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Vaccin méningocoque
à base de lipooligosaccharide (LOS) et de protéine de Neisseria meningitidis
L'invention s'inscrit dans le domaine des vaccins à l'encontre des infections
dues à
Neisseria meningitidis et propose notamment une composition vaccinale
comprenant du
lipooligosaccharide (LOS) en association avec la sous-unité B (TbpB) lipidée
du
récepteur de la transferrine humaine d'une souche de N. meningitidis.
Dans le domaine des vaccins, un des enjeux majeurs des prochaines années sera
notamment la mise sur le marché d'un vaccin destiné à prévenir l'ensemble des
infections à N. meningitidis sérogroupe B. Cette bactérie est responsable d'un
certain
nombre de pathologies, parmi lesquelles de façon dominante, les méningites et
les
méningococcies, mais aussi des arthrites et péricardites. Les méningococcies
peuvent se
compliquer de purpura fulminans et de choc septique mortel.
D'une manière générale, les méningites sont soit d'origine virale, soit
d'origine
bactérienne. Dans les pays développés, les bactéries principalement
responsables sont
N. meningitidis et Streptococcus pneumoniae, respectivement impliquées dans
environ
40 et 50 % des cas de méningites bactériennes. Dans les pays en voie de
développement
Haemophilus influenzae reste aussi une source importante de méningites.
On dénombre en France, environ 600 à 800 cas par an de méningites à N.
meningitidis.
Aux Etats-Unis, le nombre de cas s'élève à environ 2 500 à 3 000 par an.
L'espèce N. meningitidis est subdivisée en sérogroupes selon la nature des
polysaccharides de capsule. Bien qu'il existe une douzaine de sérogroupes, 90
% des cas
de méningites sont attribuables aux sérogroupes : A, B, C, Y et W135.
Il existe des vaccins efficaces à base de polysaccharides capsulaires pour
prévenir les
méningites à N meningitidis des sérogroupes A, C, Y et W135. Ces
polysaccharides tels
quels ne sont que peu ou pas immunogènes chez les enfants de moins de 2 ans et
n'induisent pas de mémoire immunitaire. Toutefois, ces inconvénients peuvent
être
surmontés en conjuguant ces polysaccharides à une protéine porteuse.
Par contre, le polysaccharide capsulaire de N. meningitidis sérogroupe B n'est
pas ou peu
immunogène chez l'homme, qu'il soit sous forme conjuguée ou non (Bruge et al,
Vaccine (2004) 22 : 1087). D'autre part, ce polysaccharide est porteur d'un
épitope qui
peut potentiellement réagir de manière croisée avec des tissus humains. Ainsi,
il apparaît
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
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hautement souhaitable de rechercher un vaccin à l'encontre des méningites
induites par
N. meningitidis notamment du sérogroupe B autre qu'un vaccin à base de
polysaccharide
capsulaire.
Le lipopolysaccharide (LPS) est un constituant majeur de la membrane externe
de la
paroi des bactéries à Gram-négatif. Le LPS est toxique à forte dose pour les
mammifères
et au regard de cette activité biologique, a été dénommé endotoxine. Il est
responsable
du choc septique, pathologie mortelle qui se développe suite à une infection
aigüe par
une bactérie à Gram-négatif.
Néanmoins, le LPS n'est pas seulement toxique, il est aussi immunogène. Chez
les
mammifères, les anticorps anti-LPS sont générés pendant le portage et
l'infection et
peuvent être protecteurs. Ainsi, l'usage du LPS a déjà été envisagé dans la
prophylaxie
des infections dues aux bactéries à Gram-négatif et des maladies associées.
La structure du LPS est constituée d'une partie lipidique, appelée le lipide
A, liée de
manière covalente à une partie polysaccharidique.
Le lipide A est responsable de la toxicité du LPS. Il est fortement hydrophobe
et permet
d'ancrer le LPS dans la membrane externe de la paroi. Le lipide A est composé
d'une
structure disaccharidique substituée par des chaînes d'acides gras. Le nombre
et la
composition des chaînes d'acides gras varient d'une espèce à l'autre.
La partie polysaccharidique est constituée par des chaînes de carbohydrates
qui sont
responsables de l'antigénicité. On distingue au moins 3 grandes régions dans
cette partie
polysaccharidique :
(i) un core interne, constitué de monosaccharides [un ou plusieurs KDO (acide
2-
céto-3-desoxy-octulosonique) et un ou plusieurs heptose (Hep)] invariants au
sein d'une
même espèce bactérienne ;
(ii) un core externe lié à un heptose et constitué de divers monosaccharides ;
et
(iii) une chaîne externe O-spécifique constituée d'un enchaînement d'unités
répétitives - unités répétitives elles-mêmes composées de un ou plusieurs
monosaccharides différents.
D'une espèce à une autre, la structure du LPS est variable. C'est ainsi que
par exemple,
chez un certain nombre de bactéries non-entériques à Gram-négatif telles que
les
Neisseriae, Bordetellae, Branhamellas, Haemophilus et Moraxellae, la chaîne O-
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spécifique n'existe pas. La partie saccharidique de LPS de ces bactéries n'est
constituée
que du core oligosaccharidique. Par conséquent, le LPS de ces bactéries est
souvent
dénommé lipooligosaccharide (LOS).
La structure du LPS varie non seulement d'une espèce à une autre, mais peut
aussi au
sein d'une même espèce.
Ainsi, toutes les souches de N. meningitidis ne possède pas un LOS de même
structure,
bien que tous les LOS du méningoccoque partagent la structure de base qui est
schématisée dans la formule développée suivante :
KDO
R1-4 al-5 Ja2-4
4
a chain Ri - G1c - Hep - KDO -6Lipid A
1 al-3
0 chain R2 - Hep - R3
I al-2
G1cNAc
y chain
Le core externe (ou chaîne a) est variable en fonction du type
d'oligosaccharide
(substituant R1), accroché sur le résidu glucose porté par l'heptose I.
Alors que le lipide A est essentiellement invariant, le core interne,
constitué lui aussi de
manière invariante, de deux KDO (acide 2-céto, 3-desoxy, octulosonique) et de
deux
heptoses (Hepl et HepII), porte des substitutions diverses au niveau (i) de
l'heptose II
(substituants R2 et R3) ; et (ii) de la chaîne y, constituée d'une glucosamine
N-acétylée
(G1cNAc) qui peut être on non O-acétylée. Dans la littérature, le résidu R2
est
communément appelé chaîne 0, lorsque R2 est un résidu glucose.
Les souches de N. meningitidis sont classées en plusieurs immunotypes (IT L1 à
L13),
en fonction de leur réactivité avec une série d'anticorps qui reconnaissent
des épitopes
variés sur le LOS (Achtman et al, 1992, J. Infect. Dis. 165: 53-68). La
majorité des
souches invasives à N. meningitidis sérogroupe B est d'immunotype L3,7 comme
cela a
été mis en évidence par la réactivité de ces souches avec un anticorps
monoclonal
dénommé L3,7,9. Cet anticorps monoclonal est capable de reconnaître chacun des
immunotypes L3, L7 et L9 (Gu et al, J. Clin. Microbiol. (1992) 30: 2047; Moran
et al,
Infect. Immun. (1994) 62 (12) : 5290; et Scholten et al, J. Med. Microbiol.
(1994) 41 :
236).
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La classification du LOS suit celle des souches. Les différences entre
immunotypes
proviennent de variations dans la composition et dans la conformation des
chaînes
oligosaccharidiques. Ceci transparaît dans le tableau ci-dessous, dérivé du
tableau 2 de
Braun et al, Vaccine (2004) 22 : 898, complété par des données obtenues
ultérieurement
et relatives aux immunotypes L9 (Choudhury et al, Carbohydr. Res. (2008) 343 :
2771)
et L11 (Mistretta et al, (2008) Poster at the 16th International Pathogenic
Neisseria
Conférence, Rotterdam) :
Tableau I :
IT Rl (chaîne a) R2 R3
LI NeuNAca2-6 Galal-4 Galpl-4 PEA-3 -
L2 NeuNAca2-3 GaJJ31-4 GIcNAcjl-3 Galpl-4 Glca (1-3) PEA-6 ou PEA-7
L3 NeuNAca2-3 Galpl-4 GIcNAcf31-3 Galpl-4 PEA-3 -
L4 NeuNAca2-3 Galpl-4 GIcNAcR1-3 Galpl-4 - PEA-6
L5 NeuNAca2-3 Gal(31-4 GIcNAc(31-3 Galf31-4 GIcR1-4 Glca (1-3) -
L6 GIcNAcj31-3 GaIJ31-4 - PEA-6 ou PEA-7
L7 Galpl-4 GIcNAc(31-3 Galpl-4 PEA-3 -
L8 Galpl-4 PEA-3 -
L9 Galpl-4 GIcNAcJ1-3 Galpl-4 - PEA-6
L10 n.d. n.d. n.d.
L11 GIcR1-4 PEA-3 PEA-6.
L12 n.d n.d. n.d.
L13 n.d n.d. n.d.
n.d.: non déterminé.
Entre autre, on peut noter que certains LOS peuvent être sialylés (présence
d'acide N-
acétyl neuraminique sur le résidu galactose (Gal) terminal de la chaîne a).
Ainsi, les
immunotypes L3 et L7 ne diffèrent que par la présence / absence respective de
cette
sialylation. Par ailleurs, la plupart des LOS sont substitués par un
groupement O-acétyle
sur le résidu glucosamine (a-GIcNAc) du core interne (Wakarchuk et al. (1998)
Eur. J.
Biochem. 254: 626 ; Gamian et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 922 ; Kogan et al
(1997)
Carbohydr. Res. 298: 191 ; Di Fabio et al. (1990) Can. J. Chem. 68 : 1029 ;
Michon et
al. (1990) J. Biol. Chem. 275: 9716 ; Choudhury et al. (supra) ; et Mistretta
et al.
(supra).
Les autres variations dans la structure du LOS sont dues à différents facteurs
génétiques
au nombre desquels
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(i) la présence / absence de certains gènes impliqués dans la voie de
biosynthèse
du LOS et aux associations possibles des gènes entre eux ;
(ii) la variation de phase à laquelle sont soumis certains gènes ;
(iii) la recombinaison homologue [certains gènes possédant des régions
5 conservées (lgtB, lgtE et lgtH) et d'autres gènes étant des hybrides (lgtZ
est l'hybride
des gènes lgtA et lgtB), des réarrangements peuvent se produire] ; et
(iv) les mutations.
Les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse du LOS (à l'exception de deux)
sont
répartis en trois loci (lgt-1, lgt-2 et lgt-3). La description de ces gènes
ainsi que leur
fonction est fournie ci-après, illustrée de manière schématique par la figure
1 qui
présente la structure du LOS de N. meningitidis, les différents sites où la
variabilité
s'exprime ainsi que les niveaux d'intervention des gènes.
Les gènes hors locus sont lpt3 et lot3. Le gène lpt3 code pour une PEA
transférase. Cette
enzyme a la capacité d'accrocher un résidu phosphoéthanolamine (PEA) en
position O-3
de l'heptose II. Le gène lot3 code pour une LOS 0-acétyltransférase qui
possède la
capacité de O-acétyler la chaîne y. Il est soumis à une variation de phase.
Le locus lgt-1 comporte 7 gènes : lgtA, lgtB, lgtC, lgtD, lgtE, lgtH et lgtZ
codant chacun
pour une glycosyl transférase particulière. Parmi ces gènes, lgtA et lgtC sont
soumis à
une variation de phase. lgtE et lgtH présentent une variation allélique : le
codon
déterminant l'acide aminé en position 153 code soit pour un résidu thréonine
(et dans ce
cas l'enzyme qui en résulte est une Gal-transférase) ; soit pour un résidu
méthionine (et
dans ce cas l'enzyme qui en résulte est une Glc-transférase).
Le locus lgt-1 est classé en 8 types génétiques (Zhu et al, Microbiology
(2002) 148
1833).
Le locus lgt-2 comporte 2 gènes : lgtF et lgtK codant pour des glycosylases.
Le produit
du gène lgtF intervient dans la construction de la chaîne a en permettant la
fixation du
résidu glucose sur l'heptose I et donc n'intervient pas sur la nature de
l'immunotype ; ni
le gène lgtK d'ailleurs.
Le locus lgt-3 comporte 2 gènes : IgtG et lpt6. Le gène lgtG code pour une Glc
synthétase qui possède la capacité d'accrocher un résidu glucose en position O-
3 de
l'heptose II. Le gène lpt6 code pour une PEA transférase qui possède la
capacité
d'accrocher un substituant phosphoéthanolamine (PEA) en position O-6 ou O-7 de
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l'heptose II. Le gène lgtG est soumis à une variation de phase. Lorsqu'il est
On et
accompagné d'un gène lpt3 fonctionnel, l'accrochage du résidu glucose se fait
toujours
au dépend du PEA (dont l'accrochage est médié par lpt3).
Le locus lgt-3 est classé en 5 types génétiques (Wright et al, J. Bact. (Oct.
2004) : 6970).
Le motif de carbohydrates Gal(3l-4GIcNAc(3l-3Galpl-4G1c(31-4 ou motif lacto-N-
néotétraose qui est présent dans la chaîne a de certains immunotypes du LOS de
N.
meningitidis, constitue un épitope qui peut potentiellement réagir de manière
croisée
avec les érythrocytes humains. Ainsi, en vue de fabriquer un vaccin destiné
aux
humains, il convient de choisir un LOS ne possédant pas ce motif. Il peut donc
être
particulièrement avantageux d'utiliser un LOS provenant de souches
d'immunotype L6
ou L8.
De manière alternative, on peut aussi envisager de partir par exemple d'une
souche
d'immunotype L2 ou L3 dans laquelle on a inactivé par mutation un gène
intervenant
dans la biosynthèse de la chaîne a, de manière à obtenir une structure LNnT
incomplète.
De telles mutations sont proposées dans la demande de brevet WO 04/014417. Le
LOS
des souches mutées qui en résultent, possèdent une chaîne a de type L6 et un
substituant
phosphoethanolamine (PEA) en position O-3 de l'heptose II.
On a maintenant trouvé que le LOS d'une souche d'immunotype L8 (LOS
d'immunotype L8), en association avec la sous-unité B (TbpB) lipidée du
récepteur de la
transferrine humaine d'une souche de N. meningitidis, pouvait induire une
activité
bactéricide améliorée par rapport à celle induite par un LOS (en association
avec la
même TbpB) possédant une chaîne a de type L6, et un substituant
phosphoethanolamine
(PEA) en position O-3 de l'heptose II.
C'est pourquoi, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique
vaccinale à
l'encontre des infections àN. meningitidis, qui comprend :
(i) un LOS de N. meningitidis constitué notamment d'un lipide A, d'un core
interne,
d'une chaîne a de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne
(a)
porte en position O-3 un substituant phosphoéthanolamine (PEA) et ne porte pas
de substituant PEA en positions O-6 et O-7 ; ou (b) porte un substituant
phosphoéthanolamine (PEA), en position O-3 et en position O-6 ou O-7 ; et
(ii) la sous-unité B (TbpB) lipidée du récepteur de la transferrine humaine
d'une
souche de N. meningitidis ou un fragment lipidé de cette TbpB.
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Sous un aspect particulier, un vaccin selon l'invention comprend :
(i) un LOS de N. meningitidis constitué notamment d'un lipide A, d'un core
interne,
d'une chaîne a de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne
porte
en position O-3 un substituant phosphoéthanolamine (PEA) et ne porte pas de
substituant PEA en positions O-6 et O-7 ;
(ii) un LOS de N. meningitidis constitué notamment d'un lipide A, d'un core
interne,
d'une chaîne a de type L8, dans lequel le résidu heptose Il du core interne
porte
un substituant phosphoéthanolamine (PEA), en position O-3 et en position O-6
ou O-7 ; et
(iii) la TbpB de N. meningitidis ou un fragment lipidé de cette dernière.
Dans la suite du texte, le terme ou un fragment lipidé de cette dernière
n'apparaît
plus, par souci de simplification. Néanmoins il reste sous-entendu chaque fois
que le
terme TbpB lipidée ou TbpB apparaît.
Une composition selon l'invention peut (i) prévenir au moins 60 %,
avantageusement au
moins 70 %, de préférence au moins 80 % des infections dues à N. meningitidis,
notamment de sérogroupe B ou (ii) prévenir des infections dues au moins à 60
%,
avantageusement au moins 70 %, de préférence au moins 80 % des souches de N.
meningitidis notamment de sérogroupe B.
De manière avantageuse, une composition selon l'invention ne contient pas
d'OMV
(vesicule de membrane externe) de N. meningitidis.
