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Nouvelle forme d'administration de complexes de protéines ostéogéniques
[0001] La présente invention concerne le domaine des formulations
ostéogéniques et plus particulièrement des formulations des protéines
ostéogéniques appartenant à la famille des Bone Morphogenetic Proteins, BMPs.
[0002] Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de
croissance impliqués dans les mécanismes d'ostéoinduction. Les BMPs appelées
également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par
Urist
en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir
d'os
cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre
d'animaux (Urist MR. Science 1965; 150, 893).
[0003] Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après
maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139
résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont
des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent
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résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant
un
cysteine knot (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ; Schlunegger
MP,J. Mol. Biol. 1993; 231, 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e
cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à
l'origine
de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287:103.).
[0004] Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire
en hétérodimères comme cela a été décrit par Israel et al. (Israel DI, Growth
Factors. 1996; 13(3-4), 291). Les BMPs dimériques interagissent avec les
récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004,
22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de
signalisation
intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à
l'activation ou à la répression des gènes cibles.
[0005] Les BMPs, à l'exception des BMP 1 et 3, jouent un rôle direct et
indirect
sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur
différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003,
85A
1544-1552). Elles possèdent en outre des propriétés de chimiotactisme et
induisent la prolifération, la différentiation et l'angiogénèse.
[0006] Certaines BMPs recombinantes humaines et notamment la rhBMP-2 et
la rhBMP-7 ont clairement montré une capacité à induire la formation d'os in
vivo
chez l'homme et ont été approuvées pour certaines applications médicales.
Ainsi,
la BMP-2 recombinante humaine, dibotermine alfa selon la dénomination
commune internationale, est formulée dans les produits commercialisés sous le
nom de InFUSE aux Etats-Unis et de InductOs en Europe. Ce produit est
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prescrit dans la fusion des vertèbres lombaires et la régénération osseuse du
tibia
pour les fractures dites non-union. Dans le cas d'InFUSE pour la fusion des
vertèbres lombaires, l'intervention chirurgicale consiste tout d'abord, à
imbiber
une éponge de collagène avec une solution de rhBMP-2, puis à placer l'éponge
dans une cage creuse, LT Cage, préalablement implantée entre les vertèbres.
[0007] La BMP-7 recombinante humaine, eptotermine alpha selon la
dénomination commune internationale, a les mêmes indications thérapeutiques
que la BMP-2 et constitue la base de deux produits : OP-1 Implant pour les
fractures ouvertes du tibia et OP-1 Putty pour la fusion des vertèbres
lombaires.
OP- 1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène
à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite
appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-1
Putty
se présente sous la forme de deux poudres : l'une contenant la rhBMP-7 et du
collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une
intervention
chirurgicale, la CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et
mélangée
avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le
site à
traiter.
[0008] L'administration des protéines ostéogéniques est un problème majeur
en raison de leur instabilité et de la nécessité qui apparait d'obtenir des
formulations ostéogéniques contenant une quantité minimale de protéine
ostéogénique. Ceci afin d'éviter les effets secondaires générés par des
concentrations importantes de ces protéines et également en raison du prix de
ces
protéines.
[0009] De nombreuses formulations ont été et sont développées comme par
exemple celles citées dans la revue de Seeherman (Seeherman, H. et al., Spine
2002, 27 (16 Suppl 1), S16-S23.), dans laquelle l'importance de la nature du
système de délivrance est soulignée.
[00010] Les systèmes de délivrance utilisés doivent permettre d'augmenter le
temps de rétention des protéines au site d'administration, d'obtenir une
libération
totale de la quantité de protéine mise en oeuvre et d'éviter une libération
trop
brutale pouvant entrainer une diffusion hors du site d'administration.
[00011] Le système de délivrance utilisé doit également pouvoir servir de
matrice à la croissance osseuse sur le site à traiter tout en permettant de
circonscrire cette croissance osseuse sur le site à traiter.
[00012] Quatre types de matériaux sont employés dans les systèmes de
délivrance à ce jour, les polymères naturels, les polymères synthétiques, les
matériaux inorganiques et les mélanges de ces matériaux.
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[00013] Aucun des systèmes développés n'a néanmoins permis de réduire
significativement la dose de BMP. Cela est lié entre autres, soit à
l'instabilité de la
protéine dans la formulation, soit à la mauvaise biodisponibilité de celle-ci
en
raison de la structure du support.
[00014] S'agissant des polymères naturels le collagène, les hyaluronanes, la
fibrine, les chitosans, les alginates et d'autres polysaccharides naturels
sont
utilisés.
[00015] Si les éponges à base de collagène recombinant permettent d'éIiminer
la plupart des inconvénients connus de ce polymère naturel, l'introduction
dans les
éponges de la protéine ostéogénique n'est pas à ce jour satisfaisante.
[00016] Les autres polysaccharides naturels sous forme d'hydrogels présentent
essentiellement le défaut d'être trop rapidement résorbés, sauf à être
préalablement réticulés sous forme de gels, ce qui conduit aux mêmes
inconvénients que ceux précités pour les éponges de collagène.
[00017] S'agissant des polymères synthétiques, les plus couramment utilisés
sont des polymères de poly(a-hydroxyacides) comme le polylactide (PLA), le
polyglycolide (PLG) et leurs copolymères (PLGA).
[00018] Les inconvénients majeurs de ces polymères sont les abaissements de
pH dus à leur dégradation et les réactions inflammatoires qu'ils peuvent
induire.
[00019] S'agissant des matériaux inorganiques, des systèmes de délivrance
combinant des phosphates de calcium avec une protéine ostéoinductrice ont été
développés.
[00020] Parmi ceux-ci, on citera les céramiques à base de phosphate de
calcium, comme l'hydroxyapatite (HAP) et le phosphate tricalcique (TCP) et les
phosphates de calcium non-céramiques , comme les ciments à base de
phosphates de calcium (CPCs).
[00021] Il est connu depuis les années 1970 que les céramiques de phosphate
de calcium peuvent avoir un intérêt pour la reconstruction osseuse comme cela
est rappelé dans la revue de M. Bohner (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl 4,
37-
47.).
[00022] Mais il est admis que la dose de BMP-2 efficace est plus importante
dans une céramique que dans une éponge de collagène. Une étude clinique de
fusion postérolatérale chez l'homme (Boden, S. D. et al., Spine 2002, 27 (23),
2662-2673.) rapporte que la dose de BMP-2 (40 mg) est plus importante avec des
granules de BCP (60 % HAP et 40 % TCP) produit développé par la société
MEDTRONIC SOFAMOR, que dans une éponge de collagène qui ne contient pas de
phosphate de calcium (12 mg).
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[00023] Afin de pallier cet inconvénient, un très grand nombre de systèmes ont
été développés à base de phosphate de calcium non-céramique et parmi ceux-ci
figurent les ciments de phosphate de calcium. Les ciments ont été découverts
dans les années 1980 par Brown et Chow et répondent à la définition suivante :
Les ciments de phosphate de calcium sont constitués d'une solution aqueuse et
de un ou plusieurs phosphates de calcium. Lorsque le mélange est effectué,
le(s)
phosphate(s) de calcium se dissolve(nt) et précipite(nt) en un sel de
phosphate de
calcium moins soluble. Au cours de la précipitation, les cristaux de phosphate
de
calcium grossissent et s'enchevêtrent, ce qui conduit à la rigidité mécanique
du
ciment. (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl 4, 37-47.).
[00024] Un article de Kim (Kim, H. D. et al., Methods Mol Biol 2004, 238, 49-
64.) décrit l'emploi d'un ciment développé par la société Etex, l'aplha-BSM,
avec
de la BMP-2. Ce nouveau produit conduit bien à une acivité ostéoinductrice de
la
matrice.
[00025] Cependant, la BMP-2 introduite dans cette matrice perd une partie
importante de son activité ce qui conduit à devoir augmenter la quantité de
BMP-2
embarquée. Ainsi une dose de 40 pg de BMP-2 est employée dans le modèle de
la formation d'os ectopique chez le rat au lieu des 20 pg de BMP-2 employés
dans
une éponge de collagène.
[00026] En effet, les ciments présentent deux inconvénients. Tout d'abord, le
ou les phosphates de calcium qui en sont les précurseurs doivent être
synthétisés
au préalable dans des conditions incompatibles avec des protéines. Ainsi dans
le
brevet US 5650176 sont décrites les conditions réactionnelles nécessaires pour
la
préparation du phosphate de calcium amorphe qui est un des composés de
l'alpha-BSM. Ces conditions sont incompatibles avec les protéines car une
quantité
très importante de soude est employée. De plus, ces produits nécessitent une
purification poussée puisque des composés toxiques tels que le calcium nitrate
sont utilisés.
[00027] D'autres exemples de ciments tels que ceux décrits par la société
Graftys dans le brevet EP1891984A1 sont obtenus dans des conditions
incompatibles avec les protéines puisque du dichlorométhane est employé lors
de
la synthèse du phosphate de calcium. Les ciments décrits par la société
Lisopharm
dans le brevet US2009/0155320 sont obtenus en présence d'hydroxide de calcium
ce qui est également incompatible avec les protéines.
[00028] De plus, d'une façon générale, la formation de ciment s'obtient en
faisant réagir un sel de phosphate de calcium soluble avec un sel de phosphate
de
calcium solide traité à plus de 400 C afin de rendre celui-ci réactif. La
réaction
entre ces deux composés est incontrôlée, la plupart du temps exothermique et
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conduit à un ciment à structure monolithique qui séquestre dans sa masse la
protéine.
[00029] Dans le brevet US563461 il est mentionné la présence de lacunes
réactives dans le solide sans que l'on sache si cela est néfaste à la
stabilité
5 chimique de la BMP-2.
[00030] Afin de réduire les pertes de protéine dans la masse de solide formé,
il
a été décrit dans le brevet US5650176 qu'il est avantageux d'ajouter au
mélange
réactif des composés effervescents susceptibles de réduire le caractère
monolithique du ciment.
[00031] Malgré ces améliorations, force est de constater que les quantités en
protéine nécessaires pour obtenir une formation d'os dans le modèle de rat
ectopique, restent importantes.
[00032] S'agissant des systèmes mixtes, ceux-ci n'ont pas permis à ce jour de
résoudre les problèmes ci-dessus évoqués.
[00033] En résumé, les systèmes décrits dans l'art antérieur concernant
l'emploi de polymères synthétiques, des polymères naturels ou encore des
matériaux inorganiques tels que les céramiques ou les ciments de phosphates de
calcium ne permettent pas de répondre complètement au cahier des charges
imposé pour les applications de la réparation osseuse.
[00034] Il est du mérite de la demanderesse d'avoir développé une approche
originale qui consiste à mettre en présence la protéine ostéogénique avec des
sels
solubles de calcium et des sels solubles de phosphate qui permettent de
répondre
au cahier des charges imposé pour les applications de la réparation osseuse.
[00035] Cette approche originale permet d'une part de précipiter la protéine,
en
évitant toute dégradation chimique au contact des réactifs présents, et
d'autre
part de la co-précipiter avec un sel insoluble de calcium, de préférence le
phosphate de calcium, ledit coprécipité étant sous forme divisée, ce qui
limite très
nettement les pertes dans la masse de solide telles que constatées avec les
ciments.
[00036] Ainsi, la demanderesse a mis au point de nouvelles compositions
ostéogéniques composées d'un coprécipitat qui contient au moins un sel
insoluble
de calcium et au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un
polysaccharide, ledit coprécipitat étant sous forme divisée.
[00037] La conjonction de ces deux évènements permet d'obtenir des
formulations très ostéogéniques contenant des quantités beaucoup plus faibles
de
protéine.
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[00038] Ces nouvelles compositions présentent ainsi l'avantage de contenir de
plus faibles quantités de protéines qui est l'objectif majeur ceci afin de
réduire les
effets secondaires après administration chez les patients.
[00039] De plus, elles permettent de réduire les coûts des traitements en
réduisant la quantité de protéine car ces protéines sont très chères.
[00040] On connait au nom de la demanderesse les demandes provisoires
numéros 61/129023 et 61/129617 dont les entiers contenus sont incorporés dans
la présente par référence qui décrivent et revendiquent des compositions
ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, un sel soluble de
cation divalent et une matrice.
[00041] On connait au nom de la demanderesse les demandes provisoires
numéros 61/129011 et 61/129618 dont les entiers contenus sont incorporés dans
la présente par référence qui décrivent et revendiquent des compositions
ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, au moins une
protéine angiogénique, un sel soluble de cation divalent, éventuellement un
polysaccharide anionique et éventuellement une matrice.
[00042] On connait au nom de la demanderesse les demandes provisoires
numéros 61/129616 et 61/129012 dont les entiers contenus sont incorporés dans
la présente par référence qui décrivent et revendiquent des compositions
ostéogéniques comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique
/polysaccharide anionique un sel soluble de cation au moins divalent et une
matrice.
