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WO 2010/049611
PCT/FR2009/001263
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Copolymères à blocs à base de polysaccharide et de polypeptide, les vésicules
constituées de ces copolymères et leur utilisation
L'invention concerne un nouveau copolymère dibloc
polysaccharide-b/oc-polypeptide, biorésorbable ou biodégradable et
biocompatible, son procédé de préparation, les vésicules micellaires
constituées de ce copolymère, et leur utilisation pour l'encapsulation, le
transport, la vectorisation, et le ciblage de molécules d'intérêt, naturelles
ou
synthétiques, ayant ou non une activité thérapeutique.
Il existe naturellement chez les organismes vivants des structures
vésiculaires résultant de l'assemblage de biomolécules amphiphiles formées à
partir de lipides, de protéines et de carbohydrates. Ces vésicules naturelles
sont de taille variable, les plus grandes jouant le rôle de membranes qui
protègent le contenu intracellulaire de l'environnement extracellulaire, alors
que
les petites vésicules lipidiques jouent un rôle de transporteur de
biomolécules à
l'intérieur de la cellule.
Des structures vésiculaires stables ont pu être préparées par
synthèse, en commençant par les liposomes dans les années 1960, obtenus
par assemblage de phospholipides naturels ou synthétiques, jusqu'aux
récentes vésicules de polymères formées par l'assemblage de copolymères à
blocs synthétiques, appelées polymersomes (B.M.Discher et al., Science
1999, 284, 1143).
Les polymersomes semblent très prometteurs pour le
développement d'applications biomédicales, notamment pour le transport
d'agents thérapeutiques ou comme microréacteurs mimant le comportement
des cellules vivantes.
De plus, les polymersomes présentent de nombreux
avantages par rapport aux liposomes, notamment une concentration critique
d'agrégation plus faible, une structure vésiculaire unilamellaire ou
multilamellaire associée avec une faible dispersion de taille, et une
stabilité
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membranaire plus élevée diminuant la fuite passive des molécules
encapsulées.
De plus, la diversité chimique des copolymères à blocs permet
d'envisager des possibilités infinies de modification des propriétés de la
vésicule pour la conformer à l'application souhaitée.
La plupart des polymersomes rapportés dans la littérature ont
été formés par assemblage de composés synthétiques amphiphiles, comme,
par exemple, le polylactide-b/oc-poly(oxyde d'éthylène), le poly(butadiène)-
b/oc-
poly(oxyde d'éthylène), la polycaprolactone-bloc-poly(oxyde d'éthylène) et la
poly(2-méthyloxazoline)-bloc-poly(diméthylsiloxane)-bloc-poly(2-méthyloxa-
zoline), très étudiés du fait de la biocompatibilité ou de la biorésorbabilité
de
leurs blocs respectifs.
L'intérêt scientifique s'est ensuite porté sur des assemblages
comportant des blocs naturels, tels que des polypeptides ou des
polysaccharides. En particulier, l'intérêt pour des assemblages de
polypeptides
repose sur le fait qu'ils présentent des propriétés physicochimiques uniques :
ils
sont optiquement actifs par nature, biocompatibles et biodégradables dans
certains cas, peuvent servir à mimer des séquences polypeptidiques naturelles,
et sont capables de subir des transitions conformationnelles réversibles selon
les conditions de pH et/ou de température.
Les copolypeptides à blocs représentent une sous-classe
particulière associant deux blocs synthétiques polypeptidiques qui combinent
une capacité d'auto-assemblage et de structures tridimensionnelles hautement
ordonnées. Ils ont été décrits dans la littérature comme des matériaux
prometteurs pour des applications telles que les biocapteurs, l'ingénierie
tissulaire ou la libération sélective de principes actifs. La chimie des
copolymères à blocs à base de polypeptides a été étudiée de manière
approfondie dans la littérature, en utilisant la polymérisation par ouverture
de
cycle des monomères N-carboxyanhydrides (en anglais NCA ) des acides
aminés correspondants, amorcée par des dérivés aminés. En adaptant la
technique de couplage par cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen,
communément appelée chimie-click (en anglais click-chemistry ), dont le
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principe repose sur la formation d'une liaison 1,2,3 triazole-1,4
disubstituée,
combinant des conditions opératoires douces, la tolérance des groupes
fonctionnels et un rendement élevé, à ce type de copolymères, des
copolymères à blocs à base de polypeptides ont été préparés, comme par
exemple le poly(L-glutamate de y-benzyle)-bloc-poly(E-trifluoroacetyl-L-
Lysine)
(D. Taton et S. Lecommandoux, Macromolecular Rapid Communications, 2008,
29, 1147).
En utilisant des méthodes chimiques plus conventionnelles,
d'autres copolypeptides à blocs ont pu être synthétisés, tels que le poly(L-
acide
glutamique)-bloc-poly(L-lysine) (J. Rodriguez-Hemandez et S. Lecommandoux,
J.A.C.S, 2005, 127, 2026) ou le poly(L-lysine)-bloc-poly(L-leucine) (E.G.
Bellomo et al., Nat. Mater., 2004, 3, 244) ou encore le poly(L-lysine)-bioc-
poly(y-benzyl-L-glutamate)-b/oc-poly(L-lysine) (H. latrou et al., Biomacro-
molecules, 2007, 8, 2173).
Il est possible d'obtenir par cette chimie des tailles de vésicules
très variables, allant de 100 nm à quelques pm, en faisant varier les
conditions
opératoires, jusqu'à des vésicules géantes allant jusqu'à 50 pm utilisées
comme modèles des membranes de cellules vivantes.
La chimie des copolymères blocs à base de polysaccharides a fait
l'objet de plus rares études, du fait de sa complexité. Récemment, un procédé
de synthèse de copolymère dibloc dextrane-bioc-polystyrène par polymérisation
radicalaire contrôlées par transfert d'atome (en anglais ATRP ) a été
rapportée (C.Houga et al., Chem. Commun., 2007, 3063). Le nombre de
systèmes copolymères à blocs basés sur des sucres qui a été étudié est limité,
et il existe peu d'informations disponibles sur leur comportement en solution
et
leurs propriétés.
Par exemple, il a été décrit que le dextrane-bloc-poly(e-
caprolactone) s'auto-assemble dans l'eau en structures micellaires
polydisperses ayant un diamètre moyen d'environ 100 nm (J. Liu et al.,
Carbohydrate Polymers, 2007, 69, 196).
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Cependant, il n'a jamais été décrit ni suggéré dans la littérature de
copolymères à blocs combinant dans une seule chaîne linéaire un segment
polypeptidique et un bloc polysaccharide.
On a maintenant trouvé qu'il était possible, par la synthèse de
structures associant, dans un copolymère, des blocs d'unités saccharidiques et
des blocs d'unités peptidiques, de préparer des composés permettant de mimer
les structures naturelles glycoprotéiques qui sont impliquées dans de nombreux
mécanismes biologiques.
Une glycoprotéine est une protéine portant au moins un
groupement polysaccharidique et une chaine polypeptidique. Chez les
organismes uni- ou multi-cellulaires, de nombreuses glycoprotéines se trouvent
sur la face externe de la membrane plasmique, la partie glyc,osylée étant
orientée vers le milieu extracellulaire. Les glycoprotéines sont présentes, en
particulier, chez les microorganismes tels que les virus et les bactéries.
Ainsi,
beaucoup de microorganismes pathogènes ont évolué de façon à reconnaître
les sucres présents à la surface des cellules et s'en servent comme points
d'ancrage et d'entrée dans les cellules à infecter. Par exemple, le virus VIH
pénètre dans les cellules du système immunitaire en se liant à des récepteurs
membranaires tels que les récepteurs CXCR4 et CXCR5, qui sont des
glycoprotéines.
Ainsi, il est particulièrement intéressant de disposer de structures
synthétiques biomimétiques pouvant mimer les glycoprotéines et susceptibles
de s'auto-assembler sous forme de vésicules. Ceci permet, par exemple, de
former des virus synthétiques mimant la structure des virus et leur rôle
fonctionnel, et permettant d'envisager une délivrance intracellulaire efficace
de
molécules d'intérêt.
Pour aboutir à la synthèse de telles structures complexes, il a été
nécessaire de mettre en oeuvre des réactions chimiques modernes, qui doivent
être particulièrement bien contrôlées, en particulier les réactions de chimie-
click permettant un couplage efficace et quantitatif des différentes entités
chimiques dans des conditions douces.
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L'invention a donc pour objet, selon un premier aspect, un copolymère dibloc
polysaccharide-b/oc-polypeptide constitué d'un bloc d'unités saccharidiques
naturelles
ou synthétiques et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques.
Une réalisation de l'invention concerne un copolymère amphiphile dibloc
polysaccharide-b/oc-polypeptide constitué d'un bloc d'unités saccharidiques
naturelles
ou synthétiques comprenant de 5 à 100 unités et d'un bloc d'unités peptidiques
naturelles ou synthétiques comprenant de 5 à 100 unités, caractérisé en ce que
ledit
polysaccharide est l'acide hyaluronique, le copolymère dibloc est linéaire et
le bloc
polysaccharide et le bloc polypeptide sont reliés par leurs extrémités.
Une autre réalisation de l'invention concerne le copolymère ci-dessus défini,
caractérisé en ce qu'il comprend de 10 à 100 unités saccharidiques et de 10 à
100
unités peptidiques.
Une autre réalisation de l'invention concerne le copolymère ci-dessus défini,
caractérisé en ce qu'il comprend de 10 à 50 unités saccharidiques et de 10 à
50 unités
peptidiques.