Le LOS
Pour usage dans une composition selon l'invention, le LOS constitué notamment
d'un
lipide A, d'un tore interne, d'une chaîne a de type L8, dans lequel le résidu
heptose II
du core interne porte un substituant phosphoéthanolamine (PEA), en position O-
3 et en
position O-6 ou O-7, peut être celui d'une souche d'immunotype L8 atypique
telle que
la souche Al (Zhu, Klutch & Tsai, FEMS Microbiology Letters (2001) 203 : 173
ainsi
que Gu, Tsai & Karpas, J. Clin. Microbiol. (Aug 1992) 30 (8) : 2047). Selon un
mode
avantageux, le LOS provient d'une souche de sérogroupe A.
On peut aussi fabriquer un vaccin selon l'invention, en utilisant un LOS
constitué
notamment d'un lipide A, d'un tore interne, d'une chaîne a de type L8, dans
lequel le
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résidu heptose II du core interne porte en position O-3 un substituant
phosphoéthanolamine (PEA) et ne porte pas de substituant PEA en positions O-6
et O-7.
De manière typique, un tel LOS provient d'une souche d'immunotype L8, de
préférence
de sérogroupe A.
On propose également d'obtenir un tel LOS à partir d'une souche de N.
meningitidis
d'immunotype L6 modifiée de telle sorte qu'elle exprime un gène lpt3 et
qu'elle
n'exprime plus les gènes lpt6 et lgtA. La souche de départ pouvant être
utilisée à des fins
de modification peut être la souche C708 déposée le 11 mars 2008, auprès de la
Collection Nationale de Culture de Microorganisme, 25 rue du Dr Roux 75015
Paris,
selon les termes du traité de Budapest. Cette souche porte le numéro d'ordre
CNCM I-
3942. Cette souche possède entre autre un gène lgtA actif (gène allumé ON )
; un
gène lgtB - (gène non fonctionnel) ; un gène lgtG éteint ( Off ) ; un gène
lpt3
tronqué ; un gène lpt6 actif ; un gène lot3 actif ; et un gène msbB actif.
La souche C708 comporte un gène lpt3 tronqué. Pour la modifier de telle sorte
que le
LOS soit porteur d'un substituant PEA en position 03, on peut restaurer la
fonctionnalité
du gène lpt3, notamment par recombinaison homologue faisant usage d'un gène
lpt3
complet (full-length). Lorsque cette souche est utilisée dans le procédé selon
l'invention,
il convient en plus de désactiver les gènes lptA et lpt6 pour obtenir une
souche qui
n'exprime plus ces gènes. La désactivation de ces gènes peut être notamment
réalisée
par délétion totale ou partielle des gènes lptA et lpt6 ou bien encore par
insertion intra-
génique d'une séquence non pertinente, par exemple d'un gène de résistance à
un
antibiotique.
Le sérogroupe de N. meningitidis contre lequel il est impératif de proposer un
vaccin en
priorité est le sérogroupe B (des vaccins contre les autres sérogroupes
prévalents A, C, Y
et W135 sont déjà disponibles). Or la purification du LOS à partir d'une
souche de
sérogroupe B peut conduire à un produit contenant des quantités résiduelles de
polysaccharide de capsule, indésirables dans le vaccin. Pour pallier ces
difficultés, on a
maintenant trouvé qu'un LOS adhoc issu d'une souche de sérogroupe A pouvait
remplir
les besoins en matière de vaccination contre le sérogroupe B.
De manière avantageuse, un LOS pour usage dans une composition selon
l'invention,
possède une chaîne y qui est 0-acétylée, au moins de manière partielle.
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Aux fins de la présente invention, le LOS peut être obtenu par des moyens
conventionnels : en particulier, il peut être extrait à partir d'une culture
bactérienne ;
puis purifié selon des méthodes classiques. De nombreux procédés d'obtention
sont
décrits dans la littérature. A titre d'exemple, on cite i. a., Westphal &
Jann, (1965) Meth.
Carbohydr. Chem. 5 : 83 ; Gu & Tsaï, 1993, Infect. Immun. 61 (5) : 1873 ; Wu
et al,
1987, Anal. Biochem. 160: 281 and US 6,531,131. Une préparation de LOS peut
être
quantifiée selon des procédures bien connues. Le dosage du KDO par
chromatographie
d'échange d'anions à haute performance (HPAEC-PAD) est une méthode qui
convient
tout particulièrement.
Détoxification du LOS
Pour incorporation dans un vaccin, le LOS se doit d'être détoxifié. La
toxicité du LOS
est due à son lipide A. Néanmoins, il n'est pas impératif de retirer le lipide
A dans son
intégralité ; ni de le modifier par exemple par mutation (e.g. mutation msbB
minus). En
effet, la toxicité étant plus particulièrement liée à une conformation supra
moléculaire
conférée par la totalité des chaînes d'acides gras portées par le noyau
disaccharidique du
lipide, selon un mode avantageux, il suffit d'agir au niveau de ces chaînes.
La détoxification peut être obtenue selon des approches diverses : chimique,
enzymatique, génétique ou bien encore par complexation avec un peptide
analogue de la
polymixine B ou bien encore par incorporation / formulation en liposomes.
Le niveau de détoxification du LOS, peut être apprécié i.a. selon l'un des
deux tests
standard suivants :
Le test pyrogène chez le lapin. Ce test, les calculs et leur lecture et ont
été
réalisés selon les principes énoncés par la Pharmacopée Européenne (Edition
6.0, paragraphe 2.6.8.).
- Le test LAL (Limulus Ainebocyte Lysate) réalisé selon les principes énoncés
par la Pharmacopée Européenne (Edition 6.0, paragraphe 2.6.14.).
Détoxification par voie chimique
L'approche chimique consiste à traiter le LOS par un agent chimique. Selon un
mode
particulier, le LOS est soumis à une hydrolyse acide douce avec de l'acide
acétique qui
élimine le lipide A ainsi que les ou les KDO en ramification quand celui-ci
(ceux-ci) est
(sont) présent(s) dans la structure du LOS. Un tel traitement est par exemple
décrit dans
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Gu & Tsai Infect. Immun. (1993) 61 : 1873. Selon un mode alternatif et
préféré, le LOS
est soumis à une dé-O-acylation, de préférence primaire, i. a. par traitement
à l'hydrazine
qui hydrolyse les chaînes d'acides gras primaires estérifiées du lipide A. Un
tel
traitement est par exemple décrit dans USP 6,531,131, Gupta et al, Infect.
Immun.
5 (1992) 60 (8) : 3201 et Gu et al, Infect. Immun. (1996) 64 (10) : 4047.
Détoxification par voie enzymatique
L'approche enzymatique consiste à mettre le LOS en présence de lipases
capables de
digérer les chaînes d'acides gras esterifiées du lipide A. De telles lipases
sont produites
par l'amibe Dictyostelium discoideum. Selon un mode particulièrement
avantageux, on
10 cultive ensemble (co-culture) l'amibe et une bactérie à Gram-négatif
pouvant être
phagocytée par l'amibe, telle que N. meningitidis. Puis on récupère le
surnageant et on
extrait le LOS du surnageant qui est alors dépourvu des chaînes d'acides gras.
Ce peut
être également une acyloxyacyl hydrolase produite par certaines cellules
humaines
(brevet WO 87/07297 Munford R.) ou par Salmonella typhimurium (Trent et al
2001 J.
Biol. Chem. 276: 9083-9092 ; Reynolds et al. 2006 J. Biol. Chem. 281 : 21974-
21987)
(enzyme codée par les gènes PagL ou LpxR dans ce dernier cas).
Détoxification par voie génétique
L'approche génétique consiste à utiliser un LOS produit par une souche
bactérienne dont
le génotype est tel que l'entité du LOS normalement responsable de sa toxicité
(le lipide
A et plus particulièrement les queues lipidiques du lipide A) présente un
degré de
toxicité largement réduit ou même inexistant. Une telle souche bactérienne
peut être
commodément obtenue par mutation. A partir d'une souche sauvage (c'est-à-dire
produisant un LOS toxique), il s'agit alors d'inactiver par mutation certains
gènes
intervenant dans la biosynthèse des chaînes d'acides gras ou dans leur
accrochage sur le
noyau disaccharidique du lipide A. Ainsi, on peut prévoir d'inactiver les
gènes lpxLl ou
lpxL2 (aussi appelés htrB1 / htrB2) de N. meningitidis ou leur équivalents
dans d'autres
espèces (par exemple, les équivalent des gènes lpxL1 et lpxL2 du méningoccoque
sont
appelés respectivement appelés msbB. ou lpxM et htrB ou lpxL chez E. coli.).
Une
mutation inactivant l'un de ces gènes conduit à un LOS dépourvu d'une ou de
deux
chaînes acyles secondaires. Des mutants lpxLl ou L2 de N. meningitidis ou
d'Haemophilus influenzae sont en particulier décrits dans les demandes de
brevet WO
00/26384, US 2004/0171133 et WO 97/019688. Chez N. meningitidis le gène
endogène
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lpxA peut être aussi remplacé par le gène homologue en provenance d'E. coli ou
Pseudomonas aeruginosa. Les chaînes d'acides gras en sont modifiées, avec pour
conséquence un lipide A moins toxique (Steeghs et al, Cell. Microbiol. (2002)
4 (9) :
599). L'approche génétique est privilégiée lorsque le LOS est purifié sous
forme
d'OMVs.
LOS détoxifié par complexation avec un peptide analogue de la polymixine B
Une quatrième approche consiste à complexer le LOS avec un peptide analogue de
la
polymixine B, comme cela est par exemple décrit dans la demande de brevet WO
06/108586. Le LOS complexé et par conséquent, détoxifié est appelé
endotoxoïde.
L'analogue de la polymixine B entrant dans la composition d'un endotoxoïde
utile aux
fins de la présente invention peut être n'importe quel peptide capable de
détoxifier le
LOS par simple complexation. De tels peptides sont notamment décrits dans les
brevets
ou demandes de brevet US 6,951,652, EP 976 402 et WO 06/ 06/108586.
Ainsi un peptide avantageux peut être le peptide de formule (I)
NH2-A-Cysl-B-Cys2-C-COOH, dans laquelle :
A est un peptide de 2 à 5, de préférence 3 ou 4 résidus d'acide aminé, dans
lesquels au moins 2 résidus d'acide aminé, sont indépendamment choisis parmi
Lys, Hyl
(hydroxylysine), Arg et His ;
B est un peptide de 3 à 7, de préférence 4 ou 5 résidus d'acide aminé, qui
comporte au moins deux, de préférence trois résidus d'acide aminé choisis
parmi Val,
Leu, I1e, Phe, Tyr et Trp ; et
C est facultatif (cette position peut être vide ou pas) et est un résidu
d'acide
aminé ou un peptide constitué de 2 à 3 résidus d'acide aminé ;
à condition que rapport acide aminé cationique / acide aminé hydrophobe dans
le peptide
de formule I soit de 0.4 à 2, avantageusement de 0.5 à 1.2 ou 1.5, de
préférence de 0.6 à
1 ; mieux de 0.6 à 0.8 ; par exemple de 0.75.
De préférence dans le peptide de formule (I) la position C est une position
vide.
Des exemples particuliers du peptide de formule (I) sont les peptides suivants
:
NH2-Lys-Thr-Lys-Cysl-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys2-COOH (peptide SAEP2) ;
NH2-Lys-Thr-Lys-Cysl-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH (peptide SAEP2-L2) ;.
NH2-Lys-Arg-His-Hyl-Cys 1 -Lys-Arg-Ile-Val-Leu-Cys2-COOH ;
NH2-Lys-Arg-His-Cysl-Val-Leu-Ile-Trp-Tyr-Phe-Cys2-COOH ;
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NH2-Lys-Thr-Lys-Cys 1-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH ; et
NH2-Hyl-Arg-His-Lys-Cys 1-Phe-Tyr-Trp-Val-Ile-Leu-Cys2-COOH.
Les peptides de formule (I) peuvent être sous forme de monomère ou de
préférence sous
forme de dimère, parallèle ou anti-parallèle.
D'une manière générale, on peut aussi employer un peptide dimérique de formule
(II)
NH2-A-Cysl-B-Cys2-C-COOH
NH2-A' -Cysl-B' -Cys2-C' -COOH
dans laquelle les deux résidus de Cysl sont liés ensemble par un pont
disulfure et les
deux résidus Cys2 sont liés ensemble par un pont disulfure ;
ou de formule (III)
NH2-A-Cysl-B-Cys2-C-COOH
1 1
COOH-C' -Cys2-B' -Cys 1-A' -NH2
dans laquelle les résidus Cysl sont liés aux résidus Cys2 par des ponts
disulfure inter
chaîne peptidique ;
formules (II) et (III) dans lesquelles :
A et A' sont de manière indépendante un peptide de 2 à 5, de préférence 3 ou 4
résidus d'acide aminé, dans lesquels au moins 2 résidus d'acide aminé, sont
indépendamment choisis parmi Lys, Hyl (hydroxylysine), Arg et His ;
B et B' sont de manière indépendante un peptide de 3 à 7, de préférence 4 ou 5
résidus d'acide aminé, qui comportent au moins deux, de préférence trois
résidus d'acide
aminé ont indépendamment choisi parmi Val, Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp ; et
- C et C' sont facultatifs (ces positions peuvent être vides ou pas) et sont
de
manière indépendante un résidu d'acide aminé ou un peptide de 2 à 3 résidus
d'acide
aminé ;
à condition que le rapport acide aminé cationique / acide aminé hydrophobe
dans le
dimère de formule (II) ou (III), soit de 0.4 à 2, avantageusement de 0.5 à 1.2
ou 1.5, de
préférence de 0.6 à 1 ; mieux de 0.6 à 0.8 ; par exemple. 0.75.
Avantageusement, A et A' sont de manière indépendante un peptide de 2 à 5, de
préférence 3 ou 4 résidus d'acide aminé, dans lesquels au moins un, de
préférence 2
résidus d'acide aminé, sont choisis de manière indépendante parmi Lys, Hyl,
Arg et His ;
et le cas échéant, ceux qui ne sont pas choisis parmi Lys, Hyl, Arg et His (
les résidus
restants d'acide aminé ), étant choisis dans le groupe des résidus d'acide
aminé non-
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chargés, polaires ou non-polaires ; de préférence Thr, Ser et Gly ; de manière
tout
particulièrement préférée Thr.
Quand A et A' comportent 3 résidus d'acide aminé, chacun d'entre eux peut être
un
résidu cationique ; ou alternativement, deux sur trois résidus sont les acides
aminés
cationiques, tandis que le résidu restant est choisi dans le groupe des
résidus d'acide
aminé non-chargés, polaires ou non-polaires ; de préférence Thr, Ser et GIy ;
de manière
tout particulièrement préférée Thr.
Quand A et A' comportent 4 résidus d'acide aminé, on préfère que deux ou trois
sur
quatre résidus soient choisis parmi les groupes de résidus d'acide aminé
cationiques
comme défini ci-dessus, tandis que le résidu restant (s) est (sont) choisi(s)
dans le groupe
des résidus des résidus d'acide aminés non-chargés polaires ou non polaires
comme
défini ci-dessus.
Quand A et A' comportent 5 résidus d'acide aminé, on préfère que trois ou
quatre sur
cinq résidus soient choisis parmi les groupes de résidus cationiques d'acide
aminé
comme défini ci-dessus, tandis que le résidu restant (s) est (sont) choisi(s)
dans le groupe
des résidus des résidus d'acide aminés non-chargés polaires ou non polaires
comme
défini ci-dessus.
Avantageusement, B et B' sont de manière indépendante un peptide de 3 à 7, de
préférence 4 ou 5 résidus d'acide aminé, qui comporte au moins deux, de
préférence trois
résidus d'acide aminé indépendamment choisis parmi Val, Leu, I1e, Phe, Tyr et
Trp ; de
préférence Leu, Ile et Phe ; et le cas échéant, ceux qui ne sont pas choisis
parmi Val,
Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp ( les résidus restants d'acide aminé ), étant
indépendamment
choisis dans le groupe constitué de Lys, Hyl, Arg et His. Comme on peut
facilement le
comprendre, B et B' peuvent comporter jusqu'à 7 résidus d'acide aminé choisis
de
manière indépendante parmi Val, Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp.
Avantageusement, B et B' comportent la séquence - X1 - X2 - X3 -, dans lequel
Xl et
X2 ; X2 et X3 ; ou Xl, X2 et X3 sont indépendamment choisis parmi Val, Leu,
Ile, Phe,
Tyr et Trp ; de préférence parmi Leu, Ile et Phe. Dans un mode de réalisation
préféré, la
séquence - X1 - X2 - X3 - comporte le motif Phe-Leu.
Les modes de réalisation particuliers de B et B' incluent :
(i) la séquence - X1 - X2 - X3 - dans laquelle :
X1 est Lys, Hyl, His ou Arg, de préférence Lys ou Arg ; de préférence Lys ;
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X2 est Phe, Leu, I1e, Tyr, Trp ou Val ; de préférence Phe ou Leu ; de manière
plus
particulièrement préférée Phe ; et
X3 est Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp ou Val ; de préférence Phe ou Leu ; de manière
plus
particulièrement préférée Leu ; et
(ii) le cas échéant, les résidus d'acide aminé, chacun étant indépendamment
choisi dans
le groupe constitué par Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Hyl, Arg et His ;
de préférence
Val, Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp ; de manière plus particulièrement préférée
Leu, Ile et Phe.