[00043] On connait au nom de la demanderesse la demande provisoire numéro
US61/193216 dont l'entier contenu est incorporé dans la présente par référence
qui décrit et revendique des compositions ostéogéniques comprenant au moins un
complexe protéine ostéogénique/polysaccharide anionique, un sel soluble de
cation au moins divalent et un polymère formant un hydrogel.
[00044] On connait au nom de la demanderesse la demande provisoire numéro
US61/193217 déposée le 6 novembre 2008 dont l'entier contenu est incorporé
dans la présente par référence qui décrit et revendique des compositions
ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, un sel soluble de
cation au moins divalent et un polymère formant un hydrogel.
[00045] S'agissant de la présente invention, la demanderesse a également mis
au point le procédé de préparation du coprécipitat, sous forme divisée,
contenant
au moins un sel insoluble de calcium et au moins un complexe entre une
protéine
ostéogénique et un polysaccharide.
[00046] L'invention concerne également les formulations, les produits
pharmaceutiques et les dispositifs médicaux comprenant ledit coprécipitat.
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[00047] Les compositions et les kits permettant de mettre en oeuvre ce procédé
et d'obtenir le coprécipitat sont également des inventions ci-après décrites.
[00048] La coprécipitation est obtenue par :
[00049] - la précipitation du complexe entre le polymère anionique et la
protéine ostéogénique par addition de la solution de sel d'ions calcium,
[00050] - la précipitation des ions calcium par l'addition d'une composition
comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel
insoluble de calcium à un pH déterminé.
[00051] Dans un mode de réalisation, le coprécipitat résulte de précipitations
simultanées.
[00052] Dans un mode de réalisation, le coprécipitat résulte de précipitations
séquentielles.
[00053] Le complexe entre le polymère anionique et la protéine ostéogénique
étant obtenu par addition de la solution de polysaccharide anionique à la
solution
de protéine ostéogénique.
[00054] Dans un mode de réalisation, la précipitation du sel de calcium est
effectuée sous forme de phosphate de calcium, par addition d'une solution de
phosphate soluble.
[00055] La nature et la forme du coprécipitat peuvent varier en fonction du pH
des solutions mises en présence car les sels de phosphates de calcium
présentent
différentes phases solides en fonction du pH et en fonction du polysaccharide
anionique et de la proteine constituant le complexe.
[00056] L'invention concerne un coprécipitat consistant en au moins un
complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide sous sa forme
insolubilisée et au moins un sel de calcium insoluble, ledit coprécipitat
étant sous
forme divisée.
[00057] Dans un mode de réalisation, il comprend en outre au moins un facteur
de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique.
[00058] Dans un mode de réalisation, le sel de calcium insoluble est choisi
dans
le groupe consitué par les orthophosphates de calcium sous forme anhydre ou
hydratée seuls ou en mélange.
[00059] Dans un mode de réalisation, le coprécipitat comprend en outre au
moins un sel de calcium insoluble choisi dans le groupe constitué par
l'oxalate de
calcium, l'ascorbate de calcium, le carbonate de calcium ou le sulfate de
calcium.
[00060] Lesdits sels de calcium insolubles peuvent être des sels mixtes formés
entre les ions calcium cationiques et les ions anioniques tels que les
phosphates,
mono, di ou tribasiques, les carboxylates des polysaccharides, les carbonates,
les
hydroxydes et les eventuels anions portés par les bases.
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[00061] Les orthophosphates de calcium sont des sels qui résultent de la
neutralisation des différentes acidités de l'acide phosphorique par les sels
de
calcium et selon la littérature les pKa varient de 2,12 à 12,67 à 25 C.
[00062] Les principaux orthophosphates de calcium insolubles sont les
phosphates dicalciques, DCP, anhydre ou dihydraté, les phosphates
octacalciques,
OCP, les phosphates tricalciques, TCP, les hydroxyapatites phosphacalciques,
HAP
ou PCA, et le phosphate tétracalcique, TTCP.
[00063] Les complexes polymère anionique/protéine ostéogénique consistent
en les complexes décrits dans la demande PCT/EP2008/059832 au nom de la
demanderesse.
[00064] Ils sont insolubilisés par addition d'un sel de calcium soluble tel
que
décrit dans les demandes FR 08 54621 et 61/129616 .
[00065] Cette coprécipitation en fonction de l'effet recherché est effectuée
éventuellement en présence d'une base permettant d'ajuster le pH à une valeur
prédéterminée.
[00066] Elle permet d'obtenir une composition chimique solide, à l'état
divisé,
qui permet notamment de contrôler la délivrance de la protéine ostéogénique
contenue dans la composition.
[00067] Cette composition chimique solide, à l'état divisé, est obtenue
spontanément dans des conditions de température ambiante, et son état divisé
est stable en conditions physiologiques in vitro.
[00068] Dans un mode de réalisation, l'invention consiste en un kit pour la
préparation d'un implant ostéogénique comprenant au moins :
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique,
b - une composition comprenant au moins un polysaccharide,
c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble,
d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion
susceptible de former un sel insoluble de calcium,
[00069] Dans un mode de réalisation, le kit comprend en outre, une
'composition supplémentaire comprenant au moins une base.
[00070] Dans un mode de réalisation, une deuxième base peut être additionnée
aux compositions b, c ou d.
[00071] Certaines de ces compositions sont susceptibles d'être réunies avant
la
formation du coprécipitat afin de diminuer le nombre de flacons.
[00072] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant la protéine
ostéogénique peut comprendre également le polysaccharide pour former le
complexe.
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[00073] La composition comprenant la protéine ostéogénique ou la composition
comprenant le complexe peut également comprendre le sel soluble d'un anion
susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.
[00074] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant le
polysaccharide peut comprendre également le sel soluble d'un anion susceptible
de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.
[00075] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant le sel de
calcium soluble peut comprendre également une base.
[00076] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique,
b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et
au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble
de calcium,
c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble,
d - une composition comprenant au moins une base.
[00077] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou
différente à la base de la composition d peut être additionnée aux
compositions b
et c.
[00078] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique,
b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique,
c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au
moins une base
d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion
susceptible de former un sel insoluble de calcium.
[00079] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou
différente à la base de la composition c peut être additionnée aux
compositions b
et d.
[00080] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique,
b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et
au moins une base,
c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble,
d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion
susceptible de former un sel insoluble de calcium.
[00081] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou
différente à la base de la composition b peut être additionnée aux
compositions c
et d.
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[00082] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique et au
moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de
calcium,
5 b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique,
c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble,
d - une composition comprenant au moins une base.
[00083] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou
différente à la base de la composition d peut être additionnée aux
compositions b
10 et c.
[00084] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique,
b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique,
c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble,
d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion
susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base.
[00085] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou
différente à la base de la composition d peut être additionnée aux
compositions b
et c.
[00086] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique,
b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et
au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble
de calcium,
c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble,
d - une composition comprenant au moins une base.
[00087] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou
différente à la base de la composition d peut être additionnée aux
compositions b
et c.
[00088] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique,
b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique, au
moins une base et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de
former un sel insoluble de calcium,
c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble.
[00089] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
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a - une composition comprenant au moins un complexe protéine
ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un
anion susceptible de former un sel insoluble de calcium,
b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble,
c - une composition comprenant au moins une base.
[00090] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou
différente à la base de la composition c peut être additionnée aux autres
compositions.
[00091] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique,
b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et
au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble
de calcium,
c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au
moins une base.
[00092] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou
différente à la base de la composition c peut être additionnée à la
composition b.
[00093] Dans un mode de réalisation, le kit comprend :
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique,
b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et
au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble
de calcium,
c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble.
[00094] Dans un mode de réalisation, le kit comprend :
a - une composition comprenant au moins un complexe protéine
ostéogénique polysaccharide anionique,
b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au
moins une base,
c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion
susceptible de former un sel insoluble de calcium.
[00095] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou
différente à la base de la composition b peut être additionnée aux autres
compositions.
[00096] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins un complexe protéine
ostéogénique polysaccharide anionique,
b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble,
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c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion
susceptible de former un sel insoluble de calcium.
[00097] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins un complexe protéine
ostéogénique polysaccharide anionique,
b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble,
c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion
susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base.
[00098] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou
différente à la base de la composition c peut être additionnée aux autres
compositions.
[00099] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins un complexe protéine
ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un
anion susceptible de former un sel insoluble de calcium,
b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble.
[000100] Dans un mode de réalisation, le kit comprend :
a - une composition comprenant au moins un complexe protéine
ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un
anion susceptible de former un sel insoluble de calcium,
b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au
moins une base.
[000101] Dans un mode de réalisation, le kit comprend
a - une composition comprenant au moins un complexe protéine
ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un
anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une
base,
b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble.
[000102] Dans un mode de réalisation, le kit comprend :
a - une composition comprenant au moins un complexe protéine
ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un
anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une
base,
b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au
moins une base.
[000103] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant au moins une
protéine ostéogénique comprend en outre au moins un facteur de croissance
ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique,
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[000104] Dans un mode de réalisation, le kit, comprend en outre au moins une
matrice organique ou une matrice minérale ou une matrice mixte.
[000105] Dans un mode de réalisation, les compositions constituant le kit sont
des solutions aqueuses.
[000106] Dans un mode de réalisation, les compositions constituant le kit sont
des lyophilisats.
[000107] Dans un mode de réalisation, certaines des compositions constituant
le
kit sont des lyophilisats.
[000108] Dans ce mode de réalisation, les lyophilisats sont réhydratés avant
réaction, par de l'eau ou une des autres compositions en solution.
[000109] Ainsi par exemple, la composition comprenant la protéine ostéogénique
sous forme de lyophilisat peut être réhydratée avec la solution comprenant un
polysaccharide anionique, ou avec la solution comprenant un polysaccharide
anionique et un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble
de
calcium et/ou une base.
[000110] Dans un mode de réalisation, les formulations, les dispositifs
médicaux
et produits pharmaceutiques comprenant ledit précipitat sont des suspensions
aqueuses.
[000111] Dans un mode de réalisation, les formulations et produits
pharmaceutiques comprenant ledit précipitat sont des lyophilisats.
[000112] Dans ce mode de réalisation, les lyophilisats sont réhydratés avant
emploi, au moyen de sérum physiologique ou de sang.
[000113] On entend par protéine ostéogénique un facteur de croissance
ostéogéniques ou BMP seuls ou en combinaison avec une BMP choisie dans le
groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives.
[000114] Plus particulièrement les protéines ostéogéniques sont choisies dans
le
groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7
(Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison.
[000115] Les BMPs utilisées sont des BMPs recombinantes humaines, obtenues
selon les techniques connues de l'homme de l'art ou achetées auprès de
fournisseurs comme par exemple la société Research Diagnostic Inc. (USA).
[000116] On entend par facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-
attractant et angiogénique des protéines telles que les PDGF, notamment le
PDGF-
BB, les VEGF ou les FGF, notamment le FGF-2.
[000117] Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie
dans
le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7
(Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au
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moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique
est le PDGF.
[000118] Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins de la
BMP-2 et du PDGF-BB.
[000119] Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins de la
BMP-7 et du PDGF-BB.
[000120] Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins du
GDF-5 et du PDGF-BB.
[000121] Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie
dans
le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7
(Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au
moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique
est le VEGF.
[000122] Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie
dans
le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7
(Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au
moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique
est le FGF.
[000123] Le sel soluble de calcium est un sel de calcium dont l'anion est
choisi
dans le groupe constitué par le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le
D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate ou l'aspartate.
[000124] Dans un mode de réalisation, le sel soluble de calcium est du
chlorure
de calcium.
[000125] On entend par sel soluble d'un anion susceptible de former un
précipité
avec l'ion calcium un sel soluble dont l'anion est choisi dans le groupe
constitué
des anions phosphates comprenant l'ion phosphate PO43- l'ion
hydrogénophosphate HPO42- et l'ion dihydrogénophosphate H2PO4-.
[000126] Dans un mode de réalisation, un deuxième anion choisi dans le groupe
constitué par les anions oxalate, ascorbate, carbonate ou sulfate est en outre
ajouté à la composition comprenant un anion phosphate.
[000127] Les sels solubles d'un anion susceptibles de former un précipité avec
l'ion calcium sont choisis dans le groupe constitué par les phosphates de
sodium,
d'oxalate de sodium, l'ascorbate de sodium, le carbonate de sodium, le sulfate
de
sodium et l'hydrogénocarbonate de sodium.
[000128] On entend par polysaccharide anionique un polysaccharide choisi dans
le groupe des polysaccharides fonctionnalisés par des dérivés hydrophobes.
[000129] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le
groupe des dérivés de polysaccharides, comportant majoritairement des liaisons
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glycosidiques de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2), fonctionnalisés par au
moins
un dérivé du tryptophane tels que décrits dans la demande FR08/55567.
[000130] Ces polysaccharides sont constitués en majorité de liaisons
glycosidiques de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2). Ils peuvent être neutres,
5 c'est-à-dire ne pas être porteur de fonctions acides ou anioniques et
porteurs de
fonctions acides.
