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NOUVEAUX ANTICORPS UTILES POUR LE TRAITEMENT DU CANCER
La présente invention est relative à de nouveaux anticorps, notamment
monoclonaux d'origine murine, chimériques et humanisés, capables d'inhiber la
croissance tumorale ainsi que les séquences d'acide aminé et nucléiques codant
pour ces
anticorps. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet de nouveaux
anticorps,
composés dérivés ou fragments fonctionnels, capables d'inhiber la
prolifération des
cellules tumorales. L'invention comprend également l'utilisation de ces
anticorps à titre
de médicament pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des
cancers ainsi
que dans des procédés ou nécessaires de diagnostic des cancers. L'invention
comprend
enfin des produits et/ou des compositions comprenant de tels anticorps en
association,
par exemple, avec des anticorps et/ou des agents anticancéreux ou conjugués
avec des
toxines et leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement de certains
cancers.
CD151, appelé aussi PETA-3 ou SFA-1, est une protéine membranaire
appartenant à la famille des tétraspanines (Boucheix et Rubinstein, 2001, Cell
Mol. Life
Sci. 58, 1189-1205 ; Hemler, 2001, J. Cell Biol. 155, 1103-1107). Chez
l'homme,
CD151 possède 253 acides aminés, et comporte 4 fragments membranaires et 2
domaines extracellulaires EC 1 (18 acides aminés, séquence [40-57]) et EC2
(109 acides
aminés, séquence [113-221]), appelés aussi boucles extracellulaires. Il est
cependant à
noter qu'au niveau de la séquence nucléotidique, deux variants pour CD151 ont
été
identifiés à ce jour, à savoir l'un comprenant les nucléotides A et C
respectivement aux
positions 395 et 409 [Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355] et l'autre
comprenant
pour les mêmes positions les nucléotides G et T au lieu et place des
nucléotides A et C
[Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263]. De ce fait, une mutation
au niveau
de la séquence peptidique peut être observée, à savoir une mutation des
résidus K (Lys)
et P (Pro) respectivement aux positions 132 et 137 en les résidus R Arg) et S
(Ser)
[Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355 / Hasegawa et al., 1996, J.
Virol. 70(5),
3258-3263].
CD 151 est surexprimé dans de nombreux cancers, comme par exemple les
cancers du poumon [Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114], du
colon
[Hashida et al., 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167], de la prostate [Ang et al.,
2004,
Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721] ou du pancréas [Gesierich et
al.,
2005, Clin. Cancer Res. 11, 2840-2852].
L'utilisation des souris knock-out n'exprimant pas CD151, et d'anticorps anti-
CD151 et de siRNA pour bloquer in vitro la fonctionnalité et l'expression de
CD151
dans différents types cellulaires a permis de montrer que CD 151 est impliqué
dans
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
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plusieurs phénomènes liés au cancer, comme l'adhésion cellulaire (Nishiuchi et
al.,
2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1939-1944 ; Winterwood et al., 2006,
Mol. Biol.
Cell 17, 2707-2721), la motilité cellulaire (Kohno et al., 2002, Int. J.
Cancer 97, 336-
343), la migration cellulaire (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-
2765 ; Testa et
al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820 ; Penas et al., 2000, J. Invest.
Dermatol. 114,
1126-1135 ; Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416),
l'invasion cellulaire (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343 ; Shiomi
et al.,
2005, Lab. Invest. 85, 1489-1506 ; Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281,
24279-24292)
et l'angiogénèse (Yanez-Mo et al., 1998, J. Cell Biol. 141, 791-804 ; Sincock
et al.,
1999, J. Cell Sci. 112, 833-844 ; Takeda et al., 2007, Blood 109, 1524-1532).
L'une des propriétés remarquable des tétraspanines est leur capacité à
s'associer
entre elles, ainsi qu'à un nombre important d'autres molécules de surface pour
former
des complexes macromoléculaires structurés. Au sein de ces complexes, chaque
tétraspanine est associée spécifiquement à une ou plusieurs molécules de
surface
formant ainsi des complexes primaires, constitués d'une tétraspanine et d'une
molécule
partenaire. Les tétraspanines peuvent organiser des microdomaines particuliers
de la
membrane plasmique au sein desquels elles recruteraient leurs partenaires
moléculaires
qui pourraient être couplés fonctionnellement. L'ensemble des interactions
impliquant
les tétraspanines a été dénommé réseau des tétraspanines ou Tetraspanin
Web .
CD151 interagit à la surface des cellules avec différentes protéines
membranaires. Des complexes très stables, résistants à l'action de certains
détergents,
ont notamment été mis en évidence avec les intégrines récepteurs des
laminines, et plus
particulièrement avec les intégrines a3131 ou a6134 dont le ligand
préférentiel est la
laminine 5 (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765 ; Lammerding et
al., 2003,
Proc. Natl. Acad. Sci USA 100, 7616-7621). Cette association implique les
domaines
extracellulaires de CD151 et des intégrines. La séquence QRD [194-196] de
CD151,
localisée dans la boucle EC2, est très importante dans cette association
puisque la
mutation de ce site provoque la perte de l'interaction avec certaines
intégrines (Kazarov
et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). Des complexes ternaires
fonctionnels
CD151/intégrine a6(34/c-Met (récepteur du HGF) ont d'autre part été mis en
évidence
dans les cellules tumorales (Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 336,
408-416). L'inhibition de l'expression de CD151 par traitement des cellules
avec un
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ARN interférence provoque une inhibition de la croissance et de la migration
cellulaire
induite par HGF.
Les interactions au sein d'une même cellule de CD151 avec d'autres
tétraspanines, nécessaires à la formation du réseau des tétraspanines,
dépendraient des
régions membranaires et cytoplasmiques de CD151 puisqu'il a été montré que la
délétion de la boucle EC2 ne rompait pas l'association de CD151 avec d'autres
tétraspanines (Berditchevski, 2001, J. Cell Sci. 114, 4143-4151).
CD151 est capable de réguler les phénomènes d'adhésion, de migration et
d'invasion cellulaire par la modulation de différentes voies de signalisation,
comme par
exemple la voie des phosphoinositides via une association avec la P14-kinase
(Yauch et
al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765), la voie de signalisation de c-Jun
via la
phosphorylation de FAK, Src, p38-MAPK et JNK (Hong et al., 2006, J. Biol.
Chem.
281, 24279-24292), la phosphorylation des intégrines par la PKC (Zhang et al.,
2001, J.
Biol. Chem. 276, 25005-25013), l'activation de GTPases de la famille Rho
(Shigeta et
al., 2003, J. Cell Biol. 163, 165-176).
Des interactions de type homophilique entre cellules sont aussi responsables
d'une augmentation de la motilité cellulaire et de l'expression de la
métalloprotéinase
MMP-9 (Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292). Ces interactions
intercellulaires CD 151-CD 151 provoquent l'activation de c-Jun via la
phosphorylation
de FAK, Src, p38-MAPK et JNK
A ce jour, en dépit de l'intérêt de la protéine CD 151, deux anticorps à visée
thérapeutique ont été générés, à savoir les anticorps monoclonaux 50-6 et
SFA1.2B4.
Ces 2 anticorps possèdent des activités comparables. Ils inhibent en effet la
formation
des métastases in vivo dans des modèles animaux, mais aucun effet sur la
croissance
tumorale in vivo n'a été mis en évidence.
L'anticorps monoclonal 50-6 (isotype IgG1) dirigé contre CD151 a été généré
chez la souris par immunisations soustractives avec des cellules humaines de
carcinome
épidermoïde HEp-3 (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820).
L'anticorps 50-6 est capable d'inhiber in vitro la migration des cellules
humaines de carcinome cervical HeLa transfectées afin de surexprimer CD151 et
des
cellules HEp-3, et l'angiogénèse dans un modèle de néovascularisation de
membrane
chorioallantoïque induite par le bFGF (basic fibroblast growth factor). Il
inhibe in vivo
les métastases induites par inoculation de cellules HEp-3 dans 2 modèles
d'embryon de
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poulet (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820). Dans ces modèles,
l'activité
inhibitrice de l'anticorps 50-6 est déterminée par la mesure de l'activité de
la protéine
huPA (human urokinase-type plasminogen activator) dans des extraits de
poumons.
Selon les auteurs, ce dosage constitue le reflet de la présence de cellules
humaines dans
les poumons. Après dosage, la réduction des métastases (dissémination des
cellules
HEp-3 dans les poumons des embryons de poulet) induite par l'anticorps 50-6
est
estimée, par comparaison à un anticorps contrôle, à 74% dans un modèle dit de
métastase spontanée dans lequel l'inoculation des cellules est suivie par
une
injection de l'anticorps, et à 57% dans un modèle dit de métastase
expérimentale
dans lequel les cellules et l'anticorps sont inoculés conjointement. Selon les
auteurs, les
propriétés anti-tumorales de l'anticorps 50-6 observées in vivo ne semblent
pas être
liées à un effet cytostatique ou cytotoxique puisqu'il n'a montré aucun effet
sur la
prolifération in vitro des cellules HEp-3.
L'hybridome produisant l'anticorps 50-6 est disponible à 1'ATCC sous la
référence CRL-2696 (hybridome déposé initialement sous la référence 50-6 [PTA-
227]).
L'anticorps monoclonal anti-CD151 SFA1.2B4 (isotype IgGi) a été généré chez
la souris après immunisation par voie intra-péritonéale avec des cellules NIH
3T3
transfectées par le gène de CD151 humain (Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70,
3258-
3263). L'anticorps SFA1.2B4 est capable d'inhiber in vitro l'invasion et la
motilité
cellulaire de différentes lignées tumorales humaines (Kohno et al., 2002, Int.
J. Cancer
97, 336-343). Il inhibe in vivo les métastases pulmonaires induites par les
lignées de
cancer du colon RPM114788 et de fibrosarcome HT1080 transfectées pour
surexprimer
CD151 (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343).
D'autres anticorps murins anti-CD151 ont été décrits dans la littérature,
comme
par exemple les anticorps monoclonaux 14A2H1 (Ashman et al., 1991, Br. J.
Haematol.
79, 263-270 ; Roberts et al., 1995, Br. J. Haematol. 89, 853-860), TS151 et
TS151R
(Serru et al., 1999, Biochem. J. 340, 103-111 ; Geary et al., 2001, Tissue
Antigens 58,
141-153 ; Charrin et al., J. Biol. Chem. 276, 14329-14337 ; Chometon et al.,
2006, Exp.
Cell Res. 312, 983-985). Aucune activité anti-tumorale in vivo n'a été décrite
pour ces
différents anticorps.
Plusieurs études expérimentales ont montré le rôle majeur des tétraspanines
dans
la formation de métastases, en agissant soit comme suppresseurs, soit comme
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promoteurs de métastases. Ainsi, la transfection de tétraspanines comme CD9,
CD63 ou
CD82 réduit le potentiel métastatique de lignées cancéreuses. En revanche,
l'expression
des tétraspanines CD151 et Co-029 semble produire l'effet inverse. Ces 2
tétraspanines
seraient donc des promoteurs de la métastase. Ces résultats sont cohérents
avec
5 différentes études cliniques qui ont démontré que, dans plusieurs cancers
(sein, poumon,
oesophage, estomac, foie, pancréas, côlon, prostate, mélanome...), CD9 et CD82
sont
moins exprimés sur les tumeurs primitives lorsqu'il y a métastase et que leur
baisse
d'expression prédit un taux de survie inférieur. Dans le cancer du poumon, la
diminution combinée de l'expression de CD9 et de CD82 a été corrélée à un
potentiel
métastatique plus important que lorsque l'expression d'un seul de ces deux
antigènes est
réduite.
Plusieurs études rétrospectives ont montré que la surexpression de CD 151
était
associée à l'agressivité de certains cancers, comme les cancers du poumon, du
colon et
de la prostate, et pouvait être considérée comme un facteur de mauvais
pronostic
(Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114 ; Hashida et al., 2003,
Br. J.
Cancer 89, 158-167 ; Ang et al., 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13,
1717-
1721). Dans ces cas, la moyenne de survie est en effet diminuée chez les
patients dont la
tumeur exprime CD 151, comparativement à ceux dont la tumeur n' exprime pas CD
151.
La surexpression de CD 151 dans différentes lignées tumorales humaines (HeLa,
RPM114788, A172, HT1080), induite par transfection du gène correspondant,
provoque une augmentation de la motilité, de la migration et de l'invasion des
cellules
transfectées (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820 ; Kohno et al.,
2002, Int. J.
Cancer 97, 336-343). Ces phénomènes sont inhibés en présence d'anticorps anti-
CD151.
Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un anticorps isolé, ou l'un
de
ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, capable de se lier à la
protéine CD 151,
ledit anticorps étant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un CDR choisi
parmi les
CDRs de séquence SEQ ID No. 1-6, 17-22, 33-35, 43-48, 59-63, 69-73, 79-8 1, ou
85-89
ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80%, de préférence 85%,
90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID
No.
1-6, 17-22, 33-35, 43-48, 59-63, 69-73, 79-81, ou 85-89.
Par fragment fonctionnel d'un anticorps selon l'invention, on entend
désigner en particulier un fragment d'anticorps, tel que des fragments Fv,
scFv (se pour
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simple chaîne), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diabodies, ou tout fragment
dont la durée
de demie-vie aurait été augmentée. De tels fragments fonctionnels seront
décrits en
détails plus loin dans la présente description.
Par composé dérivé d'un anticorps selon l'invention, on entend désigner en
particulier une protéine de liaison comprenant une charpente peptidique ou
scaffold
et au moins l'un des CDRs de l'anticorps d'origine afin d'en conserver la
capacité de
reconnaissance. De tels composés dérivés sont bien connus de l'homme de l'art
et
seront décrits plus en détails dans la suite de la présente description.
De manière plus préférée, l'invention comprend les anticorps, leurs composés
dérivés ou leurs fragments fonctionnels, selon la présente invention,
notamment
chimériques ou humanisés, obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse
chimique.