Quand B et B' comportent plus de 4 résidus non polaires d'acide aminé, A et A
comportent de préférence au moins 3 résidus d'acide aminé chargés de manière
positive.
Dans C et C', les résidus d'acide aminé peuvent être n'importe quel résidu
d'acide aminé
à condition que le rapport de résidus d'acide aminé cationique / résidus
d'acide aminé
hydrophobe demeure dans la gamme indiquée. Avantageusement, ils sont
indépendamment choisis parmi les résidus d'acide aminé non-chargés, polaires
ou non-
polaires, ces derniers étant préférés. Cependant, d'une façon préférée, les
positions C et
C' sont des positions vides.
Par conséquent, une classe préférée des dimères sont de formule (IV)
NH2-A-Cysl-B-Cys2-COOH
NH2-A' -Cysl-B' -Cys2-COOH
dans laquelle les deux résidus de Cysl sont liés ensemble par un pont
disulfure et les
deux résidus Cys2 sont liés ensemble par un pont disulfure ;
ou de formule (V)
NH2-A-Cysl-B-Cys2-COOH
HOOC-Cys2-B'-Cysl-A'-NH2
dans laquelle les résidus Cysl sont liés aux résidus Cys2 par des ponts
disulfure inter-
chaîne peptidique ;
formules (IV) et (V) dans lesquelles A, A', B et B' sont comme décrit ci-
dessus ; à
condition que le rapport acide aminé cationique / acide aminé hydrophobe dans
le
dimère de formule (IV) ou (V), soit de 0.4 à 2, avantageusement de 0.5 à 1.2
ou 1.5, de
préférence de 0.6 à 1 ; mieux de 0.6 à 0.8 ; par exemple. 0.75.
Dans les formules (II) à (V), A et A' sont de préférence identiques. De même
en ce qui
concerne B et B' d'une part ; et C et C' d'autre part. Un dimère de formule
(II) à (V),
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dans lesquelles A et A' ; B et B' ; et C et C' sont deux à deux identiques,
est désigné
sous le nom de dimère homologue.
Pour ces derniers, on cite à titre d'exemple, les dimères parallèle et
antiparallèle formés
à partir du peptide SAEP2-L2:
5 NH2-Lys-Thr-Lys-Cysl-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH
NH2-Lys-Thr-Lys-Cysl-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH ; et
NH2-Lys-Thr-Lys-Cys 1-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH
10 HOOC-Cys2-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Cys 1-Lys-Thr-Lys-NH2.
L'endotoxoïde utile aux fins de la présente invention peut être
avantageusement
caractérisé par un rapport molaire LOS : peptide de 1 : 1.5 à 1 : 0.5, de
préférence de 1 :
1.2 à 1:0.8, de manière tout particulièrement préférée de 1 : 1.1 à 1 : 0.9,
e.g. de 1 : 1.
LOS détoxifié en liposomes
15 Lorsque le LOS est formulé en liposomes, il n'apparaît pas forcément
nécessaire de le
détoxifier au préalable. En effet, le LOS en liposomes - c'est-à-dire associé
à la
bicouche lipidique formant les liposomes - peut voir sa toxicité décroître de
manière très
substantielle. L'ampleur de cette décroissance pouvant aller jusqu'à une perte
substantielle, est en partie fonction de la nature des composants formant le
liposome.
Ainsi, lorsque l'on utilise des composants chargés positivement (composants de
nature
cationique), la perte de toxicité peut être plus importante qu'avec des
composants non-
chargés (neutre) ou anioniques.
Par liposomes , on entend une entité synthétique, de préférence une
vésicule
synthétique, formée d'au moins une membrane (ou matrice) lipidique bi-couche
refermée sur un compartiment aqueux. Aux fins de la présente invention, les
liposomes
peuvent être unilamellaires (une seule membrane bi-couche) ou plurilamellaires
(plusieurs membranes disposées en oignon). Les lipides constituant la membrane
bi-
couche comportent une région non-polaire qui de manière typique est faite de
chaîne(s)
d'acides gras ou de cholestérol, et d'une région polaire, typiquement faite
d'un
groupement phosphate et/ou de sels d'ammonium tertiaires ou quaternaires. En
fonction
de sa composition, la région polaire peut, notamment à pH physiologique (pH
7), être
porteuse d'une charge de surface nette (globale) soit négative (lipide
anionique), soit
positive (lipide cationique) ou ne pas porter de charge nette (lipide neutre).
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Aux fins de détoxification du LOS, les liposomes peuvent être n'importe quel
type de
liposomes ; en particulier, ils peuvent être constitués de n'importe quel
lipide connu pour
son utilité dans la fabrication des liposomes. Le ou les lipides entrant dans
la
composition des liposomes peuvent être des lipides neutres, anioniques ou
cationiques ;
ces derniers étant préférés. Ces lipides peuvent être d'origine naturelle
(produits
d'extraction de plante ou d'oeuf, par exemple) ou synthétique ; ces derniers
étant
préférés. Les liposomes peuvent être aussi constitués d'un mélange de ces
lipides ; par
exemple d'un lipide cationique ou anionique et d'un lipide neutre, en mélange.
Dans ces
deux derniers cas, le lipide neutre est souvent désigné sous le terme de co-
lipide. Selon
un mode de mélange avantageux, le rapport molaire lipide chargé (cationique ou
anionique) : lipide neutre est compris entre 10 : 1 et 1 : 10, avantageusement
entre 4 : 1
et 1 : 4, de préférence entre 3 : 1 à 1 : 3, bornes incluses.
En ce qui concerne les lipides neutres, on cite à titre d'exemple : (i) le
cholestérol ; (ii)
les phosphatidylcholines comme par exemple les 1,2-diacyl-sn-glycéro-3-phospho-
cholines e.g., la 1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), ainsi que
les 1-acyl-
2-acyl-sn-glycéro-3-phosphocholines dont les chaînes acyles sont différentes
entres elles
(chaînes acyles mixtes) ; et (iii) les phosphatidyléthanolamines comme par
exemple les
1,2-diacyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamines e.g., la 1,2-dioleoyl-sn-glycéro-
3-
phosphoéthanolamine (DOPE), ainsi que les 1 -acyl-2-acyl-sn-glycéro-3 -
phosphoéthanolamine portant des chaînes acyles mixtes.
En ce qui concerne les lipides anioniques, on cite à titre d'exemple (i)
l'hémisuccinate
de cholestérol (CHEMS) ; (ii) les phosphatidylsérines telles que les 1,2-
diacyl-sn-
glycéro-3-[phospho-L-sérine] e.g., la 1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-[phospho-L-
sérine]
(DOPS), et les 1-acyl-2-acyl-sn-glycéro-3-[phospho-L-sérine] portant des
chaînes acyles
mixtes ; (iii) les phosphatidylglycérols tels que les 1,2-diacyl-sn-glycéro-3-
[phospho-
rac-(1-glycérol)] e.g., la 1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-[phospho-rac-(1-
glycérol)] (DOPG),
et les 1-acyl-2-acyl-sn-glycéro-3-[phospho-rac-(1-glycérol)] portant des
chaînes acyles
mixtes ; (iv) les acides phosphatidiques tels que les 1,2-diacyl-sn-glycéro-3-
phosphate
e.g., le 1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphate (DOPA), et les 1-acyl-2-acyl-sn-
glycéro-3-
phosphate portant des chaînes acyles mixtes ; et (v) les phosphatidylinositols
tels que les
1,2-diacyl-sn-glycéro-3-(phospho-inositol) e.g., le 1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-
(phospho-
inositol) (DOPI) et les 1-acyl-2-acyl-sn-glycéro-3-(phospho-inositol) portant
des chaînes
acyles mixtes.
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En ce qui concerne les lipides cationiques, on cite à titre d'exemple :
(i) les amines lipophiles ou alkylamines comme par exemple le
diméthyldioctadécylammonium (DDA), le triméthyldioactadecylammonium (DTA) ou
les homologues structuraux du DDA et du DTA [ces alkylamines sont
avantageusement
utilisées sous forme de sel ; on cite par exemple le bromure de
diméthyldioctadécylammonium (DDAB)] ;
(ii) l'octadécenoyloxy(éthyl-2-heptadécenyl-3-hydroxyéthyl) imidazolinium
(DOTIM) et ses homologues structuraux ;
(iii) les lipospermines telles que la N-palmitoyl-D-erythrospingosyl-1-O-
carbamoyl
spermine (CCS) et la dioctadecylarnidoglycylspermine (DOGS, Transfectam) ;
(iv) les lipides incorporant une structure éthylphosphocholine tels les
dérivés
cationiques des phospholipides, en particulier les dérivés ester phosphoriques
de la
phosphatidylcholine, par exemple ceux décrits dans la demande de brevet WO
05/049080 et incluant notamment :
- la 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-éthylphosphocholine,
- la 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-éthylphosphocholine,
- la 1,2-palmitoyl-oleoyl-sn-glycéro-3 -éthylphosphocholine,
- la 1,2-distearoyl-sn-glycéro-3-éthylphosphocholine (DSPC),
- la 1,2-dioleyl-sn-glycéro-3-éthylphosphocholine (DOEPC ou EDOPC ou
20- ethyl-DOPC ou ethyl PC),
ainsi que leurs homologues structuraux ;
(v) les lipides incorporant une structure triméthyl ammonium tels que le N-(1-
[2,3-
dioleyloxy]propyl)-N,N,N-trimethylammonium (DOTMA) et ses homologues
structuraux et ceux incorporant une structure triméthylammoniurn propane, tels
que le
1,2-dioleyl-3-triméthylammonium propane (DOTAP) et ses homologues structuraux
;
ainsi que les lipides incorporant une structure diméthylammonium tels que le
1,2-
dioleyl-3-diméthylammonium propane (DODAP) et ses homologues structuraux ; et
(vi) les dérivés cationiques du cholestérol tels que le 3f3-[N-(N',N'-
dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholestérol (DC-Chol) ou d'autres dérivés
cationiques du cholestérol comme ceux décrits dans le brevet US 5 283 185 et
notamment l'iodure de cholestéryl-3(3-carboxamidoéthylènetriméthylammonium, la
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cholestéryl-3 (3-carboxyamidoéthylènamine, l'iodure de cholestéryl-3 [3-
oxysuccinamido-
éthylènetriméthylammonium et le 3(3-[N-(polyéthylènimine)-carbamoyl]-
cholestérol.
Par homologues structuraux , on signifie les lipides qui possèdent la
structure
caractéristique du lipide de référence tout en s'en différentiant par des
modifications
secondaires, notamment au niveau de la région non-polaire, en particulier du
nombre
d'atomes de carbone et des doubles liaisons des chaînes d'acides gras.
Ces acides gras, que l'ont trouve aussi dans les phospholipides neutres et
anioniques,
sont par exemple l'acide dodécanoique ou laurique (C12 :0), l'acide
tétradécanoique ou
myristique (C14:0), l'acide hexadécanoique ou palmitique (C16:0), l'acide cis-
9-
hexadecanoique ou palmitoleique (C16:1), l'acide octadécanoique ou stéarique
(C18 :0), l'acide cis-9-octadécanoique ou oleique (C18 :1), l'acide cis,cis-
9,12-
octadécadiénoiquec ou linoléique (Cl8:2), l'acide cis-cis-6,9-
octadécadiénoique
(Cl8 :2), l'acide all cis-9,12,15-octadécatriénoique ou a-linolénique (C18
:3), l'acide all
cis-6,9,12-octadécatriénoique ou y-linolénique (Cl8:3), l'acide eicosanoique
ou
arachidique (C20 :0), l'acide cis-9-eicosénoique ou gadoleique (C20 :1),
l'acide all cis-
8,11,14-eicosatrienoique (C20 :3), l'acide all cis-5,8,11,14-
eicosatetraenoique ou
arachidonique (C20:4), l'acide all cis-5,8,11,14,17-eicosapentaneoique (C20
:5), l'acide
docosanoique ou behenique (C22 :0), l'acide all cis-7,10,13,16,19-
docosapentaenoique
(C22:5), l'acide all cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoique (C22 :6) et l'acide
tétracosanoique ou lignocérique (C24 :0).
Selon un mode particulier, on utilise un mélange de lipide cationique et de
lipide neutre.
A titre d'exemple, on cite :
un mélange de DC-chol et de DOPE, notamment dans un rapport molaire DC-
chol : DOPE allant de 10 : 1 à 1 : 10, avantageusement de 4 : 1 à 1 : 4, de
préférence
d'environ 3 : 1 à 1 : 3;
un mélange d'ethyl-DOPC et de cholestérol, notamment dans un rapport molaire
ethyl-DOPC : cholestérol allant de 10: 1 à 1 : 10, avantageusement de 4: 1 à 1
: 4, de
préférence d'environ 3 : 1 à 1 : 3; et
un mélange d'ethyl-DOPC et de DOPE, notamment dans un rapport molaire
ethyl-DOPC : DOPE allant de 10 : 1 à 1 : 10, avantageusement de 4: 1 à 1 : 4
de
préférence d'environ de 3 : 1 à 1 : 3.
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Selon un mode de préparation avantageux, on réalise dans un premier temps, un
film
lipidique sec avec tous les composés entrant dans la composition des
liposomes. Puis on
reconstitue le film lipidique en milieu aqueux, en présence de LOS, par
exemple dans un
rapport molaire lipides : LOS de 100 à 500, de manière avantageuse de 100 à
400 ; de
préférence de 200 à 300 ; de manière tout particulièrement préférée, de 250
environ.
D'une manière générale, on estime que ce même rapport molaire ne devrait pas
varier de
manière substantielle en final du procédé de préparation des liposomes LOS.
De manière générale, l'étape de reconstitution en milieu aqueux conduit à la
formation
spontanée de vésicules multi-lamellaires dont la taille est ensuite
homogénéisée par
diminution progressive du nombre de lamelles par extrusion, par exemple à
l'aide d'un
extrudeur par passages de la suspension lipidique sous pression d'azote, à
travers des
membranes en polycarbonates ayant des diamètres de pores de plus en plus
réduits (0.8,
0.4, 0.2 gin). On peut aussi remplacer le procédé d'extrusion par un autre
procédé
mettant en oeuvre un détergent (tensio-actif) qui disperse les lipides. Ce
détergent est
ensuite éliminé par dialyse ou par adsorption sur des microbilles de
polystyrène poreuses
particulièrement affines de détergent (BioBeads). Quand le tensio-actif se
retire de la
dispersion lipidique, les lipides se réorganisent en double couche.
A l'issue de l'incorporation du LOS en liposomes, on peut communément obtenir
un
mélange constitué de liposomes adhoc et de LOS forme libre. Avantageusement,
les
liposomes sont alors purifiés afin de se débarrasser du LOS non-détoxifié sous
forme
libre.
Conjugaison du LOS
Dans un vaccin selon l'invention, le LOS est avantageusement sous forme de
conjugué
LOS-polypeptide porteur, notamment quand il n'est pas sous forme d'OMVs ni de
liposomes.
Le polypeptide porteur peut être n'importe quel polypeptide, oligopeptide ou
protéine
porteuse en usage dans le domaine des vaccins conjugués ; et notamment
l'anatoxine
pertussis, diphtérique ou tétanique, le mutant de la toxine diphtérique
dénommé
CRM197, une OMP bactérienne, un complexe bactérien de protéine [par exemple
l'OMPC (outer-membrane protein C) de N. meningitidis], l'exotoxine A de
Pseudomonas, la lipoprotéine D d'Haemophilus influenzae, la pneumolysine de
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Streptococcus pneumoniae, l'hémagglutinine filamenteuse de Bordetella
pertussis et la
sous-unité B lipidée du récepteur de la transferrine humaine de N.
meningitidis.
De nombreuses méthodes de conjugaison existent dans le domaine technique.
Certaines
sont répertoriées par exemple dans les demandes de brevet EP 941 738 et WO
98/31393.
5 D'une manière générale, les groupements réactifs du LOS mis en jeu lors de
la
conjugaison sont ceux du core interne (inner core) ou du lipide A. Il peut
s'agir entre
autre de la fonction acide du KDO ou bien d'un aldéhyde généré suite à un
traitement
approprié sur le disaccharide du lipide A. Par exemple, un traitement à la
phosphatase
génère un aldéhyde sur la structure de la deuxième glucosamine du lipide A de
N.
10 meningitidis (Brade H. (2002) J. Endotoxin Res. 8 (4) : 295 Mieszala et al,
(2003)
Carbohydrate Res. 338: 167 et Cox et al, (2005) Vaccine 23 (5) : 5054).