[000131] Ils sont fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane, noté
Trp .
- ledit dérivé du tryptophane étant greffé ou lié aux polysaccharides par
10 couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide pouvant être une
fonction
acide d'un polysaccharide anionique et/ou une fonction acide portée par un
bras
de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F
résultant du
couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide
neutre
ou anionique,
15 - F étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate,
carbamate, éther, thioéther ou amine,
- R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones,
éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs
hétéroatomes, tels que O, N et/ou S, et ayant au moins une fonction acide,
[000132] Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du
couplage entre l'amine du tryptophane et le au moins un acide porté par le
groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique.
[000133] Selon l'invention, le polysaccharide comportant majoritairement des
liaisons glycosidiques de type (1,4), (1,3) et/ou (1,2), fonctionnalisé par au
moins
un dérivé du tryptophane peut répondre à la formule générale I suivante
Polysaccharide
[ Trp ]O ]j
R
1
[ Trp in
Formule I
le polysaccharide étant constitué en majorité de liaisons glycosidiques
de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2),
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= F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH
du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester,
thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou amine,
= R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones,
éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs
hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
= Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du
couplage entre l'amine du dérivé du tryptophane et le au moins un acide
porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide
anionique.
n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est
comprise entre 0,05 et 0,7.
- représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides
substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
- i représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le
groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2,
- j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le
polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et
1,
- (i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité
saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2,
- lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du
groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence
comme Na ou K.
- lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une
ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp,
alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na' ou
K+
- lesdits polysaccharides étant amphiphiles à pH neutre.
[000134] Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un
carbamate ou un éther.
[000135] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).
[000136] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe constitué
par le
pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une
cellulose
soluble dans l'eau.
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[000137] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un pullulane.
[000138] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un alginate.
[000139] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un hyaluronane.
[000140] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane.
[000141] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un galacturonane.
[000142] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une cellulose
soluble dans l'eau.
[000143] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3).
[000144] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdlane.
[000145] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).
[000146] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline.
[000147] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3).
[000148] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane.
[000149] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2).
[000150] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le mannane.
[000151] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est
caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants
F O O F O F
O
y yly
OH OH OH OH
ou leurs sels de cations alcalins.
[000152] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est
caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi dans le groupe
constitué
par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole
éthylamine
et leurs sels de cation alcalin.
[000153] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est
caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi parmi les esters du
tryptophane de formule II.
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O
E0E
H Formule II
[000154] E étant un groupement pouvant être :
- un alkyle linéaire ou ramifié en Cl à C8.
- un alkylaryle ou un arylalkyle linéaire ou ramifié en C6 à C20.
[000155] Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris
entre 10 et 10000.
[000156] Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m
compris entre 10 et 1000.
[000157] Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m
compris entre 10 et 500.
[000158] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le
groupe des dextranes fonctionnalisés avec des acides aminés hydrophobes tels
que le tryptophane et les dérivés du tryptophane tels que décrits dans la
demande
FR 07/02316.
[000159] Selon l'invention, le dextrane fonctionnalisé peut répondre à la
formule
générale III suivante
Dextran
F
FAA]
t
Formule III
R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones,
éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs
hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
= F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH
du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester,
thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou amine,
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= AA étant un reste amino-acide hydrophobe, L ou D, produit du couplage
entre l'amine de l'amino-acide et un acide porté par le groupement R.
t représente la fraction molaire de substituant F-R-[AA]n par unité
glycosidique et est comprise entre 0,1 et 2,
- p représente la fraction molaire des R substitués par AA et est
comprise entre 0,05 et 1, et,
- lorsque R n'est pas substitué par AA, alors le ou les acides du
groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence
comme Na+, K+,ledit dextrane étant amphiphile à pH neutre.
[000160] Dans un mode de réalisation, le cation alcalin est Na+.
[000161] Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un
carbamate ou un éther.
[000162] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est
un
carboxymethyl dextrane de formule IV.
R=H
O
OR 0 * R * ONa
RO RO
n
Formule IV
ou l'acide correspondant.
[000163] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est
un
ester monosuccinique de dextrane de formule V
R=H
0 O
* R=
OR O ONa
RO RO O
n Formule V
ou l'acide correspondant.
[000164] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est
caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants
F F F
O O O O -~~Y OH OH OH OH
ou leurs sels de cations alcalins.
[000165] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est
caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est choisi parmi les dérivés du
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tryptophane, tels que le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le
2-
indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
[000166] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est
caractérisé en ce que les dérivés du tryptophane sont choisis parmi les esters
du
5 tryptophane de formule II tels que définis précédemment.
[000167] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est un
carboxyméthyldextrane modifié par le tryptophane de formule VI :
R=H
O
OR R ONa
L RO RO
C02Na -n 0 R N NH
H
Formule VI
[000168] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est un
ester
10 monosuccinique de dextrane modifié par le tryptophane de formule VII
R=H
O O
OR 0 R ONa
RO RO O
O C02Na
R=
N NH
Formule VII
[000169] Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est
caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est choisi parmi la
phenylalanine,
la leucine, l'isoleucine et la valine et leurs dérivés alcool, amide ou
décarboxylés.
15 [000170] Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est
caractérisé en ce que les dérivés de la phenylalanine, de la leucine, de
l'isoleucine
et de la valine sont choisis parmi les esters de ces acides aminés de formule
VIII.
O O O O
H2N OE H2N OE H2N OE H2N
OE
Formules VIII
20 E étant défini comme précédemment.
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[000171] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est
caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est la phénylalanine, et ses
dérivés alcool, amide ou décarboxylés.
[000172] Le dextrane peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10
et 10000.
[000173] Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m
compris entre 10 et 1000.
[000174] Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m
compris entre 10 et 500.
[000175] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le
groupe des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles tels
que ceux décrits dans la demande FR 08/05506 dont au moins un est substitué
par un dérivé d'alcool hydrophobe, noté Ah
ledit alcool hydrophobe (Ah) étant greffé ou lié au polysaccharide
anionique par un bras de couplage R, ledit bras de couplage étant lié au
polysaccharide anionique par une fonction F' ladite fonction F' résultant du
couplage entre la fonction amine du bras de liaison R et une fonction
carboxyle du polysaccharide anionique, et ledit bras de couplage étant lié à
l'alcool hydrophobe par une fonction G résultant du couplage entre une
fonction carboxyle, isocyanate, thioacide ou alcool du bras de couplage et
une fonction de l'alcool hydrophobe, les fonctions carboxyles du
polysaccharide anionique non substituées étant sous forme de carboxylate
de cation, alcalin de préférence comme Na' ou K+.
^ F' étant une fonction amide,
^ G étant soit une fonction ester, thioester, carbonate,
carbamate,
= R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones,
éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement
comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N
ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,
- Ah étant un reste d'un alcool hydrophobe, produit du couplage entre la
fonction hydroxyle de l'alcool hydrophobe et au moins une fonction
électrophile portée par le groupement R,
ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles
étant amphiphile à pH neutre.
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[000176] Le polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles en
partie substitués par des alcools hydrophobes est choisi parmi les
polysaccharides
comportant des groupes fonctionnels carboxyles de formule générale IX
Polysaccharide + carboxyle
F'
R
Ah
q Formule IX
- dans laquelle, q représente la fraction molaire des fonctions
carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est comprise entre
0,01
et 0,7,
- F', R, G et Ah répondant aux définitions données ci-dessus, et lorsque la
fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F'-R-G-Ah,
alors la ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des
carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na' ou K+.
[000177] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des
groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides naturellement
porteurs
de groupes fonctionnels carboxyles et sont choisis dans le groupe constitué
par
l'alginate, le hyaluronane, le galacturonane.
[000178] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des
groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus
à
partir de polysaccharides comportant naturellement des groupes fonctionnels
carboxyles ou à partir de polysaccharides neutres sur lesquels au moins 15
groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été
greffées
de formule générale X.
Polysaccharide
Q
r
X
- les polysaccharides naturels étant choisis dans le groupe des
polysaccharides constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6)
et/ou (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2),
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- L étant une liaison résultant du couplage entre le bras de liaison Q et
une fonction -OH du polysaccharide et étant soit une fonction ester,
thioester,
carbonate, carbamate ou éther,
- r représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité
saccharidique du polysaccharide,
- Q étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones,
éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs
hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et comportant au moins un groupe
fonctionnel carboxyle, - CO2H
[000179] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6).
[000180] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,6) est le dextrane.
[000181] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).
[000182] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe constitué
par le
pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une
cellulose
soluble dans l'eau.
[000183] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un pullulane.
[000184] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un alginate.
[000185] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un hyaluronane.
[000186] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane.
[000187] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un galacturonane.
[000188] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une cellulose
soluble dans l'eau.
[000189] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3).
[000190] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdlane.
[000191] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).
[000192] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline.
[000193] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3)
[000194] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane.
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[000195] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2).
[000196] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le mannane.
[000197] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est
caractérisé en ce que le groupe Q est choisi dans les groupes suivants
L L
O O
O
yly
OH OH OH
OH
[000198] Dans un mode de réalisation, r est compris entre 0,1 et 2.
[000199] Dans un mode de réalisation, r est compris entre 0,2 et 1,5.
[000200] Dans un mode de réalisation, le groupement R selon l'invention est
caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides aminés.
[000201] Dans un mode de réalisation, les acides aminés sont choisis parmi les
alpha acides aminés.
[000202] Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés sont choisis
parmi les alpha acides aminés naturels.
[000203] Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés naturels sont
choisis parmi la leucine, l'alanine, Viso-leucine, la glycine, la
phénylalanine, le
thryptophane, la valine.
[000204] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les
alcools gras.
[000205] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les
alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée comprenant de 4 à
18
carbones.
[000206] Dans un mode de réalisation, l'alcool gras est choisi parmi le
méristyl,
le cétyl, le stéaryl, le cétéaryl, le butyl, l'oléyl, la lanoline.
[000207] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les
dérivés du cholestérol.
[000208] Dans un mode de réalisation, le dérivé du cholestérol est le
cholestérol.
[000209] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe Ah est choisi parmi
les tocophérols.
[000210] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'alpha tocophérol.
[000211] Dans un mode de réalisation, l'alpha tocophérol est le racémique de
l'alpha tocophérol.
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[000212] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les
alcools porteurs de groupe aryle.
[000213] Dans un mode de réalisation, l'alcool porteur de groupe aryle est
choisi
parmi l'alcool benzylique, l'alcool phenéthylique.
5 [000214] Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris
entre 10 et 10000.
[000215] Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m
compris entre 10 et 1000.
[000216] Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m
10 compris entre 10 et 500.
[000217] Dans un mode de réaliastion le polysaccharide est choisi dans le
groupe constitué par le dextran fonctionnalisé par le tryptophane, le dextran
fonctionnalisé par le phénylalaninate d'octanol, le dextran fonctionnalisé par
le
glycinate d'octanol, le dextran fonctionnalisé par le glycinate de dodécanol
ou le
15 dextran fonctionnalisé par l'ester éthylique du tryptophane.
[000218] Afin de neutraliser les composés acides présents dans le mélange, les
bases sont choisies parmi les bases minérales ou organiques.
[000219] Parmi les bases minérales, on citera la soude, l'hydrogénocarbonate
de
20 sodium ou le carbonate de sodium.
[000220] Parmi les bases organiques, on citera les amines et les acides aminés
déprotonés.
[000221] Parmi les bases organiques, on citera l'imidazole et ses dérivés
notamment l'histidine, la proline, l'éthanolamine ou la sérine.
25 [000222] Dans un mode de réalisation, une matrice organique peut être
utilisée
afin de favoriser la réparation, elle est choisie parmi les matrices à base de
collagène naturel purifié, stérilisé et réticulé.
[000223] Les polymères naturels comme le collagène sont des composants de la
matrice extracellulaire qui favorisent l'attachement, la migration et la
différentiation cellulaire. Ils présentent l'avantage d'être extrêmement
biocompatibles et sont dégradés par des mécanismes de digestion enzymatique.
Les matrices à base de collagène sont obtenues à partir de collagène
fibrillaire de
type I ou IV extraits à partir de tendon ou d'os de boeuf ou de porc. Ces
collagènes sont d'abord purifiés avant d'être réticulés puis stérilisés.
[000224] Elles peuvent également être obtenues par résorption en milieu acide
d'os autologue, conduisant à la perte de la majorité des composants
minéralisés
mais à la préservation des protéines collagéniques on non-collagéniques,
incluant
les facteurs de croissance. Ces matrices déminéralisées peuvent également être
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préparées sous forme inactive après extraction avec des agents chaotropiques.
Ces matrices sont essentiellement composées de collagène de Type I insoluble
et
réticulé.
