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COMPOSITION DE COMPLEXE PROTHROMBIQUE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de
préparation d'une composition ou concentré de complexe
prothrombique comprenant les facteurs de coagulation II,
VII, IX et X. L'invention fournit encore une composition
susceptible d'être obtenue par ce procédé.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La mise à disposition de concentrés de protéines
dépendantes de la vitamine K et, plus particulièrement,
de concentrés de complexe prothrombique comprenant les
Facteurs de coagulation II, VII, IX et X (également
appelé PPSB) est primordiale pour prévenir ou traiter les
accidents hémorragiques chez les patients hémophiles qui
souffrent d'un déficit en l'un ou plusieurs des facteurs
de la coagulation et/ou qui souffrent d'un déficit pour
certaines protéines de haut poids moléculaires.
Lors d'un épisode hémorragique, les patients sont soumis
à un traitement par le PPSB et reçoivent par conséquent
des doses importantes de protéines plasmatiques
usuellement co-purifiées avec le PPSB, qui peuvent
entraîner l'apparition d'effets secondaires tels que des
chocs anaphylactiques, des réactions de type
inflammatoire et des problèmes de tolérance. C'est
notamment le cas avec les Immunoglobulines M et les
facteurs C3a, C4a ou C5a, également appelés
anaphylatoxines, qui résultent de l'activation des
facteurs C3, C4, C5. Les facteurs C3a, C4a et C5a
(particulièrement le C3a) sont impliqués dans
l'inflammation allergique. L'activation des mastocytes et
des basophiles par les fragments C5a et C3a du complément
entraîne en effet la libération de leucotriènes et
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d'histamine, à l'origine d'une augmentation de la
perméabilité capillaire, d'une bronchoconstriction et
d'une vasodilatation.
Afin d'éviter la formation de ces fragments au cours
du procédé de purification des facteurs vitamine-K
dépendant, il est donc préférable d'éliminer leur
précurseurs respectifs à savoir les facteurs C3, C4 ou C5
du système du complément.
Les concentrés de PPSB disponibles commercialement à
ce jour, tels que le Kaskadil (du Laboratoire Français
du Fractionnement et des Biotechnologies) comprennent
tous une proportion importante (environ 80%) de protéines
contaminantes autres que les Facteurs II, VII, IX et X
composant le PPSB. La protéine vitamine-K-dépendant dont
la concentration est la plus importante est la
prothrombine ou facteur II (avec une concentration de
l'ordre de 4,5 mg/ml pour une concentration de protéines
totales dans le Kaskadil d'environ 35-45 mg/ml).
Il existe par conséquent un besoin important pour un
procédé autorisant un plus haut degré de purification du
PPSB, et susceptible de préserver l'activité et la
proportion respective des Facteurs II, VII, IX et X qui
le composent.
Le document EP-A-0528701 (Association pour l'essor
de la transfusion sanguine) décrit un procédé de
préparation de thrombine humaine destiné à un usage
thérapeutique et comprenant des étapes successives de
purification d'un surnageant de cryoprécipité de plasma
sur une résine DEAE-Sephadex A50, de recalcification et
d'inactivation virale de l'éluat contenant le PPSB.
Le document US-P-4411794 décrit un procédé de
purification des facteurs de coagulation II, VII, IX et X
comprenant une étape d'adsorption d'un surnageant de
précipitation du plasma avec du sulfate d'ammonium sur un
support minéral de type hydroxyapatite en présence d'ions
calcium, suivie d'une étape de purification sur silice
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colloïdale et d'une dialyse. Il apparaît toutefois que le
concentré de PPSB qui en résulte comprend de nombreuses
protéines contaminantes et ne possède pas le degré de
pureté requis pour répondre aux critères actuels en
matière de sécurité sanitaire des produits dérivés du
sang. Le sulfate d'amonium n'est en particulier pas
adapté à une utilisation thérapeutique et présente une
toxicité relative.
Le document US-P-4272523 décrit un procédé de
fractionnement du plasma à partir d'un surnageant de
cryoprécipité de plasma. Ce brevet décrit notamment la
préparation d'un concentré de PPSB en cumulant les étapes
d'adsorption du surnageant de cryoprécipité sur silice
colloïdale, de dialyse/ultrafiltration, d'adsorption sur
phosphate tricalcique de type hydroxyapatite, et
d'adsorption sur résine échangeuse d'anions de type DEAE-
Sephadex. Il apparaît toutefois que l'étape de
purification sur silice colloïdale utilisée pour éliminer
les protéines de haut poids moléculaire telles que le
fibrinogène et que l'étape de purification sur phosphate
tricalcique se déroulent sous la forme d'une adsorption
par lot (en batch) , une forme de mise en oeuvre qui, par
sa faible reproductibilité et sa difficulté
d'automatisation, se révèle difficile à mettre en oeuvre à
une échelle industrielle. En effet le phosphate
tricalcique est difficilement maîtrisable car il se
présente sous forme de poudre sensible à l'hygrométrie et
dont les caractéristiques intrinsèques peuvent varier en
fonction des lots. Le procédé du document US-P-4272523
s'avère donc inadapté pour la préparation à grande
échelle de concentrés de PPSB destinés à un usage
thérapeutique.
Le document EP-A-0832200 décrit un procédé de
purification d'une composition de FXI recombinant,
comprenant les étapes successives de chromatographie sur
résine échangeuse d'anions, sur résine héparine puis sur
résine hydroxyapatite. Ce document n'a pas trait à un
facteur du complexe prothrombique et le produit de départ
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est une composition d'un facteur recombinant et non
d'origine humaine.
Le document W02006/075664 décrit un procédé de
purification de FVII recombinant comprenant une étape de
chromatographie sur hydroxyapatite, sans traitement
préalable de la composition contenant le FVII
recombinant.
RESUME DE L'INVENTION
Le demandeur a trouvé de manière surprenante qu'un
procédé de purification d'un concentré de protéines
dépendantes de la vitamine K, notamment complexe
prothrombique, combinant les étapes de préparation d'un
surnageant de cryoprécipité de plasma, de chromatographie
sur résine échangeuse d'anions et de chromatographie sur
hydroxyapatite permet de préparer, de manière
industrielle, un concentré de PPSB présentant un haut
degré de pureté. Le PPSB préparé par l'invention est
sensiblement dépourvu de protéines contaminantes et les
facteurs II, VII, IX et X qu'il contient présentent une
activité spécifique élevée. Le procédé de l'invention se
distingue tout particulièrement des procédés de
purification connus à ce jour par le nombre réduit et la
reproductibilité des étapes de purification mises en
oeuvre, et par l'utilisation d'hydroxyapatite pour
chromatographier un éluat contenant des protéines de haut
poids moléculaire telles que fibrinogène, fibronectine,
immunoglobulines, protéines du complément.
La présente invention a pour objet un procédé de
préparation d'une composition de complexe prothrombique
comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un surnageant d'un cryoprécipité de
plasma,
b) appliquer ledit surnageant sur une résine
échangeuse d'anions, et éluer en un éluat contenant ledit
complexe et des protéines de haut poids moléculaire,
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c) appliquer l'éluat résultant de l'étape b) sur une
colonne d'hydroxyapatite,
d) éluer en un éluant contenant ledit complexe.
5 Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de
l'invention comprend une étape additionnelle de
préélution cl), ladite préélution étant de préférence
effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de préférence
environ 8,avec un tampon phosphate de sodium ou phosphate
de potassium, notamment en une concentration de 0,005 à
0,05M, avantageusement de 0,01 à 0,05M, avantageusement
de 0,02 à 0,05M, et de manière préférée 0,03M, ledit
tampon comprenant également du NaCl 0,25 M.
Plus préférablement, l'élution de l'étape d) est
réalisée avec un tampon phosphate de potassium de
préférence 0,5 M, NaCl 0,075 M, pH 8.
Avantageusement, le procédé de l'invention comprend
au moins une étape additionnelle d'inactivation virale de
l'éluat résultant de l'étape b) et/ou de l'éluat
résultant de l'étape d). Dans un mode de réalisation
préféré, ladite au moins une étape d'inactivation virale
est effectuée sur l'éluat résultant de l'étape b) sous la
forme d'un traitement solvant-détergent, de préférence en
présence d'un mélange Tween(polysorbate 80)-TnBP, de
préférence par un mélange polysorbate 80 1%(v/v) - TnBP
0,3% (v/v). Dans un mode de réalisation particulier,
ladite au moins une étape d'inactivation virale est
effectuée sous la forme d'un traitement UV-C (Ultra
Violet C), traitement avec des ions caprylate et/ou par
chauffage à sec. Avantageusement, ladite au moins une
étape d'inactivation virale est complétée par une étape
d'élimination virale effectuée sur l'éluat résultant de
l'étape d) sous la forme d'une nanofiltration, par
exemple une ou plusieurs nanofiltrations sur un ou
plusieurs filtre(s) de porosité comprise par exemple
entre 15nm et 100nm. De préférence sur au moins un filtre
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de porosité par exemple de 15nm, notamment sur un filtre
Planova 15N de Asahi.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé
de l'invention comprend au moins une étape additionnelle
de diafiltration-ultrafiltration après l'étape b) et/ou
après l'étape d) .