De manière avantageuse, le procédé de conjugaison fait usage (i) d'un agent de
liaison
bifonctionnel (linker) ou (ii) d'un espaceur et d'un linker.
Par exemple, dans le premier cas, on active le LOS avec un agent de couplage
15 bifonctionnel (linker) de formule R1 - A - R2 de telle sorte que le radical
R2 réagisse
avec un groupement réactif du KDO ou du lipide A afin d'obtenir un LOS activé
; puis
on conjugue le LOS activé avec le polypeptide de telle sorte que le
substituant R1
réagisse avec un groupement fonctionnel porté par le polypeptide afin
d'obtenir un
conjugué.
20 Par exemple, dans le deuxième cas, on dérive le LOS avec un espaceur de
formule R3 -
B - R4 de telle sorte que le radical R3 réagisse avec un groupement réactif du
KDO ou
du lipide A afin d'obtenir un LOS dérivé ; puis on active le LOS dérivé avec
un agent de
couplage bifonctionnel (linker) de formule R1 - A - R2 de telle sorte que le
radical R2
réagisse avec le radical R4 afin d'obtenir un LOS dérivé et activé ; enfin on
conjugue le
LOS dérivé et activé avec le polypeptide de telle sorte que le radical Rl
réagisse avec un
groupement fonctionnel porté par le polypeptide afin d'obtenir un conjugué.
Dans le deuxième cas on peut aussi procéder de la manière suivante : On dérive
le
polypeptide avec un espaceur de formule R3 - B - R4 de telle sorte que le
radical R4
réagisse avec un groupement fonctionnel porté par le polypeptide ; on active
le LOS
avec un agent bifonctionnel (linker) de formule R1 - A - R2 de telle sorte que
le radical
R2 réagissent avec un groupement réactif du KDO ou du lipide A afin d'obtenir
un LOS
activé ; puis, on conjugué le LOS activé avec le polypeptide dérivé de telle
sorte que le
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radical R1 du LOS activé réagisse avec le radical R3 du polypeptide dérivé
afin
d'obtenir un conjugué.
Dans la formule de l'espaceur, B peut être une chaîne carbone, de préférence
carbonyl,
alkyl ou alkylène, par exemple en Cl à C12. R3 et R4 peuvent être de manière
indépendante un groupe thiol ou amine ou un résidu le portant, par exemple un
groupe
hydrazide i.e., NH2-NH-CO-. Des composés pouvant être utilisés comme espaceur
sont
par exemple de formule NH2 - B - NH2, ou de préférence NH2 - B - SH et NH2 - B
- S
- S - B' - NH2. A titre d'exemple particulier on cite : la cystéamine, la
cystéine les
diamines e.g., le diaminohexane, l'acide adipique dihydrazide (ADH) l'urée et
la
cystamine.
Dans la formule du linker, A peut être une chaîne aromatique ou de préférence
aliphatique substituée ou non, qui de manière avantageuse, comprend de 1 à 12
atomes
de carbone ; de préférence 3 à 8 atomes de carbone. Par exemple A peut être un
C2 à C8
alkylène, un phénylène, un C7 à C12 aralkylène, un C2 à C8 alkyle, un phényle,
un C7 à
C12 aralkyle, C6 alkanoyloxy ou un benzylcarbonyloxy, substitué ou non.
Le radical R2 est le groupement fonctionnel du linker qui crée le lien au LOS
ou au LOS
dérivé. Ainsi, R2 est un groupement fonctionnel qui peut réagir avec un groupe
carboxyle, hydroxyle, aldéhyde ou amine. Si le linker doit réagir avec un
groupe
hydroxyle carboxyle ou aldéhyde, R2 est de préférence un groupe amine ou un
résidu le
portant, par exemple un groupe hydrazide i.e., NH2-NH-CO-. Si le linker doit
réagir avec
un groupe amine, R2 est de préférence un groupe carboxyl, succinimidyl (e.g.,
N-
hydroxy succinimidyl) ou sulfosuccinimidyl (e.g., N-hydroxy
sulfosuccinimidyl).
Ainsi, des composés pouvant être utilisés comme linker peuvent être choisis
parmi
l'acide adipique dihydrazide (ADH) ; le sulfosuccinimidyl-6-(3-[2-
pyridyldithio]
propionamido)-hexanoate (Sulfo-LC-SPDP) ; le succinimidyl-6-(3-[2-
pyridyldithio]
propionamido)-hexanoate (LC-SPDP) ; le N-succinimidyl-S-acetyl thioacetate
(SATA) ;
le N-Succinimidyl-3-(2-pyridyl dithio) propionate (SPDP), succinimidyl acetyl
thiopiopionate (SATP) ; le succinimidyl-4-(N-maleimido methyl) cyclohexane-1-
carboxylate (SMCC) ; le maleimido benzoyl-N-hydroxy succinimide ester (MBS) ;
le N-
succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (SIAB) ; le succinimidyl 4-(p-
maleimidophenyl) butyrate (SMPB) ; le bromoacétique acide -N-hydroxy
succinimide
(BANS) ester ; le dithiobis (succinimidyl propionate) (DTSSP) ; le H-(y-
maléimido
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butyryloxy) succinimide ester (GMBS) ; le succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)
cyclohexane- 1 -carboxylate ; le N-succinimidyl-4-(4-maléimidophényl) butyrate
; le N-
[13-maleimidocaproic acid] hydrazide (BMCH) ; le N-succinimidyl-4-maléimido-
butyrate ; et le N-succinimidyl-3-maléiimido-benzoate.
A titre d'exemple, on propose d'utiliser la fonction acide du KDO pour dériver
le LOS
avec de l'ADH en présence d'un carbodiimide [e.g., 3-diméthylaminopropyl)-3-
ethyle
carbodiimide hydrochloride (EDAC)]. Puis on fait réagir la fonction amine
ainsi
introduite avec les fonctions carboxyles du polypeptide, en présence d'EDAC,
après
avoir protégé les fonctions amines de ce dernier (Wu et al (2005) Vaccine 23 :
5177) ou
les avoir transformées en fonctions acide (Succinylation de la protéine ;
Pavliakova et al,
Infect. Immun. (1999) 67 (10) : 5526).
De manière alternative, on propose d'utiliser la fonction acide du KDO pour
dériver le
LOS avec de la cystéamine ou de la cystéine en présence d'EDAC. Puis on fait
réagir la
fonction thiol ainsi introduite avec la fonction maléimide d'un linker
homobifonctionnel,
tel que le bis maleimido hexane ; ou hétérobifonctionnel, tel que le GMBS.
Dans le
premier cas, on fait alors réagir la fonction maléimide ainsi introduite avec
les fonctions
thiols du polypeptide. Dans le deuxième cas, on fait réagir la fonction
succinimidyle du
LOS dérivé et activé avec les fonctions amines du polypeptide.
En fonction du mode de conjugaison retenu, le LOS et le polypeptide peuvent
être
conjugués l'un à l'autre dans un rapport molaire LOS : polypeptide de 10"1 à
102, de
manière avantageuse de 1 à 102, de préférence de 1 à 50 ; de manière tout
particulièrement préférée de 20 environ.
La TbpB de N. meningitidis
La TbpB de N. meningitidis telle que naturellement produite par N.
meningitidis, est une
lipoprotéine. Néanmoins, elle peut être avantageusement produite par voie
recombinante
dans un système d'expression qui permet notamment d'assurer la lipidation du
polypeptide au sein même de l'organisme chargé de l'expression. Selon un mode
préféré, la TbpB lipidée est une TbpB recombinante - c'est-à-dire produit par
voie
recombinante, e.g. dans un système d'expression hétérologue.
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Un système d'expression met typiquement en oeuvre une cassette d'expression et
une
cellule hôte procaryote ou eucaryote (levure). La cassette d'expression code
pour un
précurseur de la TbpB (aussi appelé pro-TbpB). Ce précurseur est constitué
d'une
séquence signal caractéristique d'une lipoprotéine et de la séquence de la
protéine
mature ayant un résidu Cystéine en position N-terminale. Les trois acides
aminés en
position C-terminale de la séquence signal ainsi que le résidu Cystéine en
position N-
terminale de la séquence mature constitue le site de clivage (aussi appelé
lipobox) : Cette
lipobox a typiquement pour séquence : Leu - Ser/Ala - Ala/Gly - Cys. Une
séquence
signal typique est celle de la lipoprotéine Lpp d'E. coli : Met - Lys - Ala -
Thr - Lys -
Leu - Val - Leu - Gly - Ala - Val - Ile - Leu - Gly - Ser - Thr - Leu - Leu -
Ala -
Gly. Ainsi, dans la cassette d'expression, la séquence de polynucléotide
codant pour la
séquence d'acides aminés de la TbpB est fusionnée en 5' à une séquence signal
appropriée.
La TbpB de N. meningitidis est comme toute protéine, définie par une séquence
d'acides
aminés. A l'intérieur de l'espèce, cette séquence d'acides aminés peut
présenter un
certain degré de variabilité sans que cela porte atteinte à la fonction
biologique de la
lipoprotéine. On parle alors de variant allélique . A une TbpB de N.
meningitidis,
correspondent une multiplicité de séquences présentant entre elles un certain
degré
d'identité, chacune des séquences provenant d'une souche particulière, l'une
étant le
variant allélique de l'autre.
Ainsi, on comprendra aisément que la présente invention ne se limite pas à
l'emploi
d'une TbpB particulière, définie par une séquence d'acides aminés
particulière. Toute
référence à une séquence d'acides aminés est faite à titre illustratif, non-
limitatif.
La présente invention ne se limite pas non plus à une TbpB lipidée de forme
sauvage. En
effet, il peut s'agir non seulement d'une forme sauvage, mais aussi d'une
forme mutée
par addition, substitution ou délétion d'un ou plusieurs acides aminés.
Pour usage dans la présente invention, un fragment lipidé de la TbpB de N.
meningitidis,
est avantageusement le fragment N-terminal lipidé de la TbpB. La partie
polypeptide
du fragment peut avantageusement comporter un ou des épitopes T-helper - c'est-
à-dire
des épitopes capables d'être reconnus par les cellules-T helper - et de les
activer.
Avantageusement, il s'agit d'épitopes T-helper caractéristiques de l'organisme
auquel le
vaccin à base de LOS est destiné (un mammifère, notamment un humain) - c'est-à-
dire
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d'épitopes capables d'être reconnus par les cellules-T helper de l'organisme
receveur et
de les activer.
Le cadre de lecture ouvert (ORF) codant pour la TbpB (tbpB) de plusieurs
souches de N.
meningitidis a déjà été identifié par sa séquence ; et la séquence d'acides
aminés de la
protéine correspondante déduite. Ainsi les séquences tbpB et TbpB des souches
de N.
meningitidis de serogroupe B, M982 et B16B6, sont divulguées dans la demande
de
brevet EP 586 266. Celles des souches de méningoccoque MC58 (sérogroupe B),
Z2491
(sérogroupe A) et FAM18 (sérogroupe C) sont respectivement divulguées dans
Tettelin
et al, Science, March 2000, 287: 1809 ou WO 00166791; Parkhill et al, Nature
(March
2000) 404: 502 ; et Bentley et al, PLoS Genet., 3, e23 (2007).
L'identification de ces dernières séquences ayant été faite dans le cadre du
séquençage
complet des génomes, un numéro d'ordre leur a été attribué. Ainsi, dans
Tettelin et al
(supra) ou WO 00/66791, les séquences tpbB / TbpB de la souche MC58 sont
désignées
sous la référence NMB 0460. Dans la suite du texte, on pourra désigner les
protéines de
N. meningitidis sans que cela fasse référence de manière limitative aux
séquences de la
souche MC58.
Chez N. meningitidis, on a documenté à ce jour deux grandes familles de TbpB :
l'isotype I caractérisé par un gène tbpB de 1.8 kb et l'isotype II caractérisé
par un gène
tbpB de 2.1 kb (EP 560 969 et EP 586 266). L'isotype I s'exprime dans le
complexe
clonai ST-11 et le II dans les complexes clonaux ST-8, ST-18, ST-32, ST-41/44
(Harrison et al, BMC Microbiol. 2008, 8: 66). Les souches 1316B6 (sérogroupe
B) et
FAM18 (sérogroupe C) sont des représentants de l'isotype I ; les souches M982,
BZ83
et 8680 sont des représentants de l'isotype II.
Pour usage aux fins de la presente invention, la TbpB lipidée est celle d'une
souche de
N. meningitidis d'isotype I ou d'isotype II, de préférence d'isotype II. Selon
une mise en
oeuvre particulière, une composition selon l'invention comprend la TbpB
lipidée d'une
souche d'isotype I et d'une souche d'isotype II. La TbpB lipidée d'une souche
de N.
meningitidis d'isotype I peut être celle de la souche B16B6 ; et la TbpB
lipidée d'une
souche de N. meningitidis d'isotype II peut être celle de la souche M982.
En raison de sa queue lipidique, on s'attend à ce que, sous forme purifiée, la
TbpB
lipidée et purifiée présente un certain degré d'insolubilité en condition
purement
aqueuse. En conséquence, il convient de la placer dans des conditions
favorisant sa
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solubilité. L'homme de l'art maîtrise les techniques visant à rendre soluble
une
lipoprotéine. Il est par exemple possible d'utiliser un détergent lors de la
purification de
la lipoprotéine, afin d'obtenir une préparation d'une lipoprotéine purifié
soluble en
présence de détergent. La quantité de détergent restant dans la préparation
finale sera
5 contrôlée de manière à ce qu'elle soit juste nécessaire au maintien sous
forme soluble, de
la lipoprotéine purifiée. De manière alternative, il est possible d'enlever
complètement le
détergent utilisé lors de la purification puis de rajouter un autre produit
ayant aussi la
capacité de maintenir sous forme soluble, la lipoprotéine purifiée.
Lorsque le LOS est formulé en liposomes, la ou les TbpBs peuvent être
incorporées avec
10 le LOS en liposomes ou bien être en simple mélange avec des liposomes LOS
(LOS
formulé en liposomes : ce dernier mode de réalisation étant toutefois préféré.
Lorsque l'on incorpore ensemble en liposomes (protéoliposomes) le LOS et la
TbpB
lipidée, les liposomes utiles à cette fin sont les mêmes que ceux précédemment
décrits
pour la formulation du seul LOS. Un moyen de mener à bien cette formulation
consiste à
15 formuler ensemble en liposomes, le LOS et la TbpB lipidée, par exemple en
reconstituant un film lipidique en milieu aqueux en présence de LOS et de TbpB
lipidée,
notamment dans :
- un rapport molaire lipides : LOS de 100 à 500, de manière avantageuse de 100
à
400 ; de préférence de 200 à 300; de manière tout particulièrement préférée,
de 250
20 environ ; et / ou
- un rapport molaire LOS : TbpB lipidée de 10-2 à 103, de manière avantageuse
de
10-1 à 102 ; de préférence de 1 à 50 ; de manière tout particulièrement
préférée, de 15 à
30, e.g., de 20 environ.
A l'issue de l'incorporation en liposomes, du LOS et de la TbpB lipidée, on
peut
25 communément obtenir un mélange constitué de liposomes adhoc
(protéoliposomes), de
LOS et/ou de TbpB lipidée sous forme libre. Avantageusement, les liposomes
sont alors
purifiés afin de se débarrasser du LOS sous forme libre. Une fois le LOS libre
éliminé,
on peut utiliser le mélange tel quel à des fins vaccinales ou bien les
liposomes peuvent
être purifiés plus encore afin de se débarrasser de la Tbpb lipidée libre. Une
fois les
liposomes complètement purifiés, on peut prévoir de rajouter de la Tbpb
lipidée libre,
notamment en quantité définie.
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Une composition vaccinale / pharmaceutique selon l'invention est notamment
utile pour
traiter ou prévenir une infection à N. meningitidis, telles que les méningites
à N.
meningitidis, les méningococcémies et les complications qui peuvent en dériver
telles
que le purpura fulminans et le choc septique ; ainsi que les arthrites et
péricardites à N.
meningitidis.
Elle peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on
associe une
quantité efficace d'un point de vue thérapeutique ou prophylactique des
constituants
essentiels du vaccin, LOS et TbpB, à un support ou à un diluant acceptable
d'un point de
vue pharmaceutique. Avantageusement, elle peut en outre comprendre un adjuvant
acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Pour usage dans une composition selon l'invention, le (les) LOS est (sont)
avantageusement formulé(s) en liposomes.
Les quantités de LOS et de rTbpB par dose de vaccin qui sont efficaces d'un
point de
vue immunogène, prophylactique ou thérapeutique, dépendent de certains
paramètres
incluant l'individu traité (adulte, adolescent, enfant ou nourrisson), -la
voie
d'administration et de sa fréquence.
Ainsi, la quantité de LOS par dose peut être comprise entre 5 et 500 g,
avantageusement entre 10 et 200 g, de préférence entre 20 et 100 g, de
manière tout à
fait préférée entre 20 et 80 gg ou entre 20 et 60 g, bornes incluses.