[000225] Des matériaux mixtes peuvent également être utilisés, par exemple
une matrice qui associe le collagène et des particules inorganiques. Ces
matériaux
qui peuvent se présenter sous la forme d'un matériau composite aux propriétés
mécaniques renforcées ou encore sous la forme d'un putty ou la collagène
joue un rôle de liant.
[000226] Les matériaux inorganiques utilisables comprennent essentiellement
des céramiques à base de phosphate de calcium telles que l'hydroxyapatite
(HA),
le phosphate de calcium tricalcique (TCP), le phosphate de calcium biphasique
(BCP) ou le phosphate de calcium amorphe (ACP) qui présentent comme principal
intérêt une composition chimique très proche de celle de l'os. Ces matériaux
possèdent de bonnes propriétés mécaniques et sont immunologiquement inertes.
Ces matériaux peuvent se présenter sous différentes formes comme des poudres,
des granulats ou des blocs. Ces matériaux présentent des vitesses de
dégradation
très différentes en fonction de leurs compositions. Ainsi l'hydroxyapatite se
dégrade très lentement (plusieurs mois) alors que le phosphate de calcium
tricalcique se dégrade plus rapidement (plusieurs semaines). C'est dans ce but
que les phosphates de calcium biphasiques ont été développés car ils
présentent
des vitesses de résorption intermédiaires. Ces matériaux inorganiques sont
connus pour être principalement ostéoconducteurs.
[000227] Dans un mode de réalisation, la matrice organique est un hydrogel
réticulé.
[000228] Un hydrogel réticulé est obtenu par réticulation de chaînes de
polymères. Les liaisons covalentes inter-chaînes définissant une matrice
organique. Les polymères pouvant être employés pour la constitution d'une
matrice organique sont décrits dans la revue de Hoffman intitulée Hydrogels
for
biomedical applications (Adv. Drug Deliv. Rev, 2002, 43, 3-12).
[000229] Dans un mode de réalisation, l'implant peut comprendre un hydrogel
non réticulé.
[000230] On entend par hydrogel non réticulé un réseau tri-dimensionel
hydrophile de polymère capable d'adsorber une quantité importante d'eau ou de
liquides biologiques (Peppas et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-
46).
Cet hydrogel est constitué d'interactions physiques et n'est donc pas obtenu
par
réticulation chimique des chaînes de polymère.
[000231] La liste des polymères formant des hydrogels est très large et une
liste
importante mais non exhaustive est donnée dans la revue de Hoffman intitulée
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Hydrogels for biomedical applications (Adv. Drug Deliv. Rev., 2002, 43, 3-12).
Parmi ces polymères, on peut trouver des polymères synthétiques ainsi que des
polymères naturels. Une autre revue couvrant les polysaccharides formant des
hydrogels permet de choisir un polymère utile pour l'invention (Alhaique et
al. J.
Control. Release, 2007, 119, 5-24).
[000232] Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel est
choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les
copolymères
de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène
glycol et
de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides
polyvinyliques, les
polyacrylamides, les acides polyacryliques.
[000233] Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel est
choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide
hyaluronique,
le kératane, le pullulane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les
dérivés de
cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la
chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs
sels
biologiquement acceptables.
[000234] Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le
groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide
hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, la pectine, la cellulose et ses
dérivés,
le pullulane, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et
leurs
sels biologiquement acceptables.
[000235] Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le
groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide
hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables.
[000236] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé juste avant
l'implantation ou l'injection.
[000237] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé et conservé
dans une seringue pré-remplie afin d'être ensuite implanté ou injecté.
[000238] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé par
réhydratation d'un lyophilisat juste avant l'implantation ou l'injection, ou
être
implanté sous forme déshydraté.
[000239] Parmi les différentes matrices utilisables on citera à titre
d'exemples
les éponges de collagène comme Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro,
New
Jersey), les DBM (Demineralized Bone Matrix) seules ou en mélange avec
d'autres
matériaux organiques comme des polysaccharides, du glycérol ou des gélatines
comme Osteofil (Medtronic), Allomatrix (WRIGHT), Grafton (Osteotech), DBX
(MTF/Synthes), Bioset (Regeneration Technologies), les matrices constituées
de
phases minérales comme Vitoss (Orthivista), Osteoset (Wright) ou les
matrices
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mixtes comme MasterGraft (Medtronic), Healos (Depuy Spine)CopiOs
(Zimmer), Sunnmax Collagen Bone Graft Matrix (Sunmax).
[000240] Le système après formation du coprécipitat est constitué de deux
phases, une phase liquide et une phase solide.
[000241] Dans la suite de l'exposé lorsque la notion de volume est employée,
il
s'agit du volume total comprenant les deux phases.
[000242] Les quantités par unité de volume dans le produit résultant après
mélange des compositions des différentes formes du kit sont données ci-après
et
ne comprennent pas les quantités d'ions calcium ou d'ions phosphate provenant
de la matrice lorsque des matrices minérales ou mixtes sont utilisées..
[000243] Dans un mode de réalisation, les quantités totales des différentes
protéines par unité de volume sont comprises entre 0,01 mg et 2 mg, de
préférence entre 0,05 mg et 1,5 mg, et encore de préférence entre 0,1 mg et
1,5
mg par ml de suspension obtenue.
[000244] Les quantités totales de phosphates par unité de volume sont
comprises entre 0,02 mmol à 0,5 mmol, de préférence entre 0,05 à 0,25 mmol
par ml de suspension obtenue.
[000245] Les quantités totales de calcium par unité de volume sont comprises
entre 0,01 mmol et 1 mmol, de préférence entre 0,05 et 1 mmol et encore de
préférence entre 0,1 mmol et 0,5 mmoi, par unité de volume.
[000246] Le pourcentage des ions calcium dans la phase solide est compris
entre
60 et 95 % des ions calcium introduits.
[000247] Les quantités totales de polysaccharides par unité de volume sont
comprises entre 1 et 100 mg, de préférence entre 2 et 40 mg par ml de
suspension obtenue. Le pourcentage de polysaccharides dans la phase solide est
supérieur à 80 % du polysaccharide introduit.
[000248] Les quantités de base mises en oeuvre correspondent à environ 0,1 à 2
équivalents par rapport aux protons apportés par les ions phosphates.
[000249] En fonction des volumes mis en oeuvre et du nombre de compositions,
on peut déterminer par le calcul les quantités mises en oeuvre dans les
compositions de départ. Cela peut être réalisé pour les différents modes de
réalisation des kits.
[000250] Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral, les doses de
facteur de croissance ostéogénique seront comprises entre 0,01 mg et 20 mg, de
préférence entre 0,05 mg et 8 mg de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de
préférence entre 0,1 mg et 2 mg, alors que les doses couramment admises dans
la littérature sont comprises entre 8 et 12 mg.
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[000251] Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral, les doses de
facteur de croissance angiogénique seront comprises entre 0,05 mg et 8 mg, de
préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg.
[000252] Dans un mode de réalisation, pour la formulation d'un implant
comprenant le coprécipitat selon l'invention, on réalise un kit comprenant
trois
flacons, lesdits flacons contenant :
[000253] le premier entre 2 et 10 mg de protéine ostéogénique sous forme
lyophilisée,
[000254] le second entre 2 et 6 ml d'une solution d'un polysaccharide à une
concentration comprise entre 10 et 50 mg/ml et d'un mélange équimolaire
d'hydrogénophosphate de sodium Na2HPO4 et de dihydrogénophosphate de
sodium NaH2PO4de concentration comprise entre 0,15 et 0,50 M,
[000255] le troisième entre 2 et 6 ml d'une solution de chlorure de calcium à
une
concentration comprise entre 0,25 et 0,90 M.
[000256] Dans un mode de réalisation, le deuxième flacon contient en outre une
solution de bicarbonate de sodium à une concentration comprise entre 0,05 et
0,8
M.
[000257] Dans un mode de réalisation, le deuxième et le troisième flacon
contiennent en outre une solution d'histidine à une concentration comprise
entre
0,02 et 0,2 M.
[000258] Dans un mode de réalisation, le troisième flacon contient en outre
une
solution de proline à une concentration comprise entre 0,05 et 0,3M.
[000259] Les solutions sont additionnées simultanément ou successivement
avant implantation sur une éponge de collagène d'un volume compris entre 15 et
30 ml.
[000260] Dans un mode de réalisation, pour la formulation d'un implant
comprenant le coprécipitat selon l'invention on mélange trois solutions
comprenant :
[000261] la première d'un volume entre 1 et 3 mi contenant une protéine
ostéogénique à une concentration comprise entre 0,33 et 2 mg/ml.
[000262] la seconde d'un volume entre 1 et 3 ml contenant un polysaccharide à
une concentration comprise entre 5 et 15 mg/ml et un mélange équimolaire
d'hydrogénophosphate de sodium Na2HPO4 et de dihydrogénophosphate de
sodium NaH2PO4de concentration comprise entre 0,05 et 0,15 M,
[000263] la troisième d'un volume entre 1 et 3 ml contenant du chlorure de
calcium à une concentration comprise ente 0,25 et 0,50 M.
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[000264] Dans un mode de réalisation, une solution de bicarbonate de sodium à
une concentration comprise entre 0,20 et 0,4 M est additionnée au mélange
obtenu.
[000265] Dans un mode de réalisation, une solution d'histidine à une
5 concentration comprise entre 0,02 et 0,15 M est additionnée au mélange
obtenu.
[000266] Dans un mode de réalisation, une solution de proline à une
concentration comprise entre 0,05 et 0,3M est additionnée au mélange obtenu.
[000267] Le mélange comprenant le coprécipitat selon l'invention est ensuite
lyophilisé.
10 [000268] Au moment de la mise en oeuvre celui-ci est réhydraté avec de
l'eau
injectable et/ou du sang à environ 35 % du volume initial.
[000269] L'invention concerne également l'utilisation des compositions de
l'invention par implantation, par exemple, pour combler des défauts osseux,
pour
effectuer des fusions vertébrales ou des réparations maxillo-faciales ou pour
le
15 traitement des fractures osseuses en particulier du type pseudarthrose.
[000270] L'invention concerne également l'utilisation des compositions de
l'invention par injection pour le traitement des défauts osseux, notamment
ceux
causés par l'ostéoporose et pour toute autre pathologie pouvant être traitée
par
voie percutanée.
20 [000271] L'invention concerne également l'utilisation des compositions
selon
l'invention comme implant osseux.
[000272] Dans un mode de réalisation, les compositions pourront être utilisées
en combinaison avec un dispositif prothétique du type prothèse vertébrale ou
cage
de fusion vertébrale.
25 [000273] L'invention concerne également les méthodes thérapeutiques et
chirurgicales utilisant les compositions dans la reconstruction osseuse.
[000274] Dans ces différentes utilisations thérapeutiques, la taille de la
matrice
et la quantité de facteur de croissance ostéogénique sont fonction du volume
du
site à traiter.
30 [000275] Des exemples des différents modes de réalisation de l'invention
sont
donnés ci-après.
[000276] Des exemples de kits sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 1 : Préparation d'un kit contenant 5 flacons
[000277] Kit 1 : Un kit de 5 flacons comprend un flacon contenant la protéine
ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère
lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble
lyophilisé
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ou en solution, un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou
en
solution et un flacon contenant une base lyophilisée ou en solution.
Exemple 2 : Préparation d'un kit contenant 4 flacons
[000278] Kit 2 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant la protéine
ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère
lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble
lyophilisé
ou en solution et un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé
ou en
solution.
Exemple 3: Préparation d'un kit contenant 4 flacons
[000279] Kit 3 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant la protéine
ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère un
sel
de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de
calcium soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant une base
lyophilisée ou en solution.
Exemple 4 : Préparation d'un kit contenant 4 flacons
[000280] Kit 4 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant la protéine
ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère
lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble et
une
base lyophilisés ou en solution et un flacon contenant un sel de phosphate
soluble
lyophilisé ou en solution.
Exemple 5 : Préparation d'un kit contenant 4 flacons
[000281] Kit 5 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant le complexe
entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé ou en solution, un
flacon
contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution, un flacon
contenant
un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant
une
base lyophilisée ou en solution.
Exemple 6 : Préparation d'un kit contenant 3 flacons
[000282] Kit 6 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant la protéine
ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère et un
sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un
sel de
calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution.
Exemple 7: Préparation d'un kit contenant 3 flacons
[000283] Kit 7 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant la protéine
ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère et un
sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un
sel de
calcium soluble lyophilisé ou en solution.
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Exemple 8 : Préparation d'un kit contenant 3 flacons
[000284] Kit 8 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant le complexe
entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé ou en solution, un
flacon
contenant un sel de phosphate- soluble lyophilisé ou en solution, un flacon
contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution.
Exemple 9 : Préparation d'un kit contenant 3 flacons
[000285] Kit 9 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant le complexe
entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé ou en solution, un
flacon
contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution, un flacon
contenant un sel de calcium soluble lyophilisés ou en solution.
Exemple 10 : Préparation d'un kit contenant 2 flacons
[000286] Kit 10 : Un kit de 2 flacons comprend un flacon contenant le complexe
entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé et un sel de
phosphate
soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium
soluble
lyophilisé ou en solution.