Une autre réalisation de l'invention concerne le copolymère ci-dessus défini,
caractérisé en ce que le polypeptide, dans lequel l'acide aminé qui le
constitue peut-
être sous forme optiquement active L ou D ou sous forme racémique DL, est
choisi
parmi le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle), la
poly(trifluoroacétyl-
Lysine), la poly(sarcosine), la poly(hydroxyéthyl-asparagine), la
poly(hydroxyalkyl-
asparagine), la poly(hydroxyalkyl-aspartamide), le poly(aspartate de benzyle)
et leurs
dérivés.
Une autre réalisation de l'invention concerne le copolymère ci-dessus défini,
caractérisé en ce que ledit polysaccharide est hydrophile et ledit polypeptide
est
hydrophobe en conditions physiologiques.
Une autre réalisation de l'invention concerne le copolymère ci-dessus défini,
caractérisé en ce que le polypeptide est choisi parmi le poly(L-glutamate de y-
benzyle)
et la poly(E-trifluoroacétyl-L-lysine).
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,
5a
Une autre réalisation de l'invention concerne un procédé de préparation d'un
copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide tel que ci-dessus défini,
caractérisé
en ce qu'il comprend les étapes consistant à :
- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à
introduire une
fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polysaccharidique,
- introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne
polypeptidique, et
- coupler la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique dans un
solvant
commun.
Une autre réalisation de l'invention concerne un procédé de préparation d'un
copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide tel que ci-dessus défini,
caractérisé
en ce qu'il comprend les étapes consistant à:
- introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polypeptidique,
- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à
introduire une
fonction azoture à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, et
- coupler la chaîne polypeptidique et la chaîne polysaccharidique dans un
solvant
commun.
Une autre réalisation de l'invention concerne un procédé tel que ci-dessus
défini,
caractérisé en ce que l'introduction de la fonction azoture ou alcyne est
effectuée à
l'aide d'un agent bifonctionnel.
Une autre réalisation de l'invention concerne un vésicule micellaire formée à
partir d'un copolymère amphiphile dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide
constitué d'un
bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques comprenant de 5 à 100
unités
et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques comprenant de 5 à
100
unités, ledit polysaccharide est l'acide hyaluronique, le copolymère dibloc
est linéaire et
le bloc polysaccharide et le bloc polypeptide sont reliés par leurs
extrémités.
Une autre réalisation de l'invention concerne le vésicule micellaire ci-dessus
défini, caractérisée en ce que ledit copolymère comprend de 10 à 50 unités
saccharidiques, et de 10 à 50 unités peptidiques.
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5b
Une autre réalisation de l'invention concerne le vésicule micellaire ci-dessus
défini, caractérisée en ce que le polypeptide, dans lequel l'acide aminé qui
le constitue
peut-être sous forme optiquement active L ou D ou sous forme racémique DL, est
choisi parmi le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle), la
poly(trifluoroacétyl-Lysine), la poly(sarcosine), la poly(hydroxyéthyl-
asparagine), la
poly(hydroxyalkyl-asparagine), la poly(hydroxyalkyl-aspartamide), le
poly(aspartate de
benzyle) et leurs dérivés.
Une autre réalisation de l'invention concerne le vésicule micellaire ci-dessus
défini, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est hydrophile et ledit
polypeptide est
hydrophobe en conditions physiologiques.
Une autre réalisation de l'invention concerne le vésicule micellaire ci-dessus
défini, caractérisée en ce que le polypeptide est choisi parmi le poly(L-
glutamate de y-
benzyle) et la poly(c-trifluoroacétyl-L-lysine).
Une autre réalisation de l'invention concerne le vésicule micellaire ci-dessus
défini, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une molécule d'intérêt,
naturelle ou
synthétique, choisie parmi un principe actif de médicament, un peptide, une
protéine,
une hormone, une enzyme, un acide nucléique, un oligonucléotide, un antigène,
un
anticorps, un interféron, un facteur de croissance, un modulateur d'activité
enzymatique, un activateur ou un inhibiteur de récepteur cellulaire et une
vitamine.
Une autre réalisation de l'invention concerne le vésicule micellaire ci-dessus
défini, caractérisée en ce qu'elle est formée à partir d'un copolymère dibloc
polysaccharide-bloc-polypeptide dans lequel le polysaccharide ou le
polypeptide
présente une affinité pour au moins un récepteur cellulaire.
Une autre réalisation de l'invention concerne le vésicule micellaire ci-dessus
défini, caractérisée en ce que ledit polysaccharide ou ledit polypeptide est
susceptible
d'être impliqué dans un mécanisme d'endocytose contrôlée.
Une autre réalisation de l'invention concerne le vésicule micellaire ci-dessus
défini, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est utilisée pour la
prévention ou
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=
5c
le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique,
in vitro ou in
vivo, chez l'animal ou encore sur des cellules isolées.
Une autre réalisation de l'invention concerne une utilisation d'une vésicule
micellaire formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-
polypeptide, telle
que ci-dessus définie, pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation
et/ou le ciblage
d'au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, choisie parmi un
principe
actif de médicament, un peptide, une protéine, une hormone, une enzyme, un
acide
nucléique, un oligonucléotide, un antigène, un anticorps, un interféron, un
facteur de
croissance, un modulateur d'activité enzymatique, un activateur ou un
inhibiteur de
récepteur cellulaire et une vitamine
Une autre réalisation de l'invention concerne l'utilisation ci-dessus définie,
caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est utilisée dans le domaine
pharmaceutique ou médical.
Une autre réalisation de l'invention concerne l'utilisation ci-dessus définie,
caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est utilisée dans au moins un
domaine
choisi parmi l'imagerie médicale, la cosmétique, l'hygiène, le nettoyage et la
détergence, la phytopharmacie, l'agroalimentaire et la chimie organique.
Une autre réalisation de l'invention concerne une composition pharmaceutique
comprenant une vésicule micellaire tel que ci-dessus définie et un excipient
pharmaceutiquement acceptable.
Par copolymère à blocs , comme par copolymère dibloc , on entend une
structure linéaire dans laquelle un bloc polysaccharide et un bloc polypeptide
sont reliés
par leurs extrémités.
Leur structure linéaire est une caractéristique avantageuse des copolymères
selon l'invention.
En effet, la modification chimique de chaînes polymères (y compris des chaînes
peptidiques) sur les groupements latéraux, qui conduit à des structures
greffées, peut
être effectuée par des réactions chimiques simples. Cependant, de telles
modifications
résultent souvent dans des structures mal définies : nombre de greffons
variable,
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,
5d
répartition homogène ou hétérogène le long de la chaîne, manque de
reproductibilité,
etc.
Ces inconvénients majeurs sont incompatibles avec un développement
industriel, en particulier dans le domaine pharmaceutique. La structure
linéaire des
copolymères selon l'invention permet avantageusement d'avoir degré de contrôle
et
une reproductibilité élevés de la structure copolymère, assurant ainsi une
régularité des
propriétés.
Ce contrôle moléculaire, associé à une prédiction et un contrôle des
propriétés
interfaciales, permet de former des vésicules de façon reproductible et
prédictible.
Avantageusement, le copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide selon
l'invention est biorésorbable ou biodégradable et biocompatible.
Dans la suite de la description, les expressions bloc d'unités
saccharidiques ,
bloc polysaccharide ou polysaccharide peuvent être utilisées
indifféremment
pour désigner un enchaînement d'unités monomères saccharidiques formant un
polysaccharide ou un dérivé de polysaccharide. De même, on utilisera
indifféremment
les expressions bloc d'unités peptidiques , bloc polypeptide ou
polypeptide
pour désigner un enchaînement
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d'unités monomères peptidiques formant un polypeptide ou un dérivé de
polypeptide.
Le copolymère dibloc selon l'invention peut comprendre tout type
de polysaccharide naturel ou synthétique, ou d'un de ses dérivés, et tout type
de polypeptide naturel ou synthétique, ou d'un de ses dérivés.
Par dérivés de polysaccharide , on entend les composés issus
d'une modification chimique d'un polysaccharide, susceptible de conférer, par
exemple, un caractère hydrophobe à un polysaccharide naturellement
hydrophile, ou, éventuellement, d'ajouter de nouveaux groupes fonctionnels sur
la molécule.
De tels dérivés peuvent être, par exemple, des dérivés esters ou
éthers, en particulier des esters organiques; des esters inorganiques tels que
les phosphates ou les sulfates; des dérivés éthers non ioniques, tels que, par
exemple, les dérivés alkyles, hydroxyalkyles ou les hydroxyalkylaryles ; les
dérivés éthers ioniques, tels que, par exemple, les dérivés sulfopropyles,
carboxyméthyles ou les (diéthylamino)éthyles ; ou encore d'autres dérivés tels
que les conjugués de polysaccharides, les dérivés para-toluènesulfonate,
thiols
ou sylilés.
Des polysaccharides préférés peuvent être, par exemple, choisis
parmi le dextrane, l'acide hyaluronique et leurs dérivés.
Des dérivés de polysaccharides et des procédés de modification
de polysaccharides sont décrits, par exemple, dans les ouvrages de référence
Polysaccharides I , Adv. Polym. Sci. (2005), 186, et Polysaccharides Il ,
Adv. Polym. Sci. (2006), 205.