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape b)
du procédé de l'invention comprend 2 sous-étapes mises en
oeuvre sur deux résines échangeuses d'anions distinctes.
Dans un mode de réalisation particulier, la résine
échangeuse d'anions de l'étape b) possède un groupe
chargé positivement choisi parmi le diéthylaminoéthane
(DEAE), la polyéthylèneimine (PEI) et l'aminoéthane
quaternaire (QAE), ladite résine échangeuse d'anions
étant de préférence du type DEAE.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé
de l'invention comprend l'addition d'un inhibiteur de la
thrombine, de préférence l'antithrombine III ou d'un
mélange d'antithrombine III et d'héparine après l'étape
b) ou après l'étape d).
Dans un mode de réalisation, la composition préparée
par le procédé de l'invention comprend en outre d'autres
protéines dépendantes de la vitamine K tel que les
protéines C, S et Z.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé
selon l'invention comprend une étape additionnelle finale
de formulation, de préférence par lyophilisation et/ou
addition d'adjuvants ou de véhicules pharmaceutiquement
acceptables.
La présente invention concerne également une
composition de complexe prothrombique susceptible d'être
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obtenue par le procédé selon l'invention, et dont la
concentration en Immunoglobulines, et de préférence en
IgM, est inférieure à 0,1 %, et/ou dont la concentration
en fibrinogène est inférieure à 0,1 %, et/ou dont la
concentration en fibronectine est inférieure à 0,1 %
et/ou dont la concentration en facteurs du complément est
inférieure à 0,1 %.
Dans un mode de réalisation particulier, l'activité
spécifique moyenne du FIX dans la composition de complexe
prothrombique selon l'invention est d'au moins 4 UI par
mg de protéines.
Dans un mode de réalisation particulier, la
composition de complexe prothrombique selon l'invention
comprend en outre la protéine C, la protéine S et la
protéine Z.
Dans un mode de réalisation particulier, les
protéines dépendantes de la vitamine K, constituées par
le Facteur II (FII), le Facteur VII (FVII), le Facteur IX
(FIX), le Facteur X (FX), la protéine C, la protéine S et
la protéine Z de la composition de complexe prothrombique
selon l'invention représentent au minimum 80 %, de
préférence 85%, et plus préférablement 90%, des protéines
totales de la composition.
La présente invention concerne également
l'utilisation de la composition de complexe prothrombique
selon l'invention comme médicament, préférablement comme
médicament pour le traitement et la prévention
d'accidents hémorragiques liés au déficit en facteurs
dépendants de la vitamine K, ou au surdosage en
antivitamine K, ou comme médicament pour le traitement et
la prévention d'accidents hémorragiques liés à un déficit
constitutionnel ou acquis en facteur II ou en facteur X.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
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Figure 1 : Rendements d'élution en facteurs II, IX,
VII et X en fonction de la charge protéique déposée sur
la colonne d'hydroxyapatite.
Figure 2 : Quantité de facteurs II, IX, VII et X non
retenus sur colonne d'hydroxyapatite en fonction de la
charge protéique introduite.
Figure 3 : Variation du pourcentage de FII et de FIX
non fixé en fonction de la charge protéique déposée sur
colonne d'hydroxyapatite.
Figure 4 : Gel SDS-PAGE correspondant aux quantités
de protéines éliminées au cours de la préélution lors de
la chromatographie sur hydroxyapatite. gel SDS PAGE 12 %
- Non réduit - dépôts : 10 pg de protéines, correspondant
aux Prééluats et éluats de la chromatographie sur HA
Biorad. Puits 1 et 10 : Standards de poids moléculaires.
Puits 2 : PI-1. Puits 3 : Essai 3 prééluat 0,25 M NaCl.
Puits 4 : Essai 3 éluat. Puits 5 : Essai 5 prééluat 0,25
M NaCl ; 30 mM phosphate. Puits 6 : Essai 5 éluat. Puits
7 : PI-1. Puits 8 : Essai 6 prééluat 0,25 M NaCl ; 30 mM
phosphate. Puits 9 : Essai 6 éluat.
Figure 5: Evolution de la pression de filtration en
fonction du temps.
Figure 6 : Evolution du débit de filtration en
fonction du poids filtré.
Figure 7 : Electrophorèse SDS Page Novex 4 - 12 %
sans réducteur - coloration bleu coomassie colloïdal.
Puits 1 : 97 E 0801 - PI-1. Puits 2 : 97 E 0801 - Non
Adsorbé HA Céramique. Puits 3 : 97 E 0801 - Pré élution.
Puits 4 : 97 E 0801 - élution. Puits 5 : 97 E 0801 -
élution dialysée 10 kDa. Puits 6 : 97 E 0901 - Après
filtration 15 nm. Puits 7 : 97 E 1401 - Après filtration
15 nm. Puits 8 : 97 E 1601 - Après filtration 15 nm.
Puits 9 : 97 E 1601 - Retentât final 15 nm. Puits 10
Témoin de poids moléculaires Novex.
Figure 8 : Caractérisation du facteur IX par
immunoblot. Puits 1 : 97 E 1106 - Eluat HA dialysé avant
nanofiltration. Puits 2 et 3 : 97 E 1106 - PI-1. Puits
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4 : 97 E 1504 - Filtrat 15 nm. Puits 5 : Témoin Facteur
IX HP. Le Facteur IX HP est un Facteur IX de haute
pureté , c'est-à-dire un concentré de Facteur IX ayant
une activité spécifique (exprimée en unité de FIX par mg
de protéines) supérieure à 100 U/mg.
DESCRIPTION DETAILLEE DE MODES DE REALISATION
Le procédé de purification de protéines dépendantes
de la vitamine K et notamment de complexe prothrombique
de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) fournir un surnageant d'un cryoprécipité de
plasma. Dans un mode de réalisation particulier, le
surnageant de cryprécipité de plasma peut être obtenu par
fractionnement de Cohn. Dans ce cas particulier, il
s'avère nécessaire d'éviter la dénaturation des protéines
par l'éthanol et donc de travailler à basse température
ou d'éliminer l'alcool avant de procéder à l'adsorption
des protéines sur hydroxyapatite. Dans un autre mode de
réalisation, le surnageant de cryprécipité de plasma peut
être obtenu par fractionnement avec un sel ammonium
sulfate. Dans ce cas particulier, il s'avère nécessaire
d'opérer une dialyse afin de se trouver dans des
conditions optimales d'adsorption sur hydroxyapatite.
b) appliquer ledit surnageant sur une résine
échangeuse d'anions, et éluer en un éluat contenant ledit
complexe et des protéines de haut poids moléculaire,
c) appliquer l'éluat résultant de l'étape b) sur une
colonne d'hydroxyapatite,
d) éluer en un éluant contenant ledit complexe.
Les protéines de haut poids moléculaires sont celles
ayant un PM exprimé en kDa supérieur à 300, de préférence
supérieur à 200, notamment supérieur à 160, voire
supérieure à 100.
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La résine hydroxyapatite utilisée dans l'invention
peut être par exemple ceramic-Hydroxyapatite (ceramic
HA), Biogel HT, etc.
5 Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de
l'invention comprend une étape additionnelle de
préélution cl), ladite préélution étant de préférence
effectuée à température ambiante avec un tampon phosphate
de potassium 0,01 M, NaCl 0,25 M, pH 8,0 ou un tampon
10 phosphate de potassium 0,03 M, NaCl 0,25 M, pH 8,0. La
concentration en phosphate de potassium du tampon de
préélution varie de préférence de 0.02 à 0.05M, et est
préférentiellement égale à 0.03M. Le pH du tampon de
préélution varie de préférence de pH 6,5 à pH 8,5, et est
préférentiellement égal à pH 8.
De manière préférentielle, l'élution de l'étape d)
est réalisée avec un tampon phosphate de potassium 0,5 M,
NaCl 0,075 M, pH 8. Le pH du tampon d'élution varie de
préférence de pH 6,5 à pH 8,5, et est préférentiellement
égal à pH 8. La concentration en phosphate de potassium
du tampon d'élution varie de préférence de 0,1 M à 0,5 M
et est préférentiellement égale à 0,25 M.
La chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite et,
de préférence sur hydroxyapatite céramique (HA-Biorad),
permet d'éliminer les protéines de haut poids moléculaire
qui sont éluées avec les protéines dépendantes de la
vitamine K (notamment le complexe prothrombique) lors de
l'étape b) de chromatographie sur résine échangeuse
d'anions. L'élimination de ces protéines de haut poids
moléculaire permet de réduire, ou de préférence
d'éliminer les effets secondaires qui résultent
généralement de l'utilisation thérapeutique d'une
solution de complexe prothrombique. En effet, les
protéines contaminantes de haut poids moléculaire qui
sont éliminées lors de la chromatographie sur
hydroxyapatite comprennent par exemple certains facteurs
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du complément (tel le C4) qui réduisent, de manière
directe ou indirecte (par exemple après clivage sous la
forme d'anaphylatoxines), la tolérance du patient aux
solutions de complexe prothrombique distribuées
commercialement à ce jour. Le demandeur a trouvé de
manière surprenante que la seule étape de chromatographie
sur hydroxyapatite permet d'éliminer la plupart des
protéines contaminantes de haut poids moléculaire
contenues dans le surnageant de cryoprécipité de plasma
sans nécessiter la mise en oeuvre préalable telle qu'une
purification sur silice colloïdale, par exemple. On
élimine aussi les protéines telles que fibrinogène,
fibronectine, Ig.
La chromatographie sur hydroxyapatite permet en
outre de ne pas modifier la proportion respective des
facteurs dépendants de la vitamine K lors de leur
purification, puisque le rapport entre les facteurs II,
VII, IX ou X dans le concentré de complexe prothrombique
obtenu par le procédé de l'invention est extrêmement
comparable à celui rencontré dans le plasma natif.
Il en résulte que la composition de complexe
prothrombique (concentré de protéines dépendantes de la
vitamine K) résultant de la chromatographie sur
hydroxyapatite est significativement enrichi. La teneur,
par rapport à la teneur en protéines, de cette
composition ou concentré en protéines du complexe
prothrombique est d'environ 60%, de préférence d'environ
70%, et plus préférablement d'environ 80%, et l'activité
spécifique des facteurs II, VII, IX X est
significativement accrue par rapport aux concentrés
prothrombiques distribués commercialement (de 4 à 8 fois
supérieure, de préférence 5 fois supérieure), comme par
exemple le Kaskadil .
Par ailleurs, l'élimination des protéines de haut
poids moléculaire lors de la chomatographie sur
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hydroxyapatite constitue un avantage industriel en ce
qu'elle permet désormais d'inactiver viralement le
concentré de protéines dépendantes de la vitamine K par
nanofiltration sur des filtres de porosité de l'ordre de
15 nm. Les filtres seraient sinon rapidement colmatés par
la présence de telles protéines de haut poids moléculaire
dans la solution à filtrer. Enfin, lorsqu'une
inactivation virale par traitement solvant-détergent est
réalisée entre la chromatographie sur la résine
échangeuse d'anions de l'étape b) et la chromatographie
sur hydroxyapatite de l'étape d), la purification sur
hydroxyapatite permet d'éliminer sensiblement
l'intégralité du solvant et du détergent présents dans le
concentré protéique chargé sur l'hydroxyapatite.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de
l'invention comprend au moins une étape additionnelle
d'inactivation virale de l'éluat résultant de l'étape b)
et/ou de l'éluat résultant de l'étape d) . De manière
préférentielle, l'étape d'inactivation virale effectuée
sur l'éluat résultant de l'étape b) correspond à un
traitement solvant-détergent, de préférence en présence
d'un mélange Tween (polysorbate 80)-TnBP, de préférence
par un mélange polysorbate 80 1% (v/v) - TnBP 0, 3% (v/v) .
Dans un mode de réalisation particulier, ladite au moins
une étape d'inactivation virale est effectuée sous la
forme d'un traitement UV-C (Ultra Violet C), traitement
avec des ions caprylate et/ou par chauffage à sec. De
manière préférentielle, le procédé de l'invention peut
comprendre une seconde étape d'élimination virale
effectuée sur l'éluat résultant de l'étape d) et
correspondant à au moins une nanofiltration, de
préférence au moins sur un filtre de porosité 15nm, de
préférence sur un filtre Planova 15N (Asahi).
On peut ainsi éliminer les virus à enveloppe et ceux
sans enveloppe.
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Le procédé de l'invention peut donc comprendre au
moins une étape d'inactivation virale visant à sécuriser
d'un point de vue virologique le produit final qui est
destiné à une administration thérapeutique.
Une première étape d'inactivation virale par
traitement avec un mélange solvant-détergent et
permettant d'inactiver les virus enveloppés peut être
mise en oeuvre à tout stade du procédé et, de préférence
après la purification sur résine échangeuse d'anions. Le
mélange solvant-détergent utilisé peut correspondre à
tout mélange approprié connu de l'homme du métier et se
compose de manière préférentielle comme indiqué supra. Le
traitement d'inactivation virale par solvant-détergent
est généralement mis en oeuvre pendant une durée de
quelques heures (par exemple 7 heures), à une température
sensiblement ambiante (par exemple de 25 1 C).
Par ailleurs, le procédé de l'invention peut
également comprendre au moins une étape d'élimination
virale par nanofiltration sur au moins un filtre de
faible porosité, par exemple sur au moins un filtre de
porosité comprise entre 15nm et 100nm. Une telle étape de
nanofiltration permet plus particulièrement de sécuriser
le produit final vis-à-vis des virus non-enveloppés
(virus de type poliovirus ou parvovirus) et des agents
transmissibles non conventionnels (type prion). Dans le
cadre du procédé de l'invention, la nanofiltration est
réalisée sur au moins un filtre ayant une porosité de
15nm, et de préférence sur au moins un filtre Planova 15N
(Asahi). Dans un mode de réalisation particulier, la
nanofiltration est réalisée sur au moins deux filtres
ayant une porosité différente, de préférence une porosité
décroissante. Cette nanofiltration est de préférence
effectuée après la chromatographie sur hydroxyapatite
dans la mesure où la présence de concentrations
importantes de protéines de haut poids moléculaires (par
exemple le fibrinogène, la fibronectine, ou les IgM) dans
l'extrait protéique à filtrer conduit généralement au
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colmatage du filtre, a fortiori lorsque le procédé est
mis en oeuvre à une échelle industrielle.
Le concentré de PPSB résultant du procédé comprenant
les 2 étapes d'inactivation virale susmentionnées se
révèle conforme aux recommandations internationales
émises par l'EMEA ou la FDA en ce qui concerne les
produits plasmatiques et biotechnologiques, dans la
mesure où il satisfait à la fois aux conditions de
sécurité requises pour les virus non enveloppés et pour
les virus nus.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de
l'invention comprend au moins une étape additionnelle de
diafiltration-ultrafiltration après l'étape b) et/ou
après l'étape d).
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de
l'invention comprend deux sous-étapes de chromatographie
sur résine échangeurs d'anions. Il y a alors une étape
additionnelle b2) consistant à appliquer l'éluat de
l'étape b) sur une seconde résine échangeuse d'anions et
à éluer le concentré de protéines dépendantes de la
vitamine K comprenant des protéines de haut poids
moléculaire. De manière préférentielle, la seconde résine
échangeuse d'anions est une résine de type DEAE-
Sepharose, et de préférence la DEAE-Sepharose FF
(Amersham). Une résine DEAE-Sépharose présente l'avantage
de résister à la pression ainsi qu'au traitement à la
soude usuellement utilisé pour sanitiser et régénérer le
gel.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de
l'invention comprend une étape additionnelle finale de
formulation, de préférence par lyophilisation et/ou
addition d'adjuvants ou de véhicules pharmaceutiquement
acceptables. Dans un mode de réalisation, le produit
obtenu après formulation comprend du NaCl 0,13 M, de
l'arginine 2g/l, de la lysine 2g/l, du citrate de sodium
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3 g/l, et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de
réalisation, le produit obtenu après formulation comprend
de l'arginine 10g/l, du mannitol 35g/l, et a un pH de 6,9
à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le produit
5 obtenu après formulation comprend du mannitol 45g/1 et a
un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le
produit obtenu après formulation comprend du citrate de
sodium 1 g/l, du mannitol 35g/1, et a un pH de 6,9 à 7,1.
10 Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de
l'invention comprenant une étape d'addition d'un
inhibiteur de la thrombine, de préférence l'antithrombine
III ou un mélange d'antithrombine III et d'héparine.
L'antithrombine peut être d'origine plasmatique humaine
15 ou d'origine humaine recombinante, comme par exemple
l'Atryn(D, distribuée commercialement par GTC
Biotherapeutics. Cette addition peut être effectuée après
l'étape b) et/ou après l'étape d). De manière préférée,
l'addition de l'inhibiteur de la thrombine est effectuée
après le traitement solvant-détergent de l'éluat
résultant de l'étape b), ou avant nanofiltration de
l'éluat résultant de l'étape d). Le cofacteur II de
l'héparine peut également être utilisé en tant
qu'inhibiteur de la thrombine, dans l e s mêmes
concentrations que celles proposées pour l'antithrombine.
L'addition d'un inhibiteur de la thrombine permet
avantageusement d'empêcher ou de limiter l'activation de
la prothrombine (FII) en thrombine lors des étapes de
purification mises en oeuvre lors du procédé de
l'invention. L'absence d'activité thrombique dans le
concentré de protéines dépendantes de la vitamine K
obtenu par le procédé de l'invention le rend compatible
avec une utilisation en tant que médicament thérapeutique
ou prophylactique chez l'homme et permet une conservation
satisfaisante de ce concentré.
