigne toute
source de protéine de conformation non-pathologique, ne pouvant pas modifier
la
conformation d'une autre protéine pour la rendre insoluble. De manière
préférentielle, la
source de substrat pour l'ATNC et/ou pour la forme normale non pathologique de
la
protéine peut appartenir à la même espèce, ou à une espèce différente du
produit biologique
testé. Cette source peut être, par exemple, issue d'une forme normale non
pathologique de
la protéine du même produit que celui contenu dans l'échantillon à tester. De
manière
alternative, la source de forme normale non pathologique peut être produite de
manière
recombinante ou synthétique, en mettant en oeuvre des moyens connus de l'homme
du
métier.

Cellules de l'étape (i) :

Les cellules utilisées à l'étape (i) de la méthode de l'invention présentent
avantageusement
les critères suivants :

- l'adéquation entre la vitesse de réplication ou multiplication des cellules
et la durée
d'incubation nécessaire à la mise en évidence d'une réplication de l'ATNC dans
les cellules
infectées;


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- la stabilité des cellules après leur mise en contact avec l'agent infectieux
qui peut
être mise en évidence par l'absence de cytotoxicité liée à l'accumulation de
dATNC dans
les cellules;

- leur bonne sensibilité à l'infection, évaluée par exemple par la
multiplicité
d'infection faible permettant d'obtenir une accumulation de dATNC dans les
cellules
exposées à l'agent infectieux.

Etant donné que les cellules nerveuses (neurones, cellules gliales) ne sont
pas
nécessairement les meilleurs substrats à des fins de titrage in vitro, du fait
de leur mauvaise
adaptation en culture, on préfère établir des lignées cellulaires
transgéniques par
combinaison d'un type de cellules spécifiques et d'un transgène particulier,
par des
techniques connues, nécessaire pour fournir un environnement idéal à la
réplication de
l'ATNC.

Dans un mode de réalisation préféré, les cellules de l'étape (i) sont des
cellules épithéliales
de lapin, en particulier des cellules de la lignée Rov9 (Vilette et al. PNAS,
Mars 2001 ; 98,
4055-9).

Vilette et al. ont montré que des cellules épithéliales de lapin,
transgéniques et stables,
exprimant la PrP ovine (transgène), sont capables de répliquer une souche de
tremblante et
de produire la PrPsc ovine après infection par un homogénat de cerveau
infectieux
contenant de la PrPsc ovine. Le modèle cellulaire construit, la lignée Rov9,
exprime de
façon inductible la PrP exogène, ce qui garantit son maintien lors de la
période d'incubation
nécessaire à l'accumulation de la PrPsc dans ces cellules mises en contact
avec un matériel
infectieux.

Dans un autre mode de réalisation, les cellules de l'étape (i) sont des
cellules gliales
murines, en particulier des cellules de la lignée MovS2ou MovS6 (Archer et al.
Journal of
Virology, 2004 ; 78 p. 482-90). Ces lignées consistent en des cellules gliales
murines
exprimant la PrP ovine et supportant la réplication d'ATNC d'origine ovine.


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Mise en contact avec l'échantillon à tester :

Les cellules supportant la réplication ou la propagation de l'ATNC sont mises
en contact,
avec l'échantillon à tester, susceptible d'être infecté par cet ATNC, ou avec
un matériel
infectieux contenant 1'ATNC en tant que matériel de référence, par exemple des
extraits de
5 cerveaux d'animaux infectés par un ATNC, tels qu'un prion d'ovin. La mise en
contact est
réalisée selon des méthodes connues de l'homme du métier (voir par exemple
Archer et al.
Journal of Virology, Jan. 2 004, p. 4 82 3 0 49 0),

Ces cellules sont ensuite cultivées pendant un ou plusieurs passages pour
permettre à
1'ATNC de se répliquer ou de se propager.

