Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
NOUVELLES UTILISATIONS DE DÉRIVÉS DE D-MANNOPYRANOSE
La présente invention est relative à l'utilisation du mannose-6-
phosphate (M6P) et de certains de ses dérivés pour le contrôle de
l'angiogenèse et la
régénération ligamentaire et/ou la reconstruction de cartilage. Le M6P et
certains de
ses dérivés peuvent notamment être utilisés pour la préparation d'une
composition
pharmaceutique destinée à la régénération ligamentaire et/ou la reconstruction
de
cartilages.
De nombreuses pathologies ont été décrites comme ayant une
composante ou un stade lié au phénomène d'angiogénèse. On peut citer entre
autres de
très nombreux cancers, les rétinopathies liées au diabète, l'athérosclérose,
l'arthrose,
la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, ainsi que les pathologies
inflammatoires ou
celles liées à une cicatrisation retardée.
L'angiogenèse est un mécanisme de néovascularisation prenant
naissance à partir d'un réseau capillaire préexistant. Le bourgeonnement de
petits
vaisseaux, les capillaires, à partir de ceux préexistants, intervient pour le
meilleur lors
du développement embryonnaire et l'implantation du placenta, lorsqu'il s'agit
de
cicatriser une .blessure, ou de pallier l'obstruction d'un vaisseau ; mais
également pour
le pire dans les cancers (croissance des tumeurs et développement des
métastases),
l'arthrite rhumatoïde, certaines maladies ophtalmologiques comme la
rétinopathie
diabétique ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge... Pour l'ensemble de
ces
processus, le schéma général reste le même. L'activation des cellules
endothéliales
conduit à la dégradation de la membrane basale et de la matrice
extracellulaire
environnante. La migration orientée est suivie d'une phase proliférative. Les
cellules
se différencient ensuite en une structure de type capillaire pour former un
réseau
vasculaire nécessaire au développement des tissus. Au cours de ces dernières
années,
il est devenu clair que l'angiogenèse n'est pas contrôlée par un seul facteur,
mais par
une balance d'inducteurs et d'inhibiteurs produits par les cellules normales
ou
tumorales. Parmi ces facteurs, des polypeptides comme le facteur de croissance
des
fibroblastes-2 ("Fibroblast Growth Factor-2" : FGF-2) et le "facteur de
croissance de
l'endothélium vasculaire ("Vascular Endothelial Growth Factor" : VEGF) sont
apparus comme étant des régulateurs clés de l'angiogenèse.
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
2
De nombreuses molécules ont été étudiées pour leur effet inhibiteur
ou activateur de l'angiogénèse.
En ce qui concerne l'inhibition de l'angiogénèse, une révolution
conceptuelle récente dans le traitement du cancer consiste à cibler le réseau
vasculaire
qui irrigue une tumeur. Il est maintenant bien établi que le développement
d'une
vascularisation intra ou péritumorale est un événement clé autant pour la
croissance
d'une tumeur que pour la dissémination métastatique par la voie sanguine. En
décembre 2005, la revue scientifique anglaise Nature, qui consacrait son
numéro à
l'angiogénèse, dénombrait plus de 300 inhibiteurs, dont 80 en cours d'essais
cliniques.
Mais les premiers médicaments testés - angiostatine, endostatine, interférons,
inhibiteurs de matrice métalloprotéinases... - furent décevants. Parmi des
molécules
plus récentes, on peut citer le bevacizumab. Injecté au patient, il neutralise
un type de
VEGF circulant dans les capillaires ou diffus dans la tumeur, le VEGF-A. Sa
première
indication fut en 2004 pour le cancer colorectal métastatique, en association
avec une
chimiothérapie. Il est aujourd'hui en essais cliniques contre les cancers du
rein
métastatiques, du poumon et du sein. Mais on observe qu'il accroît le risque
d'hypertension et d'hémorragie. On peut également citer le sunitinib et le
sorafenib qui
présentent l'avantage de pouvoir autoriser une formulation sous forme de
comprimés à
absorber par voie orale et qui conduisent à des résultats thérapeutiques
encourageants.
Ils présentent également l'inconvénient d'engendrer quelques effets
secondaires
comme l'hypertension, la fatigue ou des problèmes de peau.
Ainsi, les Inventeurs ont découvert que le mannose-6-phosphate et
certains dérivés sélectionnés de celui-ci et tels qu'ils vont être décrits ci-
après
(composés de formule (I)) présentaient une activité inhibitrice de
l'angiogénèse, et
permettaient la régénération ligamentaire et/ou la reconstruction de
cartilages.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation, à titre de
principe actif, d'au moins un composé de formule (I) ci-après :
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
3
R2
n
HO O
OH
HO
OR,
dans laquelle :
- R1 représente un radical alkyle linéaire ou ramifié en Ci-C4 ; un
radical alkyle comportant un ou plusieurs groupements fonctionnels choisis
parmi les
groupements hydroxyle, amine, thiol, carboxyle, azide et nitrile ; un cycle
hydrocarboné, saturé ou insaturé, en C3-C6 ; un cycle hydrocarboné, saturé ou
insaturé, en C3-C6 comportant un ou plusieurs groupements fonctionnels choisis
parmi
les groupements hydroxyle, amine, alkyle en C1-C4, thiol, carboxyle, azide et
nitrile ;
un hétérocycle saturé ou insaturé comportant au moins un hétéroatome choisi
parmi
les atomes d'oxygène, d'azote et de souffre ;
- n est un nombre entier égal à 0 ou 1,
- R2 est choisi parmi les groupements (G1) à (G4) suivants :
0 OR3
COOR'
R30-P--0R3 R300C T
O=S=O 3
R4
(G1) (G2) (G3)
R3O O
(G4)
dans lesquels
* R3 et R'3, identiques ou différents, représentent un atome
d'hydrogène ou de sodium ;
* R4 représente un atome d'oxygène ou de soufre, et
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
4
* la flèche représente le point d'attachement du groupement sur
l'atome de carbone porteur de R2,
pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la
régénération ligamentaire et/ou la reconstruction d'un cartilage.