La quantité de TbpB lipidée par dose peut être comprise entre 5 et 500 g,
avantageusement entre 10 et 200 g, de préférence entre 20 et 100 g, de
manière tout à
fait préférée entre 20 et 80 gg ou entre 20 et 60 g, bornes incluses.
Dans le vaccin selon l'invention, le rapport molaire LOS : TbpB lipidée est de
10"2 à 103,
de manière avantageuse de 10-1 à 102 ; de préférence de 1 à 50 ; de manière
tout
particulièrement préférée, de 15 à 30 ou de 20 environ. A titre d'exemple, on
indique
que le rapport molaire LOS : TbpB lipidée peut être typiquement de 20 ou de 25
environ, selon que l'isotype de la TbpB est I ou II.
Le terme dose employé ci-dessus doit être entendu comme désignant un
volume de
vaccin administré à un individu en une seule fois - c'est-à-dire à un temps T.
Des doses
conventionnelles sont de l'ordre du millilitre, par exemple 0.5, 1 ou 1.5 ml ;
le choix
définitif dépendant de certains paramètres et notamment de l'âge et du statut
du
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receveur. Un individu peut recevoir une dose répartie en plusieurs sites
d'injection le
même jour. La dose peut être unique ou si nécessaire, l'individu peut aussi
recevoir
plusieurs doses à un certain délai d'intervalle - délai d'intervalle pouvant
être déterminé
par l'homme de l'art.
Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle
voie
conventionnelle en usage dans le domaine de l'art, e.g. dans le domaine des
vaccins,
notamment par voie entérale ou parentérale. L'administration peut avoir lieu
en dose
unique ou répétée avec un certain délai d'intervalle. La voie d'administration
varie en
fonction de divers paramètres par exemple de l'individu traité (condition,
âge, etc.).
Enfin l'invention a également pour objet :
Une méthode pour induire chez un mammifère, par exemple un humain, une
réponse immune à l'encontre de N. meningitidis, selon laquelle on administre
au
mammifère une quantité efficace d'un point de vue immunogénique d'une
composition
selon l'invention pour induire une réponse immune, en particulier une réponse
immune
protectrice à l'encontre de N. meningitidis ; et
Une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection induite par N.
meningitidis, selon laquelle on administre une quantité efficace d'un point de
vue
prophylactique ou thérapeutique d'une composition selon l'invention à un
individu ayant
besoin d'un tel traitement.
DONNEES EXPERIMENTALES
A Données expérimentales relatives aux souches dérivées de N. meningitidis
C708
1. Matériel & Méthodes
1.1 Transformation de la souche C708
La souche C708 est cultivée en milieu agar BHI (Brain Heart Infusion) à 37 C
sous une
atmosphère à 10 % C02. La nappe bactérienne est récoltée en milieu liquide BHI
complémenté en MgCl2 5 mM pour obtenir une suspension bactérienne à 109 cfu/mL
(cfu : colony-forming-unit ou colonie formant unité).
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A 900 L du milieu liquide BHI + MgC12 5 mM, on ajoute 10 .tg d'ADN nécessaire
à la
transformation (plasmide linéarisé) ; puis 100 l de la suspension bactérienne
(108
germes). Le milieu de transformation est incubé 30 min à 37 C, 10 % C02.
Cinq cent L de cette préparation (soit environ 5.107 cfu) servent à
ensemencer 4,5 mL
de BHI + MgC12 5 mM. On laisse les bactéries se régénérer 2 hrs à 37 C, 10 %
C02.
Puis, à partir de cette suspension, on réalise des dilutions en BHI + MgC12 5
mM. 300
gL d'une dilution contenant environ 30 000 cfu sont étalés sur boîte BHI agar
140 mm.
Les boîtes sont placées à 37 C, 10 % C02 pendant au moins 20 hrs.
1.2. Buvardage des colonies de transformants
Les colonies sont transférées sur membrane Hybond-XL 137 mm (GE Healthcare;
#RPN
1375 ). Les germes déposés sur membrane sont lysés en tampon de dénaturation
(NaOH
0.5 M, NaCI 1,5 M). Les membranes sont lavées en tampon de neutralisation
(Tris 0,5
M, NaCl 1,5 M, pH 7.5) ; transférées en milieu SSC 2X; puis séchées. L'ADN est
fixé
par incubation 2 hrs à 80 C.
1.3. Détection des transformants par hybridation avec une sonde marquée au 33P
dCTP
Le marquage de la sonde est obtenu par amplification PCR en utilisant le kit
Ready-to-
Go PCR Beads (GE Healthcare) ; puis la sonde marquée est purifiée sur colonne
ProbeQuant G50 Microcolumn (GE Healthcare).
Les membranes à hybrider sont placées par trois dans 50 ml de tampon Rapid Hyb
(GE
Healthcare), 15 min à 65 C, sous agitation lente, pour pré-hybridation. La
sonde
marquée et dénaturée au préalable 2 min à 95 C, est ajoutée aux membranes. En
final, la
concentration de la sonde est de 5 ng/ml. On laisse l'hybridation se
poursuivre 2 hrs à
65 C, sous agitation lente.
Les membranes sont ensuite soumises à des lavages successifs en procédant
comme
suit :
En tampon de faible stringence (2 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 15 min à
température ambiante sous agitation lente ;
En tampon de moyenne stringence (1 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 20 min
à 65 C sous agitation lente ; et
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En tampon de faible stringence (0.1 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 45 min à
65 C sous agitation lente.
Une fois séchées, les membranes sont révélées par autoradiographie (film
Biomax MR).
1.4. Détection des transformants par hybridation avec un oligonucléotide
marqué au [,y32 Pl ATP
On réalise le marquage de l'extrémité 5' de l'oligonucléotide dans le milieu
réactionnel
suivant (les quantités indiquées sont celles correspondant à l'hybridation
d'une quantité
d'oligonucléotide nécessaire à l'hybridation de 3 membranes dans une boîte) :
Oligonucléotide 5'-OH libre 3 jtl maxi soit 10 pmoles
- Tampon de phosphorylation 10 X 1 l soit 1 X
[y-32P] ATP 10 mCi/ml 5 l soit 50 Ci
T4 kinase (10 U/ l) 1 gl soit 10 U
H2O qsp 10 l
Le milieu réactionnel est incubé 30 min à 37 C. Puis la T4 kinase est
inactivée par
chauffage 10 min à 70 C.
Les membranes à hybrider sont placées par trois dans 60 mL de tampon Rapid Hyb
(GE
Healthcare), 15 min à 48 C, sous agitation lente, pour pré-hybridation. Le
tampon de
pré-hybridation est éliminé, remplacé par 50 mL du tampon d'hybridation
suivant : 5 X
SSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5 % de SDS (poids/vol.) et 100 gg/ml d'ADN de
sperme de saumon à 10 mg/ml soniqué et dénaturé 5 min à 100 C.
L'oligonucléotide marqué (10 l) est ajouté aux membranes. On laisse
l'hybridation se
poursuivre une nuit à une température inférieure de 5 C au Tm de
l'oligonucléotide,
sous agitation lente.
Les membranes sont ensuite soumises à des lavages successifs en procédant dans
l'ordre
comme suit :
En tampon de faible stringence (2 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 5 min à
Tm de l'oligonucléotide - 5 C, sous agitation lente ;
En tampon de moyenne stringence (1 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 15 min
à Tm de l'oligonucléotide - 5 C, sous agitation lente ; et
- En tampon de faible stringence (0.1 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 10 min à
Tm de l'oligonucléotide - 5 C, sous agitation lente.
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Une fois séchées, les membranes sont révélées par autoradiographie (film
Biomax MR).
2. Construction d'une souche de N. meningitidis exprimant un LOS dont la
chaîne a est celle d'un LOS d'immunotype L6 et comportant dans chacune
des positions 03 et 06 du résidu heptose II (hep II) du core interne, un
5 substituant phosphoéthanolamine (PEA)
On utilise pour souche de départ, la souche de N. meningitidis C708 de
sérogroupe A et
d'immunotype L6 possédant entre autres les caractéristiques suivantes :
- Un gène lgtA actif (gène allumé ON ) ;
- Un gène igtB - (gène non fonctionnel) ;
10 - Un gène lgtG éteint ( OFF ) ;
- Un gène lpt3 tronqué ;
- Un gène lpt6 actif ; et
- Un gène lot3 actif.
La souche C708 a été déposée le 11 mars 2008, auprès de la Collection
Nationale de
15 Culture de Microorganisme, 25 rue du Dr Roux 75015 Paris, selon les termes
du traité
de Budapest. Cette souche porte le numéro d'ordre CNCM I-3942.
La souche C708 comporte un gène lpt3 tronqué. Pour la modifier de telle sorte
que le
LOS soit porteur d'un substituant PEA en position 03, on choisit de remplacer
par
recombinaison homologue, le gène lpt3 tronqué par le gène lpt3 complet (full-
length) de
20 la souche de N. meningitidis FAM18 sérogroupeC (souche mise à disposition
dans les
laboratoires de recherche, à l'échelle mondiale). La souche qui en résulte
sera
dénommée plus commodément C708 lpt3 FL.
2.1. Amplification par PCR (polymerase chain reaction) du gène lpt3 complet
(FL = full-length) de la souche de N. meningitidis FAM18
25 Cent ng d'ADN génomique de la souche FAM1 8 ont été utilisés pour
amplification avec
la Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen, #11304-011).
Le couple d'amorces est le suivant (couple n 1) :
CG GAATTC GCC GTC TCA A ATG AAA AAA TCC CTT TTC GTT CTC (Tm =
55,9 C) ; et
30 AA CTGCAG TCA TTG CGG ATA AAC ATA TTC CG (Tm = 57,1 C).
(sont respectivement soulignés les sites EcoRI et Pstl).
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Pour amplification le mélange suivant a été réalisé :
Composant Volume Concentration finale
Tampon 1 OX High Fidelity PCR 5 gl lX
Mélange 10 mM dNTP 1 l 0.2 mM de chaque
MgSO4 50 mM 2 g1 2 mM
Mélange d'amorces (10 gM chacune) 1 gl 0.2 gM de chaque
ADN génomique x gl 100 ng
Platinum Taq High Fidelity 0.2 gl 1.0 unit
Eau dépourvue de nucléase pour 50 gl final Ne s'applique pas
Le programme du thermocycleur est le suivant :
Dénaturation initiale : 94 C pendant 30 secondes
30 cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 30 secondes
Hybridation : 55 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 1 minute / kb de produit PCR.
Après la réaction, 1/10 du produit PCR a été déposé sur gel d'agarose pour
vérification.
2.2. Construction d'un vecteur de transformation
Le produit PCR d'une part et le plasmide pUC19 d'autre part ont été soumis à
une
double digestion par EcoRI et Pstl pendant 2 hrs à 37 C. On a utilisé 10
unités de
chaque enzyme par gg d'ADN dans le tampon REact2 (Invitrogen).
Le fragment PCR a été ensuite inséré dans le vecteur pUC 19 linéarisé. Les
ligations ont
été réalisées sous un volume final de 20 gl avec 50 ng de vecteur, 0,5 U de T4
DNA
ligase (Invitrogen) et 1 gl d'ATP 10 mM (Invitrogen) pendant 16 heures à 16 C.
La
ligase a ensuite été inactivée par chauffage 10 min à 65 C.
Le vecteur ainsi obtenu a été transféré par la technique d' électroporation
dans une
souche d'E. coli PLI blue MRF résistante à la kanamycine et rendue électro
compétentes. Les paramètres suivis pour l'électroporation sont les suivants :
Capacitance : 500 gFD ; Résistance : 200 ohms ; Voltage : 1700 volts.
La sélection des clones transformés a été faite par étalement sur boîtes LB
ampicilline
100 gg/m1. L'authentification de 10 des 50 clones positifs a été réalisée par
amplification PCR. 100 % des clones présentaient le profil attendu.
Finalement, le gène
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lpt3 dans un plasmide d'un de ces clones (plasmide pM1222) a été vérifié par
séquençage.
2.3. Transformation de la souche C708 et détection de l'évènement de
recombinaison homologue
2.3.1. Transformation
40 g de pM1222 ont été digérés par 400 U d'EcoRI et 10 g ont été utilisés
pour
transformer la souche C708 selon la méthode décrite dans la section A.1.1.
Après transformation, les bactéries ont été étalées sur 17 boîtes de Pétri de
140 mm à
une concentration théorique de 30 000 cfu par boîte ; soit 510 000 cfu
(colonies-
forming-units), puis ont été placées une nuit à 37 C. Les boîtes ont ensuite
été placées
30 min à +4 C.
Après 24 heures à 37 C, la numération des boîtes contrôle a permis d'estimer
le nombre
de cfu à 27 000 par boîte pour le mutant.
2.3.2. Sélection des clones
L'évènement de recombinaison, c'est-à-dire le remplacement du gène lpt3 TR
(tronqué)
par le gène lpt3 FL (complet), a été détecté après transfert des clones sur
membrane
d'hybridation et hybridation avec une sonde marquée au 33P dCTP selon les
méthodes
décrites dans les sections A. 1.2. et A.1.3.
La sélection des clones positifs s'est faite par hybridation de l'ADN fixé sur
les
membranes avec une sonde ADN marquée au 33P dCTP correspondant à la partie
tronquée du gène lpt3, donc présente uniquement chez les clones recombinants.
Préparation de la sonde
Afin d'obtenir la sonde lpt3 de 270 pb, 10 ng du plasmide pUClpt3 ont été
utilisés pour
amplification par PCR avec la Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity
(Invitrogen, #11304-011).
Le couple d'amorces est le suivant (couple n 2) :
CGC CGA ATA CTT TAT CTT GAG GC (Tm = 60,6 C) ; et
CTC GCC AAA GAG CAG GGC (Tm = 60,5 C).
Pour amplification, le mélange suivant a été réalisé :
Composants Volume Concentration finale
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Tampon 1OX High Fidelity PCR 5 l lX
Mélange 10 mM dNTP 1 l 0.2 mM de chaque
MgSO4 50 mM 2 l 2 mM
Mélange d'amorces (10 M chacune) 1 l 0.2 M de chaque
Plasmide pUC x l 100 ng
Platinum Taq High Fidelity 0.2 l 1.0 unit
Eau dépourvue de nucléase pour 50 l final Ne s'applique pas
Le programme du thermocycleur est le suivant :
Dénaturation initiale : 94 C pendant 30 secondes
30 cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 30 secondes
Hybridation : 55 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 45 secondes.
Après la réaction, 1/10 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose pour
s'assurer de
la spécificité de l'amplicon, puis le fragment PCR a été purifié en utilisant
le kit
QlAquick PCR Purification Kit (Qiagen, #28104).
Hybridation et révélation
Les étapes de marquage de la sonde, d'hybridation, de lavages et de révélation
ont été
réalisées selon ce qui est décrit dans la section A.1.3.
Environ 460 000 cfu ont été testées. Après mise en exposition avec les films
BioMax
MR, les autoradiographies ont révélé 5 spots positifs (C708 contenant un gène
lpt3 FL)
chacun sur une membrane différente.
Criblage et authentification des clones positifs
Après repérage sur la boîte de Pétri, une partie de la zone prélevée autour
des clones
positifs a été conservée en milieu de congélation (milieu M199, sérum de veau
foetal
20 %, glycérol 10 %) et l'autre partie a été utilisée pour l'authentification
par PCR.
Pour ce faire, chacun des prélèvements a d'abord été repris par 80 111 de
bouillon BHI,
de façon à étaler 30 l de cette suspension, en mini nappe sur une boîte BHI.
Le volume restant a été centrifugé 5 min à 6000 rpm, puis le culot a été
repris par 50 l
d'eau dépourvue de nucléase. Les germes ont été lysés 5 min à 95 C et le
surnageant,
qui sert de matrice à la réaction PCR, a été prélevé après centrifugation.
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Pour chaque prélèvement correspondant à un spot positif ainsi que les témoins,
une
amplification PCR avec le couple d'amorces ayant servi à l'amplification de la
sonde
C708 lpt3 de 270 pb (couple n 2) a été réalisée avec le kit Expand Long
Template PCR
(Roche) comme décrit ci-dessous.
Composants Volume Concentration Finale
Tampon 10X ELT PCR 5 gl 1X
Mélange de dNTP (10 mM de chaque) 2 l 0.4 mM de chaque
Mélange d'amorces (10 gM de chaque) 1,5 l 0.3 M de chaque
Matrice d'ADN 40 gl Ne s'applique pas
Polymerase ELT 0.75 l 3.75 unités
Eau dépourvue de nucléase pour 50 l Ne s'applique pas
Le programme du thermocycleur est le suivant :
Dénaturation initiale : 94 C pendant 2 min
10 cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 10 secondes
Hybridation : 54 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 45 secondes
cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 15 secondes
Hybridation : 54 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 45 secondes + 20 sec/cycle
20 Elongation finale : 68 C pendant 7 min
Après la réaction, 1/10 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose pour
vérification. Quatre des 5 clones présentaient le profil attendu. La fréquence
d'obtention
d'un clone positif vrai était de 1/ 115 000 cfu testées.