10 De manière avantageuse, les cellules transgéniques peuvent être mises en
contact avec au
moins une dilution de l'échantillon susceptible d'être infecté par 1'ATNC dans
une solution
aqueuse biologiquement acceptable, en particulier avec plusieurs dilutions,
tout
particulièrement avec des dilutions sériées ou successives. Ces dilutions
permettent
d'affiner la quantification de l'infectiosité dans l'échantillon testé.

Plusieurs réplicats de cellules peuvent être mis en contact avec la même
dilution du produit
biologique, afin d'offrir une résolution statistique plus fine aux résultats.

Culture des cellules (étape ii) :

L'étape de culture des cellules potentiellement infectées par le produit
biologique, selon
toute technique connue de l'homme du métier, est requise pour la réplication
ou la
propagation de 1'ATNC, donc pour amplifier une quantité d'ATNC insuffisante,
initialement, pour être détectée.

Dans un exemple de réalisation, l'étape ii) de culture des cellules
transgéniques stables
effectuée pour amplifier la quantité d'ATNC présente dans ledit échantillon
biologique par
réplication de 1'ATNC, est réalisée en milieu DMEM + Ham-F12 (4 :1)
complémenté en
glutamine et sérum de veau foetal (5% final). Les cellules sont incubées à 37
C sous 5% de
C02. Un passage des cellules (split ratio de : 1 pour 10) est réalisé chaque
semaine.


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Le produit résultant de la mise en culture des cellules contient la protéine
marqueur
(notamment PrP) sous sa forme pathologique, dont la quantité est supérieure à
la quantité
initialement présente dans l'échantillon biologique, si celui-ci en contient.
La protéine
marqueur (notamment PrP) sous sa forme pathologique et l'ATNC s'accumulent au
sein de
la culture cellulaire (au niveau des cellules infectées et dans le milieu de
culture).

Mise en contact avec une source de substrat pour la protéine de conformation
pathologique et/ou l'ATNC (étape iii) :

L'étape ii) de la méthode de l'invention est suivie de la mise en contact et
de l'incubation
du produit résultant de la mise en culture des cellules avec une source de
substrat pour le
conformère pathologique et/ou pour 1"ATNC.

Cette source de substrat peut être apportée par exemple sous la forme d'un
produit
d'origine animale, par exemple un homogénat de cerveau sain, ou encore de
matériel issu
de culture in vitro. Ce matériel peut être par exemple issu de cellules,
telles que MovS, Rov
N2A (Weissmann et al. (2003), PNAS vol.100 n 20 p1666-11671), ou encore des
levures,
des mycètes, ou des bactéries, cette liste n'étant pas limitative. Ce matériel
issu de culture
in vitro peut être exprimé dans divers compartiments cellulaires, comme le
compartiment
extracellulaire (par exemple le surnageant, les exosomes, cette liste n'étant
pas limitative)
et/ou des compartiments membranaires et/ou cytosoliques (lysat de cellules par
exemple).
Cette étape a pour fonction de permettre l'amplification in vitro de la
protéine de
conformation pathologique (notamment PrPsc) et/ou de l'ATNC récolté au cours
de l'étape
ii) par la conversion de la forme non-pathologique de la protéine marqueur
(notamment
PrP) (contenue dans le substrat) en forme pathologique, une autoconversion de
la forme

non-pathologique étant théoriquement impossible. La protéine sous sa forme
pathologique
initierait la transformation de la forme non-pathologique en forme
pathologique.

En fin de réaction de conversion, la forme non-pathologique non convertie
n'est pas
détectée par le système de détection, comme il sera expliqué plus loin.


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L'incubation du produit de la culture cellulaire de l'étape (ii) avec une
source de substrat
pour la protéine de conformation pathologique et/ou 1ATNC est réalisée pendant
une durée
suffisante pour permettre à au moins une partie des protéines possédant une
forme non
pathologique, d'être transformée en une forme pathologique de la protéine, ou
à 1ATNC de
s'amplifier. De préférence, chaque étape d'incubation est effectuée pendant
une durée
comprise entre 10 secondes et 4 heures, préférentiellement entre 20 minutes et
1 heure, et
de manière particulièrement préférée pendant 30 minutes.