Selon l'invention, parmi les radicaux alkyle en C1-C4 mentionnés
pour R1, le radical méthyle est particulièrement préféré.
Parmi les radicaux alkyle fonctionnalisés cités pour R1, on peut en
particulier mentionner les radicaux mono et dihydroxyalkyle en C1-C4, mono et
diaminoalkyle en C1-C4, mono et dithioalkyle en C1-C4 et mono et
dicarboxyalkyle en
C1-C4.
Parmi les cycles hydrocarbonés cités pour R1, on peut en particulier
mentionner les cycles cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane, cyclohexane,
phényle
et benzyle.
Parmi les hétérocycles cités pour R1, on peut en particulier
mentionner les cycles oxadiazole, triazole, oxazole, isoxazole, imidazole,
thiadiazole,
pyrrole, tetrazole, furane, thiophène, pyrazole, pyrazoline, pyrazolidine,
thiazole,
isothiazole, pyridine, pyrimidine, pipéridine, pyranne, pyrazine et
pyridazine. Dans les
composés de formule (I) ci-dessus, lorsque n = 0, R2 est de préférence choisi
parmi les
groupements G3 et G4 et lorsque n = 1, R2 est de préférence choisi parmi les
groupements G1 et G2.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les composés
de formule (I) sont choisis parmi ceux dans lesquels R2 représente un
groupement G1
ou G3 tels que définis ci-dessus dans lesquels R3 et R'3 sont identiques et
représentent
un atome de sodium et parmi ceux dans lesquels R2 représente un groupement G2
ou
G4 tels que définis ci-dessus dans lesquels R3 représente un atome de sodium.
Parmi les composés de formule (I) ci-dessus, on peut en particulier
citer
- le 6-phosphate-D-manno-pyranoside de méthyle ; également connu
sous la dénomination triviale mannose-6-phosphate (M6P) dans la
littérature ;
- le (disodium)-6-phosphate-D-manno-pyranoside de méthyle ;
- le 6,7-didéoxy-7-sodiumsulfonato-D-manno-heptopyranoside
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
de méthyle ;
- l'acide (6,7-didésoxy-D-manno-heptopyranoside de méthyle)
uronique ; et
- le 6-déoxy-6-malonate-D-mannopyranoside de méthyle.
5 Parmi ces composés, le 6-phosphate-D-manno-pyranoside de
méthyle (M6P), le (disodium)-6-phosphate-D-manno-pyranoside de méthyle et le
6,7-
didéoxy-7-sodiumsulfonato-D-manno-heptopyranoside de méthyle sont
particulièrement préférés.
Le mannose-6-phosphate, ainsi que certains des composés de
formule (I) listés ci-dessus sont connus en tant que tels et ont déjà été
proposés dans le
domaine pharmaceutique, notamment pour améliorer la cicatrisation de la peau
tout en
diminuant la formation de cicatrices disgracieuses (Clavel, C. et al., Il
Farmaco, 2005,
60, 721-725). Ils n'y ont cependant encore jamais été utilisés et aucune
activité de ces
composés sur la régénération ligamentaire et/ou la reconstruction de
cartilages n'a
encore été décrite.
Ainsi qu'on l'a vu précédemment, les composés de formule (I)
conformes à la présente invention, on une activité inhibitrice sur
l'angiogenèse et une
activité sur la régénération ligamentaire et/ou la reconstruction de
cartilages. Ils
peuvent par conséquent être utilisés pour la préparation d'une composition
pharmaceutique destinée à la régénération ligamentaire et/ou à la
reconstruction d'un
cartilage. En effet, lors de la régénération ligamentaire ou de la
reconstruction d'un
cartilage, on utilise généralement des implants constitués de polymères
biocompatibles contenant des cellules ad hoc. Dans ce cas, il est souhaitable
d'empêcher la vascularisation de l'implant de façon à garder un matériau
acellulaire.
Aussi, pour cette application, la composition pharmaceutique se présente de
préférence sous la forme d'un biomatériau polymérique renfermant au moins un
composé de formule (I).
La composition pharmaceutique de l'invention telle que défini ci-
dessus comprend, en plus du composé de formule (I), au moins un excipient
pharmaceutiquement acceptable.
L'homme du métier choisira un ou plusieurs excipients
pharmaceutiquement acceptables en fonction de la voie d'administration de la
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
6
composition pharmaceutique. Bien entendu, l'homme de l'art veillera à cette
occasion
à ce que le ou les excipients utilisés soient compatibles avec les propriétés
intrinsèques attachées à la composition conforme à la présente invention.
En outre, la forme du médicament ou de la composition
pharmaceutique (par exemple, une solution, une suspension, une émulsion, des
comprimés, des gélules, des suppositoires, un biomatériau polymérique, etc...)
dépendra de la voie d'administration choisie.
Ainsi, au sens de la présente invention, le médicament ou la
composition pharmaceutique peut être administré par n'importe quelle voie
appropriée, par exemple par la voie orale, locale, systémique, intraveineuse,
intramusculaire ou mucosale, ou bien en utilisant un patch ou un biomatériau
polymérique.