L'étape suivante a consisté à isoler un clone pur. Pour cela, un des clones
positifs
hétérogènes a été étalé en cfu isolées et plusieurs de ces cfu (40) ont été
analysées en
PCR, avec les couples d'amorces 1 ou 2.
Chaque cfu a été resuspendue dans 100 gl d'eau dépourvue de nucléase, 30 gl
ont été
déposés sur une boîte BHI et les 70 l restant ont été lysés 5 min à 95 C et
le
surnageant, qui sert de matrice à la réaction PCR, a été prélevé après
centrifugation.
Les PCR ont été réalisées avec la Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen)
comme déjà
décrit pour l'amplification de la sonde lpt3. La température d'hybridation
était de 54 C.
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Après la réaction, 1/10 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose pour
vérification. Cinq des 40 clones se sont révélés être des clones purs.
La mini nappe des clones purs a été reprise en milieu de congélation,
aliquotée sous 100
l et conservée à -70 C. La pureté et l'identité de ce congelât ont été
validées.
5 3. Construction d'une souche de N. meningitidis exprimant un LOS dont la
chaîne a est celle d'un LOS d'immunotype L6 et comportant uniquement en
position 03 du résidu heptose II (hep II) du tore interne, un substituant
phosphoéthanolamine (PEA)
On utilise pour souche de départ, la souche de N. meningitidis C708 lpt3 FL
obtenue
10 comme précédemment décrit. L'objectif est d'inactiver le gène lpt6 de cette
souche par
délétion d'une partie centrale du gène.
3.1. Amplification par PCR (polymerase chain reaction) du gène lpt6 complet
(full-length) de la souche de N. meningitidis Z2491 de sérogroupe A (gène
NMA 0408)
15 Cent ng d'ADN génomique de la souche Z2491 (souche mise à disposition dans
les
laboratoires de recherche, à l'échelle mondiale) ont été utilisés pour
amplification avec
la Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen, #11304-011).
Le couple d'amorces est le suivant (couple n 3) :
CG GAATTC GCC GTC TCA A GGT TGC CTA TGT TTT CCT GTT TTT G (Tm =
20 59,7 C) ; et
AA CTGCAG CTA ACG GGC AAT TTT CAA AAC GTC (Tm = 59,3 C).
(sont respectivement soulignés les sites EcoRI et Pstl).
Pour amplification le mélange suivant a été réalisé :
Composants Volume Concentration finale
25 Tampon 1OX High Fidelity PCR 5 l lX
Mélange 10 mM dNTP 1 gl 0.2 mM de chaque
MgSO4 50 mM 2 gl 2 mM
Mélange d'amorces (10 gM chacune) 1 gl 0.2 M de chaque
ADN génomique x 111 100 ng
30 Platinum Taq High Fidelity 0.2 gl 1.0 unit
Eau dépourvue de nucléase pour 50 gl final Ne s'applique pas
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Le programme du thermocycleur est le suivant :
Dénaturation initiale : 94 C pendant 30 secondes
30 cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 30 secondes
Hybridation : 55 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 1 minute / kb de produit PCR.
Après la réaction, 1/10 du produit PCR a été déposé sur gel d'agarose pour
vérification.
3.2. Construction du vecteur pM1223 (pUC19 lpt6 FL)
Le produit PCR d'une part et le plasmide pUC19 d'autre part ont été soumis à
une
double digestion par EcoRI et Pstl pendant 2 hrs à 37 C. On a utilisé 10
unités de
chaque enzyme par g d'ADN dans le tampon REact2 (Invitrogen).
Le fragment PCR a été ensuite inséré dans le vecteur pUC19 linéarisé. Les
ligations ont
été réalisées sous un volume final de 20 l avec 50 ng de vecteur, 0,5 U de T4
DNA
ligase (Invitrogen) et 1 gl d'ATP 10 mM (Invitrogen) pendant 16 heures à 16 C.
La
ligase a ensuite été inactivée par chauffage 10 min à 65 C.
Le vecteur ainsi obtenu a été transféré par la technique d'électroporation
dans une
souche d'E. coli XL1 blue MRF résistante à la kanamycine et rendue électro
compétente. Les paramètres suivis pour l'électroporation sont les suivants :
Capacitance : 500 FD ; Résistance : 200 ohms ; Voltage : 1700 volts.
La sélection des clones transformés a été faite par étalement sur boîtes LB
ampicilline
100 g/ml. L'authentification des clones positifs (présence d'un gène 1pt6 FL)
a été
réalisée par digestion enzymatique NdeI après extraction de l'ADN par
miniprep. Sur 20
clones analysés, 6 présentaient le profil attendu. Le plasmide recombinant du
clone
sélectionné a été nommé pM1223.
3.3. Délétion de la partie centrale du gène lpt6 provenant de la souche Z2491
Construction d'un vecteur de transformation
Avec le kit Expand Long Template PCR (Roche), on a réalisé une PCR inverse à
partir
du plasmide pM1223 à l'aide du couple d'amorces suivant (couple n 4) :
CG GGATCC CAT CGA CAC GAA CGC CGC (Tm = 60,5); et
CG GGATCC CCG CGC TTA ACG ACT ACA TC (Tm = 59,4) ;
(sont soulignés les sites BamHI).
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Ceci permet de réamplifier le plasmide en délétant la partie que l'on souhaite
retirer (808
bp).
Pour amplification le mélange suivant a été réalisé :
Composants Volume Concentration Finale
Tampon 10X ELT PCR 5 .d lx
Mélange de dNTP (10 mM de chaque) 2 l 0.4 mM de chaque
Mélange d'amorces (10 M de chaque) 1,5 gl 0.3 M de chaque
Matrice d'ADN (pM1223) 40 gl Ne s'applique pas
Polymérase ELT 0.75 id 3.75 unités
Eau dépourvue de nucléase pour 50 l Ne s'applique pas
Le programme du thermocycleur est le suivant :
Dénaturation initiale : 94 C pendant 2 min
10 cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 10 secondes
Hybridation : 54 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 3 min
cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 15 secondes
Hybridation : 54 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 3 min + 20 sec/cycle
Élongation finale : 68 C pendant 7 min
20 Après la réaction, 1/10 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose.
Après purification sur colonne QiaQuick, le produit PCR a été digéré par
BarnHI à
raison de 10 U d'enzyme par gg d'ADN. Une fois digéré, il a été purifié par
électroélution puis extraction phénol-chloroforme.
La ligation du vecteur sur lui-même a été réalisée sous un volume final de 20
gl avec 0,5
U de T4 DNA ligase (Invitrogen) et 1 l d'ATP 10 mM (Invitrogen) pendant 16
heures à
16 C. La ligase a ensuite été inactivée par chauffage 10 min à 65 C.
La dernière étape a consisté à transférer le vecteur ainsi ligué dans une
souche
d'Escherichia col! comme décrit pour le pM1222. L'authentification de clones
positifs a
été réalisée par digestion enzymatique NdeI-PstI après extraction de l'ADN par
miniprep. Sur les 4 clones analysés 100 % présentent le profil attendu.
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Le plasmide recombinant du clone positif sélectionné a été renommé pM1224 et
ce
clone a été conservé en glycérol à -70 C. La présence dans le plasmide pM1224
d'un
gène lgt6 délété de sa partie centrale a été vérifiée par séquençage.
3.4. Transformation de la souche C708 lpt3 FL et détection de l'évènement de
recombinaison homologue
Transformation
Dix gg de plasmide pM1224 ont été linéarisés par EcoRI à raison de 10 unités
d'enzyme
par g de plasmide à digérer dans le tampon approprié pendant 2 heures à 37 C.
La transformation dans la souche C708 a été faite en suivant la technique
décrite dans la
section A.1.1.
Après transformation, les bactéries ont été étalées sur 16 boîtes de Pétri de
140 mm à
une concentration théorique de 50 000 cfu par boîte ; soit 800 000 cfu. Les
boîtes ont été
placées une nuit à 37 C puis ensuite été placées 30 min à +4 C.
Sélection des clones : Préparation de la sonde, hybridation et révélation
L'évènement de recombinaison a été détecté après colony blot et hybridation
avec un
oligonucléotide marquée au y32P dATP.
L'évènement de recombinaison, c'est-à-dire le remplacement du gène lpt6 FL par
le gène
lpt6 TR, a été détecté après transfert des clones sur membrane et hybridation
avec une
sonde marquée selon les méthodes décrites dans les sections A. 1.2. et A. 1.4.
Les clones transférés sur membranes sont soumis à des étapes de lyse et de
lavage.
L'ADN est fixé sur les membranes en plaçant ces dernières 2 heures à 80 C.
La sélection des clones positifs s'est faite par hybridation de l'ADN fixé sur
membranes
Hybond N+ avec un oligonucléotide radioactif dont la séquence est chevauchante
sur les
deux extrémités recombigéniques. Il s'agit de l'oligonucléotide suivant : GTC
GAT
GGG ATC CCC GCG CTT AAC G (Tm = 69.5 C).
Environ 840 000 cfu ont été testées. Après mise en exposition avec les films
BioMax
MR, les autoradiographies ont révélé 16 spots positifs (C708 contenant un gène
lpt6 TR)
répartis sur 9 membranes différentes.
Criblage et authentification des clones positifs
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Pour chacun des 16 spots positifs, après repérage sur la boîte de Pétri, une
partie de la
zone prélevée autour des clones positifs a été conservée en milieu de
congélation (Ml 99,
SVF 20 %, glycérol 10 %) et l'autre partie a été utilisée pour
l'authentification par PCR.
Pour ce faire les prélèvements ont d'abord été repris par 80 gl de bouillon
BHI, de façon
à étaler, en mini nappe sur une boîte BHI, 30 gl de chaque suspension.
Le volume restant a été centrifugé 5 min à 6000 rpm, puis le culot a été
repris par 50 gl
d'eau dépourvue de nucléase. Les germes ont été lysés 5 min à 95 C et le
surnageant,
qui sert de matrice à la réaction PCR, a été prélevé après centrifugation.
Pour chaque prélèvement correspondant à un spot positif, une amplification PCR
a été
réalisée avec la Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen) et le couple
d'amorces suivant
(couple n 5)
CCG ACT GGC GGA ATT GGG (TM = 60,5 C) ; et
CCC ATT TCT TCC TGA CGG AC (Tm = 59,4 C).
Pour amplification, le mélange suivant a été réalisé :
Composants Volume Concentration finale
Tampon 1OX High Fidelity PCR 5 gl 1X
Mélange 10 mM dNTP 1 g1 0.2 mM de chaque
MgSO4 50 mM 2 g1 2 mM
Mélange d'amorces (10 gM chacune) 1 gl 0.2 gM de chaque
Matrice d'ADN x 111 100 ng
Platinum Taq High Fidelity 0.2 gl 1.0 unit
Eau dépourvue de nucléase pour 50 gl final Ne s'applique pas
Le programme du thermocycleur est le suivant :
Dénaturation initiale : 94 C pendant 1 min
30 cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 30 secondes
Hybridation : 55 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 50 secondes.
Après la réaction, 1/10 du produit PCR a été déposé sur gel d'agarose, pour
vérification.
Deux candidats sur 16 se sont révélés être de vrais positifs : soit une
fréquence
d'obtention d'un clone positif vrai pour 425 000 cfu testées.
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L'étape suivante a consisté à isoler un clone pur. Pour cela, un des 2 clones
positifs
hétérogènes a été étalé en cfu isolées et plusieurs de ces cfu (24) ont été
analysées en
PCR, avec le couple d'amorces n 5.
Chaque cfu a été resuspendue dans 50 1 d'eau dépourvue de nucléase, 20 gl ont
été
5 déposés sur une boîte BHI et les 30 l restant ont été lysés 5 min à 95 C et
le
surnageant, qui sert de matrice à la réaction PCR, a été prélevé après
centrifugation.
Les PCR ont été réalisées avec la Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen)
comme déjà
décrit pour le criblage des prélèvements des spots positifs.
Après la réaction, 1/5 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose pour
vérification.
10 Seul un clone sur 24 s'est révélé être un positif vrai.
La mini nappe du clone positif pur a été reprise en milieu de congélation,
aliquotée sous
100 gl et conservée à -70 C. La pureté et identité de ce congelât ont été
validées.
4. Construction d'une souche de N. meningitidis exprimant un LOS dont la
chaîne a est celle d'un LOS d'immunotype L8 et comportant uniquement en
15 position 03 du résidu heptose II (hep II) du core interne, un substituant
phosphoéthanolamine (PEA)
On utilise pour souche de départ, la souche de N. meningitidis C708 lpt3 FL
lpt6 TR
obtenue comme précédemment décrit dans la section A.3. L'objectif est
d'inactiver le
gène lgtA de cette souche par délétion d'une partie centrale du gène.
20 4.1. Amplification par PCR (polymerase chain reaction) du gène lgt A
complet
(full-length) de la souche de N. meningitidis MC58 de sérogroupe B (gène
NMB 1929)
Cent ng d'ADN génomique de la souche MC58 (souche mise à disposition dans les
laboratoires de recherche, à l'échelle mondiale) ont été utilisés pour
amplification avec
25 la Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen, #11304-011).
Le couple d'amorces est le suivant :
CG GAATTC GCC GTC TCA A ATG CCG TCT GAA GCC TTC AG (Tm = 59,4'C);
et
AA CTGCAG AAC GGT TTT TCA GCA ATC GGT GC (Tm = 60,6 C).
30 (sont respectivement soulignés les sites EcoRI et Pstl).
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41
Pour amplification le mélange suivant a été réalisé :
Composants Volume Concentration finale
Tampon 1OX High Fidelity PCR 5111 1X
Mélange 10 mM dNTP 1 gi 0.2 mM de chaque
MgSO4 50 mM 2 1 2 mM
Mélange d'amorces (10 M chacune) 1 l 0.2 M de chaque
ADN génomique x l 100 ng
Platinum Taq High Fidelity 0.2 l 1.0 unit
Eau dépourvue de nucléase pour 50 l final Ne s'applique pas
Le programme du thermocycleur est le suivant :
Dénaturation initiale : 94 C pendant 30 secondes
30 cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 30 secondes
Hybridation : 55 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 1 minute / kb de produit PCR.
Après la réaction, 1/10 du produit PCR a été déposé sur gel d'agarose pour
vérification.
4.2. Construction du vecteur pUC19 lgtA FL
Le produit PCR obtenu en 4.1. d'une part et le plasmide pUC19 d'autre part ont
été
soumis à une double digestion par EcoRI et PstI pendant 2 hrs à 37 C. On a
utilisé 10
unités de chaque enzyme par gg d'ADN dans le tampon REact2 (Invitrogen).
Le fragment PCR a été ensuite inséré dans le vecteur pUC19 linéarisé. Les
ligations ont
été réalisées sous un volume final de 20 l avec 50 ng de vecteur, 0,5 U de T4
DNA
ligase (Invitrogen) et 1 l d'ATP 10 mM (Invitrogen) pendant 16 heures à 16 C.
La
ligase a ensuite été inactivée par chauffage 10 min à 65 C.
Le vecteur ainsi obtenu a été transféré par la technique d'électroporation
dans la souche
d'E. coli XL1 Blue MRF résistante à la kanamycine et rendue électro-
compétente. Les
paramètres suivis pour l'électroporation sont les suivants : Capacitance : 500
FD ;
Résistance : 200 ohms ; Voltage : 1700 volts.
La sélection des clones transformés a été faite par étalement sur boîtes LB
ampicilline
100 g/ml. L'authentification des clones positifs (présence d'un gène lgtA FL)
a été
réalisée par digestion enzymatique après extraction de l'ADN par miniprep. 1/5
des
clones analysés présentaient le profil de digestion enzymatique attendu.
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4.3. Amplification par PCR (polymerase chain reaction) du gène de résistance à
l'érythromycine (erm)
L'amplification par PCR de la cassette érythromycine (erm) au départ du pMGC10
a été
faite avec des amorces permettant d'intégrer les sites de restriction BamHI-
XbaI.
Le couple d' amorces utilisé est le suivant :
CG GGATCC GGA AGG CCC GAG CGC AGA AGT (Tm: 65,7 C) ; et
GC TCTAGA CAA CTT ACT TCT GAC AAC GAT CGG (Tm: 61 C)
Pour amplification, le mélange suivant a été réalisé :
Composants Volume Concentration finale
Tampon Pfu turbo 1OX 5 l 1X
10 mM dNTP mixture 0.4 l 0.2 mM de chaque
Mélange d'amorces (10 gM chacune) 1 l 0.2
pMGC10 x l 10 ng
Pfu turbo (Stratagène) 1 l 2.5 units
Nuclease free water to 50 gl Pas applicable
Le programme du thermocycleur a été le suivant:
Initial dénaturation: 95 C for 2 mn
30 cycles of:
Denature: 95 C for 30 seconds
Anneal: 55 C for 30 seconds
Extend: 72 C for 1 minute
Final élongation: 72 C for 10 mn
Après la réaction 1/10 des produits PCR sont déposés sur gel d'agarose.