Selon une forme de réalisation préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention est caractérisé en ce
qu'il consiste
en un anticorps monoclonal.
Il faut entendre par anticorps monoclonal un anticorps issu d'une
population d'anticorps sensiblement homogènes. Plus particulièrement, les
anticorps
individuels d'une population sont identiques à l'exception de quelques
mutations
éventuelles pouvant se produire naturellement qui peuvent se retrouver en
proportions
minimes. En d'autres termes, un anticorps monoclonal consiste en un anticorps
homogène résultant de la prolifération d'un seul clone cellulaire (par exemple
un
hybridome, une cellule hôte eucaryote transféctée avec une molécule d'ADN
codant
pour l'anticorps homogène, une cellule hôte procaryote transfectée avec une
molécule
d'ADN codant pour l'anticorps homogène, etc.) et qui est généralement
caractérisé par
des chaînes lourdes d'une seule et même classe et sous-classe, et des chaînes
légères
d'un seul type. Les anticorps monoclonaux sont fortement spécifiques et sont
dirigés
contre un seul antigène. En outre, contrairement aux préparations d'anticorps
polyclonaux qui comprennent classiquement différents anticorps dirigés contre
différents déterminants, ou épitopes, chaque anticorps monoclonal est dirigé
contre un
seul épitope de l'antigène.
Il doit être compris ici que l'invention ne concerne pas les anticorps sous
forme
naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement
naturel mais qu'ils
ont pu être isolés ou obtenus par purification à partir de sources naturelles,
ou bien
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obtenus par recombinaison génétique, ou par synthèse chimique, et qu'ils
peuvent alors
comporter des acides aminés non naturels comme cela sera décrit plus loin.
Plus particulièrement, selon une première forme d'exécution de l'invention, il
est décrit un premier anticorps qui est caractérisé en ce qu'il comprend
i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1,
CDR-L2 et CDR-L3, avec
- CDR-L1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 1 ou 59 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 1 ou 59 ,
- CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 2 ou 60 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 2 ou 60 ,
- CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 3 , ou au moins une séquence qui présente
au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No.
3;
et/ou
ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1,
CDR-H2 et CDR-H3, avec
- CDR-H1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 4 ou 61 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 4 ou 61 ,
- CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 5 ou 62 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 5 ou 62 ,
- CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 6 ou 63 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 6 ou 63.
Selon une deuxième forme d'exécution de l'invention, il est décrit un deuxième
anticorps qui est caractérisé en ce qu'il comprend
i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1,
CDR-L2 et CDR-L3, avec
- CDR-L1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 17 ou 69 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 17 ou 69,
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- CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 18 ou 70 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 18 ou 70 ,
- CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 19, ou au moins une séquence qui présente
au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No.
19,
et/ou
ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1,
CDR-H2 et CDR-H3, avec
- CDR-H1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 20 ou 71 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 20 ou 71 ,
- CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 21 ou 72 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 21 ou 72 ,
- CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 22 ou 73 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 22 ou 73.
Selon encore une troisième forme d'exécution de l'invention, il est décrit un
troisième anticorps qui est caractérisé en ce qu'il comprend
i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1,
CDR-L2 et CDR-L3, avec
- CDR-L1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 33 ou 79 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 33 ou 79 ,
- CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 2 ou 60 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 2 ou 60 ,
- CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 3 , ou au moins une séquence qui présente
au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No.
3
et/ou
ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1,
CDR-H2 et CDR-H3, avec
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- CDR-H1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 4 ou 61 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 4 ou 61 ,
- CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 34 ou 80 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 34 ou 80 ,
- CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 35 ou 81 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 35 ou 81.
Enfin, selon une dernière forme d'exécution de l'invention, il est décrit un
quatrième anticorps qui est caractérisé en ce qu'il comprend
i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1,
CDR-L2 et CDR-L3, avec
- CDR-L1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 43 ou 85 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 43 ou 85 ,
- CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 44 ou 86 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 44 ou 86 ,
- CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 45, ou au moins une séquence qui présente
au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No.
45
et/ou
ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1,
CDR-H2 et CDR-H3, avec
- CDR-H1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 46 ou 87 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 46 ou 87 ,
- CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 47 ou 88 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 47 ou 88 ,
- CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 48 ou 89 , ou au
moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement
optimal
avec la séquence SEQ ID No. 48 ou 89.
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De manière générale, il est ici rappelé que par région CDR ou CDR, on entend
désigner les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères des
immunoglobulines. Il existe 3 CDRs de chaîne lourde et 3 CDRs de chaîne
légère. Le
terme CDR ou CDRs est utilisé ici pour désigner suivant les cas, l'une de ces
régions ou
5 plusieurs, voire l'ensemble, de ces régions qui contiennent la majorité des
résidus
d'acide aminés responsables de la liaison par affinité de l'anticorps pour
l'antigène ou
l'épitope qu'il reconnaît.
Selon une première approche, les CDRs peuvent être définies suivant le système
IMGT. Le système de numérotation unique IMGT a été défini de manière à
comparer
10 les domaines variables quelque soit l'antigène, le type de chaîne ou
l'espèce [Lefranc
M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997), Lefranc M.-P., The Immunologist, 7,
132-
136 (1999), Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier,
E.,
Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77
(2003)]. Dans ce système de numérotation, les acides aminés conservés gardent
toujours
la même position comme la cystéine 23 (lst-CYS), le tryptophane 41 (CONSERVED
TRP), l'acide aminé hydrophobe 89, la cystéine 104 (2nd-CYS), la phénylalanine
ou
tryptophane 118 (J-PHE ou TRP). Le système de numérotation unique IMGT fournit
donc une délimitation standardisée des régions charpentes (FR1-IMGT :
positions 1 à
26, FR2-IMGT: positions 39 à 55, FR3-IMGT: positions 66 à 104 et FR4_IMGT :
positions 118 à 128) ainsi que des régions déterminant la complémentarité ou
CDRs
(CDR1-IMGT : positions 27 à 38, CDR2-IMGT: positions 56 à 65 et CDR3-IMGT:
positions 105 à 117). Comme les trous ou espaces représentent des
positions
inoccupées, la longueur des CDR selon IMGT devient une information cruciale.
Le
système IMGT est utilisé dans les représentations graphiques en 2D, désignés
alors
comme les colliers de perles IMGT [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P.,
Immunogenetics, 53,
857-883 (2002), Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30
(2007)], et dans les structures en 3D nommées IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q.,
Ruiz,
M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids.
Res., 32,
D208-D210 (2004)].
Suivant cette première approche, le premier anticorps, ou l'un de ses composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3
respectivement de séquence SEQ ID No. 1, 2 et 3, ou présentant au moins 80%,
de
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préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les
séquences SEQ ID No. 1, 2 et 3, et/ou une chaîne lourde comprenant au moins un
CDR
choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ ID
No. 4, 5 et 6, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 5 et 6.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
SEQ ID No. 1 : ASVEYYGTSL
SEQ ID No. 2: EAS
SEQ ID No. 3: QQSRKAPYT
1o SEQ ID No. 4: GFTFSTYT
SEQ ID No. 5: ISSGGGTT
SEQ ID No. 6: ATPRIGTGFAY
Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de
séquence
SEQ ID Nos. 1, 2 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95%
et
98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 1, 2 et
3.
De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou
fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde
comprenant les
trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No.
4, 5
et 6, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité
après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 5 et 6.
Suivant cette même approche, le deuxième anticorps, ou l'un de ses composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3
respectivement de séquence SEQ ID No. 17, 18 et 19, ou présentant au moins
80%, de
préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les
séquences SEQ ID No. 17, 18 et 19, et/ou une chaîne lourde comprenant au moins
un
CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ
ID No. 20, 21 et 22, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95%
et 98%
d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 20, 21 et
22.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
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SEQ ID No. 17: ATPRIGTGFAY
SEQ ID No. 18: SAS
SEQ ID No. 19 : QQYSSNPT
SEQ ID No. 20 : GFTLSTSGMG
SEQ ID No. 21: IYWDDDK
SEQ ID No. 22: ARRDHYGDYSYAMDY
Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de
séquence
SEQ ID Nos. 17, 18 et 18, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%,
95%
et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 17,
18 et 19.
De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou
fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde
comprenant les
trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No.
20,
21 et 22, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité
après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 20, 21 et 22.
Toujours suivant cette même approche, le troisième anticorps, ou l'un de ses
composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une
chaîne
légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3
respectivement de séquence SEQ ID No. 33, 2 et 3, ou présentant au moins 80%,
de
préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les
séquences SEQ ID No. 33, 2 et 3 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins
un
CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ
ID No. 4, 34 et 35, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et
98%
d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 34 et 35.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
SEQ ID No. 33 : ASVDYYGTSL
SEQ ID No. 34 : ISSGGVTT
SEQ ID No. 35 : TSPRTGTGFAY
Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
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comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de
séquence
SEQ ID Nos. 33, 2 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%,
95% et
98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 33, 2 et
3.
De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou
fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde
comprenant les
trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No.
4, 34
et 35, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité
après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 34 et 35.
Enfin, toujours selon cette même approche, le quatrième et dernier anticorps,
ou
l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention
comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L
1,
CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ ID No. 43, 44 et 45, ou
présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après
alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 43, 44 et 45 ; et/ou une
chaîne
lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3
respectivement de séquence SEQ ID No. 46, 47 et 48, ou présentant au moins
80%, de
préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les
séquences SEQ ID No. 46, 47 et 48.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
SEQ ID No. 43 : ENVGTY
SEQ ID No. 44 : GAS
SEQ ID No. 45 : GQTYSFPYT
SEQ ID No. 46 : GYTFTSSS
SEQ ID No. 47 : IHPNSGNT
SEQ ID No. 48: ARARSFYYAMDC
Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de
séquence
SEQ ID Nos. 43, 44 et 45, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%,
95%
et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 43,
44 et 45.
De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou
fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde
comprenant les
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trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No.
46,
47 et 48, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité
après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 46, 47 et 48.
Selon une deuxième approche, les CDRs peuvent être définies suivant
l'approche classique de Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of
immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services,
NIH,
1991, and later editions).
Suivant cette première approche, le premier anticorps, ou l'un de ses composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3
respectivement de séquence SEQ ID No. 59, 60 et 3, ou présentant au moins 80%,
de
préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les
séquences SEQ ID No. 59, 60 et 3 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins
un
CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ
ID No. 61, 62 et 63, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95%
et 98%
d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 61, 62 et
63.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
SEQ ID No. 59: RASASVEYYGTSLMH
SEQ ID No. 60 : EASNVES
SEQ ID No. 61: STYTMS
SEQ ID No. 62: YISSGGGTTYYPDTVKG
SEQ ID No. 63 : PRIGTGFAY
Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de
séquence
SEQ ID Nos. 59, 60 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%,
95% et
98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 59, 60
et 3.
De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou
fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde
comprenant les
trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID
No. 61,
62 et 63, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité
après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 61, 62 et 63.
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Suivant cette même approche, le deuxième anticorps, ou l'un de ses composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3
respectivement de séquence SEQ ID No. 69, 70 et 19, ou présentant au moins
80%, de
5 préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les
séquences SEQ ID No. 69, 70 et 19, et/ou une chaîne lourde comprenant au moins
un
CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ
ID No. 71, 72 et 73, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95%
et 98%
d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 71, 72 et
73.
10 Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les
suivantes
SEQ ID No. 69: KASQNVGIAVA
SEQ ID No. 70: SASNRYT
SEQ ID No. 71: STSGMGVS
SEQ ID No. 72: HIYWDDDKRYNPSLKS
15 SEQ ID No. 73 : RDHYGDYSYAMDY
Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de
séquence
SEQ ID Nos. 69, 70 et 19, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%,
95%
et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 69,
70 et 19.
De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou
fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde
comprenant les
trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID
No. 71,
72 et 73, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité
après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 71, 72 et 73.
Toujours suivant cette même approche, le troisième anticorps, ou l'un de ses
composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une
chaîne
légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3
respectivement de séquence SEQ ID No. 79, 60 et 3, ou présentant au moins 80%,
de
préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les
séquences SEQ ID No. 79, 60 et 3 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins
un
CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ
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ID No. 61, 80 et 81, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95%
et 98%
d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 100, 101 et
102.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
SEQ ID No. 79: ASVDYYGTSL
SEQ ID No. 80 : YISSGGVTTYYPDTIKG
SEQ ID No. 81: PRTGTGFAY
Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de
séquence
SEQ ID Nos. 79, 60 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%,
95% et
98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 79, 60
et 3.
De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou
fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde
comprenant les
trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID
No. 61,
80 et 81, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité
après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 61, 80 et 81.
Enfin, toujours selon cette même approche, le quatrième et dernier anticorps,
ou
l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention
comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L
1,
CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ ID No. 85, 86 et 45, ou
présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après
alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 85, 86 et 45 ; et/ou une
chaîne
lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3
respectivement de séquence SEQ ID No. 87, 88 et 89, ou présentant au moins
80%, de
préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les
séquences SEQ ID No. 87, 88 et 89.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
SEQ ID No. 85 : KASENVGTYVS
SEQ ID No. 86: GASNRYTGVPD
SEQ ID No. 87 : TSSSMH
SEQ ID No. 88: EIHPNSGNTNNNEKFKG
SEQ ID No. 89: ARSFYYAMDC
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Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de
séquence
SEQ ID Nos. 85, 86 et 45, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%,
95%
et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 85,
86 et 45.
De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou
fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde
comprenant les
trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID
No. 87,
88 et 89, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité
après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 87, 88 et 89.
Dans la présente description, les termes polypeptides, séquences
polypeptidiques, peptides et protéines attachés aux composés anticorps ou à
leur
séquence sont interchangeables.