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De manière préférée, la résine échangeuse d'anions
de l'étape b) du procédé de l'invention possède un groupe
chargé positivement choisi parmi le diéthylaminoéthane
(DEAE), la polyéthylèneimine (PEI) et l'aminoéthane
quaternaire (QAE). Cette résine échangeuse d'anions est
plus préférablement la DEAE-Sephadex A-50(D distribuée par
GE Healthcare. La chromatographie de l'étape b) permet
d'éliminer une partie (qui peut être importante) des
protéines constituées par l'albumine, les
immunoglobulines (à l'exception, dans une certaine
mesure, de certaines Ig comme l'IgM), de l'antithrombine
III, et de l'alpha-antitrypsine. La récupération des
protéines plasmatiques adsorbées sur la résine échangeuse
d'anions s'opère par augmentation graduelle de la force
ionique.
Dans un mode de réalisation particulier, les
protéines vitamine K dépendants obtenus suite à l'étape
d) peuvent ensuite être purifiés indépendamment par des
techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple
sur un gel d'affinité.
La présente invention porte également sur le
concentré de facteur prothrombique (protéines dépendantes
de la vitamine K susceptible d'être obtenu par le procédé
décrit ci-dessus. Ce concentré de protéines comprend
préférentiellement les facteur II, VII, IX et X, et
possède une concentration en IgM inférieure à 0,1%
(pourcentage rapporté au taux protéines total du
concentré), une concentration en fibrinogène inférieure à
0,1% (pourcentage rapporté au taux protéines total du
concentré), une concentration en fibronectine inférieure
à 0,1% et une concentration en facteurs du complément
inférieure à 0,1%. De préférence, le concentré de
l'invention comprend également les protéines C, S et Z,
et possède une activité spécifique moyenne du FIX d'au
moins 4 UI par mg de protéines.
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La présente invention concerne enfin sur
l'utilisation du concentré de facteur prothrombique
susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention
comme médicament, et plus particulièrement comme
médicament pour le traitement et la prévention
d'accidents hémorragiques liés au déficit en facteurs
dépendants de la vitamine K, tel qu'un déficit
constitutionnel en facteur II ou en facteur X, ou au
surdosage en antivitamine K.
Le procédé de la présente invention est illustré de
manière plus détaillée par les exemples qui suivent. Ces
exemples décrivent des modes de réalisation spécifiques
de la présente invention et ne sauraient être considérés
comme restreignant la portée de cette dernière.
EXEMPLES
Exemple 1 : Conditions expérimentales mises en oeuvre
pour la purification du concentré de protéines
dépendantes de la vitamine K
A - Préparation du Surnageant de cryoprécipité de
plasma.
On utilise comme matière de départ un surnageant de
cryoprécipité de plasma que l'on obtient par congélation-
décongélation et centrifugation à 0-3 C de plasma frais
congelé.
La cryoprécipitation est réalisée en amont du
fractionnement plasmatique, à une température inférieure
à 2 C, afin de séparer le cryoprécipité insoluble à une
température inférieure à 4 , principalement composé de
Facteur VIII, de fibronectine et de fibrinogène.
Le cryoprécipité est séparé du surnageant par
centrifugation en continu à une température voisine de
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+4 C. Le surnageant de centrifugation est appelé
cryosurnageant.
Le cryosurnageant contient essentiellement
l'albumine, les immunoglobulines ainsi que les autres
facteurs de coagulation dont les facteurs Vitamine-K
Dépendant, composés de la Prothrombine (Facteur II), du
Facteur VII, du Facteur IX, du Facteur X, de la Protéine
C, de la Protéine S et de la Protéine Z.
B - Chromatographie sur résine échangeuse d'anions
L'étape suivante consiste à préparer une fraction
enrichie en facteur vitamine K-dépendant après adsorption
sur un gel d'échange d'anions faibles, le DEAE Sephadex
A- 50 (diéthylamino-éthyl Sephadex).
Le cryosurnageant est réchauffé à une température
minimale de +10 C (optimalement de +16 à 18 C). Ce
cryosurnageant peut, le cas échéant subir des filtrations
clarifiante sur filtres de 1 }gym puis de 0,5 }gym avant sa
purification sur le gel de DEAE-Sephadex.
Le volume de cryosurnageant purifié est
classiquement de 2000 à 3000 litres. Environ 1,5 g de
DEAE-Sephadex sec sont utilisés par litre de
cryosurnageant purifié.
Préalablement à la purification, la poudre de DEAE-
Sephadex est gonflée (3 lavages), avec tamisages du gel
sur toile inox après chaque lavage. La préparation, le
gonflement et l'équilibrage de la DEAE-Sephadex sont
réalisés dans une solution de chlorure de sodium 0,075 M
dans un container doté d'une pale d'agitation et d'une
grille de fond de cuve (tamis) pouvant laisser échapper
le liquide mais retenant les billes de DEAE-Sephadex.
L'opération de gonflement du DEAE-Sephadex est réalisée à
température ambiante (15 - 25 C).
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L'équilibrage final du gel est contrôlé par la
mesure de l'osmolarité de l'effluent.
Le cryosurnageant à une température préférentielle
de 17+/-1 C, est envoyé en continu sur la DEAE-Sephadex
gonflée et équilibrée, à un débit de 400 kg par heure
après équilibrage des débits d'alimentation.
La totalité du cryosurnageant est ainsi mise en
contact avec la DEAE-Sephadex sous agitation continuelle,
permettant la fixation en continu des facteurs dépendants
de la vitamine-K sur le gel.
Le gel est ensuite lavé trois fois avec un tampon
contenant 0,2M de NaCl, 10 mM d'acide citrique, à pH 7, à
raison de 140 1 de tampon pour 2200 litres de
cryosurnageant purifié.
L'élution des protéines dépendantes de la vitamine-K
(et des protéines de haut poids moléculaire qui sont co-
purifiées avec elles) est réalisée à l'aide d'un tampon
NaCl 2M, acide citrique 10 mM, à pH 7, à raison de 75
litres de tampon pour 2200 litres de cryosurnageant
purifié.
La fraction protéique obtenue lors de l'élution est
ensuite dessalée par des moyens classiques, c'est-à-dire
par ultrafiltration à l'aide de cassettes ayant un seuil
de coupure de 10 kilodaltons et éventuellement 30
kilodaltons et dialyse contre un tampon NaCl 0,15M, acide
citrique 10 mM, à pH7.
L'éluat protéique résultant de la purification sur
DEAE-Sephadex sera nommé PPSB Produit Intermédiaire 1
ou PPSB-PI-1 dans le cadre de la présente demande.
A ce stade du procédé de purification, il s'avère
possible de congeler le PPSB-PI-1 dans l'attente de la
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mise en oeuvre des autres étapes de purification l'éluat
résultant de la DEAE-Sephadex à ce stade.
C - Inactivation virale par traitement
5 Solvant/Détergent
Le PPSB-PI-1 est ensuite soumis à une inactivation
virale par traitement avec un mélange solvant-détergent,
et plus spécifiquement par un traitement avec du
10 polysorbate 80 (1% v/v) - Tri n-Butyl Phosphate (TnBP)
(0,3% v/v). Le traitement d'inactivation virale est
effectué pendant une durée d'au moins 6 heures à une
température de 24 à 25 C.
15 D'autres détergents peuvent être utilisés en tant
qu'alternative au polysorbate, tels que le cholate ou
l'octoxynol (Triton X100) à des concentrations allant de
0,5 à 2 %, en présence de TNBP, à une température de 15 à
C mais préférentiellement autour de 25 C. La durée
20 minimale d'incubation pour l'inactivation virale est de 4
heures mais cette incubation peut s'étendre jusqu'à 12
heures. Les pH généralement appliqués vont de 6 à 8 et la
concentration en protéines totales de 10 à 40 g/l.
25 D - Chromatographie sur Hydroxyapatite HA
D.1 - Package du gel
Le gel de chromatographie utilisé est le Macro prep
-
céramic hydroxyapatite hydroxyapatite (Biorad), possédant une
30 granulométrie de 40 microns. Le gel sec est mis en
suspension dans un tampon phosphate 0,4 M pH 6,8, puis
transféré dans une colonne Pharmacia K50/30.Le package
est effectué à un débit de 100 cm/h. La quantité utilisée
est de 30 g de gel sec, ce qui fourni une colonne de 50
ml de gel packé. La colonne est rincée par 5 volumes de
colonne de NaOH 2 M et stockée dans NaOH 2 M.
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D.2 - Préparation du PPSB-PI-1 à injecter sur la
colonne
Le PPSB-PI-1 est, le cas échéant, décongelé et
viralement inactivé pendant 3 heures en présence de
polysorbate 80 1% et de TnBP 0,3%. Le PPSB-PI-1
viralement inactivé est ensuite dilué au demi, de manière
optionnelle avec une solution de benzamidine 20 mM; et le
pH de la solution est ajusté à 8 avec du NaOH 0,1M.