On peut notamment citer, à titre d'exemples non limitatifs
d'excipients appropriés pour une administration par voie orale, le talc, le
lactose,
l'amidon et ses dérivés, la cellulose et ses dérivés, les polyéthylèneglycols,
les
polymères d'acide acrylique, la gélatine, le stéarate de magnésium, des
matières
grasses animales, végétales ou synthétiques, les dérivés de la paraffine, les
glycols, les
stabilisants, les conservateurs, les anti-oxydants, les agents mouillants, les
anti-
agglomérants, les dispersants, les émulsionnants, les agents modifiants du
goût, les
agents de pénétrations, de solubilisation, etc....
Les techniques de formulation et d'administration des médicaments
et compositions pharmaceutiques sont bien connues dans la technique ici
considérée,
l'homme du métier pouvant notamment se référer à l'ouvrage Remington's
Pharmaceutical Sciences, dernière édition.
Les composés de formule (I) peuvent être aisément préparés, à partir
d'un D-mannopyranoside de formule (II) définie ci-après, par déplacement
nucléophile
du précurseur sulfate cyclique de formule (IV) correspondant, par analogie à
la
méthode décrite par exemple par Van der Klein P.A.M. et al., Carbohydr. Res.,
1992,
224, 193-200 suivi de la déprotection des radicaux hydroxyle portés par le
motif
saccharidique, selon le schéma réactionnel A suivant :
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
7
o
OH OH O~S
O
O HO O
HO OH O O O O
Nu
HO .~ O
ORS H3C CH3 ORS H C CH3 OR,
(~~) (~~~) 3 (IV)
RZ RZ
(
n
HO OHO 03SO O 0
O
HO
ORS ORS
H3C CH3
(I)
M
SCHÉMA A
dans lequel R1, R2 et n ont la même signification que celle indiquée
ci-dessus pour les composés de formule (I) et Nu représente un groupement
nucléophile correspondant au groupement R2 que l'on souhaite introduire.
Cette méthode correspond à une adaptation de la méthode décrite
dans l'article de Khanjin N.A. et al., Tetrahedr. Lett., 2002, 43, 4017-4020.
Le sulfate cyclique de formule (IV) préparé selon ce procédé peut
être stocké plusieurs mois à température ambiante sous la forme d'une poudre
blanche
sans observer de décomposition. Les intermédiaires purs des sels de
monosulfate
peuvent être facilement séparés des groupements nucléophiles n'ayant pas réagi
et des
autres impuretés, par partition entre l'eau et un solvant tel que le
dichlorométhane
avant l'étape de déprotection. Le clivage simultané et quantitatif des groupes
monosulfate cyclique et isopropylidène des composés de formule (V) peut être
réalisé
sur une résine échangeuse d'ions telle qu'une résine Amberlyst-15 (H+) qui
permet la
déprotection du groupement monosulfate cyclique en 10 à 30 minutes et celle du
groupement isopropylidène en 3 à 5 heures à température ambiante dans un
mélange
méthanol/tetrahydrofuranne. Tous les composés de formule (I) préparés selon ce
procédé peuvent être obtenus avec un rendement compris entre 60 et 95 %.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore
d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se
réfère à des
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
8
exemples de préparation des composés de formule (I) conformes à l'invention,
ainsi
qu'à un exemple de mise en évidence de l'activité d'inhibition de
l'angiogénèse des
composés de formule (I) par rapport à d'autres dérivés de D-mannopyranose ne
répondant pas à la formule (I) et ne faisant donc pas partie de l'invention,
ainsi qu'à la
figure 1 annexée qui représente des photos de la vascularisation d'embryons de
poulets
après mise en culture en présence de 6 mg/ml de différents composés de formule
(I)
conformes à l'invention comparativement à trois dérivés de D-mannopyranoside
(DM)
ayant une activité pro-angiogénique et ne faisant donc pas partie de
l'invention (DM 1
7-amino-6,7-didésoxy-a-D-mannopyranoside de méthyle ; DM2 : 6-azido-6-déoxy-a-
D-mannopyranoside de méthyle et DM3 : 7-disodiumphosphonato-6,7-didésoxy-a-D-
manno-heptopyranoside de méthyle).
Il doit être entendu toutefois que ces exemples ne sont donnés qu'à
titre purement illustratif de l'invention dont ils ne constituent en aucune
manière une
quelconque limitation.
EXEMPLE 1: PRÉPARATION DU 6,7-DIDÉOXY-7-SODIUMSULFONATO-
a-D-MANNO-HEPTOPYRANOSIDE DE MÉTHYLE (Composé de formule I-1)
Na03S
OH
HO 0
HO
O-CH3
(I-1)
1) Première étape : Préparation du 2,3-O-Isopropylidène-4,6-0-(sulfate
cyclique)-a-D-mannopyranoside de méthyle (composé 3)
0
I I
6
0 O5 ,Z0
0~y,
z' 2 OCH3
(3)
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
9
Le composé (3) a été obtenu en 2 sous-étapes, sans purification
intermédiaire, via le sulfite correspondant (2).