Exemple 11 : Préparation d'un kit contenant 2 flacons
[000287] Kit 11 : Un kit de 2 flacons comprend un flacon contenant le complexe
entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé et un sel de
phosphate
soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium
soluble et
une base lyophilisés ou en solution.
[000288] Des exemples de synthèses de polymères sont donnés à titre indicatif
et non limitatif.
Exemple 12: Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le
tryptophane
[000289] Le polymère 1 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par le sel de sodium du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse
molaire moyenne en poids de 40 kg/moi (Pharmacosmos) selon le procédé décrit
dans la demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylate
de sodium, modifiés ou non par le tryptophane, soit t dans la formule III de
la
présente demande est de 1,03. La fraction molaire de méthylcarboxylates de
sodium modifiés par le tryptophane, soit p dans la formule III de la présente
demande est de 0,36.
Exemple 13: Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le
phénylalaninate d'octanol.
[000290] Le polymère 2 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par l'ester octanoique de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un dextrane de
masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé
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décrit dans la demande de brevet PCT/IB2009007054. La fraction molaire de
méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester octanoique de la
L-phénylalanine, soit r dans la formule X de la présente demande, est de 1,11.
La
fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester
octanoique
de la L-phénylalanine, soit q dans la formule IX de la présente demande est de
0, 09.
[000291] La solution de polymère 2 en fin de production est à 30,45 mg/mL.
Exemple 14: Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le
glycinate d'octanoi
[000292] Le polymère 3 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par l'ester octanoique de la L-glycine obtenu à partir d'un dextrane de masse
molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit
dans la demande de brevet FRO8.05506. La fraction molaire de méthylcarboxylate
de sodium, modifiés ou non par l'ester octanoique de la L-glycine, soit r dans
la
formule X de la présente demande est de 1,09. La fraction molaire de
méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester octanoique de la L-glycine,
soit
q dans la formule IX de la présente demande est de 0,22.
Exemple 15: Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le
tryptophane
[000293] Le polymère 4 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par le sel de sodium du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse
molaire moyenne en poids de 70 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit
dans la demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylate
de sodium, modifiés ou non par le tryptophane, soit t dans la formule III de
la
présente demande est de 1,14. La fraction molaire de méthylcarboxylates de
sodium modifiés par le tryptophane, soit p dans la formule III de la présente
demande est de 0,41.
Exemple 16 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le
phénylataninate d'octanol
[000294] Le polymère 5 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par l'ester octanoique de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un dextrane de
masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé
décrit dans la demande de brevet FR08.05506. La fraction molaire de
méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester octanoique de la
L-phénylalanine, soit r dans la formule X de la présente demande, est de 1,12.
La
fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester
octanoique
de la L-phénylalanine, soit q dans la formule IX de la présente demande est de
0,22.
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Exemple 17: Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le
glycinate de dodécanol.
[000295] Le polymère 6 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par l'ester dodécanoique de la L-glycine obtenu à partir d'un dextrane de
masse
molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit
dans la demande, de brevet FRO8.05506. La fraction molaire de
méthylcarboxylate
de sodium, modifiés ou non par l'ester dodécanoique de la L-glycine, soit r
dans la
formule X de la présente demande est de 1,04. La fraction molaire de
méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester dodécanoique de la L-
glycine,
soit q dans la formule IX de la présente demande est de 0,13.
Exemple 18: Préparation d'un dextran fonctionnalisé par
l'ester éthylique du tryptophane
[000296] Le polymère 7 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par l'ester éthylique du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse
molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit
dans la demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylate
de sodium, modifiés ou non par l'ester éthylique du tryptophane, soit t dans
la
formule III de la présente demande est de 1,09. La fraction molaire de
méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester éthylique du tryptophane,
soit
p dans la formule III de la présente demande est de 0,47.
Exemple 19: Préparation d'une solution d'un dextran
fonctionnalisé par le tryptophane
[000297] Une solution concentrée de polymère 1 est préparée en solubilisant
9.13 g de lyophilisat de polymère 1 (teneur en eau d'environ 25%) dans 35,24 g
d'eau. La solution est mise sous agitation pendant 30 minutes. La
concentration
en polymère 1 est de 162,9 mg/g déterminée par extrait sec. La densité est de
1.08. La concentration en polymère 1 est donc de 175,9 mg/mL.
Exemple 20: Préparation d'une - solution d'un dextran
fonctionnalisé par le phénylalaninate d'octanol
[000298] Une solution de polymère 2 à 40 mg/g est préparée en solubilisant
3,12 g de lyophilisat de polymère 2 (teneur en eau de 14%) dans 64 g d'eau.
Exemple 21 : Préparation d'une solution d'un dextran
fonctionnalisé par le glycinate d'octanol
[000299] Une solution de polymère 3 à 38 mg/g est préparée en solubilisant
3,95 g de lyophilisat de polymère 3 (teneur en eau de 4%) dans 100 g d'eau.
[000300] Des exemples de solution ou de lyophilisat de protéines ostéogéniques
sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
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Exemple 22 : Solution de rhBMP-2 en tampon HCl 1 mM
[000301] 10 mL d'une solution de rhBMP-2 à 0,15 mg/ml sont préparés par
ajout de 10 mL d'une solution d'HCI 1 mM à 1,5 mg de rhBMP-2 lyophilisée.
Cette
solution est laissée à incuber deux heures à 4 C et filtrée stérilement sur
0,22 pm.
5 Exemple 23: Solution de rhBMP-2 en tampon InFUSE
[000302] 1 L de tampon InFUSE est préparé en solubilisant dans une fiole
jaugée
de 1 L remplie de 800 mL d'eau 5 g de sucrose, 25 g de glycine, 3,72 g d'acide
glutamique, 0,11 g de chlorure de sodium et 0,11 g de polysorbate 80. Le pH de
cette solution est ensuite ajusté à 4,5 par ajout de 16,8 mL de soude 1 N. La
fiole
10 jaugée est enfin remplie au trait pour obtenir le tampon InFUSE. 1 mL d'une
solution de rhBMP-2 à 1,5 mg/ml dans le tampon InFUSE est préparé par ajout de
1 mL de tampon à 1,5 mg de rhBMP-2 lyophilisée. Cette solution est laissée à
incuber deux heures à 4 C et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
[000303] Cette solution peut en outre être lyophilisée.
15 Exemple 24: Solution de rhBMP-7 en tampon HCl 10 mM
[000304] Une solution de rhBMP-7 à 3,8 mg/ml est préparée par ajout de 1 mL
d'une solution d'HCI 1 mM à 3,8 mg de rhBMP-7 lyophilisée. Le pH de cette
solution est de 2,2. Cette solution est laissée à incuber 15 minutes à
température
ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
20 Exemple 25 : Solution de rhBMP-7 en tampon lactose 5% pH 3,5
[000305] Une solution de rhBMP-7 à 3,8 mg/ml est préparée par ajout de 7,8 mL
d'une solution de lactose à 5% dont le pH a été fixé à 3,5 par ajout d'HCI 1 M
à
30,3 mg de rhBMP-7 lyophilisée. Le pH de cette solution est de 3,5. Cette
solution
est laissée à incuber 15 minutes à température ambiante et est filtrée
stérilement
25 sur 0,22 pm.
Exemple 26 : Solution de rhGDF-S en tampon HCl 10 mM
[000306] 1 mL d'une solution de rhGDF-5 à 1,5 mg/ml est préparé par ajout de
1 mL d'une solution d'HCI 10 mM à 1,5 mg de rhGDF-5 lyophilisé. Cette solution
est laissée à incuber deux heures à 4 C et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
30 [000307] Des exemples de préparation de solutions de sels de phosphates
solubles sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 27: Solution de phosphate de sodium
[000308] Une solution de phosphate de sodium à 1 M est préparée en fiole
jaugée à partir d'un mélange équimolaire d'hydrogénophosphate de sodium
35 anhydre et de dihydrogénophosphate de sodium (Sigma). Cette solution est
laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur
0,22 pm.
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[000309] Des solutions plus diluées de phosphate de sodium sont préparées à
partir de la solution mère décrite ci-dessus.
[000310] Des exemples de préparation de solutions de sels de calcium solubles
sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 28 : Solution de chlorure de calcium à 2 M
[000311] Solution 1 : Une solution de chlorure de calcium à 2 M est préparée
en
fiole jaugée à partir de chlorure de calcium anhydre ou dihydrate (Sigma).
Cette
solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée
stérilement sur 0,22 Pm.
Exemple 29 : Solution de chlorure de calcium à 0,75 M
[000312] Solution 2 : Une solution de chlorure de calcium à 0,75 M est
préparée
par dilution à partir de la solution de chlorure de calcium 2 M décrite dans
l'exemple précédent. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à
température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 30 : Solution d'acétate de calcium à 0,75 M
[000313] Solution 3 : Une solution d'acétate de calcium à 0,75 M est préparée
en fiole jaugée à partir d'acétate de calcium (Sigma). Cette solution est
laissée à
incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 Pm.
Exemple 31 : Solution de gluconate de calcium à 0,75 M
[000314] Solution 4 : Une solution de gluconate de calcium à 0,75 M est
préparée en fiole jaugée à partir de gluconate de calcium (Sigma). Cette
solution
est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement
sur
0,22 Pm.
[000315] Des exemples de préparation de solutions de bases sont donnés à titre
indicatif et non limitatif.
Exemple 32 : Solution d'histidine à 1 M
[000316] Solution 5 : Une solution d'histidine à 1 M est préparée en fiole
jaugée
de 1 L en solubilisant 155,2 g de L-histidine (Sigma) dans le volume d'eau
désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est
laissée à
incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 33 : Solution de proline à 2 M
[000317] Solution 6 : Une solution de proline à 2 M est préparée en fiole
jaugée
de 1 L en ajoutant 230,2 g de L-proline (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le
volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette
solution
est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement
sur
0,22 pm.
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Exemple 34 : Solution de serine à 2 M
[000318] Solution 7 : Une solution de serine à 2 M est préparée en fiole
jaugée
de 1 L en ajoutant 210,2 g de L-serine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le
volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette
solution
est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement
sur
0,22 pm.
Exemple 35 : Solution de glycine à 2 M
[000319] Solution 8 : Une solution de glycine à 2 M est préparée en fiole
jaugée
de 1 L en ajoutant 150,1 g de L-glycine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le
volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette
solution
est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement
sur
0,22 pm.
Exemple 36 : Solution d'alanine à 2 M
[000320] Solution 9 : Une solution de alanine à 2 M est préparée en fiole
jaugée
de 1 L en ajoutant 178,2 g de L-alanine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le
volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette
solution
est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement
sur
0,22 pm.
Exemple 37: Solution de lysine à 2 M
[000321] Solution 10 : Une solution de lysine à 2 M est préparée en fiole
jaugée
de 1 L en ajoutant 292,4 g de L-lysine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le
volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette
solution
est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement
sur
0,22 pm.
[000322] Des solutions de concentration plus faible de ces différentes bases
sont
obtenues par dilution soit avec de l'eau, soit avec une solution de sels de
calcium
décrites précedemment.
Exemple 38 : Solution d'hydrogénocarbonate de sodium
[000323] Une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M est préparée en
fiole jaugée à partir d'hydrogénocarbonate de sodium anhydre (Sigma). Cette
solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée
stérilement sur 0,22 pm.
[000324] Des solutions plus diluées d'hydrogénocarbonate de sodium sont
préparées à partir de la solution mère décrite ci-dessus.
Exemple 39 : Solution de TRIS
[000325] Une solution de tris(hydroxymethyl)aminomethane à 0,5 M est
préparée en fiole jaugée à partir de tris(hydroxymethyl)aminomethane ultrapure
(Sigma) et ajustée à pH 7,4 avec de l'acide chlorhydrique 1 M. Cette solution
est
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laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur
0,22 pm.
[000326] Des exemples de préparation de solutions comprenant un polymère et
un sel de phosphate soluble sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 40: Solution comprenant le polymère 1 et du
phosphate de sodium à pH 6.5
[000327] Solution 11 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL et
du phosphate à 0,45 M est préparée par mélange de 8,6 mL de la solution de
polymère 1 à 175,9 mg/mL décrite dans l'Exemple 15, de 17 mL de la solution
1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et de 11,9 mL d'eau.
Cette
solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée
stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 41: Solution comprenant le polymère 1 et du
phosphate de sodium
[000328] Solution 12 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL et
du phosphate de sodium à 0,23 M est préparée par mélange de 5,5 mL de la
solution de polymère 1 à 175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15, de 5,5 mL de la
solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et de 13,0 mL
d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température
ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 42: Solution comprenant le polymère 2 et du
phosphate de sodium à pH 6.5
[000329] Solution 13 : Une solution comprenant le polymère 2 à 20 mg/mL et
du phosphate à 0,45 M est préparée par mélange de 10 mL de la solution de
polymère 2 à 40 mg/g décrite dans l'Exemple 20, de 9 mL de la solution 1 M de
phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et de 1 mL d'eau. Cette solution
est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement
sur
0,22 pm.