D.3 - Chromatographie:
La colonne est reliée à un détecteur U.V Pharmacia
muni d'une cellule de détection industrielle, et la
densité optique de l'effluent est enregistrée à 280 nm.
Le gel stocké en NaOH 2M est lavé par 5 volumes de tampon
de prééquilibrage (phosphate de potassium 0,4 M; pH 6,8).
La colonne est ensuite équilibrée par 15 volumes de
tampon d'équilibrage (phosphate de potassium 0,01M; NaCl
0,075 M; benzamidine 10 mM (optionnel); pH 8) . Puis la
solution de PPSB est injectée à un débit de 100 cm/h et
la colonne est lavée par le tampon d'équilibrage jusqu'au
retour à la ligne de base.
La préélution s'effectue au même débit avec un
tampon de préélution (phosphate de potassium 0,01 M; NaCl
0,25 M; benzamidine 10 mM; pH 8 ou phosphate de potassium
0,03 M; NaCl 0,25 M; benzamidine 10 mM (optionnel); pH 8)
et 5 volumes de colonne de prééluat sont recueillis. Le
gel est ensuite lavé avec 15 volumes du même tampon.
L'élution est effectuée au même débit avec un
tampon d'élution (phosphate de potassium 0,5 M; NaCl
0,075 M; benzamidine 10 mM (optionnel); pH 8) et 5
volumes de colonne d'éluat sont collectés. Le gel est
régénéré par 5 volumes de colonne de NaOH 2M et stocké
dans du NaOH 2M.
E - Ultrafiltration et dialyse
L'éluat résultant de la chromatographie sur
hydroxyapatite est soumis à une ultrafiltration réalisée
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sur une cassette Sartorius ultrasart slice polysulfone de
0,1 m2 et de 10 kD de seuil de coupure.
L'éluat est concentré 3 fois et dialysé à volume
constant contre de l'eau p.p.i (purifiée pour injection)
jusqu'à obtenir une résistivité de 70 ohms (la pression
d'entrée sur la cassette est de 0,5 bars et le débit
d'ultrafiltration est de 45 ml/mn), puis dialysé à volume
constant contre 5 volumes de tampon de dialyse (citrate
trisodique 3 g/l; NaCl 0,13 M; lysine 2 g/l; arginine 2
g/l; pH 7). Le produit est ensuite reconcentré 2 fois et
la cassette est rincée avec le tampon de dialyse de
manière à obtenir un volume final égal à 80% du volume
initial. Le produit est enfin congelé et stocké à -40 C,
et pourra, le cas échéant être ultérieurement filtré sur
filtre de porosité de 15 nm.
F - Dosage
Les quantités et/ou les concentrations des Facteur
de la coagulation II (FII), Facteur VII (FVII), Facteur
IX (FIX) et Facteur X (FX) qui composent le complexe
prothrombique (ou PPSB) sont dosées (par la mesure de la
capacité à induire la coagulation) et l'activité
thrombique est mesurée.
De même, la quantité et/ou la concentration des
protéines C, S est dosée à l'aide des kits Asserachrom
Total Protein S et Asserachrom Protein C ,
distribués par Stago.
Les dosages antigéniques des facteurs VII, IX, X et
de la protéine Z sont réalisés par ELISA à l'aide des
kits
Asserachrom VII:Ag , Asserachrom IX:Ag , Asserachro
m X:Ag , et Asserachrom Protein Z distribués par
Stago.
Les quantités et/ou les concentrations de
polysorbate 80 et de TnBP sont mesurées.
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Exemple 2 : Résultats expérimentaux
A - Etude de la capacité de la colonne
La capacité de la colonne d'hydroxyapatite a été
testée avec des doses de 3, 5, 7 et 9 ml de PPSB-PI-1
viralement inactivé par ml de gel, dans les mêmes
conditions expérimentales que celles décrites ci-dessus.
Il n'a pas été effectué de préélution.
Le rendement calculé pour chaque facteur correspond
au rapport de la quantité totale d'unités coagulantes
dans l'éluat résultant de l'hydroxyapatite sur la
quantité totale d'unités coagulantes dans le PPSB-PI-1.
Les rendements obtenus en fonction de la charge sont
détaillés dans le tableau I suivant :
Tableau I - Rendements d'élution en facteurs II, IX,
VII et X en fonction de la charge sur le gel
Charge de la Rendemen Rendemen Rendemen Rendemen
colonne ts ts FVII ts FIX ts FX
FII
ml de PPSB-PI-1
0 0 0 0
ml de gel
3 88 103 112 92
5 91 111 111 79
7 108 88 106 69
9 93 85 96 57
Ces données sont représentées graphiquement dans la
figure 1. On observe une nette décroissance de la
fixation du FX en fonction de la charge.
Le pourcentage de facteur non fixé calculé pour
chaque facteur correspond au rapport de la quantité
totale d'unités coagulantes dans la fraction non fixée à
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la quantité totale d'unités coagulantes dans le PPSB-PI-1
de départ. Les pourcentages de facteur non fixé sont
résumés dans le tableau II.
Tableau II : Quantité de facteurs II, IX, VII et X
non retenus sur le gel en fonction de la charge.
Charge de la Non fixé Non fixé Non fixé Non fixé
colonne FII FVII FIX FX
ml de PPSB-PI-1
0 0 0 0
ml de gel
3 < 1 < 1 < 1 5
5 3 < 1 < 1 14
7 11 5 < 1 26
9 18 8 < 1 35
Ces données sont représentées graphiquement dans la
figure 2. Sur cette dernière figure, il apparaît de
manière plus nette que le FII et le FX sont les facteurs
qui se fixent le moins sur la colonne d'hydroxyapatite.
La figure 3 montre par ailleurs que pour ces deux
facteurs (FII et FX), le pourcentage de facteur non fixé
varie de manière linéaire avec la charge. La charge de 5
ml de PPSB-PI-1 par ml de gel pour laquelle la fixation
des FII et FX est encore acceptable à été retenue.
B - Influence de la préélution
Dans le but d'éliminer le plus grand nombre de
protéines contaminantes, une préélution avec un tampon
phosphate 30 mM a été testée. Une telle préélution est de
préférence réalisée avec un tampon phosphate à mM,
et plus préférentiellement 30 mM, dans la mesure où
l'élution des facteurs II et VII a été constaté à partir
d'une concentration en phosphate de 50 mM. Les conditions
opératoires sont identiques à celles décrites plus haut
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et la charge protéique utilisée est de 5 ml de PPSB-PI-1
par ml de gel.
Aucun facteur de coagulation n'a pu être détecté
5 dans les prééluats. Les rendements ne sont donc pas
affectés par cette préélution, ainsi que le montre les
résultats suivants:
Tableau III : Quantité de facteurs II, IX, VII et X
10 dans l'éluat en fonction du type de préélution réalisée.
N Essai Préélution FII: FVII: FIX:C FX:C
C C
o o o o
o o o o
3 0,25 M NaCl 83 86 86 68
4 0,25 M NaCl 88 103 112 92
5 0,25 M NaCl, 30 mM 95 80 93 69
phosphate
6 0,25 M NaCl, 30 mM 80 81 79 72
phosphate
Tableau IV : Quantité de protéines copurifiées
éliminées au cours de la préélution phosphate
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N Essai Protéines totales Protéines
prééluat 30 mM totales
phosphate éluat
mg mg
3 (pas de préélution 5 1218
phosphate) 0 916
4 (pas de préélution 44 964
phosphate)
6 68 897
7 52 1078
8 58 1013
9 57 1061
62 1061
11 62 1125
12 68 1166
La préélution réalisée avec un Tampon phosphate 30
mM permet en outre d'éliminer un grand nombre de
5 protéines accompagnantes et notamment des protéines de
hauts poids moléculaire (100 à 200 kD) ainsi que le
montre le gel SDS PAGE (voir figure 4).
E - Influence de l'addition d'antithrombine et
10 d'héparine
Afin de maintenir une faible activité thrombique
dans l'extrait protéique en cours de purification, on
ajoute dans l'éluat de chromatographie hydroxyapatite
avant ultrafiltration de l'antithrombine purifiée à une
concentration de 0,5 U/ml (de préférence à une
concentration de 0,1 à 0,04 unité d'antithrombine par
unité de FIX) et de l'héparine à 2 U/ml. Les conditions
expérimentales sont les mêmes que celles décrites plus
haut, avec une préélution en tampon phosphate 3OmM. La
charge de la colonne était de 5 ml de PPSB par ml de gel.