1-a) Préparation du sulfite correspondant (2)
OH OIS,
HO 0 \0 0
0
/`- OMe OMe
(1) (2)
3,79 g (16,18 mmol - 1 éq.) de 2,3-O-isopropylidène-a-D-
mannopyranoside de méthyle (1) et 6,75 mL (48,54 mmol - 3 éq.) de
triéthylamine ont
été dissous dans 75 mL de dichlorométhane (CH2C12). Le mélange a été refroidi
à 0 C
et 1,3 mL (17,80 mmol - 1,1 éq.) de chlorure de thionyle (SOCl2) ont été
ajoutés
lentement. Le précipité blanc de chlorure de triéthylammonium s'est formé
instantanément, et le mélange réactionnel est devenu progressivement jaune,
puis
marron, en 5 à 10 minutes. Une chromatographie sur couche mince (CCM) a alors
été
réalisée en utilisant comme phase mobile un mélange d'éther de pétrole (EP) et
d'acétate d'éthyle (AcOEt) (8/2 v/v). Les résultats de cette CCM ont indiqué
alors qu'il
ne restait plus de produit de départ (Rf = 0) et que le sulfite désiré avait
été obtenu
sous forme de 2 diastéréoisomères (Rf = 0,45 et 0,60). Le mélange réactionnel
a alors
été filtré, et la phase organique a été lavée avec de l'eau distillée, une
solution d'acide
chlorhydrique (HC1) 1N, et de l'eau distillée à nouveau. Elle a été séchée sur
sulfate
de sodium (Na2SO4), filtrée et concentrée pour donner un solide légèrement
marron
qui a été directement remis en réaction.
1-b) Oxydation du sulfite (2) en sulfate (3)
0
01 il
S~ 0 00 0'S\ 0 00
OMe OMe
(2) (3)
Le sulfite brut (2) obtenu ci-dessus à la sous-étape 1-a)
(16,18 mmol - 1 éq., théoriquement) a été dissous dans 60 mL d'une solution
composée d'un mélange de CH2C12 et d'acétonitrile (CH3CN) (1/1 v/v) avant
d'ajouter
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
successivement 3,8 g (17,80 mmol - 1,1 éq.) de métapériodate de sodium, 20 mL
d'eau et 14 mg (0,06 mmol - 0,004 éq.) de chlorure de ruthénium. La réaction a
été
exothermique, et la formation du précipité d'iodate de sodium (Na103) a été
observée
très rapidement. Après 1 heure de réaction, il ne restait plus de sulfite et
seul le sulfate
5 (3) a été observé sur CCM. Le mélange réactionnel a alors été filtré et
dilué avec 100
mL de CH2C12. L'eau résiduelle de la réaction a été supprimée et la phase
organique a
été lavée 2 fois avec une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO3) à 5%,
puis
avec de l'eau distillée. Elle a ensuite été séchée sur Na2SO4, filtrée et
concentrée pour
donner un solide légèrement marron.
10 Ce solide a été dissous dans un minimum de CH2C12 en présence de
charbon actif, et filtré sur silice. La silice a été rincée avec 300 mL de
CH2C12. Les
impuretés marron, contenant les sels de ruthénium, sont restés à la surface.
Le solide
blanc obtenu a ensuite été engagé dans l'étape 2) sans aucune autre
purification.
Rendement : 84 % sur 2 étapes.
Rf : 0,48 (EP/AcOEt 7/3 v/v).
SM : (ESI+/MeOH) m/z : 297 [M+H]+, 319 [M+Na]+.
RMN 'H (400,13 MHz, Acétone-d6) S ppm : 1,38 et 1,53 (2s, 6H,
H2') ; 3,46 (s, 3H, OCH3) ; 4,17 (td, 1 H, J5-4 = J5-6b = 10,6 Hz, J5-6a = 5,5
Hz, H5) ; 4,32
(dd, 1 H, J2_3 = 5,6 Hz, J2_1 = 0,4 Hz, H2) ; 4,42 (dd, I R J3-2 = 5,6 Hz, J3-
4 = 7,7 Hz,
H3) ; 4,59 (dd, 1H, J4-3 = 7,8 Hz, J4_5 = 10,4 Hz, H4) ; 4,64 (t, 1H, J6b-5 =
10,7 Hz,
J6b-6a = -10,7 Hz, H6b) ; 4,87 (dd, 1H, J6a-5 = 5,5 Hz, J6a-6b = -10,5 Hz,
H6a) ; 5,01 (d,
1H, J1-2 = 0,5 Hz, H1).
RMN 13C (100,62 MHz, CDC13) S ppni : 26,4 et 28,3 (2C, C2') 56,1 (1C, OCH3) ;
58,9 (1C, C5) ; 72,3 (1C, C6) ; 73,6 (1C, C3) ; 76,3 (1C, C2) ; 84,6
(1C, C4) ; 99,4 (IC, C1) ; 111,0 (1C, C1=).
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
11
2) Deuxième étape : Préparation du 6,7-Didéoxy-7-sulfonato-a-D-manno-
heptopyranoside de méthyle 2 (composé I-1)
2-a) Attaque nucléophile
0 iPrO3S
0- S\ 0 00 0 0
0 0 Li03S00
OMe OCH3
(3) (4)
On a dissous sous argon, 303 mg (2,19 mmol - 1,3 éq.) d'isopropyl
méthylsulfonate et 3 gouttes de 1, 1 -diphényléthylène (indicateur coloré)
dans 2 mL de
tétrahydrofuranne (THF) anhydre. Le mélange a été refroidi à une température
de
-70 C et on a ensuite ajouté goutte à goutte 2,19 mmol (1,3 éq.) de butyl
lithium. Une
couleur rouge (due au 1,1- diphénylhexyllithium) est apparue peu à peu.