Le milieu d'amplification peut être avantageusement constitué d'un tampon
typiquement
composé de : (PBS lx), NaC1 15OmM et Triton 1%. et au minimum d'un substrat
contenant
la protéine marqueur (notamment PrP) dans une conformation non pathologique
(par
exemple d'un volume 10 fois supérieur au volume de l'échantillon à amplifier).

Séparation des agrégats :

Il s'avère que les protéines converties en formes pathologiques (type PrPs )
peuvent
s'agréger entre elles et aux autres particules de forme pathologique (PrPs ),
empêchant la
conversion d'autres protéines de forme non pathologique en forme pathologique.
Ceci est
un inconvénient car la méthode pourrait ainsi être ralentie par le faible
nombre de foyers
de conversion présents dans le milieu réactionnel.

Ainsi, l'étape iv) de la méthode de l'invention consiste en la désagrégation
des agrégats
éventuellement formés, de manière à libérer les particules de protéines
marqueurs de
conformation pathologique et/ou d'ATNC pour que celles-ci puissent convertir
d'autres
protéines non pathologiques.

De nombreuses méthodes peuvent être utilisées pour désagréger les agrégats
durant l'étape
iv) de la méthode de l'invention. On peut citer à titre d'exemple le
traitement avec un
solvant (comme le dodecyl sulfate de sodium, le dimethylsulfoxide,
l'acétonitrile, la
guanidine, l'urée, le trifluoroéthanol, l'acide trifuroacétique dilué, l'acide
formique dilué,
cette liste n'étant pas limitative), la modification des caractéristiques
physico-chimiques de
la solution, telles que le pH, la température, la force ionique, la constante
diélectrique, ainsi


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que les méthodes physiques, comme la sonication, l'irradiation au laser, la
congélation/décongélation, l'incubation en autoclave, la haute pression,
l'homogénéisation
douce, ou encore d'autres sources d'irradiation, cette liste n'étant pas
limitative.
Préférentiellement, on utilise la sonication. La sonication est une méthode
connue de
l'homme du métier, et souvent mise en oeuvre dans les méthodes de purification
de la PrP`
en permettant d'augmenter la solubilité des agrégats.

Il est possible que tous les agrégats ne soient pas désagrégés lors de la mise
en oeuvre d'une
seule étape de désagrégation. Dans ce cas, la concentration de protéines
pathologiques
augmente au fur et à mesure des étapes de désagrégation.

La durée de l'étape de désagrégation est aisément déterminable par l'homme du
métier, et
elle peut dépendre de la méthode de désagrégation choisie. De manière
préférentielle, la
durée de l'étape de désagrégation est comprise entre 1 seconde et 60 minutes,
plus
préférentiellement entre 5 secondes et 30 minutes, et plus particulièrement
entre 5 secondes
et 30 secondes.

Avantageusement, la succession des étapes iii) et iv), appelée cycle, est
répétée au moins 2
fois, préférentiellement entre 5 et 100 fois, de préférence entre 20 et 60
fois.

Ce cycle répété entre 2 et 100 fois constitue une série de cycles
d'amplification. Une série
de cycles peut également être répétée plusieurs fois. Dans ce cas, la nouvelle
série sera
initiée à partir d'un volume de la série précédente à la place de
l'échantillon d'ATNC
initial.

Détection des protéines :

L'étape (v) de détection des protéines pathologiques peut être effectuée par
toute méthode
connue de l'homme du métier.

La détection spécifique de la PrPsc peut être réalisée par une première étape
de séparation
des deux isoformes PrPc et PrPsc. Cette séparation est effectuée sur la base
de propriétés
biochimiques de la PrPsc qui permettent de la distinguer des protéines non
pathologiques,


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en particulier le fait que la PrPsc est rapportée davantage résistante aux
traitements à base
de protéases et moins soluble même en présence de détergents. Ainsi, la
première étape
après l'amplification est de préférence la séparation de la PrPc (forme
normale soluble non
pathologique de la PrP) de l'échantillon, qui peut être effectuée par exemple
au moyen de
traitement par protéase, par exemple la protéinase K, ou par centrifugation
pour séparer les
formes solubles (PrPc) des formes insolubles (PrPsc).