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El - Activités en FII, FX, FVII et X dans les éluats
dialysés après purification sur hydroxyapatite
Tableau V : Activités en facteurs II, IX, VII et X
et activité thrombique dans l'éluat après hydroxyapatite
N Essai FII :C FVII :C FIX :C FX :C activité activité
thrombique thrombique
U/ml U/ml U/ml U/ml 6h 37 C 25h 20 C
25 19 8,4 23 19 >6 h >24h
26 19 8,5 22 19 >6 h >24h
27 21 8,5 17 21 >6 h >24h
28 20 9,5 17 22 >6 h >24h
moyenne 20 9 20 20
écart type 1,0 0,5 3,2 1,5
C.V. 4,8 5,9 16,2 7,4
PI-1 35 16 27 48 >6 h >24h
Les essais réalisés sont reproductibles entre eux et
les activités thrombiques mesurées à 6h et à 24 h sont
quasiment nulles, et sont de ce fait conformes pour un
usage thérapeutique ultérieur du concentré de protéines
dépendant de la vitamine K (une activité thrombique de 6
heures et plus correspond à de très faibles quantités de
thrombine, très inférieures à 0,001 unité NIH).
E2 - Rendements en FII, FX, FVII et X dans l'éluat
dialysé après purification sur hydroxyapatite
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Tableau VI : Rendements en facteurs II, IX, VII et X
et activité thrombique dans l'éluat dialysé ou
ultrafiltré après hydroxyapatite
N Essai FII :C FVII :C FIX :C FX :C
o o o o
o o o o
25 57 59 72 59
26 64 63 63 60
27 76 57 77 65
28 85 60 70 71
moyenne 71 60 71 64
écart type 12,4 2,5 5,8 5,5
C.V. 17,7 4,2 8,2 8,6
Les rendements sont de l'ordre de 70 % pour les
facteurs II et IX et de l'ordre de 60 et 64 % en moyenne
pour les facteurs VII et X.
Tableau VII : Rendements en facteurs II, IX, VII et
X après ultrafiltration de l'éluat résultant de
l'hydroxyapatite
N Essai FII :C FVII :C FIX :C FX :C
o o o o
o o o o
25 66 74 77 77
26 - - - -
27 97 79 72 89
28 85 60 70 71
moyenne 83 71 73 79
écart type 15,6 9,8 3,6 9,2
C.V. 18,9 13,9 4, 9 11,6
Les rendements pour l'ensemble des facteurs après
ultrafiltration sont de l'ordre de 70 à 80%.
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Tableau VIII : Activités spécifiques en facteurs II,
X. VII et IX dans l'éluat dialysé après hydroxyapatite
N essai FII :C FVII :C FIX :C FX :C protéines
totales
U/mg U/mg U/mg U/mg mg/ml
25 6,3 2,8 7,7 6,8 3
26 5,7 2,7 4,9 6,3 2,9
27 6, 8 2,7 5,5 6, 8 3, 1
28 5,7 2,7 4,9 6,3 3,5
moyenne 6,1 2,7 5,8 6,6 3,1
écart type 0,5 0,1 1,3 0,3 0,3
C.V. 8,7 1,8 23,1 4,4 8,4
PPSB-PI-1 1,2 0,6 1 1,2 35
Les activités spécifiques calculées pour chaque
facteur sont augmentées d'environ cinq fois par rapport à
un concentré de FII, FVII, FIX et FX obtenu par la mise
en oeuvre d'une chromatographie sur résine échangeuse
d'anion à la place de l'hydroxyapatite de l'invention.
F -Conclusion sur l'étape de purification sur
hydroxyapatite
La fixation des facteurs de coagulation dépendants
de la vitamine K apparaît plus spécifique sur des
surfaces à base de phosphate de calcium (de type
hydroxyapatite) comparé au gel d'échange d'ions ce qui
explique la pureté du produit obtenu. L'analyse des
protéines récupérées après élution sur gel
d'hydroxyapatite montre que les protéines comprises dans
le concentré protéique d'intérêt ont un poids moléculaire
compris entre 75 et 50 kDa, ce qui correspond au poids
moléculaire des protéines dépendantes de la vitamine K,
et en particulier au poids moléculaire des différents
facteurs de coagulation composant le complexe
prothrombique.
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Le tableau IX ci-dessous établit la liste des
protéines présentes dans un concentré protéique obtenu
par purification sur une résine échangeuse d'anions après
inactivation virale (et en remplacement de la
5 purification sur hydroxyapatite de l'invention). Il
convient de remarquer que dans un tel concentré, la somme
des protéines dépendantes de la vitamine K (FII, FVII,
FIX, FX, protéine C, protéine S, protéine Z) représente
17% des protéines totales.
Tableau IX : Liste et proportions relatives des
protéines présentes dans un concentré résultant d'une
purification unique sur une résine échangeuse d'anions ou
d'une purification comprenant une première résine
échangeuse d'anions et une seconde résine échangeuse
d'anions en remplacement de la chromatographie sur
hydroxyapatite de l'invention
Protéines % P M
Ig M 0,30 à 0,40 900
C 4 bp 1,60 à 2 590
Fibronectine 0,45 à 0,65 440
Fibrinogène 0,65 à 1 330
C 4 9 à 13 206
C 3 0,55 à 0,75 180
C 3 c 0,45 à 0,65 180
C 5 0,05 à 0,1 180
Protéine S 0,90 à 1,15 75
rothrombine (F II) 12 à 15 68,7
Albumine 2,10 à 2,5 68
Antithrombine III 0,05 à 1,5 65
Facteur X 1,25 à 1,75 59
Protéine C 0,20 à 0,50 57
Facteur IX 0,15 à 0,45 55,4
Protéine Z 0,05 à 0,20 55
Facteur VII 0,01 à 0,05 50
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Au contraire, le concentré protéique résultant du
procédé de l'invention et notamment obtenu après l'étape
de chromatographie sur hydroxyapatite contient une
proportion en protéines dépendantes de la vitamine K
(FII, FVII, FIX, FX, protéine C, protéine S, protéine Z)
de l'ordre de 90 à 95 % des protéines totales.
Le concentré qui résulte de cette chromatographie
sur hydroxyapatite présente une activité spécifique
augmentée de 5 à 7 fois par rapport au produit
intermédiaire 1 résultant de la chromatographie sur
résine échangeuse d'anions. Des mesures complémentaires
montrent par ailleurs que la chromatographie sur
hydroxyapatite permet en outre d'éliminer efficacement le
polysorbate 80 et le TnBP utilisés lors de l'étape
d'inactivation virale.
Enfin, l'addition d'antithrombine III et d'héparine
dans l'éluat de chromatographie d'hydroxyapatite permet
d'obtenir de façon systématique un produit dépourvu
d'activité thrombique à 24 h.
Enfin, l'élimination de la plupart des protéines
contaminantes et notamment des protéines contaminantes de
hauts poids moléculaires permet de filtrer le produit sur
membranes de porosité 15 nm en utilisant des surfaces de
filtration acceptables (environ 10 litres de produit par
mètre carré de membrane).
G - Nanofiltration du concentré obtenu après
chromatographie sur hydroxyapatite
G.1 - Mise en oeuvre expérimentale de la
nanofiltration
Les filtres utilisés sont des filtres de référence
Planova 15 N (Asahi) . Les filtres utilisés sont composés
de fibres creuses en cellulose cupro ammonium hydrophile,
dont la taille nominale des pores est de 15 2 nm.
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Le tampon d'équilibration des filtres se compose de
chlorure de sodium 0,13M, de Tri Sodium Citrate 2 H20
3g/l, de Lysine HCl 2g/l, d'Arginine HCl 2g/1 et d'eau
p.p.i. (purifiée pour injection). Le tampon est ajusté à
pH 7,0 0,05, à une résistivité de 75 Q.cm, et à une
osmolalité de 314 mosmol / Kg H20, à une température de
20 à 25 C.
Les filtres sont préparés individuellement, rincés
en eau ppi sous une pression de l'ordre de 500 mBar.
L'intégrité du filtre est contrôlée avant utilisation
après rinçage à l'eau ppi. La réalisation du test de
fuite à l'air ou Leakage test , contrôle l'absence de
passage d'air à travers les fibres dans la jaquette
externe sous une pression d'air de 1000 50 mBar. (SOP
of integrity Test for Asahi Planova Filters). Avant
filtration de la solution, le filtre est équilibré à
l'aide du tampon de formulation. Dans un mode de
réalisation particulier, le tampon de formulation se
compose de NaCl 0,13M, arginine 2g/1, lysine 2g/1,
citrate de sodium 3 g/l, et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un
autre mode de réalisation, le tampon de formulation se
compose d'arginine 10 g/l, de mannitol 35g/1 et a un pH
de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le
tampon de formulation se compose de mannitol 45g/1 et a
un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le
tampon de formulation se compose de citrate de sodium
1g/1, de mannitol 35 g/l et a un pH de 6,9 à 7,1.
Le pH et la résistivité du filtrat 15 nm sont
contrôlés (pH 7,0 0,1 - Osmolalité 314 10 mOsmol / Kg
H20) .