Par dérivés de polypeptide , on entend les composés issus
d'une modification chimique d'un polypeptide, susceptible de conférer, par
exemple, un caractère hydrophobe à un polypeptide naturellement hydrophile,
ou, éventuellement, d'ajouter de nouveaux groupes fonctionnels sur la
molécule.
De tels dérivés peuvent être, par exemple, des dérivés esters ou
éthers, en particulier des esters organiques; aliphatiques ou aromatiques, des
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esters inorganiques; des dérivés éthers, tels que, par exemple, les dérivés
alkyles ou hydroxyalkyles, des dérivés amides ou imines, etc.
Selon un aspect préféré, le copolymère dibloc polysaccharide-
bloc-polypeptide peut comprendre un bloc polysaccharide qui présente un
caractère hydrophile et un bloc polypeptide qui présente un caractère
hydrophobe en conditions physiologiques, soit par nature ou par modification
chimique lui conférant une hydrophobicité.
Selon un autre aspect préféré, le copolymère dibloc
polysaccharide-b/oc-polypeptide peut comprendre un bloc polysaccharide qui
présente un caractère hydrophobe, notamment par modification chimique
susceptible de conférer une hydrophobicité à un polysaccharide naturellement
hydrophile, et un bloc polypeptide qui présente un caractère hydrophile en
conditions physiologiques.
De ce fait, les copolymères dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide
selon l'invention sont des composés amphiphiles aptes à s'auto-assembler pour
former un nouveau type de vésicules micellaires assemblées à base de
polymères naturels ou synthétiques. Par rapport aux vésicules existantes,
notamment les liposomes, les applications de ces vésicules à base de
copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide offrent de nouvelles
possibilités grâce aux propriétés intrinsèques des polymères utilisés.
En effet, les vésicules à base de copolymère dibloc
polysaccharide-bloc-polypeptide présentent notamment les avantages
suivants : un caractère biocompatible et biorésorbable ou biodégradable, une
stabilité élevée en solution aqueuse, une capacité à encapsuler des espèces
hydrophiles et hydrophobes, et une diversité de fonctions chimiques pouvant
être aisément mise à profit pour modifier la surface des vésicules et leur
conférer ainsi une propriété particulière telle que l'affinité pour un
récepteur
biologique.
L'utilisation de polysaccharides ou de polypeptides particuliers
présentant la propriété d'être des ligands de récepteurs cellulaires permet
également de préparer des vésicules micellaires permettant la libération
ciblée
de molécules d'intérêt, ledit polysaccharide pouvant, de par sa nature, être
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impliqué dans des mécanismes d'endocytose contrôlée par un récepteur (en
anglais Receptor mediated endocytosis ou RME).
Les copolymères selon l'invention peuvent comprendre, en
particulier, de 5 à 100 unités saccharidique et de 5 à 100 unités peptidiques,
notamment de 10 à 100 unités saccharidique et de 10 à 100 unités peptidiques
et, de préférence, environ 10 à environ 50 unités saccharidiques et environ 10
à
50 unités peptidiques. Le rapport massique polymère hydrophile/polymère
hydrophobe peut être, par exemple, d'environ 1/1.
Des copolymères avantageux selon l'invention présentent une
masse molaire de 1000 à 50000 g/mole.
Le polysaccharide peut être choisi, par exemple, parmi le
dextrane, la chitine, le chitosane, l'acide hyaluronique, le pullulane, le
fucane, le
fucane sulfaté, le succinoglycane, le galactane, l'arabinogalactane, le
galactane
sulfaté, les alginates, le glucane, l'acide polysialique, l'héparine,
l'héparane
sulfate, le chondroitine sulfate, l'acharane sulfate, le kératane sulfate, le
dermatane sulfate, le xanthane, la pectine, le xylane, l'amylose,
l'amylopectine,
la cellulose, l'agarose, le mannane, les galactomannanes, le curdlane,
l'arabinane, les carraghénanes, le schizophyllane et leurs dérivés.
Le polypeptide, dans lequel l'acide aminé qui le constitue peut être
sous forme optiquement active L ou D ou sous forme racémique DL, peut être
choisi, par exemple, parmi la poly(alanine), la poly(arginine), le poly(acide
aspartique), la poly(asparagine), le poly(aspartate), la poly(cystéine), le
poly(acide glutamique), le poly(glutamate), la poly(glutamine), la
poly(glycine),
la poly(histidine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(lysine), la
poly(méthionine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la
poly(pyrrolysine), la
poly(sélénocystéine), la poly(sérine), la poly(thréonine), le
poly(tryptophane), la
poly(tyrosine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le
poly(glutamate
d'alkyle), la poly(trifluoroacétyl-Lysine), la poly(sarcosine) la
poly(hydroxyéthyl-
asparagine), la poly(hydroxyalkyl-asparagine), la poly(hydroxyalkyl-
aspartamide), le poly(aspartate de benzyle) et leurs dérivés.
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Dans un aspect préféré, ledit polypeptide est hydrophobe en
conditions physiologiques.
Des polypeptides hydrophobes préférés sont, par exemple, le
poly(L-glutamate de y-benzyle) et la poly(E-trifluoroacétyl-L-lysine).
Selon un autre aspect avantageux, ledit polypeptide est hydrophile
en conditions physiologiques.
Des polypeptides hydrophiles préférés sont, par exemple, le
poly(L-acide glutamique), le poly(L-glutamate) et la poly(L-lysine).
Aux fins de l'invention, le polypeptide peut être obtenu par un
procédé de polymérisation par ouverture de cycle du monomère N-
carboxyanhydride (NCA) de l'acide aminé correspondant, cité plus haut.
L'invention concerne également, selon un aspect ultérieur, un
procédé de préparation des copolymères dibloc polysaccharide-bioc-
polypeptide biorésorbables ou biodégradables et biocompatibles décrits ci-
dessus.
Comme indiqué plus haut, la synthèse des copolymères selon
l'invention met en uvre des réactions chimiques bien contrôlées, en
particulier
les réactions de chimie-click)) permettant un couplage efficace et
quantitatif
dans des conditions douces.
Parmi les réactions de chimie-click , on peut citer, par exemple,
les cycloadditions d'espèces insaturées (par exemple, les cycloadditions 1,3-
dipolaires azide-alcyne, les réactions de Diels Aider entre un diène et un
diènophile), les réactions impliquant un groupe carbonyle électrophile, de
type
non aldol (par exemple, formation d'éthers d'oxime à partir d'une oxyamine,
d'hydrazones à partir d'une hydrazine, ou de thiosemicarbazones à partir d'une
thiosemicarbazine), les réactions mettant en jeu un groupement thiol
(formation
de thioéthers à partir d'un alcène et de disulfures mixtes), les réactions
impliquant des fonctions acides thiocarboxyliques ou thioesters (formation des
liaisons thioesters et amides) et les ligations de Staudinger impliquant des
fonctions phosphine et azide.
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Chacun des groupes fonctionnels cités ci-dessus peut être
introduit indifféremment sur le groupement polypeptide ou sur le groupement
polysaccharide pour le couplage.
Selon une alternative préférée, le procédé selon l'invention pour la
5
préparation des copolymères dibloc polysaccharide-bioc-polypeptide comprend
les étapes consistant à:
- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de
manière à introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne
polysaccharidique,
10 -
introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne
polypeptidique, et
- coupler la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique
dans un solvant commun.
Selon une autre alternative du procédé selon l'invention, ledit
procédé comprend les étapes consistant à:
- introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne
polypeptidique,
- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de
manière à introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne
polysaccharidique, et
- coupler la chaîne polypeptidique et la chaîne polysaccharidique
dans un solvant commun.
Le couplage de la chaîne polypeptidique et de la chaîne
polysaccharidique, ou inversement, ainsi que les copolymères dibloc à
structure
linéaire ainsi obtenus, sont représentés schématiquement sur la figure 1.
Les aspects préférés de l'invention relatifs aux copolymères dibloc
polysaccharide-bioc-polypeptide, tels que mentionnés plus haut, s'appliquent
également à leur procédé de préparation.
L'amination réductive peut être effectuée, par exemple, à l'aide
d'une amine telle que la propargylamine en présence d'un agent réducteur tel
que le borocyanohydrure de sodium.
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La fonction azoture ou alcyne peut être introduite à l'extrémité de la chaîne
polypeptidique à l'aide d'un agent bifonctionnel, tel que le 3-
azidoaminopropane, la
fonction aminé servant à amorcer la polymérisation par ouverture de cycle du
monomère NCA de l'acide aminé correspondant. La longueur du bloc polypeptide
peut
ainsi être contrôlée par le rapport molaire monomère NCA/agent bifonctionnel.
En tant que solvant pour l'étape de couplage de la chaîne polysaccharidique et
la chaîne polypeptidique, on peut utiliser, par exemple, un solvant organique
tel que le
diméthylsulfoxyde (DMSO). Cette réaction est, de préférence, catalysée par des
dérivés
de cuivre, tel que, par exemple, CuBr, en présence d'un ligand, par exemple le
pentaméthyldiéthylènetriamine. La chaîne hydrophile, polypeptide ou
polysaccharide,
peut être ajoutée en léger excès, de l'ordre de 2 équivalents molaire, puis
éliminée par
dialyse, afin d'assurer une réaction de couplage quantitative et la formation
de
copolymères à blocs purs.
L'invention concerne également, selon un aspect ultérieur, de nouvelles
vésicules micellaires formées à partir de copolymères dibloc polysaccharide-
b/oc-
polypeptide constitués d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou
synthétiques et
d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques, reliés par leur
extrémité dans
une structure de chaîne linéaire, tel que décrits plus haut.