Dans un mode de réalisation particulier, la digestion par la protéinase K est
une étape
préalable au Western Blot, digère principalement la PrPc et pas le PrPsc.
C'est en effet une
propriété de la PrPsc que d'être relativement résistante à la PK
comparativement à la PrPc.
L'étape de détection ultérieure ne détecte donc plus la forme non pathologique
de la
protéine car celle-ci a été digérée par la protéase.

L'étape de détection peut être effectuée à l'aide des méthodes suivantes
immunoc ochimie (par exemple par marquage des cellules et analyse au Facscan)
ou
immunochimie (comme le Western-blot ou un test ELISA), ou test de
radioactivité, test de
fluorescence, microscopie électronique, test de turbidimétrie pour détecter
les agrégats,
ainsi que des tests structurels incluant la RMN (résonance magnétique
nucléaire), le
dichroïsme circulaire, la spectroscopie de Raman, l'absorption UV, un
anticorps
monoclonal reconnaissant la forme pathologique de la protéine, cette liste
n'étant pas
limitative.

Il est également possible de détecter la forme pathologique des protéines au
moyen d'un
anticorps reconnaissant spécifiquement la forme pathologique et pas la forme
non
pathologique. Pour rendre sa détection plus aisée, cet anticorps peut être lui-
même marqué..
Un tel anticorps peut être par exemple l'anticorps 15B3 (Korth et al., 1997,
Nature 1997
Nov6, 390 (6655) : 74-7).

Titrage des A TNC:


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La détection des formes pathologiques des protéines marqueurs ou de l'ATNC
peut être
associée à une détermination de la quantité de de ces protéines ou de l'ATNC
présent dans
l'échantillon.

Le titrage peut être effectué au moyen de toute méthode de titrage connue de
l'homme du
5 métier. En particulier il peut être effectué sur le modèle des méthodes
décrites dans les
documents W02005022148 et W02006117483 (notamment les exemples de référence A
et
B).

L'ensemble des résultats de Western-blot pour les différentes dilutions et les
différents
réplicats peut être analysé par une méthode statistique connue de l'homme du
métier
10 permettant d'établir un titre infectieux, comme par exemple la méthode de
Spearman
Karber (Schmidt N.J., Emmous R.W., Diagnostic Procedures for viral, ricketsial
and
chlaveydial Infection, 1989, 6ème Edition).

Dans un mode de réalisation de l'invention, la méthode de calcul du titre est
la méthode de
Spearman - Karber. Cette méthode suppose la dilution de l'échantillon à tester
selon une
15 progression géométrique, c'est-à-dire de raison constante entre les
dilutions successives, et
un ensemencement d'un volume constant (en général 0,150 ml) de chaque dilution
dans
cinq puits au moins. Le facteur de dilution le plus couramment utilisé est le
facteur décimal.
Pour que la formule de Spearman-Karber soit applicable, il est nécessaire
d'utiliser un
nombre constant de puits ensemencés à l'aide de chaque dilution, un facteur de
dilution
constant et une gamme de dilutions suffisamment large pour encadrer à la fois
les dilutions
de part et d'autres desquelles cent pour cent des puits donneront une réaction
positive, et les
dilutions de part et d'autre desquelles cent pour cent des puits donneront une
réaction
négative.