Il doit être compris ici que l'invention ne concerne pas les anticorps sous
forme
naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement
naturel mais qu'ils
ont pu être isolés ou obtenus par purification à partir de sources naturelles,
ou bien
obtenus par recombinaison génétique, ou par synthèse chimique, et qu'ils
peuvent alors
comporter des acides aminés non naturels comme cela sera décrit plus loin.
Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou
d'acide aminé au sens de la présente invention, on entend désigner un
pourcentage de
nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences
à
comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce
pourcentage
étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant
réparties au
hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux
séquences
d'acide nucléique ou d'acide aminé sont traditionnellement réalisées en
comparant ces
séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison
pouvant être
réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison . L'alignement optimal
des
séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen
de
l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math.
2:482],
au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J.
Mol.
Biol. 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et
Lipman
(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels
informatiques
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utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin
Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison,
WI,
ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide
aminé est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière
optimale
dans laquelle la séquence d'acide nucléique ou d'acide aminé à comparer peut
comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de
référence pour
un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est
calculé
en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide
ou le
résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce
nombre de
positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de
comparaison et
en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage
d'identité entre ces
deux séquences.
Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 séquences
(Tatusova et al., "Blast 2 séquences - a new tool for comparing protein and
nucléotide
séquences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible sur le site
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html, les paramètres utilisés étant ceux
donnés
par défaut (en particulier pour les paramètres open gap penaltie : 5, et
extension
gap penaltie : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM
62
proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences
à
comparer étant calculé directement par le programme.
Par séquence d'acide aminé présentant au moins 80 %, de préférence 85 %,
90 %, 95 % et 98 % d'identité avec une séquences d'acide aminé de référence,
on
préfère celles présentant par rapport à la séquence de référence, certaines
modifications,
en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide
aminé, une
troncation ou un allongement. Dans le cas d'une substitution, d'un ou
plusieurs acide(s)
aminé(s) consécutif(s) ou non consécutif(s), on préfère les substitutions dans
lesquelles
les acides aminés substitués sont remplacés par des acides aminés
équivalents .
L'expression acides aminés équivalents vise ici à désigner tout acide
aminé
susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base
sans
cependant modifier essentiellement les activités biologiques des anticorps
correspondants et telles qu'elles seront définies par la suite, notamment dans
les
exemples.
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Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur
leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se
substituent, soit sur
des résultats d'essais comparatifs d'activité biologique entre les différents
anticorps
susceptibles d'être effectués.
A titre d'exemple non limitatif, le tableau 1 ci-dessous reprend les
possibilités de
substitution susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une
modification
approfondie de l'activité biologique de l'anticorps modifié correspondant, les
substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes
conditions.
Résidu originel Substitution(s)
Ala (A) Val, Gly, Pro
Arg (R) Lys, His
Asn (N) Gln
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (G) Asp
Gly (G) Ala
His (H) Arg
Ile (I) Leu
Leu (L) Ile, Val, Met
Lys (K) Arg
met (M) Leu
Phe (F) Tyr
Pro (P) Ala
Ser (S) Thr, Cys
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Phe, Trp
Val (V) Leu, Ala
Tableau 1
Il est admis par l'homme de l'art, comme état de la technique, que la plus
grande
variabilité (longueur et composition) entre les 6 CDRs se retrouve chez les 3
CDRs de
la chaîne lourde et, plus particulièrement, le CDR-H3 de cette chaîne lourde.
Par
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conséquent, il sera évident que les CDRs caractéristiques préférés de
l'anticorps selon
l'invention seront les 3 CDRs de la chaîne lourde et, encore plus
préférentiellement, le
CDR correspondant au CDR-H3.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention est relative à
un
5 anticorps murin, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels,
selon
l'invention
Selon une autre forme de réalisation de l'invention, ledit premier anticorps,
ou
l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de
séquence
10 SEQ ID No. 1, 2 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%,
95% et
98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 1, 2 et
3 ; et
une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ ID
Nos.
4, 5 et 6, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité
après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 5 et 6.
15 Selon encore une autre forme de réalisation de l'invention, ledit premier
anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend
une
chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat,
respectivement
de séquence SEQ ID No. 59, 60 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence
85%,
90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID
No.
20 59, 60 et 3 ; et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement
de
séquence SEQ ID Nos. 61, 62 et 63, ou présentant au moins 80%, de préférence
85%,
90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID
No.
61, 62 et 63.
Selon encore une autre forme de réalisation, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère de
séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 7 ou présentant au
moins
80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal
avec la
séquence SEQ ID No. 7, et/ou en ce qu'il comprend une chaîne lourde de
séquence
comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 8 ou présentant au moins 80%,
de
préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la
séquence SEQ ID No. 8.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
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SEQ ID No. 7:
DIVLSQSPASLALSLGQRATISCRASASVEYYGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYE
ASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDLAIYFCQQSRKAPYTFGGGTKLE
IK
SEQ ID No. 8:
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYTMSWVRQTPEKRLEWVAYISS
GGGTTYYPDTVKGRFTI SRDNARNTLYLQMNSLKSEDTAMYYCATPRIGTGFA
YWGQGTLVTVSA
Selon une autre forme de réalisation de l'invention, ledit deuxième anticorps,
ou
l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de
séquence
SEQ ID No. 17, 18 et 19, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%,
95% et
98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 17, 18
et 19,
et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ
ID
Nos. 20, 21 et 22, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et
98%
d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 20, 21 et
22.
Selon encore une autre forme de réalisation de l'invention, ledit deuxième
anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend
une
chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat,
respectivement
de séquence SEQ ID No. 69, 70 et 19, ou présentant au moins 80%, de préférence
85%,
90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID
No.
69, 70 et 19, et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de
séquence SEQ ID Nos. 71, 72 et 73, ou présentant au moins 80%, de préférence
85%,
90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID
No.
71, 72 et 73.
Selon encore une autre forme de réalisation, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère de
séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 23 ou présentant au
moins
80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal
avec la
séquence SEQ ID No. 23, et/ou en ce qu'il comprend une chaîne lourde de
séquence
comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 24 ou présentant au moins 80%,
de
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préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la
séquence SEQ ID No. 24.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
SEQ ID No. 23:
DIVMTQSQKFMSTSEGDRVSITCKASQNVGIAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNR
YTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYSSNPTFGAGTKLELK
SEQ ID No. 24:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFTLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYW
DDDKRYNPSLKSRLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARRDHYGDYSY
1o AMDYWGQGTSVTVSS
Selon une autre forme de réalisation de l'invention, ledit troisième
anticorps, ou
l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de
séquence
SEQ ID No. 33, 2 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95%
et
98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 33, 2 et
3 ; et
une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ ID
Nos.
4, 34 et 35, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98%
d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 34 et 35.
Selon encore une autre forme de réalisation de l'invention, ledit troisième
anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend
une
chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat,
respectivement
de séquence SEQ ID No. 79, 60 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence
85%,
90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID
No.
79, 60 et 3 ; et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de
séquence SEQ ID Nos. 61, 80 et 81, ou présentant au moins 80%, de préférence
85%,
90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID
No.
61, 80 et 81.
Selon encore une autre forme de réalisation, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère de
séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 36 ou présentant au
moins
80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal
avec la
séquence SEQ ID No. 36, et/ou en ce qu'il comprend une chaîne lourde de
séquence
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comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 37 ou présentant au moins 80%,
de
préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la
séquence SEQ ID No. 37.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
SEQ ID No. 36:
DIVLTQSPASLALSLGQRATISCRASASVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYE
ASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDLAIYFCQQSRKAPYTFGGGTKLE
IK
SEQ ID No. 37:
1o EVKLVESGGDLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYTMSWVRQTPEKRLEWVAYISS
GGVTTYYPDTIKGRFTI SRDNAKNTLFLQMNSLKSEDTAMYYCT SPRTGTGFAY
WGQGTLVTVSA
Selon une autre forme de réalisation de l'invention, ledit quatrième
anticorps, ou
l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne
légère
comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de
séquence
SEQ ID No. 43, 44 et 45, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%,
95% et
98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 43, 44
et 45 ,
et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ
ID
Nos. 46, 47 et 48, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et
98%
d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 46, 47 et
48.
Selon encore une autre forme de réalisation de l'invention, ledit quatrième
anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend
une
chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat,
respectivement
de séquence SEQ ID No. 85, 86 et 45, ou présentant au moins 80%, de préférence
85%,
90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID
No.
85, 86 et 45 ; et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement
de
séquence SEQ ID Nos. 87, 88 et 89, ou présentant au moins 80%, de préférence
85%,
90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID
No.
87, 88 et 89.
Selon encore une autre forme de réalisation, l'anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne
légère de
séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 49 ou présentant au
moins
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80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal
avec la
séquence SEQ ID No. 49, et/ou en ce qu'il comprend une chaîne lourde de
séquence
comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 50 ou présentant au moins 80%,
de
préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la
séquence SEQ ID No. 50.
Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes
SEQ ID No. 49:
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASN
RYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQTYSFPYTFGGGTKLEIK
1o SEQ ID No. 50:
QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGYTFTSSSMHWAKQRPGQGLEWIGEIHP
NSGNTNNNEKFKGKATLTVDTS SSTAYVDLS SLS SEDSAVYYCARARSFYYAM
DCWGQGTSVTVSS
Comme vu plus haut, l'invention vise également tout composé dérivé d'un
anticorps selon l'invention.
Plus particulièrement, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou
fragments
fonctionnels, selon l'invention est caractérisé en ce que ledit composé dérivé
consiste en
une protéine de liaison comprenant une charpente peptidique sur laquelle est
greffé au
moins un CDR de manière à conserver tout ou partie des propriétés paratopiques
de
reconnaissance de l'anticorps initial.
Une ou plusieurs séquences parmi les séquences des CDRs décrits dans cette
invention peuvent aussi être présentées sur des charpentes (ou scaffold
selon la
nomenclature anglaise) protéiques différentes des immunoglobulines. Dans ce
cas, la
séquence protéique permet de recréer un squelette peptidique favorable au
repliement
du ou des CDRs greffés, lui(leur) permettant de conserver leurs propriétés
paratopiques
de reconnaissance de l'antigène.
De manière générale, l'homme de l'art sait déterminer le type de charpente
protéique sur laquelle greffer au moins l'un des CDRs issu(s) de l'anticorps
originel.
Plus particulièrement, il est connu que, pour être sélectionnées, de telles
charpentes
doivent répondre au plus grand nombre de critères tels qu'énumérés ci-dessous
(Skerra
A., J. Mol. Recogn. 13, 2000, 167-187) :
- bonne conservation phylogénétique ;
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- structure tri-dimensionnelle connue (comme par exemple par
cristallographie, spectroscopie NMR ou toute autre technique connue de
l'homme de l'art) ;
- petite taille ;
5 - peu ou pas de modifications post-transcriptionelle ; et/ou
- facile à produire, à exprimer et à purifier.
L'origine de telles charpentes protéiques peut être, mais n'est pas limitée à
des
structures sélectionnées parmi : la fibronectine et préférentiellement le
10éme domaine
de la fibronectine de type 3, la lipocaline, l'anticaline (Skerra A., J.
Biotechnol., 2001,
10 74(4) :25 7-75), la protéine Z issue du domaine B de la protéine A de
Staphylococcus
aureus, la thioredoxin A ou encore les protéines à motifs répétés de type
"ankyrin
repeat" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol.100, No. 4, 1700-1705), "armadillo
repeat",
"leucine-rich repeat" ou "tetratricopeptide repeat".
Peuvent également être mentionnées les charpentes dérivées de toxines comme,
15 par exemple les toxines suivantes issues de scorpions, insectes, plantes,
mollusques, ...)
ou les inhibiteurs protéiques de la NO synthase neuronale (PIN).
Comme exemple, aucunement limitatif, de telles constructions hybrides, il peut
être cité
l'insertion du CDR-H1 (chaîne lourde) d'un anticorps anti-CD4, à savoir le
13B8.2, sur
l'une des boucles de PIN, la nouvelle protéine de liaison ainsi obtenue
conservant les
20 mêmes propriétés de liaison que l'anticorps d'origine (Bes et al., BBRC
343, 2006, 334-
344). Peut également être mentionné à titre illustratif la greffe du CDR-H3
(chaîne
lourde) d'un anticorps VHH anti-lyzozyme sur l'une des boucles de la
neocarzinostatine
(Nicaise et al., 2004).
Enfin, comme décrit plus haut, de telles charpentes peptidiques peuvent
25 comprendre de 1 à 6 CDR(s) issu(s) de l'anticorps d'origine. De manière
préférée, mais
sans aucune obligation, l'homme de l'art sélectionnera au moins un CDR issu de
la
chaîne lourde, cette dernière étant connue pour être principalement
responsable de la
spécificité de l'anticorps. La sélection du ou des CDR(s) pertinent(s) est
évidente pour
l'homme de l'art, ce dernier mettant alors en oeuvre des techniques connues
(Bes et al.,
FEBS letters 508, 2001 67-74).
Bien évidemment, ces exemples ne sont aucunement limitatifs, et toute autre
structure connue ou évidente pour l'homme de l'art doit être considérée comme
faisant
partie de la protection conférée par la présente demande de brevet.
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La présente invention a donc pour objet un anticorps, ou l'un de ses composés
dérivés ou fragments fonctionnels caractérisé en ce que la charpente
peptidique est
sélectionnée parmi les protéines a) phylogénétiquement bien conservée,
b) d'architecture robuste, c) avec une organisation moléculaire en trois
dimensions bien
connues, d) de petite taille et/ou e) comprenant des régions pouvant être
modifiées par
délétion et/ou insertion sans modifications des propriétés de stabilité.