Exemple 43: Solution comprenant le polymère 1, du
phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate
[000330] Solution 14 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL, du
phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M
est préparée par mélange de 5,5 mL de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/g
décrite dans l'Exemple 15, de 5,5 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium
décrite dans l'Exemple 27, de 12,4 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de
sodium à 0,6 M obtenue par dilution de la solution mère décrite dans l'exemple
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et de 0,6 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à
température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 44: Solution comprenant le polymère 1, du
phosphate de sodium et de l'histidine
[000331] Solution 15 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL, du
phosphate de sodium à 0,23 M et de l'histidine à 0,09 M est préparée par
mélange
de 5,5 mL de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15,
de 5,5 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27,
de 10,8 mL d'une solution d'histidine à 0,2 M obtenue par dilution de la
solution
mère décrite dans l'Exemple 32 et de 2,2 mL d'eau stérile. Cette solution est
laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur
0,22 pm.
Exemple 45: Solution comprenant le polymère 2, du
phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate
[000332] Solution 16 : Une solution comprenant le polymère 2 à 10 mg/mL, du
phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M
est préparée par mélange de 3,45 mL de la solution de polymère 2 à
30,45 mg/mL décrite dans l'Exemple 13, de 2,0 mL de la solution 1,2 M de
phosphate de sodium obtenue selon l'Exemple 27, de 2,7 mL d'une solution
d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38 et de 2,4 mL
d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température
ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 46: Solution comprenant le polymère 5, du
phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate
[000333] Solution 17 : Une solution comprenant le polymère 5 à 20 mg/mL, du
phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M
est préparée par mélange de 1,3 mL de la solution de polymère 5 à 36,87 mg/mL
décrite dans l'Exemple 16, de 0,45 mL de la solution 1,2 M de phosphate de
sodium obtenue selon l'Exemple 27 et de 0,6 mL d'une solution
d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38. Cette
solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée
stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 47: Solution comprenant le polymère 6, du
phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate
[000334] Solution 18 : Une solution comprenant le polymère 6 à 20 mg/mL, du
phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M
est préparée par mélange de 1,0 mL de la solution de polymère 6 à 46,7 mg/mL
décrite dans l'Exemple 17, de 0,45 mL de la solution 1,2 M de phosphate de
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sodium obtenue selon l'Exemple 27, de 0,6 mL d'une solution
d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38 et de 0,3 mL
d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température
ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
5 Exemple 48: Solution comprenant le polymère 7, du
phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate
[000335] Solution 19 : Une solution comprenant le polymère 7 à 40 mg/mL, du
phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M
est préparée par mélange de 1,26 mL de la solution de polymère 7 à 75,9 mg/mL
10 décrite dans l'Exemple 18, de 0,45 mL de la solution 1,2 M de phosphate de
sodium obtenue selon l'Exemple 27, de 0,6 mL d'une solution
d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38 et de 0,06 mL
d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température
ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
[000336] Des exemples de préparation de complexes entre des protéines
ostéogéniques et des polymères sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 49 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/Polymère 1
[000337] Solution 20 : 22 pl d'une solution de rhBMP-2 à 1,46 mg/ml sont
ajoutés à 267 pl d'une solution de polymère 1 à 60,0 mg/ml et à 351 pL d'eau
stérile. Cette solution de rhBMP-2 et de polymère 1 est à pH 7,4. Cette
solution
est laissée à incuber deux heures à 4 C et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 50 : Préparation d'un complexe rhBMP-7/Polymère 1
[000338] Solution 21 : 50 pl d'une solution de rhBMP-7 à 1,5 mg/ml est mélangé
à 100 pl d'une solution de polymère 1 à 60,6 mg/ml. Cette solution de rhBMP-7
et
de polymère 1 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à
4 C
et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 51 : Préparation d'un complexe rhBMP-7/Polymère 2
[000339] Solution 22 : 50 pl d'une solution de rhBMP-7 à 0,15 mg/ml est
mélangé à 100 pl d'une solution de polymère 2 à 22,7 mg/ml. Cette solution de
rhBMP-7 et de polymère 2 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber
deux
heures à 4 C et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 52: Préparation d'un complexe rhGDF-5/Polymère 2
[000340] Solution 23 : 50 pl d'une solution de rhGDF-5 à 1,5 mg/ml est mélangé
à 100 pl d'une solution de polymère 2 à 22,7 mg/ml. Cette solution de rhGDF-5
et
de polymère 2 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à
4 C
et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
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Exemple 53: Préparation d'un complexe rhBMP-2/Polymère 1
en présence de phosphate de sodium
[000341] Solution 24 : 184,0 mg de lyophilisat de rhBMP-2 dans le tampon
InFUSE contenant seulement 7,85 mg de rhBMP-2 sont repris par 19 mL de la
solution décrite dans l'Exemple 41. La solution est laissée à incuber deux
heures à
4 C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 54: Préparation d'un complexe rhBMP-2/Polymère 1
en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium
[000342] Solution 25 : 165,5 mg de lyophilisat de rhBMP-2 dans le tampon
InFUSE contenant seulement 6,95 mg de rhBMP-2 sont repris par 17,1 mL de la
solution décrite dans l'Exemple 43. La solution est laissée à incuber deux
heures à
4 C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 55: Préparation d'un complexe rhBMP-2/Polymère 1
en présence de phosphate de sodium et d'histidine
[000343] Solution 26 : 165,5 mg de Iyophilisat de rhBMP-2 dans le tampon
InFUSE contenant seulement 6,95 mg de rhBMP-2 sont repris par 17,1 mL de la
solution décrite dans l'Exemple 44. La solution est laissée à incuber deux
heures à
4 C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 56: Préparation d'un complexe rhBMP-2/Polymère 1
en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium
[000344] Solution 27 : 1,98 mL d'une solution de rhBMP-2 à 1,55 mg/mL dans le
tampon InFuse sont ajoutés à 3,5 mL de la solution de polymère 1 à 174,7 mg/g.
Puis, 9,6 mL d'une solution contenant 0,74 M de phosphate de sodium et 1,2 M
d'hydrogénocarbonate de sodium et 0,28 mL d'eau stérile sont également
ajoutés.
Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et
filtrée
stérilement sur 0,22 pm. La composition du mélange est de 0.2 mg/mL en rhBMP-
2, de 40 mg/mL en polymère 1, de 0,45 M en phosphate de sodium et de 0,75 M
en hydrogénocarbonate de sodium.
Exemple 57: Préparation d'un complexe rhBMP-7/Polymère 1
en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium
[000345] Solution 28 : 1,71 mL d'une solution de rhBMP-7 à 3,69 mg/mL dans
un tampon 10 mM HCI sont ajoutés à 3,4 mL de la solution de polymère 1 à
175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15. Puis, 3,3 mL de la solution 1 M de
phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et 7,5 mL d'une solution
d'hydrogénocarbonate de sodium à 0,6 M obtenue par dilution de la solution
mère
décrite dans l'exemple 38 et 14,1 mL d'eau stérile sont ajoutés. Cette
solution est
laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur
0,22 pm. La composition du mélange est de 0.2 mg/mL en rhBMP-7, de 20 mg/mL
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en polymère 1, de 0,11 M en phosphate de sodium et de 0,15 M en
hydrogénocarbonate de sodium.
Exemple 58 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/Polymère 2
en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium
[000346] Solution 29 : 65,2 mg d'un lyophilisat de rhBMP-2 dans le tampon
InFuse sont repris avec 10,5 mL de la Solution 16. Cette solution est laissée
à
incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
La
composition du mélange est de 0.4 mg/mL en rhBMP-2, de 10 mg/mL en
polymère 2, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en
hydrogénocarbonate de sodium.
Exemple 59 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/Polymère 5
en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium
[000347] Solution 30 : 25,7 mg d'un lyophilisat de rhBMP-2 dans le tampon
InFuse sont repris avec 2,4 mL de la Solution 17. Cette solution est laissée à
incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
La
composition du mélange est de 1.5 mg/mL en rhBMP-2, de 20 mg/mL en
polymère 5, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en
hydrogénocarbonate de sodium.
Exemple 60 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/Polymère 6
en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium
[000348] Solution 31 : 24,8 mg d'un lyophilisat de rhBMP-2 dans le tampon
InFuse sont repris avec 2,4 mL de la Solution 18. Cette solution est laissée à
incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
La
composition du mélange est de 1.5 mg/mL en rhBMP-2, de 20 mg/mL en
polymère 6, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en
hydrogénocarbonate de sodium.
Exemple 61 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/Polymère 7
en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium
[000349] Solution 32 : 25,6 mg d'un lyophilisat de rhBMP-2 dans le tampon
InFuse sont repris avec 2,4 mL de la Solution 19. Cette solution est laissée à
incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
La
composition du mélange est de 1.5 mg/mL en rhBMP-2, de 40 mg/mL en
polymère 7, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en
hydrogénocarbonate de sodium.
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[000350] Des exemples de préparation de solutions comprenant un sel de
calcium soluble et une base sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 62 : Solution de chlorure de calcium et d'histidine
[000351] Solution 33 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M
et de l'histidine à 0,4 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de
chlorure de calcium à 2 M, 120 mL d'une solution d'histidine à 1 M et 67,5 mL
d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à
température
ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 63 : Solution de chlorure de calcium et de proline
[000352] Solution 34 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M
et de proline à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de
chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de proline à 2 M et 75 mL
d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à
température
ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 64 : Solution de chlorure de calcium et de glycine
[000353] Solution 35 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M
et de glycine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de
chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de glycine à 2 M et 75 mL
d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à
température
ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 65 : Solution de chlorure de calcium et d'alanine
[000354] Solution 36 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M
et d'alanine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de
chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution d'alanine à 2 M et 75 mL
d'eau
désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température
ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 66 : Solution de chlorure de calcium et de lysine
[000355] Solution 37 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M
et de lysine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de
chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de lysine à 2 M et 75 mL
d'eau
désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température
ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 67 : Solution de chlorure de calcium et de serine
[000356] Solution 38 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M
et de serine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de
chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de serine à 2 M et 75 mL
d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à
température
ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
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[000357] Des exemples de préparation de suspensions injectables comprenant
une BMP, un polymère, un sel de calcium soluble, un sel de phosphate soluble
et/ou une base sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 68 : Préparation d'une suspension injectable d'un
complexe rhBMP-2/Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de
phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000358] Une suspension ostéogénique basée sur une coprécipitation du
complexe rhBMP-2/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium a été
obtenue par mélange de 400 pL de la Solution 29 contenant de la rhBMP-2 à
0,4 mg/mL, soit 160 pg de rhBMP-2, le Polymère 2 à 10 mg/mL, soit 4 mg de
polymère 2, du phosphate de sodium à 0,23 M, soit 92 pmol, et de
l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M, soit 124 pmol, et de 400 pL d'une
solution de chlorure de calcium à 0,38 M, soit 153 pmol. La suspension obtenue
est conservée 15 minutes à température ambiante avant injection. Cette
suspension est injectable avec des aiguilles de 27 gauges.
Exemple 69: Préparation d'une suspension injectable d'un
complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de
phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000359] Une suspension ostéogénique basée sur une coprécipitation du
complexe BMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium a été
obtenue par mélange de 1250 pL d'une solution contenant de la BMP-2 à
0,52 mg/mL soit 650 pg de BMP-2, le Polymère 1 à 20 mg/mL, soit 25 mg de
Polymère 1, du phosphate de sodium à 0,23 M, soit 288 pmol, et de
l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M, soit 388 pmol, et de 1250 pL d'une
solution à 0,38 M de chlorure de calcium, soit 477 pmol. La suspension obtenue
est conservée 15 minutes à température ambiante avant injection. Cette
suspension est injectable avec des aiguilles de 27 gauges.
[000360] Des exemples de préparation d'implants comprenant une BMP, un
polymère, un sel de calcium soluble, un sel de phosphate soluble et/ou une
base
sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
[000361] Les implants décrits dans les exemples suivants sont préparés avec
une éponge de collagène de type-I réticulée stérile de type Helistat (Integra
LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). Le volume de cette éponge varie selon
l'application, 200 pL pour une application en site ectopique chez le rat, 4,5
mL
pour une application de fusion vertébrale chez le lapin.
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Exemple 70: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de
phosphate de sodium lyophilisés
[000362] Implant 1 : 40 pl de la Solution 20 sont introduits dans une éponge
de
5 collagène réticulée de 200 mm3 stérile. La solution est laissée à incuber
pendant
30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 10 pl d'une solution
de
chlorure de calcium à une concentration de 1,64 M. Enfin, 90 pL d'une solution
de
phosphate de sodium neutralisée à une concentration de 0,053 M obtenue par
mélange de 80 pL de phosphate de sodium (22,5 mg/mL) et 10 pL d'acide
10 chlorhydrique 1 N sont ajoutés à l'éponge. L'éponge est alors congelée et
lyophilisée stérilement. La dose de rhBMP-2 dans l'éponge est de 2 pg.