De préférence, lesdits copolymères comprennent de 5 à 100 unités
saccharidiques et de 5 à 100 unités peptidiques, notamment de 10 à 100 unités
saccharidiques et de 10 à 100 unités peptidiques, et, de préférence, environ
10 à
environ 50 unités saccharidiques et environ 10 à environ 50 unités
peptidiques.
Avantageusement, lesdits copolymères sont biorésorbables ou biodégradables,
et biocompatibles.
En tant que polysaccharide et polypeptide préférés, il y a lieu de se référer
aux
aspects préférés de l'invention relatifs aux copolymères dibloc polysaccharide-
b/oc-
polypeptide, tels que mentionnés plus haut, qui s'appliquent également
auxdites
vésicules micellaires.
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Les vésicules micellaires selon l'invention peuvent être préparées
par différents procédés usuels tels que, par exemple, la dissolution directe,
l'hydratation de film, le procédé d'émulsification/diffusion ou la
nanoprécitation.
On utilisera de préférence la nanoprécipitation, qui consiste à mélanger une
solution de polymère dans un solvant organique miscible à l'eau.
L'introduction
d'une solution organique du copolymère dibloc selon l'invention dans l'eau
sous
agitation modérée induit simultanément une séparation de phases et un
procédé d'auto-assemblage qui progresse au fur et à mesure que le solvant
organique diffuse dans la phase aqueuse, celle-ci étant en excès par rapport à
la phase organique. Un solvant organique approprié est, par exemple, le
diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le formamide. Après élimination du solvant
organique par évaporation et/ou dialyse, on récupère les vésicules directement
en solution aqueuse. Elles peuvent ensuite être lyophilisées afin de les
obtenir
sous la forme d'un extrait sec redispersable. Leur taille peut être modulée en
ajustant le procédé d'émulsification/diffusion ou de nanoprécitation (sens
d'ajout, nature du solvant organique, volume des phases, concentration en
copolymère...).
Leur taille peut aussi être facilement contrôlée et adaptée en
fonction de l'application souhaitée. Elle peut être notamment réduite jusqu'à
environ 100nm après formation par action d'ultrasons ou par extrusion sur des
membranes de porosité contrôlée lorsqu'on envisage une application
biomédicale. Dans d'autres applications, par exemple dans le domaine de la
cosmétique, de l'hygiène, du nettoyage ou autres, les vésicules selon
l'invention
peuvent présenter une taille de l'ordre du pm ou de plusieurs dizaines de pm.
Les vésicules micellaires selon l'invention peuvent être
caractérisées par diffusion dynamique et statique de la lumière, diffusion de
neutrons aux petits angles et microscopie électronique en transmission. De
telles techniques pour la caractérisation des systèmes micellaires sont
décrites,
par exemple, dans G.Riess, Pro gress in Polymer Science, 2003, 28, 1107.
Dans un aspect avantageux, ladite vésicule micellaire formée à
partir de copolymères dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide contient au moins
une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité
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thérapeutique. Cette molécule peut être introduite, en fonction de sa
polarité,
dans la phase aqueuse ou dans la phase organique avant le procédé de
nanoprécipitation. Elle est ainsi encapsulée durant le processus de
fabrication
de la vésicule. Elle peut aussi être introduite après la formation des
vésicules
par des méthodes de gradient de pH ou d'émulsification/diffusion.
Par molécule ayant une activité thérapeutique , on entend, par
exemple, une molécule naturelle ou synthétique utilisée pour la prévention ou
le
traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in
vitro
ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore
sur
des cellules isolées. De telles molécules peuvent être, par exemple, un
principe
actif de médicament, tel qu'un antibiotique, un antalgique, un
antiinflammatoire,
un antitumoral, etc. ou encore un peptide, une protéine, une hormone, une
enzyme, un acide nucléique, un oligonucléotide, un antigène, un anticorps, un
interféron, un facteur de croissance, un modulateur d'activité enzymatique, un
activateur ou un inhibiteur de récepteur cellulaire, une vitamine etc.
De telles molécules ayant une activité thérapeutique peuvent être
utilisées, par exemple, dans le domaine pharmaceutique ou médical.
Le cas échéant, l'encapsulation de ladite molécule ayant une
activité thérapeutique dans une vésicule micellaire selon l'invention permet
de
diminuer significativement la toxicité de ladite molécule. En particulier la
toxicité
bien documentée des agents antitumoraux, telle que, notamment, leur
cardiotoxicité, par exemple dans le cas de l'utilisation de la doxorubicine ou
de
la mitoxantrone ou leur neurotoxicité, par exemple dans le cas de
l'utilisation de
la vincristine, peuvent être significativement diminuées.
Par molécule d'intérêt n'ayant pas d'activité thérapeutique , on
entend, par exemple, une molécule naturelle ou synthétique qui n'est pas
utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la
restauration
d'une fonction biologique, in vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal,
y
compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées. Le cas échéant, une
telle molécule peut néanmoins présenter une activité biologique, notamment
vis-à-vis des végétaux ou des microorganismes. On peut citer, à titre
d'exemples non limitatifs, les domaines d'application suivants :
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- l'imagerie médicale : agents de diagnostic, tels que, par
exemple, des agents de contraste, des isotopes, des sondes fluorescentes
- la cosmétique et l'hygiène : molécules olfactives, pigments,
colorants, antioxydants, agents antibactériens, agents antiseptiques, agents
émollients, agents exfoliants, agents hydratants, etc;
- le nettoyage et la détergence : tensioactifs, colorants,
antioxydants, antibactériens, antiseptiques, agents blanchissants, etc;
- la phytopharmacie :
pesticides, fongicides, herbicides,
insecticides, accélérateurs de croissance, etc,
- l'agroalimentaire : agents colorants, exhausteurs de goût etc,
- la chimie organique : dérivés catalytiques organiques,
métalliques ou inorganiques, etc,
ou dans tout autre domaine d'activité dans lequel on souhaite
encapsuler une molécule dans une vésicule micellaire, celle-ci présentant
l'avantage d'être biorésorbable ou biodégradable et biocompatible.
L'utilisation des vésicules micellaires formées à partir de
copolymères dibloc polysaccharide-Noc-polypeptide constitués d'un bloc
d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités
polypeptidiques naturelles ou synthétiques, tel que décrits plus haut, en tant
que véhicules pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation et/ou le
ciblage
d'au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une
activité thérapeutique, représente un autre aspect de l'invention.
L'invention concerne également les
compositions
pharmaceutiques comprenant les vésicules micellaires formées à partir de
copolymères dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide constitués d'un bloc
d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités
polypeptidiques naturelles ou synthétiques, et contenant au moins une
molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité
thérapeutique, telles que décrites plus haut, et un excipient
pharmaceutiquement acceptable.
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Les excipients pharmaceutiquement acceptables, peuvent être
choisis selon le mode d'administration envisagé parmi les excipients habituels
dans le domaine pharmaceutique.
Par exemple, pour une administration orale sous forme de
5 comprimés, les excipients peuvent être choisis parmi des liants, des
charges,
des agents de délitement, des adjuvants ou des agents retardateurs et pour
une administration par voie orale sous forme de suspensions, solutions ou
émulsions aqueuses ou huileuses, les compositions peuvent également
contenir des agents de mise en suspension; des agents émulsionnants, des
10 véhicules non aqueux ou des conservateurs
Pour une administration par voie parentérale, les compositions
pharmaceutiques peuvent se trouver sous forme de solutions injectables
stériles aqueuses et non aqueuses pouvant contenir des antioxydants, des
tampons, des agents bactériostatiques et des solutés qui rendent la
formulation
15 isotonique avec le sang du receveur choisi ; ou sous forme de
suspensions
aqueuses ou non aqueuses stériles qui peuvent comprendre des agents de
mise en suspension et des agents épaississants.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent
également être administrées par d'autres voies, telles que la voie buccale ou
sublinguale à l'aide d'un excipient adapté, la voie topique sur l'épiderme,
sous
forme de crème, de gel, de pommade, de lotion ou de timbre transdermique, la
voie intranasale, sous forme d'un liquide d'atomisation, d'une poudre ou de
gouttes ou par inhalation, au moyen d'un agent propulseur convenable.
Avantageusement, les vésicules micellaires selon l'invention sont
utilisables aussi bien pour l'encapsulation de molécules hydrophobes que de
molécules hydrophiles, car elles possèdent deux compartiments de polarité
différente, à savoir la membrane qui est hydrophobe et la cavité interne qui
est
hydrophile. Par ailleurs, comme l'auto-assemblage des copolymères en
vésicules se fait par des interactions faibles, la dissociation des vésicules
et la
libération concomitante de la molécule d'intérêt encapsulée peut être obtenue
dans des conditions définies (salinité, température, pH, hydrolyse, etc.)
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Selon un aspect préféré de l'invention, ladite vésicule micellaire
est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-bioc-polypeptide
dans lequel le polysaccharide présente une affinité pour au moins un récepteur
cellulaire.
Selon un autre aspect préféré de l'invention, ladite vésicule
micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-bioc-
polypeptide dans lequel le polypeptide présente une affinité pour au moins un
récepteur cellulaire.
Dans de tels cas, les vésicules micellaires pourront,
avantageusement, être utilisées pour le ciblage d'une molécule d'intérêt.