Selon une forme de réalisation préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention est caractérisé en ce que
ladite
charpente peptidique est sélectionnée parmi i) les charpentes issues de la
fibronectine,
préférentiellement le 10éme domaine de la fibronectine de type 3, la
lipocaline,
l'anticaline, la protéine Z issue du domaine B de la protéine A de
Staphylococcus
aureus, la thioredoxin A, ii) les protéines à motifs répétés de type "ankyrin
repeat",
"armadillo repeat", "leucine-rich repeat" ou "tetratricopeptide repeat", ou
encore iii) les
inhibiteurs protéiques de la NO synthase neuronale (PIN).
Selon un autre aspect de l'invention, il est également fait mention des
fragments
fonctionnels de l'anticorps décrit plus haut.
Plus particulièrement, l'invention vise un anticorps, ou l'un de ses composés
dérivés ou fragments fonctionnels, l'invention caractérisé en ce que ledit
fragment
fonctionnel est choisi parmi les fragments Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-
Fc et les
diabodies, ou tout fragment dont la demie-vie aurait été augmentée comme des
fragments pégylés.
De tels fragments fonctionnels d'anticorps selon l'invention consistent, par
exemple, en des fragments Fv, scFv (se pour simple chaîne), Fab, F(ab')2,
Fab', scFv-Fc
ou diabodies, ou tout fragment dont la durée de demie-vie aurait été augmentée
par
modification chimique, comme l'ajout de poly(alkylène) glycol tel que le
poly(éthylène)glycol ("PEGylation") (fragments PEGylés appelés Fv-PEG, scFv-
PEG,
Fab-PEG, F(ab')2-PEG ou Fab'-PEG) ( PEG d'après la nomenclature anglaise
Poly(Ethylene) Glycol), ou par incorporation dans un liposome, microsphères ou
PLGA, lesdits fragments présentant au moins un des CDRs caractéristiques selon
l'invention, et, notamment, en ce qu'il est capable d'exercer de manière
générale une
activité même partielle de l'anticorps dont il est issu.
De préférence, lesdits fragments fonctionnels seront constitués ou
comprendront
une séquence partielle de la chaîne variable lourde ou légère de l'anticorps
dont ils sont
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dérivés, ladite séquence partielle étant suffisante pour retenir la même
spécificité de
liaison que l'anticorps dont elle est issue et une affinité suffisante, de
préférence au
moins égale à 1/100, de manière plus préférée à au moins 1/10 de celle de
l'anticorps
dont elle est issue.
Un tel fragment fonctionnel comportera au minimum 5 acides aminés, de
préférence 10, 15, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence de
l'anticorps
dont il est issu.
De préférence, ces fragments fonctionnels seront des fragments de type Fv,
scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc ou diabodies, qui possèdent généralement
la même
spécificité de fixation que l'anticorps dont ils sont issus. Selon la présente
invention,
des fragments d'anticorps de l'invention peuvent être obtenus à partir des
anticorps tels
que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des
enzymes,
comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par
réduction
chimique. D'une autre manière les fragments d'anticorps compris dans la
présente
invention peuvent être obtenus par des techniques de recombinaisons génétiques
bien
connues également de l'homme de l'art ou encore par synthèse peptidique au
moyen par
exemple de synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la
société
Applied Biosystems, etc..
Sous un aspect également particulier, la présente invention est relative à un
anticorps chimérique, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments
fonctionnels, selon
l'invention, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend en outre les
régions
constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps d'une
espèce
hétérologue à la souris, notamment de l'Homme.
Selon encore un autre aspect de l'invention, l'anticorps humanisé, ou l'un de
ses
composés dérivés ou fragments fonctionnels, est caractérisé en ce que les
régions
constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps humain
sont
respectivement la région lambda ou kappa et gamma-1, gamma-2 ou gamma-4.
Selon un autre aspect, l'invention est relative à un premier hybridome murin
capable de sécréter un anticorps monoclonal selon la présente invention,
notamment
l'hybridome d'origine murine tel que déposé au Centre National de Culture de
Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 22 février 2008
sous le
numéro I-3920. Ledit hybridome a été obtenu par fusion de splénocytes de
souris
immunisées Balb/c et de lignées cellulaires de myélome Sp 20 Ag 14.
L'anticorps
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monoclonal dénommé ici 203B6, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments
fonctionnels est sécrété par ledit hybridome déposé à la CNCM le 22 février
2008 sous
le numéro I-3920.
Selon un autre aspect, l'invention est relative à un deuxième hybridome murin
capable de sécréter un anticorps monoclonal selon la présente invention,
notamment
l'hybridome d'origine murine tel que déposé au Centre National de Culture de
Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 22 février 2008
sous le
numéro I-3921. Ledit hybridome a été obtenu par fusion de splénocytes de
souris
immunisées Balb/c et de lignées cellulaires de myélome Sp 20 Ag 14.
L'anticorps
monoclonal dénommé ici 205H8, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments
fonctionnels est sécrété par ledit hybridome déposé à la CNCM le 22 février
2008 sous
le numéro I-3921.
Selon un autre aspect, l'invention est relative à un troisième hybridome murin
capable de sécréter un anticorps monoclonal selon la présente invention,
notamment
l'hybridome d'origine murine tel que déposé au Centre National de Culture de
Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 21 février 2008
sous le
numéro I-3918. Ledit hybridome a été obtenu par fusion de splénocytes de
souris
immunisées Balb/c et de lignées cellulaires de myélome Sp 20 Ag 14.
L'anticorps
monoclonal dénommé ici 211F3, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments
fonctionnels est sécrété par ledit hybridome déposé à la CNCM le 21 février
2008 sous
le numéro I-3918.
Enfin, selon un autre aspect, l'invention est relative à un quatrième
hybridome
murin capable de sécréter un anticorps monoclonal selon la présente invention,
notamment l'hybridome d'origine murine tel que déposé au Centre National de
Culture
de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 21 février 2008
sous le
numéro I-3919. Ledit hybridome a été obtenu par fusion de splénocytes de
souris
immunisées Balb/c et de lignées cellulaires de myélome Sp 20 Ag 14.
L'anticorps
monoclonal dénommé ici 214B2, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments
fonctionnels est sécrété par ledit hybridome déposé à la CNCM le 21 février
2008 sous
le numéro I-3919.
Pour plus de clarté, le tableau 2 ci dessous regroupe les différentes
séquences en
acides aminés correspondant aux différents anticorps selon l'invention avec
les
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séquences de CDR définies selon IMGT en gras et celles définies selon Kabat en
italique.
203B6 205H8 211F3 214B2
(I-3920) (I-3921) (I-3918) (I-3919)
CDR-L1 1 59 17 69 33 79 43 85
CDR-L2 2 60 18 70 2 60 44 86
CDR-L3 3 3 19 19 3 3 45 45
Light Chain 7 23 36 49
CDR-H 1 4 61 20 71 4 61 46 87
CDR-H2 5 62 21 72 34 80 47 88
CDR-H3 6 63 22 73 35 81 48 89
Heavy Chain 8 24 37 50
Tableau 2
Sont également compris par anticorps selon la présente invention, les
anticorps
chimériques ou humanisés.
Par anticorps chimérique, on entend désigner un anticorps qui contient une
région variable (chaîne légère et chaîne lourde) naturelle dérivée d'un
anticorps d'une
espèce donnée en association avec les régions constantes de chaîne légère et
chaîne
lourde d'un anticorps d'une espèce hétérologue à ladite espèce donnée.
Les anticorps ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent
être préparés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par
exemple,
l'anticorps chimérique pourra être réalisé en clonant un ADN recombinant
comportant
un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps
monoclonal
non humain, notamment murin, selon l'invention et une séquence codant pour la
région
constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par
un tel
gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de
cet
anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN murin et
son isotype
déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Pour les méthodes
de
préparation d'anticorps chimériques, on pourra par exemple se référer au
document
Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988).
Par anticorps humanisés, on entend désigner un anticorps qui contient des
régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties
de la
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molécule d'anticorps étant dérivée d'un (ou de plusieurs) anticorps humains.
En outre,
certains des résidus des segments du squelette (dénommés FR) peuvent être
modifiés
pour conserver l'affinité de liaison (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986
; Verhoeyen
et al., Science, 239:1534-1536, 1988 ; Riechmann et al., Nature, 332:323-327,
1988).
5 Les anticorps humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être
préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (comme par exemple
celles
décrites dans les documents Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992 ;
Mountain et
al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992 ; ou Bebbington et al.,
Bio/Technology, 10:169-175, 1992). De tels anticorps humanisés selon
l'invention sont
10 préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vitro, ou
de traitement
prophylactique et/ou thérapeutique in vivo. D'autres techniques d'humanisation
sont
également connues de l'homme de l'art comme par exemple la technique du CDR
Grafting décrite par PDL faisant l'objet des brevets EP 0 451 261, EP 0 682
040, EP 0
939 127, EP 0 566 647 ou encore US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 et US
15 5,693,761. On peut également citer les brevets US 5,639,641 ou encore
6,054,297,
5,886,152 et 5,877,293.
En outre, l'invention vise également les anticorps humanisés issus des
anticorps
murins décrit ci-dessus.
De manière préférée, les régions constantes de chaîne légère et de chaîne
lourde
20 dérivées d'un anticorps humain sont respectivement la région lambda ou
kappa et
gamma-1, gamma-2 ou gamma-4
Dans la forme d'exécution correspondant à l'isotype IgGi, une caractéristique
supplémentaire de l'anticorps est de présenter des fonctions effectrices comme
1'ADCC
(d'après la nomenclature anglaise Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity )
et/ou
25 la CDC (d'après la nomenclature anglaise Complement Dependent
Cytotoxicity ).
En outre, comme cela ressortira des exemples ci-après, l'anticorps objet de la
présente invention se caractérise des anticorps connus à ce jour en ce sens
qu'il est
capable d'inhiber la prolifération des cellules tumorales.
Comme cela a été dit plus haut, la protéine CD 151 fait partie de la famille
des
30 tétraspanines et, à ce titre, comprend 2 domaines extracellulaires EC1 (18
acides
aminés, séquence [40-57]) et EC2 (109 acides aminés, séquence [113-221]),
appelés
aussi boucles extracellulaires.
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Selon la présente invention, les anticorps utilisés sont capables de se lier à
au
moins un épitope situé dans le domaine extracellulaire. De manière préférée,
ledit
anticorps se fixera au niveau des boucles EC1 et/ou EC2.
Plus particulièrement, selon une forme d'exécution préférée de l'invention, il
est
décrit l'utilisation d'au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses
fragments
fonctionnels, capable de se lier à un épitope compris dans la boucle extra-
cellulaire 1
(EC1) et/ou 2 (EC2), préférentiellement EC2, correspondant respectivement aux
acides-
aminés 40-57 et 113-221 de la protéine CD151.
La boucle EC1 [40-57] comprend 18 acides-aminés et présente une masse
théorique de 2002,2 Da.
La boucle EC2 [113-221] possède un site de N-glycosylation (résidu Asn159) et
6 résidus Cystéine formant 3 ponts disulfure. Un modèle structural de la
boucle EC2 des
tétraspanines, et notamment de CD151, a été proposé à partir de la structure
tridimensionnelle de la boucle EC2 de la tétraspanine CD81 (Seigneuret et al.,
2001, J.
Biol. Chem. 276, 40055-40064). Selon ce modèle, les tétraspanines possèdent
une
charpente commune, relativement conservée et constituée de 3 hélices a, et un
domaine
spécifique variable. Pour CD151, cette charpente serait constituée des régions
[113-157]
et [209-221], et le domaine variable de la région [158-208].
Le domaine variable de la boucle EC2 serait plus particulièrement impliqué
dans
les interactions spécifiques de CD151 avec des protéines de la famille des
intégrines.
Des expériences de mutagénèse dirigée ont notamment montré l'importance de la
région
[193-208], et plus précisément du tripeptide QRD [194-196] et du résidu
Cystéine en
position 192, dans l'association de CD151 avec certaines intégrines récepteurs
de la
laminine, telles que les intégrines a3131 ou (x6134 (Kazarov et al., 2002, J.
Cell Biol.
158, 1299-1309).
De manière encore plus préférée, la présente invention vise l'utilisation d'au
moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable
de se
lier à un épitope de la région EC2.
Sous un nouvel aspect, la présente invention est relative à un acide nucléique
isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants
:
a) un acide nucléique, ADN ou ARN, codant pour un anticorps, ou l'un de
ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, tel que défini plus haut ;
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b) un acide nucléique complémentaire d'un acide nucléique tel que défini
ci-dessus en a),
c) un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides capable d'hybrider dans
des conditions de forte stringence avec au moins l'une des séquences d'acide
nucléique
SEQ ID No. 9-16, 25-32, 38-42, 51-58, 64-68, 74-78, 82-84 ou 90-94 ou avec une
séquence présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 %,
d'identité
après alignement optimal avec lesdites séquences.
Le tableau 3 ci-dessous regroupe les différents séquences nucléotidiques
concernant les anticorps selon l'invention avec les séquences de CDR définies
selon
IMGT en gras et celles définies selon Kabat en italique.
203B6 205H8 211F3 214B2
(I-3920) (1-3921) (I-3918) (1-3919)
CDR-L1 9 64 25 74 38 82 51 90
CDR-L2 10 65 26 75 10 65 52 91
CDR-L3 11 11 27 27 11 11 53 53
Light Chain 15 31 41 57
CDR-H 1 12 66 28 76 12 66 54 92
CDR-H2 13 67 29 77 39 83 55 93
CDR-H3 14 68 30 78 40 84 56 94
Hea Chain 16 32 42 58
Tableau 3
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide,
oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes
qui seront
employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un
enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un
fragment
ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non
naturels, et
pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que
des
produits de transcription desdits ADNs.
Il doit être aussi compris ici que la présente invention ne concerne pas les
séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-
à-dire
à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées,
c'est-à-dire
qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par
copie, leur
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environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi
également
désigner ici les acides nucléiques isolés obtenus par recombinaison génétique
au moyen
par exemple de cellules hôtes ou obtenus par synthèse chimique.
Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %,
de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 %, après alignement optimal avec une
séquence
de préférence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par
rapport à la
séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier
une
délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique et/ou une
substitution,
notamment ponctuelle. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences
codent
pour les mêmes séquences d'acide aminés que la séquence de référence, ceci lié
à la
dégénérescence du code génétique, ou de séquences complémentaires qui sont
susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences de référence de
préférence
dans des conditions de forte stringence notamment telles que définies ci-
après.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les
conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière
qu'elles
permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN
complémentaires.
A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape
d'hybridation aux fins de
définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont
avantageusement les
suivantes.
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1)
préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 MM, pH 7,5)
contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaC1 + 0,015 M
citrate
de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x
Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2)
hybridation
proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de
la sonde
(i.e. : 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages
de 20
minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1 x
SSC +
0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30
minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions
d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de
taille
définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides
de taille
plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., (1989,
Molecular
cloning : a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).
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L'invention est également relative à un vecteur comprenant un acide nucléique
selon la présente invention.
L'invention vise notamment les vecteurs de clonage et/ou d'expression qui
contiennent une séquence nucléotidique selon l'invention.
Les vecteurs selon l'invention comportent de préférence des éléments qui
permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques dans
une cellule
hôte déterminée. Le vecteur doit alors comporter un promoteur, des signaux
d'initiation
et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de
régulation de la
transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule
hôte et peut
éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion
de la
protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par
l'homme du
métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences
nucléotidiques
selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication
autonome au sein
de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par
l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un
hôte approprié
par des méthodes standards, telle que la lipofection, l'électroporation, le
choc
thermique, ou des méthodes chimiques.
Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine
plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes
afin de cloner
ou d'exprimer les séquences nucléotidiques selon l'invention.
L'invention comprend également les cellules hôtes transformées par ou
comprenant un vecteur selon l'invention.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou
eucaryotes,
par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou
les
cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut
également utiliser
des cellules d'insectes ou des cellules de plantes.
L'invention concerne également les animaux, excepté l'Homme, qui
comprennent une cellule transformée selon l'invention.
Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de production d'un
anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels selon l'invention,
caractérisé en ce qu'il
comprend les étapes suivantes :
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a) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d'une cellule
hôte selon
l'invention ; et
b) la récupération desdits anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels,
ainsi
produits à partir du milieu de culture ou desdites cellules cultivées.
5 Les cellules transformées selon l'invention sont utilisables dans des
procédés de
préparation de polypeptides recombinants selon l'invention. Les procédés de
préparation d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante,
caractérisés en
ce qu'ils mettent en oeuvre un vecteur et/ou une cellule transformée par un
vecteur selon
l'invention sont eux-mêmes compris dans la présente invention. De préférence,
on
10 cultive une cellule transformée par un vecteur selon l'invention dans des
conditions qui
permettent l'expression dudit polypeptide et on récupère ledit peptide
recombinant.
Ainsi qu'il a été dit, l'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes
procaryotes ou eucaryotes. En particulier, il est possible d'identifier des
séquences
nucléotidiques selon l'invention, facilitant la sécrétion dans un tel système
procaryote
15 ou eucaryote. Un vecteur selon l'invention portant une telle séquence peut
donc être
avantageusement utilisé pour la production de protéines recombinantes,
destinées à être
sécrétées. En effet, la purification de ces protéines recombinantes d'intérêt
sera facilitée
par le fait qu'elles sont présentes dans le surnageant de la culture
cellulaire plutôt qu'à
l'intérieur des cellules hôtes.
20 On peut également préparer les polypeptides selon l'invention par synthèse
chimique. Un tel procédé de préparation est également un objet de l'invention.
L'homme du métier connaît les procédés de synthèse chimique, par exemple les
techniques mettant en oeuvre des phases solides (voir notamment Steward et
al., 1984,
Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2ème éd.,
25 (1984)) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par
condensation de
fragments ou par une synthèse en solution classique. Les polypeptides obtenus
par
synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels
correspondants
sont également compris dans l'invention.
Les anticorps, ou l'un de leurs composés dérivés ou fragments fonctionnels,
30 susceptibles d'être obtenus par un procédé selon l'invention sont également
compris
dans la présente invention.
Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne un anticorps tel
que
décrit plus haut, caractérisé en ce qu'il est, en outre, bispécifique, c'est-à-
dire capable
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de se lier spécifiquement sur une protéine humaine ou un récepteur humain
autre que
CD151.
Les anticorps bispécifiques ou bifonctionnels constituent une seconde
génération
d'anticorps monoclonaux dans lesquelles deux régions variables différentes
sont
combinées dans la même molécule (Hollinger and Bohlen 1999 Cancer and
metastasis
rev. 18 : 411-419). Leur utilité a été mise en évidence tant dans le domaine
du
diagnostic que dans le domaine de la thérapie de part leur capacité à recruter
de
nouvelles fonctions effectrices ou à cibler plusieurs molécules à la surface
de cellules
tumorales. Ces anticorps peuvent être obtenus par des méthodes chimiques
(Glennie MJ
et al. 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375 ; Repp R. et al. 1995 J. Hemat. 377-
382) ou
somatiques (Staerz U.D. and Bevan M.J. 1986 PNAS 83, 1453-1457 ; Suresh M.R.
et
al. 1986 Method Enzymol. 121 : 210-228) mais également et préférentiellement
par des
techniques d'ingénierie génétique qui permettent de forcer
l'héterodimérisation et
facilitent ainsi le procédé de purification de l'anticorps recherché (Merchand
et al.
1998 Nature Biotech. 16 : 677-681).
Ces anticorps bispécifiques peuvent être construits comme des IgG entières,
comme des Fab'2 bispécifiques, comme des Fab'PEG ou comme des diabodies ou
encore comme des scFv bispécifiques mais également comme un anticorps
bispécifique
tétravalent où deux sites de fixation sont présents pour chaque antigène ciblé
(Park et al.
2000 Mol. Immunol. 37(18) : 1123-30) ou ses fragments comme décrit plus haut.
Outre un avantage économique du fait que la production et l'administration
d'un
anticorps bispécifique soit moins onéreuse que le production de deux anticorps
spécifiques, l'utilisation de tels anticorps bispécifiques a pour avantage de
réduire la
toxicité du traitement. En effet, l'utilisation d'un anticorps bispécifique
permet de
diminuer la quantité globale d'anticorps circulants et, par suite, la toxicité
éventuelle.
Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, l'anticorps
bispécifique
est un anticorps bivalent ou tétravalent.
Enfin, la présente invention vise l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés
ou
fragments fonctionnels, tel que décrit plus haut à titre de médicament.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à
titre de principe actif un composé consistant en un anticorps, ou l'un de ses
composés
dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention. De préférence, ledit
anticorps est
additionné d'un excipient et/ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
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Selon encore une autre forme d'exécution, la présente invention concerne
également une composition pharmaceutique telle que décrite plus haut qui
comprend, en
outre, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée
ou étalée
dans le temps, au moins un autre anticorps, un agent cytotoxique/cytostatique,
une
toxine cellulaire ou un radioélément.
On entend par "utilisation simultanée", l'administration des deux composés de
la
composition selon l'invention compris dans une seule et même forme
pharmaceutique.
On entend par "utilisation séparée", l'administration, en même temps, des deux
composés de la composition selon l'invention, compris dans des formes
pharmaceutiques distinctes.
On entend par "utilisation étalée dans le temps", l'administration successive
des
deux composés de la composition selon l'invention, compris chacun dans une
forme
pharmaceutique distincte.
D'une façon générale, la composition selon l'invention augmente
considérablement l'efficacité du traitement du cancer. En d'autres termes,
l'effet
thérapeutique de l'anticorps selon l'invention est potentialisé de manière
inattendue par
l'administration d'un agent cytotoxique. Un autre avantage subséquent majeur
produit
par une composition selon l'invention, concerne la possibilité d'utiliser des
doses
efficaces en principe actif plus faibles, ce qui permet d'éviter ou de réduire
les risques
d'apparition des effets secondaires, en particulier l'effet de l'agent
cytotoxique. De plus,
cette composition selon l'invention permettrait d'atteindre l'effet
thérapeutique escompté
plus rapidement.
Par agents thérapeutiques anti-cancer ou agents cytotoxiques , il faut
comprendre une substance qui, lorsqu'elle est administrée à un patient, traite
ou
prévient le développement du cancer chez le patient. A titre d'exemple non
limitatif
pour de tels agents, il peut être mentionné les agents alkylant , les
antimétabolites,
les antibiotiques anti-tumoraux, les inhibiteurs mitotiques, les inhibiteurs
de fonction
chromatine, les agents anti-angiogénèse, les anti-oestrogène, les anti-
androgène ou les
immuno-modulateurs.
De tels agents sont, par exemple, cités dans le VIDAL, à la page consacrée
aux composés attachés à la cancérologie et l'hématologie colonne
Cytotoxiques , ces
composés cytotoxiques cités par référence à ce document sont cités ici comme
agents
cytotoxiques préférés.
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Les agents alkylants font référence à toute substance qui peut se coupler
de manière covalente ou alkyler toute molécule, préférentiellement un acide
nucléique
(ex. : ADN), au sein d'une cellule. Comme exemples de tels agents alkylants,
il peut
être cité les moutardes à l'azote comme la méchloréthamine, le chlorambucil,
le
melphalan, le chlorhydrate, le pipobroman, la prednimustine, le phosphate
disodique ou
l'estramustine ; les oxazaphosphorines comme la cyclophosphamide, l'
altretamine, la
trofosfamide, la sulfofosfamide ou l'ifosfamide ; les aziridines ou ethylènes-
imines
comme le thiotepa, la triéthylèneamine ou l'altétramine ; les nitrosourées
comme la
carmustine, la streptozocine, la fotémustine ou la lomustine ; les sulfonates
d'alkyle
comme le busulfan, le tréosulfan ou l'improsulfan ; les triazènes comme la
dacarbazine ; ou encore les complexes du platine comme le cisplatine,
l'oxaliplatine ou
le carboplatine.
Les antimétabolites font référence à des substances qui bloquent la
croissance et/ou le métabolisme cellulaire en interférant avec certaines
activités,
généralement la synthèse d'ADN. A titre d'exemple d'antimétabolite, il peut
être
mentionné les methotrexate, 5-fluorouracile, floxuridine, 5-
fluorodeoxyuridine,
capecitabine, cytarabine, fludarabine, cytosine arabinoside, 6-mercaptopurine
(6-MP),
6-thioguanine (6-TG), chlorodésoxyadénosine, 5-azacytidine, gemcitabine,
cladribine,
deoxycoformycine et la pentostatine.
Les antibiotiques anti-tumoraux font référence aux composés qui peuvent
prévenir ou inhiber la synthèse d'ADN, d'ARN et/ou de protéines. Des exemples
de tels
antibiotiques anti-tumoraux comprennent la doxorubicine, daunorubicine,
idarubicine
valrubicine, mitoxantrone, dactinomycine, mithramycine, plicamycine,
mitomycine C,
bleomycine, et la procarbazine.
Les inhibiteurs mitotiques préviennent la progression normale du cycle
cellulaire et de la mitose. En general, les inhibiteurs des microtubules ou
taxoides
comme le paclitaxel et le docétaxel sont capables d'inhiber la mitose. Les
alcaloîdes de
vinca, comme la vinblsatine, la vincristine, la vindésine et la vinorelbine
sont également
capables d'inhiber la mitose.
Les inhibiteurs de fonction chromatine ou inhibiteurs de topo-
isomérases font référence à des substances qui inhibent la fonction normale
des
protéines modélant la chromatine comme les topo-isomérases I et II. Des
exemples de
tels inhibiteurs comprennent, pour la topo-isomérase I, la camptothécine ainsi
que ses
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dérivés comme l'irinotécan ou le topotécan et, pour la topo-isomérase II,
l'étoposide, le
phosphate d'étiposide et le téniposide.
Les agents anti-angiogénése font références à toute drogue, composé,
substance ou agent qui inhibe la croissance des vaisseaux sanguins. Des
exemples
d'agents anti-angiogénèse comprennent, sans aucune limitation, les razoxin,
marimastat,
batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginone, COL-
3,
neovastat, BMS-275291, thalidomide, CDC 501, DMXAA, L-651582, squalamine,
endostatine, SU5416, SU6668, interferon-alpha, EMD121974, interleukine-12,
IM862,
angiostatine et la vitaxine.
Les anti-oestrogène ou agents anti-oestrogénique font référence à
toute substance qui diminue, antagonise ou inhibe l'action des oestrogènes.
Des
exemples de tels agents sont les tamoxiféne, toremifène, raloxiféne,
droloxiféne,
iodoxyfène, anastrozole, letrozole, et l'exemestane.
Les anti-androgènes ou agents anti-androgène font référence à toute
substance qui réduit, antagonise ou inhibe l'action d'un androgène. Des
exemples
d'anti-androgènes sont les flutamide, nilutamide, bicalutamide,
sprironolactone,
cyproterone acetate, finasteride et la cimitidine.
Les immunomodulateurs sont des substances qui stimulent le système
immunitaire. Des exemples de tels immunomodulateurs comprennent les
interférons, les
interleukines comme l'aldesleukine, OCT-43, denileukin diflitox ou
l'interleukine-2, les
facteurs de nécrose tumorale comme la tasonermine, ou d'autres types
d'immunomodulateurs comme le lentinan, le sizofiran, le roquinimex, le
pidotimod, la
pégadémase, la thymopentine, le poly I :C, ou le levamisole en combinaison
avec le 5-
fluorouracil.
Pour plus de détails, l'homme de l'art pourra se reporter au manuel édité par
l'Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique intitulé
traité de
chimie thérapeutique, Vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans le
traitement des cancers, édition TEC & DOC, 2003 .