Exemple 71 : Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de
phosphate de sodium lyophilisés
15 [000363] Implant 2 : 40 pl de la Solution 20 sont introduits dans une
éponge de
collagène réticulée de 200 mm3 stérile. La solution est laissée à incuber
pendant
30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 10 pl d'une solution
de
chlorure de calcium à une concentration de 6,85 M. Enfin, 90 pL d'une solution
de
phosphate de sodium neutralisée à une concentration de 0,22 M obtenue par
20 mélange de 80 pL de phosphate de sodium (93,8 mg/mL) et 10 pL d'acide
chlorhydrique 1 N sont ajoutés à l'éponge. L'éponge est alors congelée et
lyophilisée stérilement. La dose de rhBMP-2 est de 2 pg.
Exemple 72: Préparation d'implants éponge collagène /
complexe BMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et
25 d'ascorbate de sodium lyophilisés
[000364] Implant 3 : 40 pl de la Solution 20 sont introduits dans une éponge
de
collagène réticulée de 200 mm3 stérile. La solution est laissée à incuber
pendant
30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 10 pl d'une solution
de
chlorure de calcium à une concentration de 1,64 mg/ml. Enfin, 80 pL d'une
30 solution d'ascorbate de sodium à une concentration de 0,41 M sont ajoutés à
l'éponge. L'éponge est alors congelée et lyophilisée stérilement. La dose de
rhBMP-2 est de 2 pg.
Exemple 73: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de
35 phosphate de sodium lyophilisés
[000365] Implant 4 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
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2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 2 mL d'une solution à 0,325 mg/mL de rhBMP-2, soit 650 pg de rhBMP-2,
à 64,5 mg/mL de Polymère 1, soit 129 mg Polymère 1, et à 0,18 M de phosphate
de sodium à pH 7,4 soit 360 pmol, puis 500 pL d'une solution de chlorure de
calcium à 1,2 M soit 600 pmol de chlorure de calcium et enfin de 500 pL d'une
solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 pmol d'hydroxyde de sodium.
Ces implants sont ensuite congelés à -80 C et lyophilisés. Chacune des éponges
lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation.
Exemple 74: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de
phosphate de sodium lyophilisés
[000366] Implant 5 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 2 mL d'une solution à 0,163 mg/mL de rhBMP-2, soit 326 pg de rhBMP-2,
à 32,5 mg/mL de Polymère 1, soit 65 mg de Polymère 1, et à 0,18 M de
phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 pmol, puis 500 pL d'une solution de
chlorure de calcium à 1,2 M soit 600 pmol et enfin 500 NL d'une solution
d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 pmol d'hydroxyde de sodium. Ces
implants sont ensuite congelés à -80 C et lyophilisés. Chacune des éponges
lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation.
Exemple 75: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de
phosphate de sodium lyophilisés
[000367] Implant 6 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 2 mL d'une solution à 0,081 mg/mL de rhBMP-2, soit 162 pg de rhBMP-2,
à 16,3 mg/mL de Polymère 1, soit 32,5 mg et à 0,18 M de phosphate de sodium à
pH 7,4 soit 360 pmol, puis 500 pL d'une solution de chlorure de calcium à 1,2
M,
soit 600 pmol et enfin 500 pL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M
soit
270 pmol d'hydroxyde de sodium. Ces implants sont ensuite congelés à -80 C et
lyophilisés. Chacune des éponges lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang
autologue 30 min avant implantation.
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Exemple 76: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de
phosphate de sodium lyophilisés
[000368] Implant 7 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 2 mL d'une solution à 0,040 mg/mL de rhBMP-2, soit 80 pg de rhBMP-2, à
8 mg/mL de Polymère 4, soit 16 mg, et à 0,18 M de phosphate de sodium à pH
7,4 soit 360 pmol, puis 500 pL d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 M,
soit
600 pmol et enfin 500 pL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit
270
pmol d'hydroxyde de sodium. Ces implants sont ensuite congelés à -80 C et
lyophilisés. Chacune des éponges lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang
autologue 30 min avant implantation.
Exemple 77: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de
phosphate de sodium
[000369] Implant 8 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 1060 pL d'une solution à 0,311 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 pg de
rhBMP-2, à 62,3 mg/mL de Polymère 4, soit 66 mg et à 0,34 M de phosphate de
sodium à pH 7,4 soit 360 pmol, puis 270 pL d'une solution de chlorure de
calcium
à 3,4 M, soit 920 pmol, et enfin 270 pL d'une solution d'hydroxyde de sodium à
1,37 M, soit 370 pmol d'hydroxyde de sodium.
Exemple 78 : Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de
phosphate de sodium
[000370] Implant 9 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 1060 pL d'une solution à 0,151 mg/mL de rhBMP-2, soit 160 pg de
rhBMP-2, à 30,2 mg/mL de Polymère 4, soit 32 mg, et à 0,34 M de phosphate de
sodium à pH 7,4 soit 360 pmol, puis 270 pL d'une solution de chlorure de
calcium
à 3,4 M, soit 920 pmol, et enfin 270 pL d'une solution d'hydroxyde de sodium à
1,37 M, soit 370 pmol d'hydroxyde de sodium.
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Exemple 79: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de
phosphate de sodium
[000371] Implant 10 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 1060 pL d'une solution à 0,311 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 pg de
rhBMP-2, à 62,3 mg/mL de Polymère 4, soit 66 mg et à 0,34 M de phosphate de
sodium à pH 7,4 soit 360 pmol, et enfin 540 pL d'une solution de chlorure de
calcium à 1,7 M, soit 920 pmol.
Exemple 80: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de
phosphate de sodium lyophilisés
[000372] Implant 11 : Un implant ostéogénique basé sur une précipitation du
complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium a été
obtenu à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54
x
0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés
1500 pL d'une solution à 0,107 mg/mL de rhBMP-2, soit 160 pg de rhBMP-2, à
21.3 mg/mL de Polymère 1, soit 32 mg, puis 500 pL d'une solution à 1,2 M de
chlorure de calcium soit 600 pmol, puis 500 pL d'une solution à 0,72 M de
phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 pmol et enfin 500 pL d'une solution
d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 pmol d'hydroxyde de sodium. L'implant
est ensuite congelé à -80 C et lyophilisé. L'éponge lyophilisée est imbibée
par 1
mL de sang autologue 30 min avant implantation.
Exemple 81 : Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 4 en présence de chlorure de calcium, de
phosphate de sodium et d'histidine
[000373] Implant 12 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 800 pL d'une solution à 0,413 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 pg de rhBMP-
2, à 20,65 mg/mL de Polymère 4, soit 16,5 mg et à 0,115 M de phosphate de
sodium à pH 7,4, soit 92 pmol, et enfin 800 pL d'une solution à 0,3 M de
chlorure
de calcium, soit 240 pmol, et à 0,2 M d'histidine, soit 160 pmol.
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Exemple 82 : Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 4 en présence de chlorure de calcium, de
phosphate de sodium et d'histidine
[000374] Implant 13 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 800 pL d'une solution à 0,413 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 pg de rhBMP-
2, à 20,65 mg/mL de Polymère 4, soit 16,5 mg et à 0,24 M de phosphate de
sodium à pH 7,4, soit 192 pmol, et enfin 800 pL d'une solution à 0,4 M de
chlorure de calcium, soit 320 pmol et à 0,4 M d'histidine soit 320 pmol.
Exemple 83 : Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de
phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000375] Implant 14 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 800 pL d'une solution à 0,2 mg/mL de rhBMP-2, soit 160 pg de rhBMP-2,
à 40 mg/mL de Polymère 1, soit 32 mg, à 0,45 M de phosphate de sodium à pH
7,4 soit 360 pmol, et à 0,75 M d'hydrogénocarbonate de sodium, soit 600 pmol,
et enfin 800 pL d'une solution à 0,75 M de chlorure de calcium soit 600 pmol.
Exemple 84 : Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de
phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000376] Implant 15 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 800 pL d'une solution contenant de la BMP-2 à 0,2 mg/mL, soit 160 pg
de
rhBMP-2, le Polymère 1 à 8 mg/mL, soit 6,4 mg, du phosphate de sodium à 0,45
M, soit 360 pmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,75 M, soit 600
pmol,
et enfin 800 pL d'une solution de chlorure de calcium à 0,75 M, soit 600 pmol.
Exemple 85 : Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de
phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000377] Implant 16 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont
CA 02744150 2011-05-18
WO 2010/058106 PCT/FR2009/001332
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x
2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'éponge de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont
ajoutés 800 pL d'une solution contenant de la BMP-2 à 0,2 mg/mL, soit 160 pg
de
rhBMP-2, le Polymère 1 à 20,6 mg/mL, soit 16,5 mg, du phosphate de sodium à
5 0,24 M, soit 192 pmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,75 M, soit
600
pmol, et enfin 800 pL d'une solution de chlorure de calcium à 0,4 M, soit 320
pmol.
Exemple 86: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-7/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de
10 phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000378] Implant 17 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe BMP-7/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été
obtenus après imprégnations successives d'une éponge de collagène de type-I
réticulée cylindrique de 198 pL par 70 pL d'une solution à 0,071 mg/mL de BMP-
7
15 soit 5 pg de BMP-7, à 31,3 mg/mL de Polymère 1, soit 1,5 mg de Polymère 1,
à
0,24 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 16,8 pmol, et à 0,4 M
d'hydrogénocarbonate de sodium soit 28 pmol, puis par 70 pL d'une solution à
0,4
M de chlorure de calcium, soit 28 pmol. Les implants sont ensuite congelés à -
80 C et lyophilisés. Les éponges lyophilisées sont imbibées par 45 pL de sang
20 autologue 30 min avant implantation.
Exemple 87: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhBMP-2/Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de
phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000379] Implant 18 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
25 du complexe rhBMP-2/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont
été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de volume d'éponge de
2.25 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 400 pL de la Solution 29 contenant de
la
rhBMP-2 à 0,4 mg/mL, soit 160 pg de rhBMP-2, le Polymère 2 à 10 mg/mL, soit 4
mg, du phosphate de sodium à 0,23 M, soit 92 pmol, et de l'hydrogénocarbonate
30 de sodium à 0,31 M, soit 124 pmol, et enfin 400 pL d'une solution de
chlorure de
calcium à 0,38 M, soit 153 pmol. Chaque solution est laissée 15 minutes en
contact avec l'éponge après ajout. Après ces durées d'imprégnation, l'éponge
est
prête pour l'implantation.
Exemple 88: Préparation d'implants éponge de collagène /
35 complexe rhBMP-7/Polymère 3 en présence de chlorure de calcium, de
phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000380] Implant 19 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe BMP-7/Polymère 3 et de particules de phosphate de calcium ont été
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obtenus après imprégnations successives d'une éponge de collagène de type-I
réticulée d'un volume de 4520 pL par 800 pL d'une solution contenant de la BMP-
7
à 0,41 mg/mL, soit 330 pg de BMP-7, le Polymère 3 à 17,5 mg/mL, soit 14 mg de
Polymère 3, du phosphate de sodium à 0,45 M, soit 360 pmol, puis par 800 pL
d'une solution contenant du chlorure de calcium à 0,4 M, soit 648 pmol et de
la
proline à 0.61 M, soit 488 pmol. Chaque solution est laissée 15 minutes en
contact avec l'éponge après ajout. Après ces durées d'imprégnation, l'éponge
est
prête pour l'implantation.
Exemple 89: Préparation d'implants éponge de collagène /
complexe rhGDF-5/Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de
phosphate de sodium et d'histidine lyophilisés
[000381] Implant 20 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe GDF-5/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été
obtenus après imprégnations successives d'une éponge de collagène de type-I
réticulée d'un volume de 4520 pL par 1500 pL d'une solution contenant du GDF-5
à 0,5 mg/mL, soit 750 pg de GDF-5, le Polymère 2 à 20 mg/mL, soit 30 mg de
Polymère 2, puis par 750 pL d'une solution contenant du chlorure de calcium à
0,8 M, soit 600 pmol et de l'histidine à 0.38 M, soit 285 pmol et enfin par
une
solution contenant du phosphate de sodium à 0,48 M, soit 360 pmol. Chaque
solution est laissée 15 minutes en contact avec l'éponge après ajout. Après
ces
durées d'imprégnation, les éponges sont congelées à -80 C et lyophilisées. Les
éponges lyophilisées sont imbibées par 1,5 mL de sang autologue 30 min avant
implantation.
[000382] Les implants décrits dans les exemples suivants sont préparés avec
une matrice résistante à la compression, CRM pour Compressive Resistant
Matrix.