Parmi les polysaccharides de ce type, on peut citer, par exemple,
l'acide hyaluronique, qui présente une affinité pour les récepteurs CD44. Les
récepteurs CD44 sont présents à des niveaux élevés dans les cellules
tumorales de différents carcinomes, mélanomes, lymphomes etc ( Chemistry
and Biology of Hyaluronan , H.G. Garg et C.A. Hales Ed. (2004), Chapitre 5,
Elsevier Ltd).
Des polypeptides intéressants à cet égard sont, par exemple, le
poly(acide glutamique) ou le poly(glutamate). En effet, le poly(acide
glutamique)
ou le poly(glutamate) sont, par exemple, des ligands des récepteurs du
glutamate (Mornet C, Briley M, Trends Pharmacol Sci. 1988;9:278-279) ou des
récepteurs TLR4 (Poo et al. 22 (2) 517 - The FASEB Journal).
Dans un autre aspect préféré, ladite vésicule micellaire est formée
à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide dans lequel
ledit polysaccharide est susceptible d'être impliqué dans un mécanisme
d'endocytose contrôlée par un récepteur (en anglais Receptor mediated
endocytosis ou RME).
Alternativement, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un
copolymère dibloc polysaccharide-bioc-polypeptide dans lequel ledit
polypeptide est susceptible d'être impliqué dans un mécanisme d'endocytose
contrôlée par un récepteur.
L'endocytose contrôlée par un récepteur est un mécanisme
biologique par lequel des molécules présentes dans l'espace extracellulaire se
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lient à des récepteurs cellulaires et sont internalisées, permettant également
le ciblage
d'une molécule d'intérêt.
Un polysaccharide intéressant aux fins de l'invention est l'arabinogalactane,
qui
interagit avec des récepteurs hépatocytaires intervenant dans des mécanismes
d'endocytose contrôlée.
Des polysaccharides susceptibles d'être impliqués dans des mécanismes
d'endocytose contrôlée par un récepteur sont mentionnés, par exemple, dans les
brevets US 5 336 506 et 5 554386.
Brève description des dessins
Des aspects préférés de la présente invention seront mieux compris à la
lecture de
la description qui va suivre qui fait référence aux dessins renfermant les
Figures 1 à 12 ci-
après définis.
- Figure 1 décrit le schéma général de synthèse des copolymères à blocs.1
polysaccharide azoture. 2: polypeptide alcyné. 4: polysaccharide alcyné. 5:
polypeptide azoture. 3 et 6: copolymères à blocs polysaccharide-bloc-
polypeptide.
- Figure 2 représente la distribution en taille des vésicules (rayon
hydrodynamique)
obtenue par diffusion de la lumière, obtenues selon l'exemple 4.
- Figure 3 représente une image de microscopie électronique en transmission
obtenue sur des vésicules selon l'exemple 4.
- Figure 4 représente la distribution en tailles des vésicules (rayon
hydrodynamique)
obtenue par diffusion de la lumière, obtenues selon l'exemple 5.
- Figure 5 représente une image de microscopie électronique en transmission
obtenue sur des vésicules selon l'exemple 5.
- Figure 6 représente le profil de libération exprimé en pourcentage de
relargage
cumulé en fonction du temps (en seconde 'A), de Doxorubicine libre (-o-) (rond
vide)
et de Doxorubicine encapsulé (rond plein) dans les vésicules selon
l'invention.
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17a
- Figure 7 représente le profil de libération exprimé en pourcentage de
relargage
cumulé en fonction du temps (en seconde 'A), de Docétaxel libre (-o-) (rond
vide) et
de Docétaxel encapsulé (rond plein) dans les vésicules selon l'invention.
- Figure 8 représente le suivi en microscopie de fluorescence in vitro sur les
cellules
C6 après 24 h d'incubation en présence des vésicules contenant la
Doxorubicine.
- Figure 9 représente l'intensité de fluorescence relative mesurée en unité
arbitraire
(UA) dans les cellules MCF-7 mesurée après incubation en présence de
Doxorubicine encapsulée (en noir), de Doxorubicine libre (en gris) et sans
Doxorubicine (hachurée), en présence ou en absence d'acide hyaluronique libre.
- Figure 10 rapporte la variation de volume de la tumeur en fonction du temps,
suite
au traitement par la Doxorubicine libre (courbe représentée par un triangle),
la
Doxorubicine encapsulée (courbe représentée par un carré) ou le PBS (courbe
représentée par un point).
-
Figure 11 représente la courbe de survie de Kaplan-Meier des animaux porteurs
de
tumeurs après injection unique de Doxorubicine libre ou de Doxorubicine
encapsulée.
- Figure 12 représente les taux sériques de créatine kinase (A) et de lactate
déshydrogénase (B) chez des animaux sains porteurs de tumeurs induites par le
DMBA, traités avec la Doxorubicine libre ou encapsulée.
L'invention est illustrée de manière non limitative par les exemples ci-
dessous.
Exemple 1 : préparation d'un copolymère dibloc acide hyaluronique-bioc-poly (L-
glutamate de v-benzyle)
Préparation du poly(L-glutamate de y-benzyle) possédant une fonction azoture
(PBLG-azoture)
6 g (22,81 mmol) de N-carboxyanhydride de L-glutamate de y-benzyle sont
introduits sous atmosphère d'argon dans un ballon de type schlenk
préalablement
flammé sous vide, et dissous dans 60 ml de DMF anhydre. La solution est agitée
10
min et 57 pL de 1-azido-3-aminopropane (570 pmol) sont ajoutés au moyen d'une
seringue purgée à l'azote. La solution est agitée 40 h sous vide à température
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17b
ambiante. Le polymère est récupéré par précipitation dans l'éther diéthylique
puis
séché sous vide. La masse de produit récupéré est 4,2 g (rendement : 70%)
L'analyse
par spectroscopie RMN du proton fournit un degré de polymérisation moyen en
nombre
de 23. Analyse 1H RMN (CDCI3 : acide trifluoroacétique deutéré, 85 : 15) : 1,8
ppm (N3-
CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 1,9 et 2,1 ppm (-CH2-CH2-CH- , 2H); 2,5 ppm (-CH2-CO, 2H);
2,6 ppm (N3-CH2-CH2-CH2- , 2H); 3,4 ppm (N3-CH2-CH2-CH2- , 2H); 4,6 ppm
(-NH-CH-00- , 1H); 5,1 ppm (-CH2-C6H5 , 2H); 7,3 ppm (-C6H5 , 5H); 7,9 ppm
(NH,
1H).
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Préparation de l'acide hyaluronique possédant une fonction alcyne (acide
hyaluronique alcyné)
L'acide hyaluronique (2,2 g; 6.10-4 mol) possédant un degré de polymérisation
moyen en nombre égal à 10 est solubilisé dans un tampon acétate (pH= 5,6) à
une concentration massique de 2 cio. 2,82 mL (4,4.10-2 mol) de propargylamine
et 2,77 g (4,4.10-2 mol) de borocyanohydrure de sodium sont ajoutés au milieu
sous agitation. Après 5 jours de réaction à 50 C et sous agitation le mélange
réactionnel est concentré à l'évaporateur rotatif et précipité dans 400 mL de
méthanol froid. Le solide est récupéré par centrifugation et lavé au méthanol
refroidi pour éliminer l'excès de propargylamine et de borocyanohydrure de
sodium. Le précipité est alors séché sous vide pendant 2 jours. La masse de
produit récupéré est 2,2 g (rendement : 100 A)). Analyse 1H RMN (D20) : 3,35
ppm (C(2)H, GIcA); 3,59 ppm (C(3)H, GIcA); 3,72 ppm (C(5)H, GIcA); 3,73 ppm
(C(4)H, GIcA); 4,48 ppm (C(1)H, GIcA); 2,03 ppm (CH3, 31-I, GIcNAc); 3,50 ppm
(C(5)H, GIcNAc); 3,55 ppm (C(4)H, GIcNAc); 3,72 ppm (C(3)H, GIcNAc); 3,86
ppm (C(2)H, GIcNAc); 3,90 ppm (C(6)H, GIcNAc); 4,54 ppm (C(1)H, GIcNAc);
8,22 (NH, GIcNAc); 3,72 ppm (C(3)H, p, GIcNAc); 3,83 ppm (C(2)H, p, GIcNAc);
3,91 ppm (C(3)H, a, GIcNAc); 4,05 ppm (C(2)H, a, GIcNAc); 4,73 ppm (C(1)H,
p, GIcNAc); 5,16 ppm (C(1)H, a, GIcNAc); 8,41 ppm (NH, a, GIcNAc); 8,47 ppm
(NH, (3, GIcNAc).