Si une ou plusieurs de ces conditions ne sont pas satisfaites, on suppose
parfois que pour un
facteur de dilution constant, la dilution supérieure ou inférieure venant
après la dernière
effectuée aurait donné le résultat souhaité. Une telle "fabrication" de
données ne repose sur
aucun fondement théorique, mais si elle est appliquée avec suffisamment de
prudence, elle


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n'est pas dangereuse. Cependant, il est préférable de répéter le titrage avec
une gamme plus
appropriée de dilutions, ce qui est indispensable s'il y a de graves lacunes
dans les données.
Selon la formule de Spearman-Karber:

Logio dose médiane = (Xo) - (d/2) + dS (r;/n;)
où:

Xo= logio de la valeur réciproque de la dilution la plus basse à laquelle tous
les inoculums
d'épreuve sont positifs.

d= log 10 du facteur de dilution, dit aussi pas de dilution (c'est-à-dire
la différence entre
les intervalles des logarithmes de dilution).

n;= nombre d'inoculums d'épreuve utilisés à chaque dilution.
R;= nombre d'inoculums positifs d'épreuve (sur ni).

S (r;/n;) =S (P) = somme de la proportion d'épreuves positives commençant à la
dilution la
plus basse et donnant cent pour cent de résultats positifs.

La sommation commence à la dilution Xo.

L'écart-type estimatif est calculé à l'aide de la formule suivante:
Log écart-type = d*I(E(p*(1-p)/(ni-1)))

Avec p = r;/n; = proportion d'épreuves positives (c'est-à-dire de cupules
d'inoculum
présentant une réaction) à chaque dilution.

La méthode de l'invention permet de quantifier l'infectiosité liée aux ATNC
sur une gamme
d'environ 4 log, c'est-à-dire de 10000 unités infectieuses in vitro. Ceci
peut, par exemple,
permettre de satisfaire aux critères de validation de l'efficacité des
procédés d'obtention de
produits biologiques vis-à-vis de l'élimination des ATNC.


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Applications de la méthode de détermination de l'infectiosité liée aux ATNC :
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon
l'invention à
une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'un procédé d'obtention
ou de
traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC.
Cette
méthode d'évaluation et/ou de contrôle est caractérisée en ce qu'on applique
au produit
biologique, en amont et en aval dudit procédé, une méthode de titrage selon
l'invention,
telle que décrite précédemment, et en ce que l'on compare les deux valeurs de
titre
obtenues. Par comparaison entre les deux mesures, on détermine le degré
d'élimination ou
le facteur de réduction de dATNC.

En particulier, la méthode de titrage selon l'invention a la capacité d'être
aisément
applicable à tout type de procédé d'obtention ou de purification de produits
biologiques, en
particulier de produits sanguins, tels que les dérivés de plasma sanguins,
utilisant par
exemple les chromatographies ou la nanofiltration, en particulier les
chromatographies
décrites dans les documents EP 0 3 59 593 et WO 02/092632 ou la nanofiltration
décrite
dans le document WO/2005/022148.

Ainsi, la mise en oeuvre de la méthode de l'invention permet d'évaluer et/ou
de contrôler
l'efficacité d'un procédé (ou d'une partie d'un procédé) d'obtention ou de
traitement, voire
de purification, de tout produit biologique, susceptible d'être contaminé par
un ATNC, dans
l'élimination de cet ATNC, grâce à un titrage utilisant des lignées
cellulaires transgéniques
spécifiques, favorisant la réplication de dATNC, mises en contact avec un
matériel
infectieux ou potentiellement infectieux contenant dATNC à tester. On mesure
les quantités
d'ATNC en amont et en aval du procédé (ou de la partie du procédé) dont on
veut apprécier
l'efficacité à l'égard de dATNC. Par comparaison des deux mesures, on
détermine le degré
d'élimination de l'agent pathogène. Ainsi, la mise en oeuvre de la présente
méthode peut être
effectuée au cours d'un procédé d'obtention d'un produit biologique ou dans le
cadre d'un
traitement d'élimination de dATNC suivant l'obtention du produit biologique.

L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon
l'invention à
une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'une procédure de
décontamination


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d'un matériel. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit
biologique
contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met
ensuite en
contact ce produit biologique infecté avec le matériel à décontaminer puis on
applique la
procédure de décontamination à ce matériel. Enfin, on détermine à nouveau le
titre du
produit biologique ayant subi la procédure de décontamination. Les deux
mesures de titre
effectuées en amont et en aval de la procédure de décontamination sont
comparées pour
évaluer l'efficacité de la procédure de décontamination. Le matériel peut, par
exemple, être
un matériel de purification, en particulier une colonne de chromatographie, ou
encore être
la sanitisation d'une colonne de chromatographie à l'aide de soude.