L'addition du
butyl lithium a été stoppée, la couleur rouge foncée a persisté. Après 5
minutes sous
agitation à la même température, 500 mg (1,69 mmol - 1 éq.) du composé (3)
obtenu
ci-dessus à l'étape 1), préalablement dissous dans 3 mL de THF anhydre, ont
été
ajoutés lentement au mélange. La couleur rouge a disparu rapidement. 580 L
(3,37
mmol - 2 éq.) d'hexaméthylphosphotriamide (HMPT) ont alors été ajoutés. On a
ensuite laissé le mélange revenir à température ambiante. Après 15 minutes,
tout le
produit de départ a été consommé. Le milieu réactionnel a alors été dilué avec
20 mL
de CH2CI2. Le produit a été extrait par 2 x 10 mL d'eau distillée. Cette phase
aqueuse
a ensuite été lavée au CH2CI2 jusqu'à ce que les impuretés organiques, comme
le
diphényléthylène et le HMPT soient éliminées. Après lyophilisation, le solide
obtenu
a directement été remis en réaction, sans aucune autre purification.
Rendement : Quantitatif.
Rf : 0,35 (CH2C12/MeOH 85/15 v/v).
Le produit révélé à l'anisaldéhyde était de couleur kaki.
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
12
2-b) Déprotection
iPrO3S NaO3S
Li03SO O
O 0
0 H 0
OCH3 OCH3
(4) (5)
744 mg (1,69 mmol - 1 éq.) de 6,7-didéoxy-7-sulfonate-4-
lithiumsulfate-2,3-O-isopropylidène-a-D-manno-heptopyranoside de méthyle (4)
ont
été dissous dans 10 mL d'eau distillée, avant d'ajouter 500 mg d'une résine
échangeuse de cations, vendue sous la référence Amberlyst-15 H+ par la société
Aldrich. Après 3 heures de réaction, les résines ont été filtrées et la phase
aqueuse a
été lyophilisée. Le solide obtenu a été purifié par chromatographie sur gel de
silice en
utilisant comme phase mobile un mélange isopropanol (IPrOH) ammoniaque
(NH4OH) dans un rapport 8/2 (v/v) pour donner une mousse transparente.
L'échange
du proton de l'acide sulfonique par un contre ion sodium a ensuite effectué,
dans l'eau,
à l'aide de résines Dowex Na+ commercialisées par la société Dow Corning.
Rendement : 95%.
Rf : 0,40 (IPrOH/NH4OH 6/4 v/v).
SM (FAB+/NBA) m/z : 273 [M+H]+, 242 [M-OMe]+.
SM (FAB-/NBA) m/z : 271 [M-H]-.
RMN'H (400,13 MHz, D20) S ppm : 1,97 (m, 1H, H7a) ; 2,36 (m,
1H, H7b) ; 2,99 (m, 1H, H6a) ; 3,13 (m, 1H, H6b) ; 3,37 (s, 3H, OCH3) ; 3,78
(m, 1H,
H5) ; 3,89-3,96 (m, 2H, H3 et H2) ; 4,45 (t, I H, J4-5 = J4-3 = 9,4 Hz, 1-14)
; 4,70 (s, I H,
H1).
RMN 13C (100,62 MHz, D20) S ppm : 26,8 (IC, C7) ; 47,6 (1C,
C6) ; 5 5,4 (1 C, OCH3) ; 69,1 (1 C, C5) ; 69,9 (1 C, C3) ; 70,4 (1 C, C2) ;
79,0 (1 C, C4)
100,9 (1C; Ci).
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
13
EXEMPLE 2: PRÉPARATION DE L'ACIDE (6,7-DIDÉSOXY-a-D-MANNO-
HEPTOPYRANOSINE DE MÉTHYLE) URONIQUE (Composé de formule I-2)
H02C7
4 0
pp6
HHO 3 z
OCH3
(I-2)
1) Première étape : Préparation 6-cyano-6-déoxy-4-O-sodiumsulfate-2,3-0-
isopropylidène-a-D-manno-pyranoside de méthyle (composé 6).
N
Ili
C,
6 50. 0
Na03S00 3
2 V 2. OCH3
(6)
1 g (3,38 mmol - 1 éq.) de 2,3-O-isopropylidène-4,6-0-(sulfate
cyclique)-a-D-mannopyranoside de méthyle (composé 3) tel qu'obtenu ci-dessus à
l'issue de l'étape 1) de l'exemple 1 a été dissous dans 3 mL de
diméthylformamide
(DMF), avant d'ajouter 331 mg (6,75 mmol - 2 éq.) de cyanure de sodium. Le
mélange
a été laissé sous agitation magnétique à température ambiante pendant 20
heures. Le
milieu réactionnel a alors été dilué avec 20 mL de NaHCO3 à 1% (pour éviter un
éventuel dégagement de cyanure d'hydrogène (HCN), et lavé avec 10 mL de
CH2C12.
Le produit a encore été extrait de la phase organique avec 2 x 10 mL d'eau
distillée.
Les phases aqueuses rassemblées ont été lyophilisées pour donner un solide un
peu
jaune, qui était assez pur pour être remis en réaction directement. Cependant,
ce
produit peut également être purifié par chromatographie sur gel de silice avec
un
gradient d'élution (CH2C12 jusqu'à CH2C12/MeOH 91/9 v/v) pour donner une
mousse
très légèrement jaune.
Rendement : Quantitatif.
Rf : 0,49 (CH2C12/MeOH 85/15 v/v).
Le produit s'est révélé de couleur bordeaux à l'anisaldéhyde.
SM (ESI+/MeOH) m/z : 384 [M+Na]+.
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
14
SM (ESI-/MeOH) m/z : 322 [M-Na]-.