Préparation du copolymère acide hyaluronique-bloc-poly(L-glutamate de
y-benzyle)
Deux équivalents d'acide hyaluronique alcyné (2,1 g; 4,2.10-4 mol) et un
équivalent de PBLG azoture (1,05 g ; 2,1.10-4 mol) sont solubilisés dans 70 mL
de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 87,04 pL de
pentaméthyldiéthylènetriamine (4,1.10-4 mol) sont ajoutés sous atmosphère
d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de
congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type
schlenk contenant du CuBr (60 mg; 4,18.10-4 mol). Le mélange réactionnel est
laissé sous agitation à 60 C pendant 3 jours puis dialysé contre de l'eau
milliQ
à pH 3,5 en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por caractérisée par
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un seuil de coupure de 50kDa. Le copolymère est alors récupéré par
centrifugation et séché sous vide pendant deux jours. La masse de produit
récupéré est 1,5 g (rendement : 70%). Analyse 1H RMN (DMSO d6 - 60 C) : 1,8
ppm (CH3, GIcNAc); 1,9 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 2,05 et 2,25 ppm (-
CH2-CH2-CH-, 2H) ; 2,5 ppm (CH2-00-, 2H) ; 2,65 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-,
2H) ; 3,1 ppm (C(2)H, GIcA) ; 3,2 ppm (C(3)H, GIcA) ; 3,1-3,7 ppm (C(3)H,
C(4)H, C(5)H, 3H, GIcNAc) ; 3,5 et 3,7 ppm (C(6)H, GIGNAc) ; 3,1-3,7 ppm
(C(4)H, C(5)H, 2H, GIcA) ; 3,5 et 3,7 ppm (C(2)H, a et g, GIcNAc) ; 4,2 et
4,35
ppm (C(1)H, a et (3, GIcA) ; 4,58 ppm (C(1)H, GIcNAc) ; 4,6 ppm (-NH-CH-CO,
1H) ; 5 ppm (-CH2-C6H5, 2H) ; 7,25 ppm (-C6H5, 5H) ; 7,6 ppm (-N3-
C(CH2)=CH-, 1H) ; 8,2 ppm (-NH-CH-00- , 1H).
Exemple 2: préparation d'un copolymère dibloc dextrane-b/oc-
polv(L-qlutamate de y-benzyle)
Préparation du dextrane possédant une fonction alcyne (dextrane alcyné)
3 g de dextrane (4,54.10-4 mol) possédant un degré de polymérisation moyen
en nombre égal à 40 sont introduits dans un ballon équipé d'un réfrigérant et
dissous par agitation magnétique dans un tampon acétate ajusté à pH=5 à une
concentration finale de polymère de 2% en masse. La propargylamine est
ajoutée en large excès (2,5g; 4,54.104 mol) sous agitation. Une fois le milieu
homogène, l'agent réducteur (NaBH3CN) est ajouté au milieu réactionnel en
large excès (2,85g ; 4,54.104 mol). La solution est laissée sous vive
agitation
dans un bain à 50 C pendant 5 jours avec un ajout quotidien d'une quantité
définie d'agent réducteur (25 équivalents molaires par rapport au dextrane).
Le
milieu réactionnel est ensuite concentré par évaporation rotative puis dialysé
contre de l'eau en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Poe
caractérisée par un seuil de coupure de 2kDa. Le polymère est enfin récupéré
par lyophilisation. La masse de polymère obtenue est 2,24 g, soit un rendement
massique de 74%. Analyse 1H RMN (DMSO d6) : 3,17 ppm (C(4)H);
3,2ppm(C(2)H) ; 3,42ppm (C(3)H) ; 3,5 et 3,75 ppm (C(6)H, 2H); 3,62ppm
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(C(5)H) ; 4,5 ppm (C(2)0H); 4,65 ppm (C(1)H) ; 4,85 ppm (C(3)0H) ; 4,95 ppm
(C(4)0H).
Préparation du copolymère dextrane-bloc-poly(L-glutamate de r-benzyle)
5 Deux équivalents de dextrane alcyné (0,4 g; 6,06.10-5 mol) et un
équivalent de
PBLG-azoture (0,147 g; 3,03.10-5 mol) sont solubilisés dans 25mL de DMSO
anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 12,6 pL de
pentaméthyldiéthylènetriamine (6,06.10-5 mol) sont ajoutés sous atmosphère
d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de
10 congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type
schlenk contenant du CuBr (9 mg; 6,06.10e mol). Le mélange réactionnel est
laissé sous agitation à température ambiante pendant 3 jours puis dialysé
contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por0
caractérisée par un seuil de coupure de 50kDa. Le copolymère est alors
15 récupéré par lyophilisation. La masse de produit récupéré est 0,302 g
(rendement : 87%). Analyse 1H RMN (DMSO d6) : 1,9 ppm (-N3-CH2-CH2-
CH2-, 2H); 2 et 2,15 ppm (-CH2-CH2-CH-, 2H) ; 2,45 ppm (CH2-00-, 2H) ;
2,65 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 3,1 ppm (N3-CH2-CH2-CH2, 2H); 3,15
ppm (C(4)H); 3,17 ppm (C(2)H); 3,42 (C(3)H) ; 3.5 et 3,75 ppm (C(6)H, 2H);
20 3,62 ppm (C(5)H) ; 4,5 ppm (C(2)0H) ; 4,65 ppm (C(1)H); 4,88 ppm
(C(3)0H) ) ; 4,9-5 ppm (C(4)0H) ; 7.2 ppm (C6H5, 5H) ; 8,25 ppm (-NH-CH-
CO- , 1H).
Exemple 3: préparation d'un copolymère dibloc dextrane-b/oc-
poly(E-trifluoroacétyl-L-lysine)
Préparation du poly(e-trifluoroacétyl-L-lysine) possédant une fonction
azoture (poly(e-trifluoroacétyl-L-lysine)-azoture)
2 g (7,46.1e mol) de N-carboxyanhydride de E-trifl uoroacétyl-L-lysine sont
introduits sous atmosphère d'argon dans un ballon de type schlenk
préalablement flammé sous vide, et dissous dans 21 mL de DMF anhydre. La
solution est agitée 10 min et 9 pL de 1-azido-3-aminopropane (94 pmol) sont
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ajoutés au moyen d'une seringue purgée à l'azote. La solution est agitée 40 h
sous vide à température ambiante. Le polymère est récupéré par précipitation
dans l'éther diéthylique puis séché sous vide. La masse de produit récupéré
est 1,5 g (rendement : 75%). L'analyse par spectroscopie RMN du proton
fournit un degré de polymérisation moyen en nombre de 64.
Analyse 1H RMN (DMSO d6) : 1,1-2 ppm (-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-, 6H);
3,12 ppm (CO-NH-CH2-, 2H); 3,8ppm ( CO-CH-NH, 1H) ; 8,2 ppm (-NH-CH-
CO- , 1H) ; 9,3 (CF3-CO-NH-, 1H)
Préparation du copolymère dextrane-bloc-poly(e-tritluoroacétyl-L-lysine)
Deux équivalents de dextrane alcyné (0,4 g; 6,06.10-5 mol) et un équivalent de
poly(e-trifluoroacétyl-L-lysine)-azoture (0,271 g; 3,03 10-5 mol) sont
solubilisés
dans 30mL de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 12,6 pL de
pentaméthyldiéthylènetriamine (6,06.10-5 mol) sont ajoutés sous atmosphère
d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de
congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type
schlenk contenant du CuBr (9 mg; 6,06.10-5 mol). Le mélange réactionnel est
laissé sous agitation à température ambiante pendant 3 jours puis dialysé
contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por
caractérisée par un seuil de coupure de 50kDa. La masse de produit récupéré
après lyophilisation est 0,320 g (rendement : 67%). Analyse 1H RMN (DMSO
d6) : 1,1-2 ppm (-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-, 6H); 3,12 ppm (CO-NH-CH2-,
2H) ; 3,15 ppm (C(4)H); 3,17 ppm (C(2)H); 3,42 (C(3)H) ; 3,5 et 3,72 ppm
(C(6)H, 2H) ; 3,62 ppm (C(5)H) ; 3,8ppm (CO-CH-NH, 1H) ; 4,5 ppm (C(2)0H) ;
4,65 ppm (C(1)H); 4,88 ppm (C(3)0H) ) ; 4,9-5ppm (C(4)0H) ; 8,2 ppm (-NH-
CH-CO-, 1H) ; 9,3 (CF3-CO-NH-, 1H).
Exemple 4: préparation de vésicules micellaires à base de
copolymère acide hyaluronique-b/oc-poly(L-qlutamate de 'y-benzyle)
Le copolymère acide hyaluronique-bloc-poly(L-glutamate de y-
benzyle) de l'exemple 1 est dissous dans le DMSO à 55 C à une concentration
de 5 mg/mL et injecté au moyen d'un pousse seringue à 18mL/h dans un
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volume de tampon Tris (10 mM, pH=7,4 ; [NaCI] = 145 mM) jusqu'à atteindre
une concentration finale en copolymère de 1mg/mL. Le solvant organique est
éliminé par dialyse contre un tampon tris (10 mM, pH=7,4 ; [NaCI] = 145 mM)
en utilisant une membrane de dialyse (6 Spectra/Poe) possédant un seuil de
coupure en masse molaire de 2kDa. Une solution de vésicules est ainsi
obtenue et caractérisée par diffusion dynamique et statique de la lumière,
diffusion de neutrons aux petits angles et microscopie électronique en
transmission.
On obtient ainsi des vésicules polymères de 200nm de rayon avec
une faible distribution en taille, et possédant une épaisseur de membrane
d'environ 9nm.
La figure 2 représente la distribution en taille des vésicules (rayon
hydrodynamique) obtenue par diffusion de la lumière. La figure 3 représente
une image de microscopie électronique en transmission obtenue sur ces
mêmes vésicules.
Exemple 5: préparation de vésicules micellaires à base de
copolymère dibloc dextrane-bloc-poly(L-qlutamate de y-benzyle)
Le copolymère dextrane-b/oc-poly(L-glutamate de y-benzyle) de
l'exemple 2 est dissous dans 1mL de DMSO à une concentration de 0,5mg/mL,
puis 9mL d'eau milliQ sont ajoutés progressivement à l'aide d'un pousse
seringue à 18mL/h sous agitation. Le DMSO est ensuite éliminé par dialyse
contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por0
caractérisée par un seuil de coupure de 2kDa. Les vésicules alors formées sont
analysées par diffusion dynamique de la lumière et microscopie électronique à
transmission.