Un flacon d'éluat résultant de la purification sur
hydroxyapatite céramique décrite plus haut et
éventuellement dialysé est décongelé en bain marie à 37 C
2 C. Une préfiltration est éventuellement réalisée sur
un filtre en tri-acétate de cellulose 0,2 }gym (Sartolab P
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- Sartorius) avant filtration sur le filtre de 15 nm
Planova 15N.
La filtration de l'éluat est réalisée sous une
pression d'air comprimé constante de 500 50 mBar. La
mesure de pression est effectuée en entrée du filtre de
nm à l'aide d'un manomètre numérique. L'éluat
résultant de la filtration sur filtre 15 nm est collecté
en sortie basse de filtre dans un flacon positionné sur
10 une balance. Des relevés du poids filtré sont effectués à
intervalles de temps réguliers afin de déterminer le
débit de filtration. La filtration réalisée est frontale
sans recirculation.
15 En fin de filtration un test de fuite à l'air
( leakage test ) est réalisé après remplissage de la
jaquette externe du filtre afin de contrôler l'intégrité
de la membrane et de valider l'étape de filtration.
Afin de tester la reproductibilité de l'étape de
nanofiltration, les essais sont réalisés en appliquant
des conditions opératoires standardisées détaillées dans
le tableau X.
Tableau X : Conditions et paramètres opératoires
appliqués lors de la nanofiltration sur 15 nm
Paramètres opératoires Valeurs
Température C 20 2
Pression appliquée mBar 500 50
Protéines totales g/l 5,0 1,0
Facteur IX :C Total UI Environ 3 200
Charge protéique moyenne g/m2 50 10
Charge volumétrique 1/m2 10,0 1
Après nanofiltration, la quantité et/ou la
concentration des facteurs de coagulation FII, FVII, FIX
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et FX est mesurée par des techniques classiques connues
de l'homme du métier. Il en va de même pour la
détermination des taux de protéines totales.
G.2 - Résultats obtenus après nanofiltration de
l'éluat résultant de l'hydroxyapatite
G.2.1 - Suivi des paramètres de nanofiltration
La pression de filtration a été maintenue dans une
moyenne de 500 100 mBar pendant les essais de
filtration (voir figure 5).
L'évolution du débit de filtration est mesurée
pendant la nanofiltration (voir la figure 6) . On observe
une diminution régulière du débit de filtration en
fonction du poids filtré. Un profil similaire est obtenu
pour tous les essais réalisés.
Tableau XI: Suivi des débits de nanofiltrations
N essai Débit initial Débit final Ratio
nanofiltration
g/min g/min %
97 E 2703 2,3 0,4 17,4
97 E 0204 3,0 0, 9 30, 0
97 E 0804 2, 0 0, 6 30, 0
97 E 0904 1,8 0, 6 33,3
97 E 1504 1,8 0,3 16,7
Suivant les préconisations du fournisseur de filtre
Asahi, le débit de filtration final doit être supérieur à
10 % du débit initial. Pour un ratio de débit inférieur à
10 % le filtre est considéré comme étant colmaté, en
particulier pour les pores de plus faible diamètre. Une
poursuite de la filtration pourrait en effet favoriser le
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passage des virus potentiels par les pores les plus
larges de la membrane.
Le ratio des débits de nanofiltration final /
5 initial est conforme pour tous les essais réalisés.
Tableau XII: suivi des paramètres de filtration
N essai Durée filtration Capacité Débit moyen Capacité
nanofiltration
min 1/m2 1/heure/m2 g/m2
97 E 2703 138 11,4 4,9 50,2
97 E 0204 70 9,7 8,0 42,7
97 E 0804 89 10,0 6,8 49,0
97 E 0904 99 10,5 6,4 52,5
97 E 1504 148 10,7 4,3 51,4
La durée moyenne de filtration est de l'ordre de 2
10 heures. La capacité volumétrique moyenne est de l'ordre
de 10 l/m2 de membrane, ce qui correspond à une capacité
d'environ 47,9 4,7 g de protéines par m2.
G.2.2 - Bilan en protéines totales et en facteurs de
15 coagulation après nanofiltration
Tableau XIII: Bilan en protéines totales
N essai Volume Protéines Perméat 15Protéines Rendement
7o Totales Totales
nanofiltration l g/l mg 1 /1 g %
97 E 2703 120,0 4,6 552 114,6 4,4 504 95,7
97 E 0204 102,0 4,8 490 108,7 4,4 478 97,7
97 E 0804 112,0 6,4 717 116,7 5,9 689 96,0
97 E 0904 110,0 5,5 605 121,4 5,0 607 100,3
97 E 1504 112,0 4,8 538 112,0 4,8 538 94,0
Moyenne/écart 111,2 5,2 580 114,7 4,9 563 96,7
type 6,4 0,7 86 4,8 0,6 85 2,4
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On note de bons rendements de nanofiltration en
protéines totales avec des valeurs supérieures à 90 %.
Les essais sont réalisés à partir de matières
premières provenant de lots différents se révèlent
parfaitement reproductibles.
Tableau XIV : Bilan en facteurs de coagulation au
cours de l'étape de nanofiltration 15 nm
N essai FII:C FVII:C FIX:C F X : C
nanofiltration UI/ml UI/ml UI/ml UI/ml
Avant Après Avant Après Avant Filtrat Avant Filtrat
N 15 N 15 N 15 N 15 N 15 N 15 N 15 N
97 E 2703 30 36 16,0 15,0 25 23 24 22
97 E 0204 32 28 19,0 18,0 27 25 30 27
97 E 0804 39 39 30,0 26,0 32 35 39 36
97 E 0904 34 39 20,0 17,0 31 26 32 29
97 E 1504 30 30 19,0 19,0 29 29 29 29
Moyenne 33 34,4 20,8 19,0 28,8 27,6 30,8 28,6
/ Ecart Type 3,7 5,1 5,4 4,2 2,9 4,7 5,4 5,0
10 On note une bonne reproductibilité des différents
essais pour tous les facteurs de coagulation
L'étape de chromatographie sur hydroxyapatite
céramique permet une bonne récupération pour l'ensemble
15 des facteurs dépendants de la vitamine K. On note que les
concentrations avant et après nanofiltration sur 15 nm
sont très proches démontrant ainsi un rendement élevé de
nanofiltration des quatre facteurs de coagulation.
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Tableau XV : Evolution de l'activité spécifique au
cours de la nanofiltration 15 nm
N essai A.S. FII A.S. FVII A.S. FIX A.S. FX
nanofiltration UI/mg UI/mg UI/mg UI/mg
Avant Après Avant Après Avant Après Avant Après
15 N 15 N 15 N 15 N 15 N 15 N 15 N 15 N
97 E 2703 6,5 8,2 3,5 3,4 5,4 5,2 5,2 5,0
97 E 0204 6,7 6,4 4, 0 4, 1 5, 6 5,7 6,3 6, 1
97 E 0804 6,1 6,6 4,7 4,4 5,0 5,9 6,1 6,1
97 E 0904 6,2 7,8 3, 6 3,4 5, 6 5,2 5,8 5, 8
97 E 1504 6,3 6,3 4, 0 4,0 6, 0 6,0 6,0 6, 0
Moyenne 6,4 7,1 4,0 3,9 5,5 5,6 5,9 5,8
/ Ecart Type 0,24 0,88 0,47 0,44 0,36 0,38 0,42 0,46
Les activités spécifiques déterminées pour tous les
facteurs de coagulation sont de même ordre pour tous les
essais réalisés avant et après nanofiltration. L'activité
spécifique déterminée par rapport au facteur IX est
supérieure à 5 pour tous les essais réalisés.
Tableau XVI : Rendement en facteurs de coagulation
après nanofiltration 15 nm
N essai FII:C FVII:C FIX:C FX:C
nanofiltration % % % %
97 E 2703 120,0 100,0 104,5 95,7
97 E 0204 93,2 101,0 98,7 95,9
97 E 0804 104,2 90,3 114,0 96,2
97 E 0904 126, 6 93,8 92, 6 100, 0
97 E 1504 84,8 107,5 98,4 95,2
Moyenne 105,8 98,5 101,6 96, 6
/ Ecart Type 17,6 6,7 8,1 1,9
On observe pour chaque essai réalisé un rendement de
même ordre (et supérieur à 90%) pour tous les facteurs de
coagulation.
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G.2.3 - Détermination de l'activité thrombique
La détermination de l'activité thrombique est
réalisée sur un appareil automatique détectant
l'apparition d'un caillot par opacification de
l'échantillon.
L'analyse réalisée correspond à un test de
coagulation dont la sensibilité permet la détection d'une
faible quantité de thrombine résiduelle dans un
échantillon. Le résultat est conforme si l'on obtient une
absence de coagulation après 6 heures à 37 C et après 24
heures à 24 C.
Aucune génération de thrombine n'est observée au
cours de la nanofiltration de l'éluat résultant de
l'hydroxyapatite. La détermination de l'activité
thrombique indique une absence de coagulation après 6
Heures à 37 C. Toutefois, les tests réalisés montrent
qu'un début de formation de caillot peut être observé au
temps 24 Heures, ce résultat étant confirmé par un test
réalisé de façon traditionnelle en bain-Marie.