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition comme
produit de combinaison selon l'invention est caractérisée en ce que ledit
agent
cytotoxique est couplé chimiquement audit anticorps pour une utilisation
simultanée.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition selon
l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique/cytostatique
est choisi
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parmi les agents inhibiteurs ou stabilisateurs du fuseau, de préférence la
vinorelbine
et/ou la vinflunine et/ou la vincristine.
Afin de faciliter le couplage entre ledit agent cytotoxique et ledit anticorps
selon
l'invention, on pourra notamment introduire des molécules espaceurs entre les
deux
5 composés à coupler, telles que des poly(alkylènes)glycols comme le
polyéthylèneglycol, ou encore des acides aminés, ou, dans un autre mode de
réalisation,
utiliser des dérivés actifs desdits agents cytotoxiques dans lesquels auront
été
introduites des fonctions capables de réagir avec ledit anticorps selon
l'invention. Ces
techniques de couplage sont bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas
10 développées dans la présente description.
L'invention est, sous un autre aspect, relative à une composition caractérisée
en
ce que l'un, au moins, desdits anticorps, ou l'un de leur composé dérivé ou
fragment
fonctionnel, est conjugué avec une toxine cellulaire et/ou un radioélément
De préférence, ladite toxine ou ledit radioélément est capable d'empêcher la
15 croissance ou la prolifération de la cellule tumorale, notamment
d'inactiver totalement
ladite cellule tumorale.
De préférence encore, ladite toxine est une toxine d'entérobactéries,
notamment
l'exotoxine A de Pseudomonas.
Les radioéléments (ou radio-isotopes) préférentiellement conjugués à
l'anticorps
20 employés en thérapie sont des radio-isotopes qui émettent des rayons gamma
et
préférentiellement l'iodine131, l'yttrium90, l'or'99, le palladiumioo, le
cuivre67, le
bismuth217 et l'antimony211. Les radio-isotopes qui émettent des rayons beta
et alpha
peuvent également être utilisés en thérapie.
Par toxine ou radioélément conjugué à au moins un anticorps, ou l'un de leur
25 fragment fonctionnel, selon l'invention, on entend désigner tout moyen
permettant de
lier ladite toxine ou ledit radioélément audit au moins un anticorps,
notamment par
couplage covalent entre les deux composés, avec ou sans introduction de
molécule de
liaison.
Parmi les agents permettant une liaison chimique (covalente), électrostatique
ou
30 non covalente de tout ou partie des éléments du conjugué, il peut être
mentionné tout
particulièrement le benzoquinone, le carbodiimide et plus particulièrement
l'EDC (1-
ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]-carbodiimide hydrochloride), le dimaleimide,
l'acide
dithiobis-nitrobenzoic (DTNB), le N-succinimidyl S-acetyl thio-acetate
(SATA),les
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agents dits de bridging présentant un ou plusieurs groupements, ayant un
ou
plusieuyrs groupements phenylaside, réagissant avec les ultraviolets (U.V.) et
tout
préférentiellement le N-[-4-(azidosalicylamino)butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)-
propionamide (APDP), le N-succinimid-yl 3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP)
et le
6-hydrazino-nicotinamide (HYNIC).
Une autre forme de couplage, tout spécialement pour les radioéléments, peut
consister en l'utilisation d'un chélateur d'ions bifonctionnel.
Parmi ces chélateurs, il est possible de mentionner les chélates dérivés de
l'EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ou du DTPA
(diethylenetriaminepentaacetic
acid) qui ont été développés pour lier des métaux, particulièrement des métaux
radioactifs, et des immunoglobulines. Ainsi, le DTPA et ses dérivés peut être
substitué
par différents groupements sur le chaîne de carbones de manière à augmenter la
stabilité
et la rigidité du complexe ligand-métal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et
al. (1991);
Gansow (1991); US patent 4 831 175).
Par exemple, le DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) et ses dérivés, qui
a
été très largement utilisé en médecine et en biologie pendant longtemps soit
sous sa
forme libre, soit sous la forme d'un complexe avec un ion métallique, présente
la
caractéristique remarquable de former des chélates stables avec des ions
métalliques et
d'être couplé à des protéines d'intérêt thérapeutique ou diagnostique comme
des
anticorps pour le développement de radio-immunoconjugués en thérapie du cancer
(Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990)).
De préférence également, ledit au moins un anticorps formant ledit conjugué
selon l'invention est choisi parmi ses fragments fonctionnels, notamment les
fragments
amputés de leur composante Fc tels que les fragments scFv.
La présente invention comprend en outre l'utilisation de la composition selon
l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au
traitement du cancer.
La présente invention est relative également à l'utilisation d'un anticorps,
ou
l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, de préférence
humanisé, et/ou
d'une composition selon l'invention pour la préparation d'un médicament
destiné à
inhiber la prolifération de cellules tumorales. De manière générale, la
présente invention
a pour objet l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou
fragments
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fonctionnels, de préférence humanisé, et/ou d'une composition selon
l'invention, pour
la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de
cancer
Parmi les cancers qui peuvent être prévenus et/ou traités, on préfère le
cancer de
la prostate, les ostéosarcomes, le cancer du poumon, le cancer du sein, le
cancer de
l'endomètre, le cancer du côlon, le myélome multiple ou le cancer des ovaires,
le cancer
du pancréas ou tout autre cancer.
De manière préférée, ledit cancer est un cancer choisi parmi le cancer de la
prostate, le cancer du poumon, le cancer du colon et/ou le cancer du pancréas.
Sous encore un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation
e l'anticorps
selon l'invention dans une méthode de diagnostic, de préférence in vitro, de
maladies
liées à un taux d'expression de CD151. Plus particulièrement, l'invention vise
une
méthode de diagnostic in vitro de maladies présentant une sur-expression ou
une sous-
expression de la protéine CD151 à partir d'un échantillon biologique dont on
suspecte
la présence anormale en protéine CD 151, ladite méthode consistant à mettre en
contact
ledit échantillon biologique avec un anticorps selon l'invention, ledit
anticorps pouvant
être le cas échéant marqué.
De préférence, lesdites maladies liées à la protéine CD 151 dans ladite
méthode
de diagnostic seront des cancers.
Ledit anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, peut se présenter sous
forme d'immunoconjugué ou d'anticorps marqué afin d'obtenir un signal
détectable
et/ou quantifiable.
Les anticorps marqués selon l'invention ou leurs fragments fonctionnels
incluent
par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par
exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline,
1'a-D-
galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique,
l'acétyl-
cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate
déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-
bromo-
désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux
anticorps ou leurs fragments fonctionnels selon l'invention et incluent
notamment la
fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la
GFP (GFP
pour Green Fluorescent Protein ), le dansyl, 1'umbelliférone etc... Dans de
tels
conjugués, les anticorps de l'invention ou leurs fragments fonctionnels
peuvent être
préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être
couplés aux
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enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un
groupe
espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le
glutaraldéhyde,
l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide
diéthylènetriaminepentaacétique
(DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que ceux mentionnés plus haut
pour
les conjugués thérapeutiques. Les conjugués comportant des marqueurs de type
fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.
D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs
chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes, des marqueurs
bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine, ou encore des
marqueurs
radioactifs tels que l'iodine123, l'iodine125, l'iodine126, l'iodine133, le
bromine77, le
technetium99m, l'indium", l'indium' 13m, le gallium67, le gallium68, le
ruthenium95, le
ruthenium97 le ruthenium103 le ruthenium' 5 le mercure 107 le mercure203 le
rhenium99m, le rhenium' ', le rhenium105, le scandium47, le tellurium121m, le
tellurium122m le tellurium125m le thulium165 le thulium167 le thulium168 la
fluorine'8,
l'yttrium'99, l'iodine131 Les procédés connus de l'homme de l'art existant
pour coupler
les radio-isotopes aux anticorps, soit directement, soit via un agent
chélateur comme
1'EDTA ou le DTPA mentionné plus haut, peuvent être utilisés pour les
radioéléments
en diagnostic. Il est donc également possible de mentionner le marquage au
[I125]Na par
la technique de la chloramine T [Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature
194:495] ou également avec le technetium99m par la technique de Crockford et
al. (US
patent 4 424 200) ou fixé via le DTPA comme décrit par Hnatowich (US patent 4
479
930).
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon
l'invention,
pour la préparation d'un médicament destiné au ciblage spécifique d'un composé
bio logiquement actif vers des cellules exprimant ou surexprimant la protéine
CD 151.
On entend désigner ici par composé biologiquement actif tout composé capable
de moduler, notamment d'inhiber, l'activité cellulaire, en particulier leur
croissance, leur
prolifération, la transcription ou la traduction de gènes.
L'invention a aussi pour objet un réactif de diagnostic in vivo comprenant un
anticorps selon l'invention, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de
préférence marqué,
notamment radiomarqué, et son utilisation en imagerie médicale, en particulier
pour la
détection de cancer lié à l'expression ou à la surexpression par une cellule
de la protéine
CD151.
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L'invention est également relative à une composition comme produit de
combinaison ou à un conjugué anti-CD151/toxine ou radioélément, selon
l'invention, à
titre de médicament.
De préférence, ladite composition comme produit de combinaison ou ledit
conjugué selon l'invention sera additionné d'un excipient et/ou d'un véhicule
pharmaceutiquement acceptable.
Dans la présente description, on entend désigner par véhicule
pharmaceutiquement acceptable, un composé ou une combinaison de composés
entrant
dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires
et
qui permet par exemple la facilitation de l'administration du ou des composés
actifs,
l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme,
l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa
conservation.
Ces véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront
adaptés par
l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode d'administration du ou
des
composés actifs choisis.
De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en
particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique,
intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie orale. De manière plus préférée,
la
composition comprenant les anticorps selon l'invention, sera administrée à
plusieurs
reprises, de manière étalée dans le temps.
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux
peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans
l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou
le
poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au
traitement et les
effets secondaires constatés.
L'invention concerne donc l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses
fragments
fonctionnels pour la préparation d'un médicament destiné au ciblage spécifique
d'un
composé biologiquement actif vers des cellules exprimant ou surexprimant CD
151.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la
suite
de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont
représentées ci-
après.
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LEGENDES DES FIGURES
La figure 1 montre les séquences nucléotidiques et protéiques de la protéine
CD 151, séquences sur lesquelles sont mises en évidences les boucles EC 1 et
EC2.
5 La figure 2 est un schéma illustrant la structure des tétraspanines dont
fait partie
la protéine CD 151, et tout particulièrement les deux boucles extra-
cellulaires EC 1 et
EC2.
La figure 3 montre les séquences respectives des chaînes lourdes et légères de
l'anticorps 203B6 selon l'invention. Les CDRs définis selon le système IMGT
10 apparaissent soulignés et en gras alors que les CDRs définis selon Kabat
apparaissent
encadrés.
La figure 4 montre les séquences respectives des chaînes lourdes et légères de
l'anticorps 205H8 selon l'invention. Les CDRs définis selon le système IMGT
apparaissent soulignés et en gras alors que les CDRs définis selon Kabat
apparaissent
15 encadrés.
La figure 5 montre les séquences respectives des chaînes lourdes et légères de
l'anticorps 211F3 selon l'invention. Les CDRs définis selon le système IMGT
apparaissent soulignés et en gras alors que les CDRs définis selon Kabat
apparaissent
encadrés.
20 La figure 6 montre les séquences respectives des chaînes lourdes et légères
de
l'anticorps 214B2 selon l'invention. Les CDRs définis selon le système IMGT
apparaissent soulignés et en gras alors que les CDRs définis selon Kabat
apparaissent
encadrés.
La figure 7 illustre l'expression de la molécule CD151 chez des patients
atteints
25 de cancer de la prostate. Chaque lettre correspond à l'étude d'un patient
et pour chaque
patient le panel supérieur correspond au tissu normal adjacent à la tumeur et
le panel
inférieur correspond au tissu tumoral.
La figure 8 illustre l'expression de la molécule CD151 chez des patients
atteints
de cancer du poumon. Chaque lettre correspond à l'étude d'un patient et pour
chaque
30 patient le panel supérieur correspond au tissu normal adjacent à la tumeur
et le panel
inférieur correspond au tissu tumoral.
La figure 9 montre l'analyse par cytométrie de flux de la reconnaissance de
CD151 par l'anticorps 203B6 à la surface des cellules NIH 3T3-CD151, PC3 et
A549.
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La figure 10 montre l'analyse par cytométrie de flux de la reconnaissance de
CD151 par l'anticorps 205H8 à la surface des cellules NIH 3T3-CD151, PC3 et
A549.
La figure 11 montre l'analyse par cytométrie de flux de la reconnaissance de
CD151 par l'anticorps 211F3 à la surface des cellules NIH 3T3-CD151, PC3 et
A549.
La figure 12 montre l'analyse par cytométrie de flux de la reconnaissance de
CD151 par l'anticorps 214B2 à la surface des cellules NIH 3T3-CD151, PC3 et
A549.
La figure 13 présente les résultats de l'évaluation de la spécificité des
anticorps
203B6, 205H8, 211F3 et 214B2 par western blot.
La figure 14 illustre l'activité anti-tumorale d'anticorps monoclonaux anti-
CD151 dans le modèle de xénogreffe de tumeur de la prostate PC3. Des souris
Swiss
Nude (n=6) ont été greffées par voie sous cutanée avec les cellules PC3. Cinq
jours
après la greffe des cellules, les souris reçoivent, par voie i.p., une dose
d'appel de 2
mg/souris de l'anticorps à tester suivie de deux administrations par semaine
d'une dose
de 1 mg/souris de cet anticorps. Le volume tumoral est évalué par la formule
n/6 x
Longueur x largeur x épaisseur.
La figure 15 montre l'analyse des anticorps 203B6 et 214B2 radiomarqués à
l'iode 125 avec (A) Autoradiographie après électrophorèse SDS-PAGE en
conditions
réductrices, et (B) Analyse par chromatographie de tamisage moléculaire.