L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon
l'invention à
une procédure de sélection et/ou méthode d'évaluation de la capacité d'un
composé
candidat à moduler (réduire ou augmenter) le titre du matériel infectieux.
Dans ce cas, on
détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen
de la
méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit
biologique
infecté avec le composé à tester puis on détermine à nouveau le titre du
produit biologique
ayant subi la procédure de décontamination. Les deux mesures de titre
effectuées en amont
et en aval de la mise en contact de l'échantillon avec le composé à tester
sont comparées.
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon
l'invention à
une procédure de sélection et/ou méthode d'évaluation d'un composé susceptible
d'inhiber
l'infectiosité d'un ATNC. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un
produit
biologique contenant un ATNC, en présence puis en absence du composé à
évaluer, au
moyen de la méthode de titrage selon l'invention. Les modalités de la mise en
présence du
composé sont déterminées selon que l'action du composé prévient l'initiation
d'un cycle
infectieux ou bloque un cycle infectieux déjà initié. Dans tous les cas, on
détermine le titre
du produit biologique avec et sans traitement avec le produit à tester. Les
deux mesures de
titre effectuées sont comparées pour évaluer l'activité inhibitrice de
l'infectiosité d'un
ATNC du composé.

L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon
l'invention à
une méthode d'identification d'un composé permettant de moduler la
transformation de la


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forme non-pathologique en la forme pathologique d'une protéine marqueur ou de
l'ATNC,
par exemple la transformation de PrP en PrPs . Dans ce cas, on détermine le
titre en ATNC
d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage
selon
l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le
composé à
tester puis on applique la méthode de titrage de l'invention afin de
déterminer à nouveau le
titre du produit biologique. Les deux mesures de titre effectuées en amont et
en aval de la
mise en contact avec le composé sont comparées pour évaluer l'efficacité du
composé à
tester.

La méthode de l'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de
description qui
va suivre, qui ne limite pas la portée de l'invention.

EXEMPLES :

Matériels et Méthodes
Les cellules MovS6 (Archer F. et al. 2004 supra) ont été sélectionnées comme
cellules
supportant la réplication des ATNC, et la souche de tremblante 127-S adaptée
aux souris
transgéniques Tg301 a été utilisée comme source d'infectiosité naturelle
(Vilette JL et al.
2001 supra). Les souris transgéniques Tg301 portent un large fragment d'ADN
isolé d'une
librairie de chromosomes artificiels ovins, et les niveaux d'expression de la
PrP ovine est
environ 8 fois supérieur à celui observé dans le cerveau de mouton. La source
d'infectiosité
initiale consistait en un homogénat de cerveaux (lot LN-3326) de souris
infectées à 200 mg
/ ml. Le titre de cet échantillon est de 5.7 logio uWB/ml et 6.35 TCID50/ml.
Culture cellulaire et inoculation :
Les cellules MovS6 ont été cultivées en milieu DMEM + Ham-F12 (4 :1)
complémenté en
glutamine et sérum de veau foetal (5% final) et incubées à 37 C sous 5% de
C02. Chaque
semaine 10% des cellules ont été ré-ensemencées dans chaque puits. Les 90% de
cellules
restantes ont été soit conservées sous forme de culot cellulaire sec
préalablement lavé en
PBS, soit éliminées.