4.4. Construction du plasmide pUC19 lgtA TR (délétion de la partie centrale du
gène lgtA par PCR inverse)
Avec le kit Expand Long Template PCR (Roche), on a réalisé une PCR inverse à
partir
du plasmide pUC19 lgtA FL, obtenu en A.4.2., dans le double but d'enlever la
partie
centrale du gène et de créer deux sites de restriction aux extrémités (BamHI
et Xbal). Le
couple d'amorces suivant a été utilisé :
CG GGATCC GCC AAT TCA TCC AGC CCG ATG (Tm = 61,8 C); et
CG TCTAGA CCC GGT TCG ACA GCC TTG (Tm = 60,5 C) ;
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Ceci permet de réamplifier le plasmide en délétant la partie que l'on souhaite
retirer.
Pour amplification, le mélange suivant a été réalisé :
Composants Volume Concentration Finale
Tampon 1OX ELT PCR 5 l iX
Mélange de dNTP (10 mM de chaque) 2 gl 0.4 mM de chaque
Mélange d'amorces (10 M de chaque) 1,5 l 0.3 gM de chaque
Matrice d'ADN (l0 ng de pUC19 lgtA FL) Ne s'applique pas
Polymérase ELT 0.75 l 3.75 unités
Eau dépourvue de nucléase pour 50 l Ne s'applique pas
Le programme du thermocycleur est le suivant :
Dénaturation initiale : 94 C pendant 2 min
10 cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 10 secondes
Hybridation : 55 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 1 min par kbs
20 cycles de : Dénaturation : 94 C pendant 15 secondes
Hybridation : 55 C pendant 30 secondes
Extension : 68 C pendant 1 min par kbs + 20 sec/cycle
Elongation finale : 68 C pendant 7 min
Après la réaction, 1/10 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose pour
vérification
de la taille (3.2.kbs). Le produit PCR a été purifié sur colonne QiaQuick.
La dernière étape a consisté à transférer le vecteur dans la souche d'E. coli
XL1 blue
MRF résistante à la kanamycine et rendue électro compétente.
L'authentification de
clones positifs (lgtA délété de sa partie centrale) a été réalisée par
digestion enzymatique
après extraction de l'ADN par miniprep.
4.5. Construction du plasmide pUC19 lgtA :: erm
Le produit PCR erm d'une part et le plasmide pUC19 lgtA TR issu de la PCR
inverse
d'autre part ont été soumis chacun à une double digestion par BamHI et Xbal
dans les
conditions suivantes :
2 g d'ADN ont été en contact avec 20 unités de Xbal en tampon 2 (InVitrogen)
sous 60
gl pendant 2 heures à 37 C. Puis Xbal a été inactivée 10 minutes à 65 C. On a
alors
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ajouté 7 l de NaCI 1 M, 20 unités de BamHI et 1 l de tampon 2. La digestion a
été
poursuivie 2 hrs à 37 C.
Les produits de digestion ont ensuite été intégralement déposés sur un gel
d'agarose
0.8%, et après migration, les bandes ont été découpées pour être électroéluées
(celle du
plasmide est à 3.2 kbs).
Après purification, le plasmide linearisé et le produit PCR erm digéré ont été
ligués
entre eux comme précédemment décrit. Le produit de la ligation a été utilisé
pour
transformer comme précédemment décrit, la souche E. coli XL1 Blue MRF
résistante à
la kanamycine et rendue électro-compétente. Les clones recombinants ont été
analysés
par digestion enzymatique. 4/11 des clones analysés présentaient le profil de
digestion
enzymatique attendu.
4.6. Transformation de la souche C708 lpt3 FL lpt6 TR et détection de
l'évènement de recombinaison homologue
Dix g de plasmide pUC19 lgtA :: erm ont été linéarisés par EcoRI à raison de
10 unités
d'enzyme par g de plasmide à digérer dans le tampon approprié pendant 2
heures à
37 C.
La transformation dans la souche C708 lpt3 FL lpt6 TR a été faite en suivant
la
technique décrite dans la section A.1.1.
Après transformation, 1,24 108 bactéries ont été étalées sur milieu BHI +
erythromycine
à 2 g/mL. L'incubation est poursuivie une nuit à 37 C. La fréquence de
transformation
observée est de 1 / 2,5 106.
B. Données expérimentales relatives aux compositions vaccinales
1. Préparation de la rTbpB lipidée
Par souci de simplification langagière, on indiquera simplement par la suite,
rTbpB ou
TbpB.
1.1. Production
Souches exprimant la TbpB lipidée M982 ou B16B6
Les souches d'expression sont les souches d'E. coli BL21 contenant
respectivement le
plasmide pTG9219 / pTG9216. Ces plasmides comportent notamment un marqueur de
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sélection à la kanamycine et le polynucléotide codant pour la rTbpB de la
souche de N.
meningitidis M982 (pTG9219) ou B 16B6 (pTG9216) (les séquences sont telles que
décrites dans le brevet EP 586 266), fusionnée à la séquence signal R1pB (Real
lipoprotein B) d'E. coli et placée sous le contrôle du promoteur arabinose
(araB).
5 Culture
Trois congelâts de la souche d'E. coli BL21/pTG9219 ou BL21/pTG9216 (1 ml
chacun)
servent à ensemencer 3 litres de milieu LB (Luria Broth) répartis en erlens.
L'incubation
est poursuivie 15 à 18 h à 37 C.
Cette pré-culture sert à ensemencer un fermenteur contenant du milieu TGM16
(extrait
10 de levure 9g/L; K2S04 0.795 g/L, K2HPO4 3.15 g/L, NaCI 0.75 g/L, CaC12,2H20
0.005
g/L, FeC13,6H2O 0.021 g/L, MgSO4,7H20 0.69 g/L, hydrolysat acide de caséine
sans sel
37.5 g/L) supplémenté avec du glycérol 20 g/L, à raison de 10 % (vol./vol.).
La culture est poursuivie à 37 C sous agitation, à une pression de 100 mbar et
sous une
alimentation d'air de 1 L/min/L de culture, en réajustant au cours du temps la
15 concentration de glycérol à 20 g/L (e.g. à D0600 de 15 + 2). Lorsque la
DO6oo est
comprise entre 21 et 27, on induit l'expression de la rTbpB par addition
d'arabinose
pour obtenir une concentration finale de 10 g/L. Après une heure d'induction,
la culture
est arrêtée en refroidissant aux alentours de 10 C.
Les culots bactériens sont récupérés par centrifugation et stockés au froid.
20 1.2. Purification
Extraction des membranes renfermant la rTbpB
LOS extraction
Un culot bactérien équivalent à un litre de culture (environ 72 g de germes,
poids
humide) est décongelé à une température de 20 C +/-5 C. Les germes décongelés
(ou
25 partiellement décongelés) sont remis en suspension par 800 ml d'une
solution à
température ambiante de Tris HCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0. On ajoute aussitôt
9
pastilles d'inhibiteur de protéases (7 pastilles de Complete Mini, EDTA free ;
ROCHE
réf. 11836170001 + deux pastilles de Complete, EDTA free ; ROCHE réf.
11836170001). Une partie des germes se lysant spontanément, 4 gl de benzonase
(1 UT
30 d'activité DNAse/ml en final ; Merck réf K32475095) sont ajoutés également.
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L'incubation est poursuivie à +4 C durant 45 minutes sous agitation magnétique
après
homogénéisation par Turrax (15 sec.).
Puis on ajoute 4 ml de MgC12 1 M afin d'être à 5 mM final. L'agitation
magnétique est
portée à 10 minutes. Une centrifugation à 15,000 g durant 45 minutes permet de
récolter
le culot (culot Cl ; vs Surnageant Si) contenant la protéine rTbpB.
Une deuxième extraction est réalisée : homogénéisation par Turrax dans 800 ml
du
tampon Tris HC150 mM, EDTA 5 mM pH 8,0 et agitation pendant 30 min. On ajoute
du
MgC12 (8 ml d'une solution molaire). L'incubation est poursuivie pendant 10
minutes.
La suspension est centrifugée 15,000 g durant 1 hr 30.
Lyse bactérienne
Le culot est remis en suspension par 1400 ml de Tris HCl 50 mM additionné de 4
pastilles d'inhibiteur de protéases et de 8 gl de Benzonase. La solution est
homogénéisée
au Turrax 15 secondes. La lyse est réalisée à +4 C durant 30 minutes grâce à
l'ajout de
14 ml (10 mg/ml en final) de lysozyme à 100 mg/ml en acétate de Na 25 mM,
glycérol
50%.
La suspension est centrifugée à 30,000 g durant 30 minutes (Culot C2 contenant
la
protéine ; vs surnageant S2 contenant les contaminants de rTbpB). Le culot
contenant les
membranes peut être congelé à ce stade.
Lavage des fragments de membranes
Le culot de lyse C2 est repris en Tris HCl 50 mM (1100 ml). Après
homogénéisation,
(Turrax 15 secondes), il est lavé durant une heure à +4 C. On opère comme
précédemment à une centrifugation à 30,000 g durant 30 minutes, Le culot (C3 ;
vs
surnageant S3) est congelé à -45 C. Le tampon Tris HCl 50 mM permet d'éliminer
une
petite quantité de protéine (surnageant S3) et ne solubilise que très peu de
rTbpB.
Le culot C3 est repris en tampon Tris HC150 mM, urée 8 M pH 8,0 (800 ml). Ce
tampon
permet d'éliminer une partie des protéines contaminantes sans solubiliser les
membranes
contenant la rTbpB. Après homogénéisation (sans Turrax), la solution est alors
agitée
durant une heure à +4 C. On procède comme précédemment à une centrifugation à
30,000 g durant 30 minutes qui permet d'obtenir un culot de membranes qui peut
être
congelé.
Solubilisation des membranes
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Le culot de membrane décongelé est solubilisé par 780 ml de tampon Tris HC1 50
mM
EDTA 6 mM Urée 2 M Elugent 4 % à pH 7,5. La présence du détergent à 4 % et de
l'urée 2 M permet de réaliser la solubilisation du culot. La solution est
agitée à +4 C une
nuit (16h minimum). La centrifugation à 30,000 g (1 heure à +4 C) de la
solution ne
laisse qu'un petit culot (C4) contenant quelques impuretés. Le surnageant S4
contenant
la protéine rTbpB est récupéré pour dépôt sur une première colonne échangeuse
de
cations (QS I).
Purification par chromatographie échangeuse d'anions sur Q Sepharose à pH 7,5
Deux chromatographies successives sont réalisées, le produit de la première
chromatographie est collecté puis déposé ensuite après une étape de dialyse
sur une
deuxième colonne de chromatographie qui utilise des conditions différentes
(absence
d'EDTA).
l è` e Chromatographie, en présence d'EDTA (Chromatographie QS I)
Une colonne de 600 ml (K50, diamètre 20 cm2) de gel Q Sepharose Fast Flow (réf
17-
0510-01 GE Healthcare) est montée, tassée en tampon d'équilibration Tris HCI
50 mM
EDTA 6 mM, Urée 2 M, Elugent 1 %, à pH 7,5 au débit de 8 ml/minute.
Le surnageant S4 (environ 845 ml) est déposé au débit de 6 ml/minute. L'éluât
direct
(partie qui ne s'accroche pas sur la colonne lors du dépôt de l'échantillon)
contient la
protéine d'intérêt rTbpB. Cet éluât (1150 mL) est prélevé, puis dialysé à +4 C
(durant 6
jours) contre 6 litres de tampon Tris HCI 50 mM, Urée 2 M, Elugent 1 %, pH 7,5
afin
d'abaisser à 1 mM la concentration en EDTA et d'éliminer le NaCI.
2e1ne chromatographie (QS II), sans EDTA
Une colonne K50 de 490 ml de gel neuf Q Sepharose Fast Flow est équilibrée en
tampon
Tris HCl 50 mM, Urée 2 M, Elugent 1 % pH 7,5.
La solution dialysée (1080 ml) est déposée sur la colonne (débit 6 ml/minute)
; puis 5
paliers d'élution salins dans ce même tampon sont réalisés: 20 mM, 50 mM, 100
mM,
250 mM et 1 M NaCI (débit de travail 6 ml/minute). La protéine rTbpB est éluée
de la
colonne à deux concentrations en sel (50 mM et 100 mM). La fraction d'élution
50 mM
est la fraction d'intérêt, la protéine rTbpB y étant la plus pure et en plus
importante
quantité (2,6 fois plus de protéine que dans la fraction 100 mM de NaCI)
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Le pH de la fraction correspondant au pic d'élution 50 mM NaCI est abaissé
sous
agitation magnétique à pH 5,5 par un ajout d'acide acétique 1,7 N. La solution
(860 ml)
est placée en dialyse contre 5 litres de tampon acétate de sodium 10 mM, Urée
1 M,
Elugent 0,2 %, pH 5,5 (24 hrs à +4 C) puis contre 4 litres de tampon acétate
de sodium
10 mM, Urée 1 M, Elugent 0,2 %, pH 5,5 (17 hrs à +4 C).
Purification par chromatographie échangeuse de cations sur SP Sepharose (SPI)
à pH
5,5
Une colonne K50 de 100 ml de gel neuf SP Sepharose Fast Flow (Ge Healthcare,
réf 17-
0729-01) est équilibrée en tampon acétate de sodium 10 mM, Urée 1 M, Elugent
0,2 %,
pH 5,5.
La solution de protéine dialysée (850 ml) est déposée sur la colonne (débit 6
ml/minute).
Puis, cinq paliers salins d'élution sont réalisés: 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500
mM et 1
M NaCI, en tampon cité ci-dessus.
La protéine rTbpB est éluée exclusivement dans la fraction 250 mM NaCI et les
contaminants de faible poids moléculaire sont éliminés essentiellement dans
l'éluât
direct (40 %). On obtient ainsi environ 35 mg de rTbpB M982 purifiée et un peu
moins
pour ce qui concerne la rTbpB B 16B6.
Dialyse et concentration du produit de SPI (fractions 250 mM)
Les fractions correspondant au pic d'élution 250 mM de la colonne SPI sont
rassemblés
(volume 274 ml). Le pH de la solution est remonté à pH 7,3 par ajout sous
agitation
d'environ 800 l de NaOH 0,5 N. La solution est placée en dialyse à +4 C
(Spectra Por
1 : seuil de coupure 6-8000 D) contre deux bains de 10 litres de PBS Elugent
0,2 % pH
7,1 (66 hrs et 22 hrs).
Le dialysat est concentré jusqu'à un volume de 21,1 ml par diafiltration
concentration
frontale sur membrane Amicon 30 kD en PBS (réf PBTK06510).
Puis le concentré obtenu est remis en dialyse contre 2 litres de PBS Elugent
0,2 % pH
7,1 (Slide A Lyser réf 66810: seuil de coupure 10 kD).
La solution est ensuite filtrée de façon aseptique sur filtre Millex 0,22 m
en Durapore
(réf Millipore SLGV 033RS). Le lot de protéine rTbpB purifiée obtenu est
congelé à -
80 C. La concentration en protéine est de 1642 gg/ml.
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1.3. Préparation de la rTbpB pour injection
La solution de rTbpB obtenue en section B.1.2. est traitée par adsorption sur
des Bio-
BeadsTM SM-2 pour éliminer l'excès du détergent ElugentTM (tensio-actif
constitué
d'alkyl glucosides) qui pourrait déstabiliser les liposomes LOS.
Activation des Bio BeadsTM
On ajoute environ 2.5 mL de méthanol à 500 mg de Bio-BeadsTM et on homogénéise
par
intermittence durant 15 min. à température ambiante. Après un temps de
décantation, le
surnageant est éliminé. Cette opération de lavage est renouvelée deux fois.
On ajoute alors environ 5 mL d'eau stérile ultrafiltrée et on homogénéise par
intermittence durant 15 min. à température ambiante. Après un temps de
décantation, le
surnageant est éliminé. Cette opération de lavage est renouvelée deux fois.
On ajoute alors environ 5 mL de PBS et on homogénéise par intermittence durant
15
min. à température ambiante. On conserve à 5 C et on utilise le jour même.
En final, le poids des Bio-BeadsTM s'est accru d'un facteur R (égal à environ
1.2).
Elimination du détergent par adsorption sur Bio BeadsTM
La solution de rTbpB obtenue à la section 1.2. contient 2 mg/mL d'ElugentTM.
La
quantité de Bio-BeadsTM devant être utilisée est déterminée en fonction de la
quantité
d'ElugentTM à éliminer.