La figure 16 illustre l'étude de la fixation de l'anticorps 203B6 radiomarqué
sur
cellules PC3 : Détermination de la constante d'affinité à l'équilibre avec (A)
Courbe de
saturation et (B) Scatchard plot.
La figure 17 illustre l'étude de la fixation de l'anticorps 214B2 radiomarqué
sur
cellules PC3 : Détermination de la constante d'affinité à l'équilibre avec (A)
Courbe de
saturation et (B) Scatchard plot.
La figure 18 montre l'effet des anticorps anti-CD151 sur les fonctions
plaquettaires avec (A) Agrégation plaquettaire et (B) Activation plaquettaire
(libération
de sérotonine).
La figure 19 montre l'effet d'anticorps anti-CD151 sur la croissance tumorale
in
vivo des cellules NCI-H441
La figure 20 illustre le phénotype A) et marqueurs de différentiation B) des
cellules THP-1 cultivées en absence ou en présence de PMA. C) Effet
d'anticorps anti-
CD151 (214B2 et 203B6) sur la sécrétion de TNF par les cellules THP-1
cultivées en
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absences ou en présence de PMA. L'anticorps 9G4 est utilisé comme isotype
contrôle et
le LPS comme témoin positif d'activation.
La figure 21 montre l'effet des anticorps 241B2 et 203B6 sur la présentation
antigénique. A) témoin de prolifération polyclonale, B) prolifération antigène-
spécifique
EXEMPLES
Exemple 1 : Etude de l'expression de la molécule CD151
L'expression de la protéine CD151 a été recherchée par immunohistochimie
(IHC) dans des échantillons de tissus humains issus de patients atteints de
cancers de la
prostate ou de cancer du poumon. Pour ces patients des lames de tissus normaux
adjacents à la tumeur étaient disponibles et ont donc été incluses pour
calibrer le niveau
d'expression dans les tissus tumoraux versus normaux.
Pour ces expériences, des lames de type Tissue array commerciales sont
utilisées. Après déparaffinage, un démasquage antigénique est effectué à 30 C
à l'aide
d'une solution enzymatique contenant de la pepsine (Labvision re AP-9007-
005).
Cette étape est suivie par une étape d'élimination des peroxydases endogènes
par
incubation des coupes dans une solution de peroxyde d'hydrogène (Sigma) à 0,3%
dans
l'eau. Une saturation des sites non spécifiques est alors effectuée avec une
solution
d'Ultra-V-Block (Labvision, ref. TA-125-UB) et le marquage est effectué à
l'aide d'un
anticorps murin anti-CD151 commercial (Serotech, Ref. MCA 1856) utilisé à une
concentration finale de 5 g/ml. Un anticorps isotype contrôle IgGi murin
(DakoCytomation, Ref. X093 1) est utilisé comme contrôle négatif d'expérience.
La
révélation du marquage se fait avec le système de révélation Envision Dual
Link
(DakoCytomation, Ref. K4061) et la référence de la DAB, substrat des
peroxydases est
S3309 de DakoCytomation.
Les résultats présentés dans la figure 7 montrent que plusieurs patients
développant des tumeurs de la prostate présentent une sur-expression de la
molécule
CD 151. Cette sur-expression peut être très significative pour 20% des
patients étudiés
(patients A et C) ou modérée (patients A et D). Il est à noter que, excepté au
niveau des
cellules endothéliales, les tissus normaux prostatiques correspondant
n'expriment pas
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ou peu le CD151 et que, en cas d'expression, celle-ci semble être limitée à
des
structures de type glandulaires. Le patient E présente un exemple de tumeur
n'exprimant pas CD151.
Dans le cas du cancer du poumon (Figure 8), une expression modérée (patient
A) à forte (patient B) est observée au niveau de certaines cellules du tissu
pulmonaire
normal. Cependant le tissu tumoral présente une très grande densité de
cellules
fortement marquées (patients A et B). Le patient C présente un exemple de
tumeur
n'exprimant pas CD151.
Exemple 2 : Génération et sélection des anticorps
Des souris BALB/c ont été immunisées par voie sous-cutanée à l'aide de 20.106
cellules NIH 3T3 exprimant CD151 humain à leur surface, cellules générées par
transfection avec le gène de CD151. La première immunisation a été réalisée en
présence d'adjuvant complet de Freund, puis les 2 suivantes en présence
d'adjuvant
incomplet de Freund. Trois jours avant la fusion, une injection de rappel
finale de
10.106 cellules NIH 3T3-CD151 a été réalisée par voie intra-péritonéale. Les
cellules de
la rate d'une souris ont ensuite été fusionnées à des cellules de myélome
SP2/0-Agl4
dans un rapport 1/1 par les techniques classiquement décrites par Kôhler et
Milstein.
Les anticorps sécrétés dans les surnageants des hybridomes résultant de la
fusion
ont ensuite été criblés pour leur capacité à reconnaître la boucle
extracellulaire
recombinante EC2 de CD151 par ELISA, et CD151 exprimé à la surface de la
lignée
tumorale humaine de cancer de la prostate PC3 par cytométrie de flux.
Pour l'ELISA, des plaques 96 puits sont sensibilisées pendant 1 nuit à +4 C
avec la boucle extracellulaire recombinante EC2 à 5 g/ml dans du PBS. Après
lavage
par du PBS, les puits sont saturés par une solution de gélatine à 0,5% dans du
PBS
pendant 1 h à 37 C puis lavés à nouveau par du PBS. Les surnageant de culture
des
hybridomes sont évalués sans dilution (incubation 1 h à 37 C). Les anticorps
fixés sur la
boucle EC2 immobilisée sont détectés par incubation successives avec un
anticorps
polyclonal de chèvre anti-IgG de souris conjugué à la péroxydase (Jackson/USA,
dilution au 115000ème, 1 h à 37 C) puis avec un substrat de la péroxydase
(TMB,
Interchim/France, 10 min à température ambiante). La réaction est stoppée par
addition
d'acide sulfurique 1M et la densité optique (DO) est mesurée à 450nm.
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Les analyses par cytométrie de flux sont réalisées sur des plaques 96 puits.
Les
surnageants d'hybridome non dilués sont ajoutés à 100000 cellules PC3
préalablement
introduites dans les puits. Après une incubation de 20 min à +4 C suivie d'un
lavage, un
anticorps polyclonal de chèvre anti-IgG de souris marqué à l'A1exa488
(Molecular
Probes, dilution au 1/500ème) est ajouté. L'intensité de fluorescence (MFI)
est
déterminée à l'aide d'un cytofluorimètre après une nouvelle incubation de 20
min à
+4 C.
A l'issue de ce criblage, les 4 hybridomes suivants ont été sélectionnés
(critères
de sélection : DO > 0,5 pour l'ELISA et MFI > 50 pour la cytométrie de flux) :
203B6,
205H8, 211F3 et 214B2. Les résultats obtenus pour ces 4 hybridomes sont
présentés
dans le tableau 4 ci-dessous :
Hybridome ELISA Cytométrie (PC3 )
DO 450nm MFI
203B6 1,130 975
205H8 0,649 595
211F3 0,959 936
214B2 0,684 1004
Tableau 4
Après clonage, un clone de chaque hybridome sélectionné a été amplifié.
L'isotype des anticorps produits a été déterminé pour chaque surnageant de
culture à
l'aide d'un kit d'isotypage des anticorps murins (SBA clonotyping system,
Southem
Biotech), puis une caractérisation finale a été réalisée par ELISA (boucle
extracellulaire
EC2) et par cytométrie de flux sur la lignée murine NIH 3T3 et le transfectant
stable
NIH 3T3-CD 151, puis sur des lignées tumorales humaines de cancer du poumon
A549,
de la prostate DU145 et du pancréas BxPC3 dans les conditions décrites
précédemment.
La concentration en anticorps des surnageants a été ajustée à 5 g/ml pour
l'ELISA et à
10 g/ml pour les analyses par cytométrie de flux Les résultats obtenus sont
présentés
dans le tableau 5 ci-dessous :
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Anticorps Isotype ELISA Cytométrie de flux
anti-CD 151 MFI
DO à NIH3T3 NIH3T3- A549 DU145 BxPC3
450nm CD151
203B6 c11A IgGi K 2,218 16 540 675 860 768
205H8 c11A IgG3 K 1,842 16 332 388 584 350
211F3 c11A IgG1 K 2,301 16 556 481 524 536
214B2 c11A IgGi K 2,477 16 748 820 1332 849
Tableau 5
Les figures 9, 10, 11 et 12 montrent les profils de reconnaissance par
cytométrie
5 de flux des cellules NIH 3T3-CD151, PC3 et A549 obtenus pour les anticorps
203B6,
205H8, 211F3 et 214B2. Ces profils sont comparables à ceux obtenus avec
l'anticorps
anti-CD151 50-6 (ATCC CRL-2696) et démontrent la spécificité de ces anticorps
pour
CD151.
Les hybridomes ont ensuite été déposés à la CNCM, Collection Nationale de
10 Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux,
75724 PARIS
Cedex 15.
Exemple 3 : Spécificité des anticorps
La spécificité des anticorps 203B6, 205H8, 211F3 et 214B2 a été évaluée par
15 western blot.
La boucle EC2 de CD151 a été clonée dans le vecteur pET22b pour une
expression sous forme soluble dans le périplasme de Escherichia coli. La
protéine
produite comporte les acides aminés 130 à 221 de la séquence peptidique de
CD151
humain, auxquels a été ajoutée une queue Poly-His en position C-terminale pour
20 faciliter la purification. La protéine EC2 recombinante a été purifiée par
chromatographie d'affinité sur métaux immobilisés (IMAC) sur support Chelating
Sepharose HP (GE Healthcare).
Des quantités croissantes de la protéine recombinante EC2 CD151 (1, 2, 4 et 8
g) et de lysat de cellules HT-29 (10, 20 et 50 g de protéines totales) ont
été déposées
25 sur un gel d'acrylamide 4-12% (BioRad). Après électrophorèse (conditions
non
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réductrices), les protéines ont été transférées sur membrane de
nitrocellulose. Les
membranes de transfert ont ensuite été incubées avec les anticorps 203B6,
205H8,
211F3 et 214B2 purifiés (0,5 g/ml), puis avec un anticorps polyclonal de
lapin anti-Ig
de souris couplé à la péroxydase (GE Healthcare) avant révélation par
chimioluminescence.
Les anticorps 203B6, 205H8, 211F3 et 214B2 reconnaissent la protéine CD151
complète et la boucle EC2 recombinante par western blot (Figure 13).
L'anticorps
205H8 présente une réactivité inférieure pour la protéine CD151 complète dans
les
conditions d'analyse. Comparativement au signal observé pour les anticorps
203B6,
211F3 et 214B2, le signal obtenu pour l'anticorps 205H8 s'avère plus faible.
Cette
différence n'est pas observée pour la reconnaissance de la protéine EC2
recombinante.
Exemple 4 : Activité antitumorale d'anticorps anti-CD151 dans le modèle
de xénogreffe PC3
Matériel et méthodes
Une surexpression de CD151 dans les tissus tumoraux de cancer de la prostate
ayant été observée par immunohistochimie sur une série de tissus array
humains,
l'évaluation d'anticorps anti-CD 151 sur une xénogreffe de cellules de cancer
de la
prostate PC3 a été envisagée. La lignée PC3 est une lignée prostatique
androgéno-
indépendante originaire de 1'ATCC et cultivée en milieu F12K (Invitrogen
Corporation, Ecosse, Royaume-Uni), 10% FCS (Invitrogen Corporation). Les
cellules
sont divisées deux jours avant la greffe de telle sorte qu'elles soient en
phase de
croissance exponentielle. Cinq millions de cellules PC3 sont greffées en sous-
cutané sur
des souris mâle Swiss Nude âgées de six semaines. Cinq jours après
l'implantation, les
volumes tumoraux sont mesurés, les souris sont randomisées pour constituer des
lots
non statistiquement différents et le traitement est initié par l'injection
i.p. d'une dose
d'appel de 2 mg d'anticorps par souris. Les animaux sont ensuite traités deux
fois par
semaine avec une dose de 1 mg d'anticorps par souris et les tumeurs mesurées 2
fois par
semaine. Les animaux du groupe contrôle reçoivent une injection de PBS. Les
volumes
tumoraux sont calculés selon la formule n/6 x longueur x largeur x hauteur.
Une analyse
statistique est effectuée à chaque mesure en utilisant un test de Mann-
Whitney.
Résultats
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Les résultats présentés en Figure 14 montrent que les anticorps 203B6, 214B2
et
211F3 indiquent des inhibitions significatives de la croissance tumorale in
vivo des
cellules PC3. L'anticorps 205H8, bien qu'inhibiteur, montre une activité
antitumorale
plus modeste dans ce modèle.
Exemple 5 : Etude de la fixation des anticorps anti-CD151 sur cellules PC3
Les anticorps anti-CD151 203B6 et 214B2 ont, dans un premier temps, été
marqués à l'iode 125 par la méthode utilisant la chloramine T. Après marquage,
les
anticorps ont été purifiés par chromatographie de tamisage moléculaire sur
colonne PD-
10 (GE Healthcare) afin d'éliminer l'iode 125 libre. La pureté radiochimique
des
anticorps radiomarqués a été déterminée, après purification, par
chromatographie sur
couche mince de silice, chromatographie de tamisage moléculaire analytique sur
colonne Superdex 200 (GE Healthcare) et par autoradiographie après
électrophorèse
SDS-PAGE. La figure 15 montre que les chaînes lourdes (-50 kDa) et légères (-
25
kDa) des 2 anticorps sont marquées de manière équivalente (15A) et confirme
l'absence
d'iode 125 libre après purification (15B). L'activité spécifique des anticorps
radiomarqués a été déterminée à l'aide d'un compteur gamma (Wallace Wizard
1480,
Perkin Elmer).