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Des plaques de titrages ont été préparées 24 heures avant l'inoculation. Les
cellules ont été
ensemencées dans des puits d'environ 2cm2 (format de plaque 24 puits), à
raison de
100.000 cellules par puits, soit environ 50.000 cellules/cm2.
L'inoculum était constitué soit de l'échantillon LN-3326 dilué 104 fois, soit
d'un
5 échantillon d'homogénat de cerveau sain qui a servi de Contrôle négatif
(lot : LN-3777).
Les inoculations ont été réalisées en 5 réplicats.
Les cellules ont été mises en contact pendant 24 heures avec 150 gl d'inoculum
dilué, puis
1 ml de milieu de culture neuf était ajouté. Les cellules ont été maintenues
en culture 72
heures supplémentaires, soit jusqu'au premier passage au cours duquel pour
chaque puits,

10 la totalité du tapis cellulaire a été transférée dans un puits d'environ
9.6cm2 (format de
plaque 6 puits).
La culture cellulaire a alors été maintenue pendant 10 semaines. Chaque
semaine, pour
chaque puits le milieu de culture a été changé et 10% des cellules ont été re-
ensemencées.
Les cellules inoculées avec l'inoculum infecté (LN-3326) non re-ensemencées
ont été pour
15 2 réplicats sur les 5, lavées une fois en PBS puis conservées à -80 C sous
forme de culot
sec (échantillons destinés à une amplification selon la méthode de
l'invention) et pour les 3
autres réplicats conservées sans lavage préalable en culot sec (échantillons
destinés à une
détection par WB). Les cellules inoculées avec l'échantillon sain et non re-
ensemencées ont
été, pour tous les réplicats, conservées sans lavage préalable sous la forme
de culot sec. Les
20 culots cellulaires obtenus permettaient d'effectuer les analyses décrites
ci après.
Détection de la PrPsc dans les cellules :
Les culots cellulaires, conservés à chaque passage, ont permis de rechercher
la PrPsc
produite par les cellules. La détection de la PrPsc produite a été réalisée
soit directement
par Western-blot pour les échantillons de culot cellulaire non lavé, soit par
un Western blot
après amplification par la méthode de l'invention pour les échantillons de
culot cellulaire
lavé.
- Détection directement par Western-blot : Les échantillons de culots
cellulaires non
lavés (3 réplicats sur les 5) ont été décongelés et repris dans 60gl de PBS.
Les cellules
ont été lysées par sonication pendant 15 secondes à l'aide d'un bain à
sonication (puissance: 15W). 20 1 de lysat cellulaire soniqué ont été prélevés
pour être
traités par la Protéinase K. Le produit de la digestion a été dénaturé puis
analysé par


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électrophorèse en gel de poly-acrylamide en conditions dénaturantes (SDS-
PAGE).
Les protéines ayant migré dans le gel ont été transférées sur une membrane
PVDF par
électro-transfert. La PrPsc présente sur les membranes a été détectée par
incubation
avec l'anticorps 6H4 (Prionics) puis un anticorps secondaire marqué à la
phosphatase
alcaline (anticorps de chèvre anti-anticorps de souris ). Les membranes
marquées
ont été révélées par chemi-luminescence. Un échantillon était considéré comme
positif si le profil électrophorétique des trois formes de PrPsc glycosylée
était visible
sur les autoradiogrammes.
- Détection par la méthode de l'invention : Chacun des échantillons de culots
cellulaires lavés a été décongelé puis repris dans 90gl de solution
d'homogénat de
cerveau sain à 5% et placé en microtube de 200 1. Un cycle des étapes (iii) à
(v) était
composé d'une phase d'incubation de 30 minutes à température 37 C suivi d'une
phase de sonication de 20 secondes. Une série de 50 cycles a été réalisée sur
les
échantillons à l'aide de l'automate Sonicateur Misonix 3000 (niveau de
puissance
réglé à 7). A partir de 18gl de produit d'amplification, une digestion par la
protéinase
K suivie d'une analyse par Western-blot a été réalisée pour détecter la
présence
éventuelle de PrPsc.