On obtient ainsi des vésicules polymères de 40 nm de rayon avec
une faible distribution en taille.
La figure 4 représente la distribution en taille des vésicules (rayon
hydrodynamique) obtenue par diffusion de la lumière. La figure 5 représente
une image de microscopie électronique en transmission obtenue sur ces
mêmes vésicules.
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Exemple 6: encapsulation d'un principe actif dans une vésicule
micellaire
La doxorubicine et le docetaxel ont été encapsulés dans des
vésicules micellaires à base du copolymère acide hyaluronique-b/oc-poly(L-
glutamate de y-benzyle) de l'exemple 1 par nanopréciptation.
Le principe actif a été dissous dans du DMSO ou du tampon Tris
dans des rapports massiques principe actif : copolymère de 0,1 :1, 0,2 :1 et
0,3 :1. Le copolymère à blocs est solubilisé dans la phase organique de DMSO
à 55 C. Cette solution est ajoutée à la solution aqueuse (tampon Tris pH =
7,4)
sous agitation continue à 55 C, ou inversement. Le principe actif libre et le
DMSO ont été éliminés par dialyse (seuil de coupure en masse molaire de
2kDa) contre du tampon Tris.
La quantité de doxorubicine encapsulée (dans la partie
hydrophobe ou hydrophile des vésicules) et l'efficacité d'encapsulation ont
été
déterminées en brisant les vésicules chargées dans un mélange DMSO :Tris
(80 :20). Après centrifugation pendant lh, l'échantillon a été filtré et
mesuré par
spectroscopie UV à 485 nm. La quantification a été effectuée à partir de la
courbe de calibration de la doxorubicine dans le mélange DMSO :Tris (80 :20).
La quantité de docetaxel encapsulé et l'efficacité d'encapsulation ont été
déterminées à partir de la reconstitution d'un extrait sec de vésicule
contenant
du docetaxel dans de l'éthanol. Ensuite, l'échantillon filtré a été mesuré par
spectroscopie UV à 230 nm. La quantification a été effectuée à partir de la
courbe de calibration de la doxorubicine dans l'éthanol.
Quantité encapsulée = (masse de principe actif dans la vésicule
chargée/masse de vésicule) x100
Efficacité d'encapsulation = (masse de principe actif dans la
vésicule chargée/masse initiale de principe actif) x100
Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous.
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Tableau 1
Rapport massique 0,1:1 0,2:1 0,3:1
principe actif :copolymère
doxorubicine (phase DMSO)
Quantité encapsulée (/0) 4,95 0,49 9,74 0,95 11,82
1,12
Efficacité d'encapsulation (%) 49,47 4,94 48,70 4,74 39,41 3,72
doxorubicine (phase aqueuse)
Quantité encapsulée (c/o) 5,32 0,58 10,51 0,32 12,43
1,19
Efficacité d'encapsulation (%) 53,50 6,21 52,56
1,60 41,45 3,97
docetaxel (phase DMSO)
Quantité encapsulée (c/o) 2,77 0,27 9,81 0.66 13,60
0,73
Efficacité d'encapsulation (%) 27,68 2,69 49,07 3.32 46,78 2,32
Les résultats montrent des taux d'encapsulations élevés de l'ordre
de 10% et une efficacité d'encapsulation aux alentours de 50%.
Exemple 7: libération d'un principe actif encapsulé dans une
vésicule micellaire
La quantité voulue (par exemple, un volume de 4mL à une
concentration de 1mg/mL) de vésicules chargées en doxorubicine et docetaxel
est versée dans un tube de dialyse (Spectra/Por Float-A-Lyzer 0, Dialysis
Tubes, seuil de coupure en masse molaire de 25kDa, diamètre 10mm, volume
10mL). Le tube de dialyse est introduit verticalement dans un cylindre de
mesure de 50 mL. Le système est maintenu à 37 C+2 et couvert de parafilm
pour éviter l'évaporation. Afin de maintenir les conditions osmotiques
requises,
2 mL ont été prélevés à l'extérieur du tube de dialyse pour chaque temps
d'échantillonnage et remplacés par le même volume de tampon Tris.
Dans le cas de la doxorubicine, l'échantillonnage est réalisé dans
le tube de dialyse, puis réinséré tel quel après analyse.
Pour le docetaxel, l'échantillonnage est réalisé à l'extérieur du
tube de dialyse. Le milieu de dialyse contenait 50 mL de tampon Tris (pH 7,4)
avec 2% v/v d'éthanol pour augmenter la solubilité du docetaxel libéré et
éviter
l'agrégation du docetaxel libre.
La quantification est effectuée par la courbe de calibration des
principes actifs libres dans leurs solvants respectifs.
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Les profils de libération exprimés en pourcentage de relargage
cumulé en fonction du temps (en seconde 1/2) sont représentés sur les figures
6
(doxorubicine) et 7 (docetaxel).
Le principe actif libre est représenté par symbole -o- (rond vide) et
5 la libération du principe actif encapsulé est représentée par le symbole -
0- (rond
plein).
Les résultats montrent clairement que la libération de ces deux
principes actifs peut être contrôlée sur plusieurs jours avec une cinétique
beaucoup plus lente que celle du principe actif libre. La libération semble
suivre
10 un modèle de diffusion homogène.
Exemple 8: libération et toxicité in vitro d'un principe actif
encapsulé dans une vésicule micellaire
Les expériences de toxicité et de libération in vitro ont été
15 réalisées à partir des vésicules à base de copolymère dibloc acide
hyaluronique-b/oc-poly(L-glutamate de y-benzyle) préparées dans l'exemple 6,
contenant 11% de doxorubicine.
Les expériences in vitro ont été réalisées sur des cellules du
gliome C6 du rat, dans un milieu de culture Dulbecco's rnodified Eagle's
20 (DMEM) contenant 5% de sérum de veau foetal. Les cellules C6 (5.105
cellules)
sont placées dans des falcons de 10cm de diamètre et croissent dans 10m1 du
milieu de culture contenant de la pénicilline (10000 pg/mL), de la
streptomycine
(10000 pg/mL) et de l'amphotéricine B (25 pg/mL) [Invitrogen Corporation] dans
un incubateur à 37 C dans une atmosphère contrôlée à 5% CO2.
25 Pour les tests de viabilité (ou toxicité) cellulaire, les cellules
C6 ont
été incubées dans une plaque de 24 puits (15.104 cellules par puits), pendant
24h. La viabilité a été déterminée par un test classique au sel de tétrazolium
MIT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-y1)-2,5-diphényl tétrazolium). Le
tétrazolium qu'il contient est réduit en formazan par la succinate
déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives. La couleur du
milieu passe alors du jaune au bleu-violacé. L'intensité de cette coloration
est
proportionnelle au nombre de cellules vivantes présentes lors du test.
L'analyse
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est réalisée par spectrophotométrie (U-2800A, HITACHI) en mesurant
l'absorbance à 570nm. Les mesures sont normées par une expérience de
contrôle, pour lequel le test MTT est réalisé sans cellules. On détermine
ainsi la
valeur d'IC50 pour un temps de 48h, correspondant à la concentration pour
laquelle la moitié des cellules restent viables.
Pour la doxorubicine libre, on obtient une valeur de 0,84 pM.
Pour les vésicules encapsulant la doxorubicine, une valeur 10 fois
supérieure (IC50=8,4 pM) est obtenue. La vésicule seule (sans doxorubicine)
n'a présentée aucune toxicité dans les conditions expérimentales
(concentration jusqu'à 200 pM, temps jusqu'à 72h).
Exemple 9: étude de l'internalisation cellulaire des vésicules
micellaires contenant un principe actif
Le suivi de l'internalisation cellulaire a été réalisé in vitro par
microscopie de fluorescence. Pour cela, les cellules C6 ont été incubées
(15.104 cellules) dans une plaque de 4 puits de 16mm. Les vésicules contenant
la doxorubicine à la concentration de 4,54 pM ont été incubées à des temps de
3h, 6h et 24h à 37 C dans une atmosphère contrôlée à 5% CO2. Pour chaque
temps d'observation, les cellules sont lavées 2 fois avec un tampon PBS,
fixées
sur un couvre-lame de microscope avec 4% de paraformaldéhyde (PF4) en
tampon PBS, laissées dans le noir à température ambiante pendant 30m in, puis
lavées une fois au tampon PBS et une fois à l'eau pure. L'observation
microscopique est réalisée avec un microscope de fluorescence Zeiss
(grossissement x 63, A ¨excitation = 546nm et Aémission = 590nm).
Le suivi en microscopie de fluorescence in vitro sur les cellules C6
après 24h d'incubation en présence des vésicules contenant la doxorubicine est
représenté sur la figure 8. Les vésicules contenant la doxorubicine sont
internalisées par endocytose. Après 24h d'incubation, on observe une forte
accumulation dans les endosomes provenant de l'internalisation des vésicules
contenant la doxorubicine. Les cellules montrent des excroissances
importantes, qui sont caractéristiques de cette internalisation.
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Exemple 10 : essai d'irritation cutanée chez le lapin
On a utilisé une dispersion à 1% (p/v) de copolymère dibloc acide
hyaluronique-bloc-poly(L-glutamate de y-benzyle) de l'exemple 1.
Cette dispersion a été appliquée à une dose de 0,5mL, sous
pansement semi-occlusif, pendant 4h sur une zone de peau saine chez 3
lapins.
Le protocole expérimental est celui de la Directive OCDE n 404
du 24 avril 2002 et de la méthode d'essai B.4 de la Directive EC 440/2008.