RMN 'H (400,13 MHz, Acétone-d6) S ppm : 1,24 et 1,41 (2s, 6H,
H2') ; 2,76 (dd, 1H, J6a-5 = 9,3 Hz, J6a-6b = -17,3 Hz, H6a) ; 3,18 (dd, 1H,
J6b-5 = 2,8 Hz,
J6b-6a = -17,3 Hz, H6b) ; 3,46 (s, 3H, OCH3) ; 3,86 (td, 1 H, J5-6a = J5-4 =
9,6 Hz, J5-6b =
2,8 Hz, H5) ; 4,15 (d, 1 H, J2-3 = 7,4 Hz, H2) ; 4,21 (dd, 1 H, J4-5 = 9,9 Hz,
J4-3 = 7,0 Hz,
H4) ; 4,44 (ddmal résolu , 1 H, H4); 4,93 (s, 1 H, H 1).
RMN 13C (100,62 MHz, Acétone-d6) S ppm : 20,6 (1C, CO ; 25,5
et 27,1 (2C, C2') ; 54,5 (1C, OCH3) ; 64,9 (1C, C5) ; 75,6 (1C, C2) ; 76,3
(1C, C4)
76,9 (1C, C3) ; 98,1 (1C, Cl) ; 109,8 (1C, C1,) ; 118,1 (1C, C7).
2) Deuxième étape : Préparation du 6-cyano-6-déoxy-a-D-mannopyranoside de
méthyle (composé 7)
N
Ili
G
6 OF~
H~0 3
OCH3
(7)
873 mg (2,53 mmol - 1 éq.) de 6-déoxy-6-cyano-4-sodiumsulfate-
2,3-O-isopropylidène-a-D-manno-heptopyranoside de méthyle (6) obtenu ci-dessus
à
l'étape précédente ont été dissous dans 20 mL d'une solution constituée d'un
mélange
de méthanol (MeOH) et de THF (1/1 v/v), puis 1 g de résine Amberlyst-15 H+ a
été
ajouté. Après 1 heure et 15 minutes de réaction, les résines ont été filtrées
et le milieu
réactionnel a été neutralisé avec une solution de NaHCO3 à 5% jusqu'à pH = 8.
Les
solvants organiques ont été éliminés à l'évaporateur rotatif et l'eau restante
a été
lyophilisée. Le mélange a été repris au MeOH, et le NaHCO3 insoluble a été
filtré. Le
produit a ensuite été purifié par chromatographie sur gel de silice avec un
gradient
d'élution (CH2CI2 jusqu'à CH2C12/MeOH 92/8 v/v) pour donner une mousse
blanche.
Rendement : 72 %.
Rf : 0,56 (CH2C12/MeOH 85/15 v/v).
SM : (ESI+/MeOH) m/z : 226 [M+Na]+, 242 [M+K]+, 429
[2M+Na]+.
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
RMN 'H (400,13 MHz, D20) S ppm : 2,86 (dd, 1 H, J6a-5 = 7,4 Hz,
J6a-6b = 17,3 Hz, H6a) ; 3,04 (dd, 1H, J6b-5 = 3,6 Hz, J6b-6a = -17,3 Hz, H6b)
; 3,44 (s,
3H, OCH3) ; 3,60 (t, 1 H, J4-5 = J4.3 = 9,7 Hz, H4); 3,76 (dd, 1 H, J3, = 9,6
Hz, J3-2 = 3,4
Hz, H3) ; 3,84 (ddd, 1 H, J5-6a = 7,1 Hz, J5-6b = 3,2 Hz, J5-4 = 10,1 Hz, H5)
; 3,96 (dd,
5 1H, J2_3 = 3,4 Hz, J2-1= 1,7 Hz, H2) ; 4,78 (d, 1H, J1_2 = 1,5 Hz, H1).
RMN 13C (100,62 MHz, D20) S ppm : 51,4 (1C, C6) ; 55,2 (1C,
OCH3) ; 67,8 (1C, C5) ; 70,2 (1C, C2) ; 70,7 (1C, C3) ; 71,6 (1C, C4) ; 101,4
(1C, C1).
3) Troisième étape : Préparation de l'acide (6,7-Didésoxy-a-D-manno-
heptopyranoside de méthyle) uronigue (I-2)
10 200 mg (0,98 mmol - 1 éq.) du 6-déoxy-6-cyano-a-D-manno-
heptopyranoside de méthyle (7), obtenus ci-dessus à l'étape précédente, ont
été dissous
dans 2 mL d'une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène (H202) à 30%, avant
d'ajouter 60 mg (1,46 mmol, 1,5 éq) de soude (NaOH). La solution a été laissée
à
température ambiante. Au bout de 12 heures puis de 24 heures de réaction, on a
à
15 nouveau ajouté au milieu réactionnel 1 mL de la solution de peroxyde
d'hydrogène et
30 mg de soude.
Après 48 heures, le milieu réactionnel a été neutralisé par des résines
Amberlites H+, avant d'être filtré et lyophilisé. Le produit obtenu a ensuite
été purifié
par chromatographie sur gel de silice avec un gradient d'élution (CH2C12
jusqu'à
CH2C12/MeOH 85/15 v/v).
Rf : 0,25 (isopropanol / NH4OH 85/15 v/v).
Rendement : 80%.
SM : (ESI+/MeOH) m/z : 245 [M+Na]+.