Ce matériau est une matrice mixte composée de collagène bovin de type I et
d'une phase minérale de phosphate de calcium composée à 15% d'hydroxyapatite
et à 85% de beta-tricalcium phosphate commercialisé par Medtronic sous le nom
de MasterGraft Matrix. Le volume de cette matrice varie selon l'application,
140 pL
pour une application en site ectopique chez le rat, 5 mL pour une application
de
fusion vertébrale chez le lapin.
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Exemple 90: Préparation d'implants éponge de collagène
entourant un CRM contenant un complexe rhBMP-2/Polymère 2 en
présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et
d'hydrogénocarbonate
[000383] Implant 21 : L'Implant 16 est enroulé autour d'un CRM sec de volume
5.0 mL (5,0 * 1,0 * 1,0 cm) avant implantation chez le lapin.
Exemple 91 : Préparation d'implants CRM / complexe
rhBMP-2/Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate
de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000384] Implant 22 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe BMP-2/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été
obtenus après imprégnations successives d'un CRM d'un volume de 140 pL par
35 pL d'une solution à 0,14 mg/mL de BMP-2 soit 5 pg de BMP-2, à 14 mg/mL de
Polymère 2, soit 0,5 mg de Polymère 2, à 0,23 M de phosphate de sodium soit
8 pmol, et à 0,31 M d'hydrogénocarbonate de sodium soit 11 pmol pendant 15
minutes, puis par 35 pL d'une solution à 0,38 M de chlorure de calcium, soit
13 pmol pendant 15 minutes. Les CRM sont prêts pour l'implantation.
Exemple 92: Préparation d'implants CRM / complexe
rhGDF-S/Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate
de sodium et d'histidine lyophilisés
[000385] Implant 23 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe GDF-5/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été
obtenus après imprégnations successives d'un CRM d'un volume de 140 pL par
35 pL d'une solution à 0,86 mg/mL de GDF-5 soit 30 pg de GDF-5, à 14 mg/mL
de Polymère 2, soit 0,5 mg de Polymère 2, à 0,23 M de phosphate de sodium soit
8 pmol pendant 15 minutes, puis par 17,5 pL d'une solution d'histidine à 0,34
M,
soit 6 pmol pendant 15 minutes et enfin par 17,5 pL d'une solution de chlorure
de
calcium à 0,74 M, soit 13 pmol. Les CRM sont ensuite congelés à -80 C et
lyophilisés. Les CRM lyophilisés sont imbibés par 45 pL de sang autologue 30
min
avant implantation.
Exemple 93: Préparation d'implants CRM / complexe
rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate
de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000386] Implant 24 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation
du complexe BMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été
obtenus après imprégnations successives d'un CRM d'un volume de 5.0 mL par
1250 pL d'une solution à 0,52 mg/mL de BMP-2 soit 650 pg de BMP-2, à
20 mg/mL de Polymère 1, soit 25 mg de Polymère 1, à 0,23 M de phosphate de
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sodium soit 288 pmol, et à 0,31 M d'hydrogénocarbonate de sodium soit 388 pmol
pendant 15 minutes, puis par 1250 pL d'une solution à 0,38 M de chlorure de
calcium, soit 477 pmol pendant 15 minutes. Les CRM sont prêts pour
l'implantation.
Contre-exemple 1 : Préparation d'implants éponge de
collagène contenant 20 pg de rhBMP-2
[000387] Implant 25 : 40 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,5 mg/ml dans un
tampon de type INFUSE sont introduits stérilement dans une éponge de collagène
réticulée, de 200 mm3, stérile. La solution est laissée pendant 30 minutes
dans
l'éponge de collagène avant implantation.
[000388] La dose de rhBMP-2 dans l'implant 25 est de 20 pg.
Contre-exemple 2: Préparation d'implants éponge de
collagène contenant 2 pg de rhBMP-2
[000389] Implant 26 : 40 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,05 mg/ml dans un
tampon de type INFUSE sont introduits stérilement dans une éponge de collagène
réticulée, de 200 mm3, stérile, de type Helistat (Integra LifeSciences,
Plainsboro,
New Jersey). La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de
collagène avant implantation.
[000390] La dose de rhBMP-2 dans l'implant 26 est de 2 pg.
Contre-Exemple 3: Préparation d'implants éponge de
collagène contenant 5 pg de rhBMP-7
[000391] Implant 27 : Des implants ostéogéniques lyophilisés à base de BMP-7
ont été obtenus après imprégnation d'une éponge de collagène de type-I
réticulée
cylindrique de 198 pL par 140 pL d'une solution à 0,036 mg/mL de BMP-7 soit 5
pg. Les implants sont ensuite congelés à -80 C et lyophilisés. Les éponges
lyophilisées sont imbibées par 45 pL de sang autologue 30 min avant
implantation.
Contre-Exemple 4: Préparation d'implants éponge de
collagène contenant 2,3 mg de rhBMP-2
[000392] Implant 28 : Des implants ostéogéniques ont été obtenus par
imprégnation d'une éponge de collagène de type-I réticulée de dimensions 5,02
x
2,54 x 0,35 cm soit un volume d'éponge de 4.52 mL par 1600 pL d'une solution à
1,45 mg/mL de rhBMP-2 soit 2,3 mg. La solution est laissée pendant 30 minutes
dans l'éponge de collagène avant implantation.
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Contre-Exemple 5: Préparation d'implants éponge de
collagène contenant 1,3 mg de rhBMP-2
[000393] Implant 29 : Des implants ostéogéniques ont été obtenus par
imprégnation d'une éponge de collagène de type-I réticulée de dimensions 5,02
x
2,54 x 0,35 cm soit un volume d'éponge de 4.52 mL par 1600 pL d'une solution à
0,80 mg/mL de rhBMP-2 soit 1,3 mg. La solution est laissée pendant 30 minutes
dans l'éponge de collagène avant implantation.
Exemple 94: Evaluation du pouvoir osteoinductif des
différentes formulations
[000394] L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir osteoinductif
des
différentes formulations dans un modèle de formation ectopique d'os chez le
rat.
Des rats mâles de 150 à 250 g (Sprague Dawley OFA - SD, Charles River
Laboratories France, B.P. 109, 69592 l'Arbresle) sont utilisés pour cette
étude.
[000395] Un traitement analgésique (buprenorphine, Temgesic , Pfizer, France)
est administré avant l'intervention chirurgicale. Les rats sont anesthésiés
par
inhalation d'un mélange 02 isoflurane (1-4%). La fourrure est éliminée par
rasage
sur une large zone dorsale. La peau de cette zone dorsale est désinfectée à
l'aide
d'une solution de povidone iodine (Vetedine solution, Vetoquinol, France).
[000396] Des incisions paravertébrales d'environ 1 cm sont effectuées afin de
dégager les muscles dorsaux paravertébraux droit et gauche. L'accès aux
muscles
est effectué par incision transfaciale. Chacun des implants est placé dans une
poche de telle manière qu'aucune compression sur celles-ci ne puisse être
exercée. Quatre implants sont implantés par rat (deux implants par site).
L'ouverture des implants est ensuite suturée au moyen d'un fil polypropylene
(Prolene 4/0, Ethicon, France). La peau est refermée au moyen d'une suture non-
absorbable. Les rats sont ensuite replacés dans leurs cages respectives et
gardés
en observation durant leur rétablissement.
[000397] A 21 jours, les animaux sont anesthésiés par une injection de
tiletamine-zolazepam (ZOLETIL 25-50 mg/kg, IM, VIRBAC, France).
[000398] Les animaux sont ensuite euthanasiés par injection d'une dose de
pentobarbital (DOLETHAL , VETOQUINOL, France). Une observation
macroscopique de chaque site est ensuite réalisée, tout signe d'intolérance
locale
(inflammation, nécrose, hémorrhagie) et la présence de tissu osseux et/ou
cartilagineux est enregistrée et côtée selon le barème suivant : 0: absence,
1:
faible, 2: modéré, 3: marqué, 4: important.
[000399] Chacun des explants est retiré de son site d'implantation et des
photographies macroscopiques sont prises. La taille et le poids des explants
sont
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ensuite déterminés. Chaque expiant est ensuite conservé dans une solution de
formol à 10% tamponnée.
Résultats :
5 [000400] Cette expérience in vivo permet de mesurer l'effet ostéoinducteur
de la
rhBMP-2 placée dans un muscle du dos d'un rat. Ce site non osseux est dit
ectopique. Les résultats des différents exemples sont résumés dans le tableau
suivant.
Présence de tissu osseux Masse des ex plants (mg)
Implant 25 3,6 38
Implant 26 - -
Implant 1 3,4 100
Implant 2 3,1 132
Implant 3 3,5 124
[000401] Une dose de 20 Ng de rhBMP-2 dans une éponge de collagène (Implant
25, Contre-exemple 1) conduit à l'obtention d'explants ossifiés de 38 mg de
masse moyenne après 21 jours.
[000402] Une dose de 2 pg de rhBMP-2 dans une éponge de collagène (Implant
26, Contre-exemple 2) n'a pas un pouvoir ostéoinducteur suffisant pour qu'on
puisse retrouver les implants collagéniques au bout de 21 jours.
[000403] En présence de complexe rhBMP-2/polymère 1, de chlorure de calcium
et de phosphate de sodium, une dose de rhBMP-2 de 2 pg lyophilisée dans
l'éponge de collagène (Implant 1, Exemple 70 et Implant 2, Exemple 71) permet
de générer des expiants ossifiés contrairement à la rhBMP-2 seule à la même
dose. De plus, ces explants sont de masse 4 fois supérieure avec un score
osseux
équivalent à ceux avec la rhBMP-2 seule. Cette formulation permet donc
d'améliorer l'activité ostéogénique de la rhBMP-2.
[000404] De façon équivalente, l'ajout d'ascorbate de sodium à l'éponge de
collagène contenant le complexe rhBMP-2/polymère 1 et du chlorure de calcium
(Implant 3, Exemple 72) permet également d'obtenir des explants ossifiés de
masse 4 fois supérieure avec un score osseux équivalent à ceux avec la rhBMP-2
seule. Cette formulation permet également d'améliorer l'activité ostéogénique
de
la rhBMP-2.
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Exemple 95: Evaluation du pouvoir osteoinductif des
différentes formulations en fusion postéro-latérale
[000405] L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir osteoinducteur
des différentes formulations dans un modèle de fusion postérolatérale chez le
lapin. Cette étude est menée suivant le protocole expérimental décrit dans la
publication de JP Lawrence (Lawrence, J. P. et al., Spine 2007, 32 (11), 1206-
1213.) à l'exception du traitement à la nicotine puisque l'induction d'une
pseudarthrose n'est pas souhaitée.
[000406] La fusion des vertèbres est évaluée par palpation manuelle de la
colonne vertébrale explantée. L'absence de mobilité entre les vertèbres est
synonyme de fusion. La colonne vertébrale est également analysée par micro-CT
à
12 semaines pour évaluer la présence d'os au niveau des vertèbres. Les
résultats
obtenus pour les différents implants sont résumés dans le tableau suivant.
1.
Protéine Dose de protéine (mg) Fusion
Implant 28 BMP-2 2,3 2/2
Implant 29 BMP-2 1,3 7/8
Implant 5 BMP-2 0,33 3/3
Implant 14 BMP-2 0,16 5/5
Implant 15 BMP-2 0,16 6/6
Implant 16 BMP-2 0,16 6/6
Implant 19 BMP-7 0.33 2/2
Implant 20 GDF-5 0.75 5/5
[000407] De ces études de fusion postérolatérale chez le lapin, il ressort que
le
complexe BMP-2 polymère co-précipités avec le sel de phosphate de calcium
permet de réduire les doses de BMP-2 d'un facteur 4 à 8 par rapport la BMP-2
seule à 1,3 mg de BMP-2 seule, dose efficace dans ce modèle d'après la
littérature, avec des résultats de fusion équivalents. Même à des doses de BMP-
2
de 0,16 mg, la fusion postérolatérale est observée chez tous les lapins dans
le cas
du complexe BMP-2 polymère co-précipité avec le sel de phosphate de calcium.
[000408] Les implants contenant le complexe BMP-7 polymère co-précipités avec
le sel de phosphate de calcium conduisent également à la fusion des vertèbres
pour des doses faibles de BMP-7, 0,33 mg de BMP-7 par implant. Les résultats
de
la littérature démontrent qu'une fusion vertébrale chez le lapin de 100% n'est
pas
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atteinte même à une dose de 3.5 mg de BMP-7, dose bien supérieure à celle
étudiée (Yao, G. et al., Spine 2008, 33 (18), 1935-1942.).
[000409] Les implants contenant le complexe GDF-5 polymère co-précipités avec
le sel de phosphate de calcium conduisent également à 100% de fusion
vertébrale
pour des doses faibles de GDF-5, 750 pg de GDF-5 par implant. Les résultats de
la
littérature démontrent qu'une fusion vertébrale chez le lapin de 100% n'est
pas
atteinte même à une dose de 2.5 mg de GDF-5, dose bien supérieure à celle
étudiée (Magit, David P. et al., Spine 2006, 31 (19), 2180-2188.).