Les caractéristiques physico-chimiques des anticorps 203B6 et 214B2
radiomarqués à l'iode 125, ['211]-203B6 et [1211] -214B2, sont résumées dans
le
tableau 6 ci-dessous :
Anticorps [125I]-203B6 [125I]-214B2
Efficacité du marquage (%) 85,5 78,1
Activité spécifique (mCi/mg) 10,6 12,7
Pureté radiochimique (%) 99,7 99,5
Atomes d'iode / anticorps 0,73 0,87
Tableau 6
L'affinité des 2 anticorps radiomarqués pour leur cible CD151 à la surface
cellulaire a ensuite été mesurée sur des cellules de cancer de la prostate
PC3. La
constante de dissociation KD des anticorps a été déterminée par la méthode de
Scatchard. Les cellules PC3 (1.106 cellules / 50 l de tampon PBS contenant
0,5%
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BSA) ont été incubées en présence de concentrations croissantes des anticorps
radiomarqués comprises entre 6 ng/ml et 27 g/ml pendant 1 h à 4 C (volume
final :
150 l). Après incubation, la radioactivité totale associée aux cellules
(anticorps
radiomarqué fixé) a été mesurée à l'aide d'un compteur gamma. La fixation non
spécifique a été déterminée, pour chaque concentration testée, en présence
d'un excès
d'anticorps non radiomarqué (x 100). La fixation spécifique est calculée par
soustraction de la radioactivité non spécifique à la radioactivité totale. Les
courbes de
saturation sont présentées sur les figures 16A et 17A, respectivement pour les
anticorps
[1211] -203B6 et [1211] -214B2. Les courbes de Scatchard obtenues (Figures 16B
et 17B)
après traitement des données avec logiciel Prism permettent de déterminer la
constante
de dissociation KD des 2 anticorps (Pente = - 1/KD) :
- 203B6 KD = 12,85 0,99 nM
- 214B2 KD = 6,38 0,45 nM
Exemple 6 : Effet des anticorps anti-CD151 sur les fonctions plaquettaires
L'agrégation est une fonction essentielle des plaquettes lors du processus de
coagulation sanguine, en réponse à une lésion vasculaire par exemple. Ce
phénomène
est généralement précédé par l'activation des plaquettes, qui se traduit par
l'exposition
de certaines protéines à leur surface et la sécrétion du contenu de leurs
granules de
stockage (granules alpha et granules denses). CD151 étant exprimé sur les
plaquettes
(Goschnick and Jackson, 2007, Mini-Rev. Med. Chem. 7: 1236-1247), l'effet des
anticorps anti-CD151 sur les fonctions plaquettaires a été évalué in vitro à
l'aide de
tests d'agrégation et d'activation plaquettaires.
Pour cette étude, le sang de donneurs à jeun a été prélevé en utilisant le
citrate
trisodique comme agent anticoagulant. Une centrifugation à 100 g pendant 10
min à
20 C permet d'obtenir un plasma riche en plaquettes (PRP), alors qu'un plasma
pauvre
en plaquettes (PPP) est obtenu par centrifugation à 1500 g pendant 10 min à 20
C.
L'agrégation plaquettaire a été mesurée sur les PRP de 10 donneurs, après
ajustement à
300000 plaquettes/mm3, selon le principe de Born (modification de la lumière
transmise) avec une agitation de 500 tours/min à 37 C. La durée de la mesure
était de 5
min pour la thrombine et l'ADP (contrôles positifs) et de 15 min pour les
anticorps
testés. L'activation des plaquettes a été mesurée sur les PPP de 10 donneurs,
par mesure
de la sécrétion de sérotonine (5-hydroxytryptamine ou 5-HT) par HPLC avec
détection
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fluorimétrique. L'effet des anticorps sur les fonctions plaquettaires a été
déterminé pour
une concentration de 10 g/ml. Plusieurs anticorps contrôles ont été utilisés
: PM6/248
(anti-CD41, intégrine (Xis) et 14A2.H1 (anti-CD151) comme anticorps contrôles
positifs, et 9G4 comme contrôle isotypique (IgGi).
L'agrégation plaquettaire induite par les différents composés testés est
estimée,
pour chaque donneur, en pourcentage de l'agrégation induite par la thrombine
prise
comme référence (100%). La figure 18A présente les valeurs moyennes
d'agrégation
obtenues pour chaque composé testé. L'ADP et l'anticorps PM6/248, agents
inducteurs
moins puissants que la thrombine, entraînent des agrégations comparables,
respectivement de 30,1 10,5 % et 47,6 12,7 %. Les écarts obtenus sont
classiquement observés en hémostase et résultent de la variabilité inter-
individuelle.
Comme attendu, l'anticorps 9G4 n'induit pas l'agrégation des plaquettes : cet
anticorps
permet de définir un seuil de détection (5 nM). L'agrégation induite par les
anticorps
anti-CD151 203B6 et 214B2, respectivement de 7,3 3,2 % et 4,9 1,6 %, est
relativement faible et proche du seuil de détection. Ces 2 anticorps induisent
une
agrégation inférieure à celle de l'anticorps contrôle 14A2.H1.
La figure 18B présente les valeurs moyennes de sérotonine libérée par les
plaquettes (en nM) en présence des différents composés testés. Les résultats
obtenus
pour ce test d'activation plaquettaire sont comparables à ceux décrits
précédemment.
L'anticorps 9G4 n'induit pas l'activation des plaquettes alors que la
thrombine
provoque une très forte libération de sérotonine (-430 nM). Les quantités de
sérotonine
libérées sont inférieures en présence d'ADP, du PM6/248 et du 14A2.H1 (valeurs
moyennes respectives de 72,6 nM, 34,6 nM et 21,6 nM), mais ces composés
peuvent
être considérés comme activateurs plaquettaires. La libération de sérotonine
induite par
les anticorps anti-CD151 203B6 et 214B2 est très faible : en effet, les
valeurs moyennes
déterminées pour ces 2 anticorps sont respectivement 2,4 et 3,6 fois plus
faibles que
celle de l'anticorps contrôle anti-CD151 14A2.H1.
En conclusion, les 2 tests confirment que les anticorps contrôles anti-
intégrine
aib PM6/248 et anti-CD151 14A2.H1 sont capables de provoquer in vitro
l'agrégation
des plaquettes et d'induire leur activation (Roberts et al., 1995, Br. J.
Haematol. 89:
853-860 ; Homby et al., 1991, Br. J. Haematol. 79: 277-285). A la différence
de
l'anticorps 14A2.H1, les anticorps anti-CD151 203B6 et 214B2 induisent des
niveaux
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d'agrégation et d'activation plaquettaire très faibles et non significatifs en
clinique
humaine.
Exemple 7 : Etude de l'activité des anticorps anti-CD151 sur la croissance
5 in vivo des tumeurs NCI-H441
Les cellules NCI-H441 provenant de 1'ATCC sont cultivées en milieu RPMI
1640 supplémenté de 10% FCS et de 1% L-Glutamine. Les cellules sont divisées
deux
jours avant la greffe de façon à obtenir des cellules en phase exponentielles
de
croissance le jour de la greffe. Dix million de cellules NCI-H441 sont
implantées en
10 localisation sous cutanée sur des souris Nude athymiques. Cinq jours après
la greffe, les
tumeurs sont mesurables et les animaux portant des tumeurs d'une taille
comparable
sont répartis en groupe de 6. Les souris sont traitées par voie i.p. avec une
dose d'appel
d'anticorps de 2 mg/souris, puis, 2 fois par semaine avec une dose de 1 mg
d'anticorps
par souris. Le volume tumoral est évalué 2 fois par semaine et calculé à
l'aide de la
15 formule: n/6 X longueur X largeur X hauteur. L'analyse spécifique des
données est
effectuée à chaque mesure en utilisant un test Mann-Whitney.
Les résultas présentés en figure 19 démontrent que les anticorps 203B6 et
214B2
sont capables d'inhiber significativement (p<0.05) la croissance in vivo des
cellules
NCI-H441.
Exemple 8 : Evaluation de l'activité de deux anticorps anti-CD151 sur la
fonction macrophagique
L'évaluation de l'expression de CD 151 sur les cellules du sang démontre que
cette molécule est exprimée de façon significative sur les lymphocytes et les
monocytes.
Afin d'anticiper d'éventuels problèmes de toxicité, les anticorps 214B2 et
203B6 ont
été testés pour un effet potentiel sur l'activation des macrophages. La
sécrétion de
TNFa étant un marqueur de l'activation des macrophages, la concentration de
TNFa de
surnageant de culture de cellules THP-1, cultivés en présence ou en absence
des
anticorps à tester, on été évalués, par ELISA. La lignées cellulaire THP-1 est
une lignée
de leucémie monocytaire capable de se différencier en lignée macrophagique en
présence d'agents de type PMA ou la 25-Dihydroxyvitamin D3. Ce processus
d'activation s'accompagne d `une sécrétion très significative de TNFa. Pour
l'évaluation des anticorps, les cellules THP-1 sont ensemencées en plaques 6
puits en
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présence ou en absence de PMA (250 nM) durant 72 heures. Après ce temps
d'incubation, une partie des cellules sont récupérées afin de contrôler la
différenciation
en présence de PMA par observation microscopique ou par analyse au FACS des
marqueurs CD14/CD11b. Les anticorps à tester (241B2 et 203B6) sont ajoutés aux
autres puits pour un temps additionnel de 24 heures. L'anticorps 9G4 est
utilisé dans les
même conditions comme isotype contrôle. Le LPS (1 g/ml) est utilisé comme
témoin
positif de l'expérience. Les surnageant de culture sont alors prélevés,
centrifugés et
stockés à -80 C avant d'être dosés pour leur contenu en TNFa par un test
ELISA.
Les résultats présentés en figure 20A montrent qu'en absence de PMA, les
cellules THP-1 sont non adhérentes, réfringentes et rondes. En présence de
PMA, ces
cellules deviennent adhérentes ce qui signe clairement une différenciation des
monocytes en macrophages. Les analyses au FACS (figure 20B) montrent qu'en
absence de PMA moins de 20% des cellules THP-1 expriment CD11b ou CD14. La
différenciation cellulaire induite par le PMA est, comme attendu, associée à
une
augmentation significative des cellules exprimant CD11b qui passent de 9 à
65%.
L'expression de CD 14 est également notablement augmentée avec un nombre de
cellules positives passant de 20 à 37% . Ces données démontrant la validité du
modèle
d'évaluation mis en place, une évaluation des anticorps anti-CD 151 a été
effectuée dans
ce test. La figure 20C montre qu'aucune production de TNFa n'est observée
lorsque les
cellules THP-1 sont cultivées en absence d'inducteur de différenciation. En
revanche,
une production très significative (100 à 200 pg/ml) de TNFa est observée.
Comme
attendu le LPS introduit comme témoin positif d'expérience entraîne également
la
sécrétion d'un taux élevé de cytokine en ce, en présence ou en absence
d'inducteur de
différenciation. présence de PMA
Aucun des anticorps anti-CD151 évalué n'entraîne de secrétions de TNFa
quelque soit l'état de différenciation cellulaire.
Exemple 9 : Evaluation de deux anticorps anti-CD151 sur la fonction de
présentation antigénique.
La molécule CD151 étant largement exprimée sur les cellules présentatrices
d'antigène, une étude a été effectuée afin de vérifier l'impact potentiel
d'une thérapie
dirigée contre CD151 sur la fonction de présentation antigénique. L'expérience
effectuée consiste à suivre la prolifération lymphocytaire spécifique de
l'antigène TT
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lorsque la protéine tétanus toxoid est introduite sur des PBMC. Dans cette
conformation, la protéine doit être processée par les cellules présentatrice
d'antigène et
présentée par ces mêmes cellules en association avec les molécules du CMH.
Cette
présentation antigénique aux lymphocytes CD4+ ou CD8+ entraînera une
prolifération
des clones spécifiques de l'antigène. Tout impact sur la présentation
antigénique se
soldera donc par une modulation de la prolifération lymphocytaire. Pour cette
expérience, des PBMC sont isolés par centrifugation du sang total sur gradient
de
Ficoll. Les cellules lavées deux fois en PBS, sont comptées et resuspendues à
raison de
0.25.106 cellules/ml en milieu RPMI 1640 supplémentées avec 10% de SVF et 1%
de
glutamine. Cent microlitres de la suspension cellulaire sont ensemencés dans
chaque
puits d'une plaque 96 puits en présence de l'antigène et des anticorps à
tester. Les
anticorps 214B2 et 203B6 sont évalués à la concentration finale de 10 g/ml.
L'anticorps 9G4 est introduit à la même concentration finale comme isotype
contrôle
d'expérience. La PHA (2.5 g/ml dans le puits), activateur polyclonal de la
prolifération
lymphocytaire est utilisée comme contrôle positif de prolifération. Tetanus
toxoid (TT)
a été sélectionné comme antigène test et est utilisé à la concentration finale
de 100
g/ml. Les plaques sont incubées à 37 C durant 96 heures à l'issue desquelles
0.25 Ci
de 3H-Thymidine sont ajoutés dans chaque puits pour un temps additionnel de 24
h.
Après incubation les cellules sont collectées sur des filtres et la
radioactivité évaluée.
Les résultats présentés en figure 21A montrent que, comme attendu, la PHA
utilisée comme contrôle positif entraîne une très forte prolifération
lymphocytaire.
L'intensité du signal est bien en accord avec une activation polyclonale de la
prolifération des cellules. Le 9G4 introduit dans l'expérience comme isotype
contrôle
n'a aucun impact sur la prolifération des cellules en absence ou en présence
de PHA. De
même les deux anticorps anti-CD151 testés ne modifient en aucun cas la
prolifération .
L'antigène TT induit une prolifération significative d'une partie de la
population
lymphocytaire (figure 21B). Cette prolifération n'est pas impactée en présence
de 9G4
ou des deux anticorps anti-CD151 testés indiquant que dans les conditions de
l'expérience la présentation antigénique n'est pas affectée par les composés
testés.