SM : (ESI-/MeOH) m/z : 221 [M-Hl-
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
16
EXEMPLE 3 : PRÉPARATION DU 6-DÉOXY-6-MALONATE-a-D-
MANNOPYRANOSIDE DE MÉTHYLE (Composé I-3)
rOH OH
8
0
7 0
6 OH
HO 4 5 0
Z
HO
OCH3
(I-3)
1) Première étape : Préparation du 2,3,4-tri-O-benzyl-6-Déoxy-6-[bis(2,2,2-
trifluoroéthyl)malonatel-a-D-mannopyranoside de méthyle (Composé 8)
a3, F3 a3, F3
~00
8 8
0 7 0
a 6 0 y{i
u
B 6
3 2
Do h
OCH3
(8)
765 mg (1,65 mmol - 1 éq.) de 2,3,4-tri-O-benzyl-a-D-
mannopyranoside de méthyle, 530 mg (1,98 mmol - 1,2 éq.) de bis(2,2,2-
trifluoroéthyl)malonate et 866 mg (3,3 mmol - 2 éq.) de triphénylphosphine ont
été
dissous dans 10 mL de toluène. 833 mg (3,3 mmol - 2 éq.) de
1,1'-(azodicarbonyl)dipipéridine (ADDP) ont ensuite été ajoutés par fraction
(pendant
30 minutes). Le mélange a été laissé sous agitation magnétique à température
ambiante et la réaction a été suivie par CCM (Et20/EP 4/6 v/v). Après 48
heures, le
milieu réactionnel a été filtré sur silice, concentré et déposé directement
sur colonne.
Le produit a été purifié par chromatographie sur gel de silice avec un
gradient
d'élution (EP jusqu'à EP/Et2O 85/15 v/v) pour donner une huile incolore.
Rendement : 55 %.
Rf : 0,79 (Et20/EP 6/4 v/v).
SM : (ESI+/MeOH) m/z : 713 [M+Na]+.
SM : (ESI-/MeOH) m/z : 737 [M-H]-.
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
17
RMN'H (400,13 MHz, CDC13) 8 ppm : 2,45 (ddd, 1H, J6a-5 = 10,0
Hz, J6a-6b = -14,4 Hz, J6a-7 = 4,9 Hz, H6a) ; 2,87 (ddd, 1H,J6b-5 = 2,6 Hz,
J6b-6a = 14,1
Hz, J6b-7 = 9,0 Hz, H6b) ; 3,51 (s, 3H, OCH3) ; 3,84 (td, 1 H,J5-4 = J5-6a =
9,7 Hz, J5-6b =
2,6 Hz, H5) ; 3,96 (t, 1 H, J4-3 = J4-5 = 9,3 Hz, H4) ; 4,02 (dd, 1 H, J2-1 =
1,9 Hz, J2-3 =
2,9 Hz, H2) ; 4,11 (dd, I H, J3-2 = 3,1 Hz, J3, = 9,2 Hz, H3) ; 4,11 (dd, I H,
J7-6a = 5,0
Hz, J7-6b = 9,2 Hz, H7) ; 4,72 (m, 4H, HY) , 4,84 (s, 2H, H1>) ; 4,87 (d, 1H,
J1-2 = 1,7
Hz, H1) ; vo = 4,96 (ABq, 2H, VA = 4,93, VB = 4,99, Ov = 24,8 Hz, JAB = 12,2
Hz, H1') ;
vo = 5,06 (ABq, 2H, VA = 4,90, VB = 5,21, Av = 121,8 Hz, JAB = 11,0 Hz, H1,)
7,50-7,62 (m, 15H, HPh).
RMN 13C (100,62 MHz, CDC13) 5 ppm : 31,5 (1C, C6) ; 48,4 (1C,
C7) ; 55,3 (1C, OCH3) ; 61,5 (q, 1C, JC-F= 37,2 Hz, C3=) ; 69,5 (1C, C5) ;
72,6, 73,4 et
75,7 (3C, CI,) ; 75,1 (1C, C2) ; 78,7 (1C, C4) ; 80,5 (1C, C3) ; 99,7 (1C, CI)
; 123,1 (q,
1C, JC-F = 276,9 Hz, C4=) ; 127,3-128,9 (15C, CHPh) ; 138,7, 138,8 et 138,9
(3C,
CIVPh) ; 167,4 et 167,7 (2C, C8).
RMN '9F (188,31 MHz, CDC13) 3 ppm : -74,14 (dd, JF-H = 8,5 Hz).
2) Deuxième étape : Préparation du 6-Déoxy-6-malonate-a-D-mannopyranoside
de méthyle (Composé I-3).
2-a) Hydrogénolyse des benzyle
ÇF3 CF3 ÇF3 ÇF3
0 0 0 0
0 0Rn o o~
BB-n0 1 0
OCH3 OCH3
(8) (9)
380 mg (0,53 mmol - 1 éq.) de 6-déoxy-6-[bis(2,2,2-
trifluoroéthyl)malonate]-2,3,4-tri-O-benzyl-a-D-mannopyranoside de méthyle (8)
tel
qu'obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 20 mL de MeOH
avant
d'ajouter 130 mg de palladium sur charbon (Pd/C). Le milieu réactionnel a été
placé
sous atmosphère d'hydrogène pendant 12 heures, puis filtré sur silice et
concentré pour
donner une mousse blanche, directement remise en réaction.
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
18
Rendement : 90 %.
Rf : 0,34 (Et20).