Résultats
La détection de la PrPsc dans les différents échantillons est représentée sur
la figure et
résumée dans le tableau 1.
Tableau 1 : Nombre de puits positifs après détection de la PrPsc dans les
lysats de
cellules MovS6.
Cellules Passage
Méthode de détection
inoculées
de la PrPsc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
par
LN-3326* Western-Blot 0/3 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3
LN-3326 PMCA +Western-Blot 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1
LN-3777** Western-Blot 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3

LN-3777 PMCA +Western-Blot NT NT 0/1 NT NT NT NT NT NT NT


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* LN-3326: inoculum infecté par la souche de scrapie 127S
** LN-3777: inoculum non infecté
NT : Non testé

Aucun signal de PrPsc n'a été détecté dans l'échantillon constitué d'homogénat
de cerveau
sain. De même aucun signal n'a été observé dans le lysat de cellules MovS6
inoculées avec
cet homogénat de cerveau sain (figure, puits 2 et 13).
Un signal spécifique de la PrPsc a été observé dans l'échantillon constitué
d'homogénat de
cerveau infecté par la souche de tremblante 127-S dilué 106 fois (figure,
puits 14). Compte
tenu du titre de 5,7 logio uWB/ml de cet homogénat, de la limite de détection
de la méthode
du Western-blot de 2.36 logio uWB/ml, la PrPsc dans cet échantillon dilué n'a
pas été
détectée par la seule méthode du Western-blot.
Un signal spécifique de la PrPsc a été observé dans les lysats des cellules
MovS6 inoculées
avec l'homogénat de cerveau infecté par la souche 127-S. Ce signal a été
observé dès le
premier passage (figure, puits 3 à 12).

Conclusions :
Amplification de la PrPsc liée à la souche 127-S dans l'homogénat de cerveau
LN-
3326:
Ces données montrent que la PrPsc associée à la souche 127-S dans
l'échantillon
d'homogénat de cerveau LN-3326 préalablement dilué 106 fois, peut être
amplifiée par la
méthode de l'invention. La détection de la PrPsc dans cet échantillon dilué
indique que le
taux d'amplification est d'au moins 2,5 à 3 logio.
Par ailleurs, cette amplification est spécifique de la PrPsc puisqu'aucun
signal n'est observé
avec l'échantillon d'homogénat sain non dilué.

Amplification de la PrPsc associée à la souche 127-S dans les lysats de
cellules
A la dilution étudiée (10-4), l'homogénat LN-3326 a induit la production de
PrPsc
détectable en Western-blot à partir du 4 ème passage. Ce délai correspond au
temps
nécessaire à la propagation de la PrPsc dans la culture cellulaire pour
atteindre le niveau de


CA 02719152 2010-09-21
WO 2009/125139 PCT/FR2009/050520
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concentration minimale détectable par Western-blot. Ce délai prouve en outre
une
production de novo de la PrPsc par les cellules.
Avec la méthode de l'invention, la PrPsc présente dans les cellules infectées
est détectée
dès le premier passage et pour tous les passages suivants. Cette amplification
semble
spécifique puisque la PrPsc n'a pas été détectée dans les cellules non
infectées.
Ainsi, ces données semblent indiquer que la méthode de l'invention, par
rapport à la
méthode du Western-blot, permet de détecter plus précocement la PrPsc produite
par les
cellules infectées.

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(86) PCT Filing Date 2009-03-25
(87) PCT Publication Date 2009-10-15
(85) National Entry 2010-09-21
Examination Requested 2011-08-09
Dead Application 2015-01-29

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Maintenance Fee - Application - New Act 2 2011-03-25 $100.00 2011-03-21
Request for Examination $800.00 2011-08-09
Maintenance Fee - Application - New Act 3 2012-03-26 $100.00 2012-02-29
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Description 2010-09-21 23 1,018
Claims 2010-09-21 3 95
Drawings 2010-09-21 1 83
Abstract 2010-09-21 1 77
Cover Page 2010-12-22 1 34
Description 2013-03-05 24 1,044
Claims 2013-03-05 3 88
Assignment 2010-09-21 3 68
PCT 2010-09-21 14 631
Correspondence 2011-01-31 2 129
Prosecution-Amendment 2011-08-09 2 77
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Prosecution-Amendment 2012-09-06 4 160
Prosecution-Amendment 2013-03-05 13 467
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