Pour un mL de la solution de rTbpB obtenue à la section B. 1.2., on ajoute 29
X R mg de
Bio-BeadsTM activées. On agite vivement pendant une heure à température
ambiante.
Puis on récupère le maximum de liquide auquel on ajoute du merthiolate 0.001 %
final.
Le tout est réalisé en condition stérile.
2. Préparation du LOS purifié
Culture
Huit mL de congelât de la souche de N. meningitidis C708, sérogroupe A, lpt3
FL lpt6
TR igtA :: erm précédemment obtenue en A.4.6. ou de la souche Al de N.
meningitidis
sérogroupe A connue pour exprimer de manière exclusive du LOS d'immunotype L8
et
dont le LOS porte 2 PEAs, l'un en position 3, l'autre en position 6 de
l'heptose II,
servent à ensemencer 800 mL de milieu Mueller Hinton (Merck) supplémentés avec
4
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mL d'une solution de glucose à 500 g/L et répartis en erlens. La culture est
poursuivie
sous agitation à 36 + 1 C pendant environ 10 heures.
On ajoute à la pré-culture 400 mL d'une solution de glucose à 500 g/L et 800
mL d'une
solution d'acides aminés. Cette préparation sert à ensemencer un fermenteur
contenant
5 du milieu Mueller-Hinton, à une D0600mn proche de 0.05. La fermentation est
poursuivie
à 36 C, à pH 6.8, 100 rpin, P02 30 % sous un flux d'air initial de 0.75
L/min/L de
culture.
Après environ 7 hrs (DO60o.n d'environ 3), on ajoute du milieu Mueller-Hinton
à raison
de 440 g/hr. Quand la concentration en glucose est inférieure à 5 g/L la
fermentation est
10 arrêtée. La D0600 finale est couramment comprise entre 20 et 40. Les
cellules sont
récoltées par centrifugation et les culots congelés à -35 C.
Purification (méthode adaptée de Westphal & Jann, (1965) Meth. Carbohydr.
Chem. 5 :
83)
Les culots sont décongelés et suspendus avec 3 volumes de phénol 4.5 %
(vol./vol.) en
15 agitant vigoureusement pendant 4 hrs à environ 5 C. Le LOS est extrait par
traitement
au phénol.
La suspension bactérienne est chauffée à 65 C puis mélangée vol./vol. avec du
phénol à
90 % en agitant vigoureusement pendant 50-70 min à 65 C. La suspension est
ensuite
refroidie à température ambiante puis centrifugée pendant 20 min à 11 000 g.
La phase
20 aqueuse est prélevée et conservée tandis que la phase phénolique et
l'interphase sont
récoltées pour être soumises à une deuxième extraction.
La phase phénolique et l'interphase sont chauffées à 65 C puis mélangées à un
volume
d'eau équivalent à celui de la phase aqueuse précédemment prélevée en agitant
vigoureusement pendant 50-70 min à 65 C. La suspension est ensuite refroidie à
25 température ambiante puis centrifugée pendant 20 min à 11 000 g. La phase
aqueuse est
prélevée et conservée tandis que la phase phénolique et l'interphase sont
récoltées pour
être soumises à une troisième extraction identique à la seconde.
Les trois phases aqueuses sont dialysées séparément contre 40 L d'eau chacune.
Puis les
dialysats sont rassemblés ensemble. A 9 volumes de dialysat on ajoute un
volume de
30 Tris 20 mM, MgC12 2mM. Le pH est ajusté à 8.0 + 0.2 avec de la soude 4 N.
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Deux cent cinquante unités internationales de DNAse sont ajoutées par gramme
de culot.
Le pH est ajusté à 6.8 + 0.2. La préparation est placée à 37 C pendant environ
2 hrs sous
agitation magnétique ; puis soumise à une filtration sur membrane de 0.22 m.
Le filtrat
purifié par passage sur une colonne de Sephacryl S-300 (5.0 x 90 cm ;
PharmaciaTM).
Les fractions contenant le LOS sont rassemblées ensemble et la concentration
en MgCl2
est élevée à 0.5 M en rajoutant de la poudre de MgC12,6H20 sous agitation.
Tout en poursuivant l'agitation, on ajoute de l'alcool absolu déshydraté pour
une
concentration finale de 55 % (vol./vol.). L'agitation est poursuivie une nuit
à 5 + 2 C,
puis on centrifuge à 5,000 g pendant 30 min à 5 + 2 C. Les culots sont
resuspendus avec
au moins 100 mL de MgC12 0.5 M puis soumis à une deuxième précipitation
alcoolique
identique à la précédente. Les culots sont resuspendus avec au moins 100 mL de
MgC12
0.5 M.
La suspension est soumise à une filtration sur gel comme précédemment décrit.
Les
fractions contenant le LOS sont rassemblées ensemble et stérilisées par
filtration (0.8-
0.22 m) et conservées à 5 + 2 C.
Ce procédé de purification permet d'obtenir environ 150 mg de LOS par litre de
culture.
3. Préparation des liposomes [LOS] par dialyse de détergent
3.1. Préparation des liposomes
Les liposomes LOS sont préparés par dialyse de détergent. En bref, les lipides
(EDOPC :
DOPE) sont mis sous forme de film lipidique et repris en tampon Tris 10 mM,
puis
dispersés en présence de 100 mM d'octyl (3-D-glucopyranoside (OG) (Sigma-
Aldrich ref
08001) et filtrés stérilement. Le LOS en OG 100 mM est ajouté stérilement. Le
mélange
lipides/LOS/OG est ensuite dialysé contre du tampon Tris 10 mM pour éliminer
l'OG et
former les liposomes.
Protocole
On réalise une préparation lipidique en chloroforme des lipides que l'on va
utiliser pour
la fabrication des liposomes. Un film sec est obtenu par évaporation complète
du
chloroforme.
Un film sec de 1,2 dioleyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (EDOPC ou ethyl-
DOPC)
et de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) dans un rapport
molaire
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EDOPC : DOPE de 3 pour 2 est obtenu en mélangeant 12.633 mL d'une solution de
EDOPC (Avanti Polar Lipids ref 890704) à 20 mg/ml en chloroforme et 7.367 mL
d'une
solution de DOPE (Avanti Polar Lipids ref 850725) à 20 mg/ml en chloroforme et
en
évaporant le chloroforme jusqu'à disparition complète.
Le film sec est repris par 30 mL de tampon Tris 10 mM pH 7.0 pour obtenir une
suspension contenant 13.333 mg de lipides /ml (8.42 mg/ml d'EDOPC et 4.91
mg/ml de
DOPE). La suspension est agitée 1 hr à température ambiante puis soniquée 5
min dans
un bain.
Puis on ajoute toujours sous agitation, 3.333 ml d'une solution stérile
d'octyl (3-D-
glucopyranoside (OG) (Sigma-Aldrich ref 08001) 1 M en tampon Tris. 10 mM pH
7.0
pour obtenir une suspension limpide de lipides à 12 mg/ml, OG 100 mM, tampon
Tris
10 mM. On poursuit l'agitation 1 hr à température ambiante sur table
d'agitation. Puis
on filtre stérilement sur Millex HV 0.45 gin.
On prépare dans des conditions stériles, une composition en mettant en
présence du LOS
et des lipides dans un rapport molaire lipides : LOS de 250 (0.160 mg/mL de
LOS, 9.412
mg/mL de lipides et 100 mM d'OG). 40 mL d'une telle composition résulte du
mélange
des les préparations suivantes :
2.005 mL de tampon Tris 10 mM pH 7.0 ; 0.223 mL d'OG 100 mM en Tris 10 mM ;
31.373 mL de la suspension EDOPC : DOPE de ratio molaire 3: 2 à 12 mg/ml en OG
100 mM Tris 10 mM ; et 6.4 mL d'une suspension stérile de LOS à 1 mg/ml en OG
100
mM Tris 10 mM.
Après une heure d'agitation à température ambiante, la suspension est
transférée
stérilement dans 4 cassettes de dialyse stériles de 10 ml. Chaque cassette est
dialysée 3
fois (24 hrs - 24 hrs - 72 hrs) contre 200 volumes de Tris 10 mM pH 7.0 soit 2
L.
On récupère les liposomes dans des conditions stériles. L'augmentation de
volume après
dialyse est environ de 30 %.
A cette préparation, on ajoute du merthiolate et du NaCI pour obtenir une
préparation de
liposomes en Tris 10 mM, NaCI 150 mM, pH 7.0, Merthiolate 0.001 % qui contient
in
fine environ 110 g/ml de LOS et 7 mg/ml de lipides dont environ 4.5 mg/ml
d'EDOPC
et environ 2.5 mg/ml de DOPE (concentrations théoriques).
Les liposomes LOS sont conservés à +5 C.
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3.2. Préparation des injectables
Les liposomes sont ajustés à la concentration requise en LOS (notamment pour
les tests
d'immunogénicité) en Tris 10 mM NaCI 150 mM pH 7.4. La concentration en
merthiolate est maintenue à 0.001 %.
4. Préparation d'un mélange liposomes [LOS] + rTbpB
On mélange de la rTbpB en PBS (section B.1.3.) avec des liposomes [LOS]
(section
B.3.) dans un rapport poids : poids rTbpB : LOS égal à 1. Puis on ajuste en
tampon Tris
mM, NaC1 150 mM, pH 7.4 pour obtenir une préparation dans laquelle chacun des
composants (rTbpB et LOS) est concentré à 80 g/ml. La concentration en
merthiolate
10 est maintenue à 0.001 %.
5. Etude d'immunogénicité chez le lapin
Les différentes formulations testées ont été fabriquées comme décrit dans
l'une des
précédentes sections.
5.1. Immunisations des lapins
Vingt quatre lapines NZ KBL (Charles River Lab.) âgées de 7 semaines sont
réparties en
4 groupes test de quatre (groupes A à D) et en 4 groupes de deux (groupes E à
H).
Les lapines de chaque groupe reçoivent sous un volume de 0.5 ml reparti en 2
injections
intramusculaires concomitantes dans les pattes, à JO, J21 et J42 :
Groupe A : 40 gg de liposomes [LOS chaîne a L8, PEA-3, PEA-6] et 40 gg rTbpB
M982,
en tampon Tris 10 mM NaCl 150 mM pH 7.4;
Groupe B : 40 gg de liposomes [LOS chaîne a L8, PEA-3, PEA-6] et 40 gg rTbpB
B16B6, en tampon Tris 10 mM NaCI 150 mM pH 7.4 ;
Groupe C : 40 g de liposomes [LOS chaîne a L8, PEA-3] et 40 gg rTbpB M982,
en tampon Tris 10 mM NaCI 150 mM pH 7.4 ;
Groupe D : 40 gg de liposomes [LOS chaîne a L8, PEA-3, PEA-6]
en tampon Tris 10 mM NaCI 150 mM pH 7.4 ;
Groupe E : 40 g rTbpB M982 et 40 g de liposomes sans LOS
en tampon Tris 10 mM NaCI 150 mM, Tween 0.5 % pH 7.0 ;
Groupe F : 40 g rTbpB B 16B6 et 40 g de liposomes sans LOS
en tampon Tris 10 mM NaCl 150 mM, Tween 0.5 % pH 7.0 ;
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Groupe G : 40 g de liposomes [LOS chaîne a L8, PEA-3]
en tampon Tris 10 mM NaCI 150 mM pH 7.4 ;
Groupe H : Tampon Tris 10 mM NaCI 150 mM pH 7.4
Du sang des animaux est prélevé pour analyse à JO, J42 (avant la troisième
injection) et à
J56.
5.2. Mesure de l'activité bactéricide des IgGs purifiées à l'encontre de
souches
de N. ineningitidis hétérologues à la souche C708
A partir des pools de sérums, les IgGs ont été purifiées par chromatographie
d'affinité à
l'aide de la colonne HiTrap rProtein A FF (GE Healthcare / Amersham
Biosciences)
selon les recommandations du fournisseur.
A partir des IgGs purifiées, on réalise des dilutions sérielles de raison 2 en
PBS
Dulbecco's gélatiné contenant des ions calcium et magnésium. Les dilutions
sont
réalisées en plaque de 96 puits pour un volume final de 50 L par puits.
L'activité bactéricide des IgGs purifiées a été testée à l'encontre des
souches citées dans
le tableau II ci-après.
On réalise une culture des souches de N. meningitidis en milieu BHI
complémenté ou
non pendant 2 hrs 30 avec du Desféral 50 gM (agent chélateur du fer sous forme
libre,
qui permet l'expression de la TbpB).
Vingt cinq L de la culture en phase exponentielle (4.103 CFU/mL) ainsi que 25
gL de
complément de bébé lapin au 1/1,5 sont ajoutés dans chaque puits. La plaque
est incubée
une heure à 37 C, sous agitation.
Cinquante gL du mélange de chaque puits sont ensuite déposés sur des boîtes de
gélose
Mueller-Hinton bioMérieux et incubées une nuit à 37 C sous 10 % de C02. On
décompte le nombre de clones.
Les témoins sont au nombre de trois :
Bactéries + complément de bébé lapin, sans sérum à tester (témoin complément
) ;
Bactéries + complément de bébé lapin inactivé, sans sérum à tester (témoin
germes ) ;
et
Bactéries + complément de bébé lapin inactivé + sérum à tester (témoin sérum).
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On exprime le titre bactéricide comme étant l'inverse de la dilution donnant
50 % dé
mort bactérienne par comparaison avec le témoin complément .
5.3. Résultats et Discussion
Test de bactéricidie
5 34 souches de N. meningitidis ont été testées en bactéricidie croisée. Leurs
noms
apparaissent dans le tableau II ci-dessous.
L'activité bactéricide des IgGs purifiées est exprimée en fold increase .
Le fold
increase est le rapport titre bactéricide des IgGs purifiées du groupe
d'intérêt : titre
bactéricide du groupe contrôle négatif correspondant. Ainsi le taux de
séroconversion en
10 fold increase mesure l'accroissement du titre bactéricide. On considère
que l'activité
bactéricide est significative lorsque l'un facteur x 8 est observé entre le
groupe d'intérêt
et le groupe témoin négatif correspondant ( fold increase supérieur ou égal
à x 8).
Comme attendu, les IgGs purifiées issues du groupe d'immunisation contrôle
négatif ne
présentent d'activité bactéricide à l'encontre d'aucune des souches ( fold
increase
15 inférieur à x 4).
Les IgGs purifiées issues des groupes d'immunisation D et G (pas
d'adjuvantation du
LOS avec une TbpB) font preuve d'une bactéricidie croisée de moindre intérêt.
On ne
présente dans le tableau II ci-après, que les résultats de bactéricidie
exprimés en fold
increase obtenus avec les IgGs purifiées des groupes A, B, C, E et F.
20 Le tableau III présente les résultats de bactéricidie exprimés en fold
increase , des
IgGs purifiées issues du groupe A, vis-à-vis de 22 souches cultivées en
présence /
absence de Desféral.
Le tableau IV présente pour diverses compositions vaccinales, le pourcentage
de
protection déduit de l'étude de bactéricidie croisée incluant 34 souches
cultivées en
25 présence de Desféral.
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Tableau III
LOS en liposomes : L8 PEA-3, -6 +
TbpB lipidée M982
Groupe A
Souches incluses dans l'étude de bactéricidie Sans agent Avec agent
croisée, cultivées en présence (Desféral) / absence chélateur chélateur
d'agent chélateur
IT Isotype Complexe Nom
TbpB épidémio-
logique
II ST-32 BZ83 < x 4 x.32
II ST-41/44 LNP23015 < x 4 x 16
II ST-41/44 LNP22979 < x 4 x,32
II ST-41/44 BZ138 x 32 x'256'
II ST-41/44 95/46 <x4 x 16
II S3032 <x4 x4
II LNP22763 <x4 x4
II M982 x 64 x:512
L3 II NG144/82 x 4 'x 128
II H44/76 <x4 x4
II NGF26 <x4 x4
II 62 <x4 x8
L4- Il ST-8 BZ163 x 8' .x 16
like
L8 II 8680 x 128 x 256
II ST-41/44 RH873 x 64 X 256
L1 II ST-41/44 92/123 x 16 x 32
I ST-269 N 28 LO 05-2606 <x4 x 8
II ST-269 N 60 AA 07-1734 `x 64 x 128`
N.d. II EG327 <x4 <x4
L2 II BZ157 <x4 <x4
II BZ232 <x4 x 32
I B16B6 <x4 <x4
Tableau IV
Compositions vaccinales % de protection déduit des
études de bactéricidie croisée
incluant 34 souches cultivées
en présence de Desféral
L8 PEA 03, 06 + TbpB M982 55.9 %
L8 PEA 03 + TbpB M982 52.9 %
L8 PEA 03, 06 + TbpB B16B6 32%
L8 PEA 03, 06 + TbpB M982 + Tb B B 16B6 58.8 - 67.6 %
L8 PEA 03 + TbpB M982 + TbpB B 16B6 64.7%