2-b) Hydrolyse du motif malonate
CF3 CF3
0 0 OH OH
0 0
%
H0 H0 0
OCH3 OCH3
(9) (I-3)
211 mg de 6-déoxy-6-[bis(2,2,2-trifluoroéthyl)malonate]-a-D-
mannopyranoside de méthyle (9) ont été dissous dans 5 mL d'une solution de
méthanol ammoniacal saturée et laissés pendant 5 heures à 5 C. Le milieu
réactionnel
a ensuite été concentré, puis le produit a été purifié par chromatographie sur
gel de
silice avec un gradient d'élution (CH2Cl2/MeOH 9/1 v/v jusqu'à CH2ClZ/MeOH
65/45
v/v) pour donner un solide blanc.
Rendement : 90 %.
Rf : 0,28 (CH2CI2/MeOH 75/25 v/v).
SM : (ESI-/MeOH) m/z : 279 [M-H]
RMN 'H (400,13 MHz, D20) S ppm : 1,96 (m, 1H, H6a) ; 2,49 (m,
1 H, H6b) ; 3,41 (s, 3H, OCH3) ; 3,49 (m, 2H, H3 et H4) ; 3,61 (dd, 1 H, J7-6a
= 5,75 Hz,
J7-6b = 9,68 Hz, H7) ; 3,71 (m, 1H, H5) ; 3,92 (dd, 1H, J2_1 = 1,68 Hz, J2.3 =
3,26 Hz,
H2) ; 4,72 (s, 1H, H1).
RMN 13C (100,62 MHz, D20) S ppm : 31,8 (1C, C6) ; 49,9 (1C,
C7) ; 55,5 (1C, OCH3) ; 70,2, 70,6 et 71,0 (4C, C2, C3, C4 et C5) ; 101,3 (1C,
C1)
174,1 et 174,9 (2C, C8).
EXEMPLE 4 : MISE EN ÉVIDENCE DE L'ACTIVITÉ INHIBITRICE DU
M6P ET DE TROIS DE SES DÉRIVÉS SUR L'ANGIOGÉNESE -
COMPARATIF AVEC TROIS DÉRIVÉS DE D-MANNOPYRANOSIDE NE
FAISANT PAS PARTIE DE L'INVENTION
Dans cet exemple on a étudié l'activité du mannose-6-phosphate
(M6P) et des composés de formule (I-1), (I-2) et (I-3) tels que préparés
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
19
respectivement aux exemples 1 à 3 ci-dessus sur l'inhibition de l'angiogénèse,
comparativement à trois dérivés de D-mannopyranoside (DM) ayant une activité
pro-
angiogénique et ne faisant donc pas partie de l'invention (DM1 : 7-amino-6,7-
didésoxy-a-D-mannopyranoside de méthyle ; DM2 : 6-azido-6-déoxy-a-D-
mannopyranoside de méthyle et DM3 : 7-disodiumphosphonato-6,7-didésoxy-(X-D-
manno-heptopyranoside de méthyle). Cette étude a été réalisée sur des embryons
de
poulet selon la méthode décrite par Ribatti D. et al., Nat. Protoc., 2006,
1(1), 85-91
avec quelques modifications mineures.
1) Matériel et Méthode
Cette étude a été réalisée sur la membrane chorioallantoïdienne
(CAM) d'embryon de poulet. La CAM est une membrane extra-embryonnaire formée
le 4ème jour de l'incubation par la fusion du chorion et de l'allantoïde. Elle
permet
d'assurer les échanges gazeux entre l'embryon de poulet et l'environnement
extra
embryonnaire jusqu'à la naissance. Cette CAM est composée d'un réseau
capillaire
très épais qui forme une surface continue en contact direct avec la coquille.
La
prolifération capillaire rapide de cette membrane continue jusqu'au 11ème jour
; l'index
mitotique diminue alors rapidement et le système vasculaire atteint son
organisation
finale au 18ème jour, juste avant la naissance (éclosion le 21ème jour).
Des ceufs fertilisés de poulet de race Leghorn blanche ont été placés
dans un incubateur dès le début de l'embryogenèse où ils ont été conservés
sous
humidité constante à une température de 38 C. Au deuxième jour de
l'incubation, une
fenêtre a été ouverte dans la coquille après élimination de 2 à 3 mL
d'albumine afin de
détacher la CAM de la coquille. La fenêtre a ensuite été scellée avec du ruban
adhésif
et l'oeuf a été remis dans l'incubateur pour poursuivre son développement
jusqu'au jour
de l'expérience. Au 7ème jour, des morceaux de polymères synthétiques inertes
(disques filtres de nitrocellulose de 0,4 cm de diamètre) ont été imbibés par
20 L de
chacune des solutions des composés à tester (6 mg/mL dans du PBS) puis
positionnés
sur la CAM. L'impact des substances testées sur l'angiogenèse a alors été
observé au
12ème jour et l'évaluation quantitative de la réponse pro- ou anti-
angiogénique a été
estimée visuellement.
CA 02723768 2010-11-05
WO 2009/138601 PCT/FR2009/000525
2) Résultats
Les résultats obtenus ont été photographiés et sont donnés sur la
figure 1 annexée sur laquelle on peut observer que le M6P ainsi que les
composés
(I-1) (I-2) et (I-3) ont un effet inhibiteur sur la vascularisation des
embryons de
5 poulet. A l'inverse, les dérivés DM I, DM2 et DM3 ne faisant pas partie de
l'invention
ont un effet d'activation sur la vascularisation des embryons de poulets. Ces
résultats
démontrent que malgré une structure chimique très proche des dérivés de
D-mannopyranose peuvent avoir des comportements totalement opposés sur la
modulation de l'angiogenèse.
10 L'ensemble de ces résultats démontre clairement que les composés
de formule (I) conformes à l'invention ont une action d'inhibition de
l'angiogenèse.