Aucune réaction cutanée (érythème ou oedème) n'a été observée
sur la zone traitée, quel que soit le temps de l'examen (24h, 48h et 72h après
l'enlèvement du pansement).
Exemple 11: Etude du potentiel d'irritation cutanée chez la souris
On a utilisé une dispersion à 1 ')/0 (p/v) de copolymère dibloc acide
hyaluronique-b/oc-poly(L-glutamate de y-benzyle) de l'exemple 1.
La dispersion de copolymère a été appliquée sur la surface
dorsale de l'oreille d'une lignée de souris femelles.
3 groupes de 4 animaux chacun ont été traités pendant trois jours
consécutifs (J1, J2, J3) avec 50 pl (25 pl par oreille) de dispersion de test
non
diluée (100%), d'une part, et de dispersion de test diluée dans du diméthyl
formamide (DMF) à des concentrations de 25% et de 50% (v/v). Un groupe
supplémentaire de 4 animaux a été traité avec du DMF.
Au 6ème jour, la prolifération des lymphocytes dans les ganglions
lymphatiques drainants de l'oreille a été déterminée par comptage cellulaire.
Le protocole expérimental a été établi conformément à la Directive
OCDE n 429 du 24 avril 2002 et à la méthode d'essai B. 42 de la Directive
EC 440/2008.
Les résultats ont montré que:
a) aucune mortalité ou signe de toxicité systémique
n'ont été observés chez les animaux testés et les animaux témoins ;
b) aucune réaction cutanée n'a été observée à des
concentrations de 25%, 50% et 100%.
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Les résultats montrent que la dispersion de copolymère selon
l'invention est non irritante aux trois concentrations testées.
Exemple 12: Evaluation de la dose maximale tolérée par voie
intraveineuse chez la souris
On a utilisé une dispersion à 1% (p/v) de copolymère dibloc acide
hyaluronique-bloc-poly(L-glutamate de y-benzyle) de l'exemple 1.
La dispersion de copolymère a été administrée par voie
intraveineuse chez un mâle et une femelle souris Swiss à un volume
d'administration de 10 mUkg. Considérant la densité de la formulation, cette
administration correspond à une dose de 10 g/kg.
Aucune mortalité n'a été observée durant les 14 jours de l'étude.
L'examen macroscopique des animaux à la fin du traitement n'a montré aucune
modification liée au traitement.
Les résultats montrent que la dose maximale tolérée (en anglais
maximal tolerated dose ou MTD) de la dispersion de copolymère selon
l'invention par voie intraveineuse est supérieure à 10 g/kg chez la souris.
Exemple 13: Etude du ciblaqe des récepteurs CD 44 lié à l'acide
hyaluronique par inhibition compétitive en présence d'acide hvaluronique libre
On a utilisé la lignée cellulaire humaine MCF-7 qui exprime de
manière significative les récepteurs CD 44.
Pour confirmer l'internalisation cellulaire de la doxorubicine
encapsulée par endocytose via les récepteurs spécifiques de l'acide
hyaluronique, un essai d'inhibition compétitive a été réalisé en ajoutant
préalablement de l'acide hyaluronique libre dans le milieu d'incubation de
manière à bloquer dans une certaine mesure les récepteurs de l'acide
hyaluronique à la surface des cellules.
Les cellules (0,1.106) ont été incubées pendant 1h à 37 C avec de
la doxorubicine pure ou de la doxorubicine encapsulée dans les vésicules
micellaires de l'exemple 6 (concentration en doxorubicine = 10pM) dans des
boîtes de 40mm de diamètre dans un milieu dépourvu de sérum, en présence
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ou en absence d'acide hyaluronique libre (PM=5000g/mol), à une concentration
de 2mg/mL.
Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec un tampon PBS
et collectées par centrifugation (1000 rpm pendant 10min). Les cellules ont
ensuite été remises en suspension dans 300pL de tampon PBS avant la
mesure.
Les échantillons ont été collectés sur un cytomètre à flux FACS
Calibur (Beckton Dickinson) et analysés en utilisant le logiciel Cell Quest
fourni
par le fabricant. Pour chaque analyse, au moins 10 000 cellules ont été
comptées.
On observe que la présence d'acide hyaluronique libre diminue
significativement l'intensité de fluorescence moyenne (IFM) de la doxorubicine
libre.
La figure 9 représente l'intensité de fluorescence relative mesurée
en unité arbitraire (UA) dans les cellules MCF-7 mesurée après l'incubation en
présence de doxorubicine encapsulée (colonne en noir), de doxorubicine libre
(colonne en gris) et sans doxorubicine (colonne hachurée), en présence ou en
absence d'acide hyaluronique libre.
Les résultats montrent que, pour la doxorubicine libre, l'incubation
en présence d'acide hyaluronique libre n'a pas ou peu d'effet sur
l'intemalisation (pas de diminution significative de l'intensité de
fluorescence
moyenne).
Ceci s'explique par le fait que la doxorubicine libre diffuse
librement dans les cellules, l'internalisation n'étant pas liée à la médiation
des
récepteurs CD 44.
En revanche, l'intensité de fluorescence en présence d'acide
hyaluronique libre, diminue significativement pour la doxorubicine encapsulée.
Ces résultats montrent le rôle des récepteurs d'acide hyaluronique
dans l'endocytose des vésicules micellaires à base d'acide hyaluronique selon
l'invention permettant la délivrance intracellulaire de la doxorubicine.
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Exemple 14: Evaluation in vivo de l'efficacité anti-tumorale de la
doxorubicine encapsulée.
1/ Protocole expérimental
5 Des femelles de rat Sprague-Dawley âgées de 8 semaines (120-
140g) ont été utilisées dans une étude de régression tumorale.
Du 7,12-diméthylbenzManthracène (DMBA) a été administré par
voie orale (dans de l'huile de soja) aux animaux en 3 doses de 45mg/kg à
intervalle d'une semaine, pour générer la tumeur.
10 Le traitement par la doxorubicine a été donné 10 semaines après
la dernière dose de DMBA. La largeur de la tumeur (L) et sa longueur (I) ont
été
enregistrées avec un pied à coulisse et la taille de la tumeur a été calculée
par
la formule (L x12 /2).
Après 10 semaines d'induction de tumeur, les animaux porteurs
15 de tumeurs ont été séparés et divisés de manière aléatoire en différents
groupes de traitement, puis traités avec une dose unique de 250111 par voie
intraveineuse de doxorubicine à 5mg/kg, soit sous forme de doxorubicine libre,
soit sous forme de doxorubicine encapsulée dans les vésicules micellaires de
l'exemple 6.
20 Le groupe témoin a reçu une dose unique de 2501.11 de tampon
PBS (pH 7,4) par voie intraveineuse.
L'étude a été terminée 30 jours après le traitement.
L'observation de la survie des animaux porteurs de tumeur ayant
été traités a été poursuivie jusqu'à 60 jours après le traitement.
2/ Activité anti-tumorale de la doxorubicine encapsulée
La figure 10 rapporte la variation de volume de la tumeur en
fonction du temps, suite au traitement par la doxorubicine libre (courbe
représentée par le symbole -V-), la doxorubicine encapsulée (courbe
représentée par le symbole -Cl-) ou le PBS (courbe représentée par le
symbole -,-).
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Les résultats montrent que la doxorubicine libre et la doxorubicine
encapsulée inhibent significativement la croissance de la tumeur en
comparaison du groupe témoin traité au PBS. Cependant, la doxorubicine
encapsulée provoque une suppression tumorale nettement supérieure à la
doxorubicine libre.
En effet, après 15 jours de traitement, on observe que la tumeur
continue à régresser avec la doxorubicine encapsulée, alors que la régression
atteint un palier avec la doxorubicine libre.
Sur la courbe de survie de Kaplan-Meier rapportée sur la Figure
11, dont chaque point représente la moyenne erreur type de la moyenne
(n=6), on a représenté le temps de survie des animaux après le début du
traitement, pour les animaux ayant reçu par administration intraveineuse la
doxorubicine encapsulée (droite continue), de la doxorubicine libre (droite en
tirets) et le groupe témoin (droite en pointillés).
Les résultats montrent l'absence de mortalité à 60 jours pour les
animaux traités par la doxorubicine encapsulée.
3/ Card iotoxicité
Un des principaux effets secondaires bien connus de la
doxorubicine est sa cardiotoxicité. Celle-ci peut être évaluée par la mesure
de
la production d'enzymes spécifiques, principalement la lactate déshydrogénase
et la créatine kinase.
La mesure du taux sérique de lactate déshydrogénase et de
créatine kinase des différents groupes d'animaux de l'expérimentation
ci-dessus montre que l'induction de lactate déshydrogénase et de créatine
kinase est inférieure chez les animaux traités par de la doxorubicine
encapsulée en comparaison de ceux traités par la doxorubicine libre, comme
rapporté sur les Figures 12A (créatine kinase) et 12B (lactate
déshydrogénase).
Les résultats montrent que la doxorubicine encapsulée induit un
faible niveau de lactate déshydrogénase et de créatine kinase ce qui implique
une diminution de la cardiotoxicité de la doxorubicine encapsulée dans les
vésicules micellaires selon l'invention.
CA 02741246 2011-04-20
WO 2010/049611
PCT/FR2009/001263
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Cette baisse de la cardiotoxicité est en accord avec la réduction
significative des effets secondaires et de la mortalité qui a été observée en
utilisant la doxorubicine encapsulée.