Des expériences ont été réalisées pour déterminer si
l'ajout d'un inhibiteur de protéases, tel que par exemple
l'antithrombine III permet de faire disparaître
l'activité thrombique résiduelle observée à 24 heures.
La détermination des activités protéasiques a été
réalisée par spectrophotomètrie, en utilisant des
substrats chromogénes spécifiques. L'hydrolyse d'un
substrat chromogène spécifique par une protéase
s'accompagne en effet de la libération d'une molécule de
couleur jaune détectée à 405 nm, dont la vitesse
d'apparition est proportionnelle à la concentration de
l'enzyme de la solution testée.
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Tableau XVII Détermination de l'activité
thrombique avec le substrat chromogène S 2238
S 2238 + i S 2238
S 2238 Activité IIa
Etapes 2581 + AT-III
U Do 0 U Do
U DO + Héparine
PPSB-PI-1 97 E 1106 0,0172 0,0142 0,0030 0,0149
Eluat HA dialysé
97 E 1106 0,0314 0,0200 0,0114 0,0339
Filtrat 15 nm
97 E 2506 0,0065 0,0020 0,0045 0,0014
97 E 1007 0,0075 0,0015 0,0060 0,0021
97 E 1607 0,0090 0,0021 0,0069 0,0017
97 E 1707 0,0103 0,0018 0,0085 0,0018
Le substrat S2238 est un substrat spécifique de la
thrombine. On note qu'en absence d'inhibiteur, une
activité résiduelle de type thrombine est observée dans
tous les échantillons testés. Cette activité est
sensiblement inhibée par l'addition de l'inhibiteur de la
thrombine i 2581 et de façon équivalente en présence d'un
mélange d'Antithrombine III (AT-III) et d'héparine. La
thrombine peut donc être neutralisée efficacement par son
inhibiteur physiologique l'AT-III en présence d'héparine.
L'activité thrombique résiduelle mesurée par le test
de l'activité thrombique avec le substrat chromogène
correspond à une activité inférieure à 0,01 UI/ml dans
les filtrats 15 nm.
L'aprotinine montre également une bonne efficacité
pour l'inhibition des protéases résiduelles. Toutefois,
l'origine bovine de cet inhibiteur ne permet pas de
l'utiliser dans le cadre de la purification de produits
destinés à un usage thérapeutique chez l'homme.
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G.2.4 - Caractérisation du concentré protéique par
électrophorèse SDS Page
Ainsi qu'on peut le voir sur la Figure 7, la
5 majorité des protéines de haut poids moléculaire ont été
éliminées dans la fraction non adsorbée de la
chromatographie sur hydroxyapatite HA Céramique. On ne
note pas de différence notable de composition à l'étape
de nanofiltration 15 nm, le filtrat 15 nm se révélant en
10 tous points similaire au concentré protéique avant
nanofiltration.
La bande majeure à 66 kDa correspond essentiellement
à la prothrombine qui représente à elle seule environ 60
% des protéines totales du concentré protéique.
G.2.5 - Caractérisation du facteur IX par immunoblot
Un immunoblot est réalisé après électrophorèse sur
gel SDS Page 10 % homogène sans réducteur. Après
transfert sur nitrocellulose et saturation avec de
l'albumine, un contact avec un anticorps primaire
monoclonal anti-facteur IX (Sigma Réf. F1020) est
réalisé. Le marquage par un anticorps secondaire anti-
souris marqué à la péroxydase (BioRad) est réalisé avant
révélation par technique ECL sur film d'autoradiographie
(Pierce). Les résultats sont montrés dans la figure 8. On
observe, la présence de bandes non spécifiques dans les
puits correspondant au PI-1.
Au contraire, l'éluat dialysé provenant de la
colonne hydroxy-apatite céramique ne présente d'une seule
bande homogène. On ne note par ailleurs pas de différence
visible après nanofiltration 15 nm, ni avec le facteur IX
HP utilisé comme témoin.
G.2.6 - Conclusion
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La nanofiltration sur filtre Planova Asahi 15 nm de
l'éluat dialysé résultant de la chromatographie sur
hydroxyapatite céramique a été réalisée de façon
reproductible en respectant des conditions opératoires
standardisées.
On note de façon reproductible, une diminution du
débit proportionnel au poids filtré. La capacité
volumétrique moyenne du filtre est de l'ordre de 10 1/m2
de membrane, ce qui correspond à une capacité moyenne de
47,9 4,7 g de protéines pour les essais réalisés.
Le bilan en protéines totales donne un rendement
moyen de 91,1 14,0 %, comparable au rendement en
facteurs de coagulation 99,4 22,2 pour le FII :C, 91,5
18,2 pour le facteur VII :C, 95,8 16,1 pour le
facteur IX :C et 90,5 15,1 pour le facteur X :C.
L'activité spécifique pour les différents facteurs
est de même ordre avant et après nanofiltration.
On ne note pas de différence notable avant et après
filtration 15 nm par caractérisation par électrophorèse
SDS Page.
H - Essais d'optimisation de la stabilité de la
solution au cours de la fabrication
Des essais complémentaires ont été réalisés en
faisant varier différents paramètres avec pour objectif
d'obtenir un éluat résultant de l'hydroxyapatite qui
puisse être filtré sur 15 nm et présenter une teneur très
faible ou inexistante en activité thrombique.
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Tableau XVIII: Liste des essais réalisés pour la
stabilisation de l'éluat hydroxy-apatite céramique
N essai Formulation Matière Benzamidine AT III Héparine Activité
N première mMol/1 U/ml UI/ml Thrombique
97 E 1806 a Congelée 50 - 2,0 Conforme
97 E 1007 a Fraîche - 2,0 * 5,0 Conforme
97 E 2312
b Fraîche - 0,5 ** 2,0 Conforme
97 E 3012
98 E 0801
b Fraîche - 0,5 ** - Conforme
98 E 1301
* AT-III additionné au moment du traitement Solvant
Détergent avant chromatographie
** AT-III additionné avant ultrafiltration
Formulation a : NaCl 0,13 M - Citrate de Sodium
0,010 M, Lysine HCl 2,0 g/l, Arginine HCl 2,0 g/l, pH 7,0
0'l
Formulation b : NaCl 0,13 M, Citrate de Sodium 0,010
M, pH 7,0 0,1
Afin de pouvoir comparer les résultats des essais
entre eux, les paramètres de conduite de l'étape de
nanofiltration n'ont pas été modifiés.
Dans l'essai 97E1806, de la benzamidine 50 mM a été
ajoutée dans les tampons et de l'héparine 2UI/ml a été
ajoutée avant l'étape de nanofiltration sur 15 nm. Le
concentré de protéines résultant de la nanofiltration sur
filtre de porosité 15 nm ne présente pas d'activité
thrombique.
Lors de l'essai 97E1007, de l'héparine 5 UI/ml et de
l'AT-III 2 U/ml ont été ajoutées au moment du traitement
Solvant Détergent et avant l'étape de chromatographie sur
hydroxyapatite, une bonne filtrabilité de 12,5 1/m2 et
une absence de coagulation (et donc d'activité
thrombique) sont observées.
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Dans les essais 97E2312 et 97E3012, de l'héparine 2
UI/ml et de l'AT-III 0,5 UI/ml sont ajoutées directement
dans l'éluat résultant de la chromatographie sur
hydroxyapatite avant étape d'ultrafiltration. Le
concentré de protéines résultant de la nanofiltration sur
filtre de porosité 15 nm ne présente pas d'activité
thrombique.
Dans les essais 98E0801 et 98E1301, de l'AT-III 0,5
UI/ ml est ajoutée en absence d'héparine dans léluat
résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite avant
l'ultrafiltration. Dans ces deux cas, le concentré de
protéines résultant de la nanofiltration sur filtre de
porosité 15 nm ne présente pas d'activité thrombique.
L'antithrombine III constitue par conséquent un bon
inhibiteur de l'activité thrombique du concentré
protéique contenant le complexe prothrombique de
l'invention. L'héparine semble en outre agir comme un
cofacteur de l'AT-III et potentialiser l'activité
inhibitrice de cette dernière. La meilleure efficacité de
l'antithrombine est ainsi obtenue lorsque celle-ci est
ajoutée dans l'éluat de chromatographie hydroxyapatite.
Il apparaît en effet que l'antithrombine ne se fixe que
très peu sur l'hydroxyapatite.
I - Comparaison entre le concentré de protéines
obtenu par le procédé de l'invention et un concentré
obtenu par un procédé comprenant une chromatographie sur
résine échangeuse d'ions en remplacement de la
chromatographie sur hydroxyapatite
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Tableau XIX : Comparaison de la composition d'un
PPSB purifié avec une chromatographie d'échange d'ions en
remplacement de la chromatographie sur hydroxyapatite et
du concentré selon l'invention nanofiltré 15 N
Caractéristiques Concentré obtenu par Concentré
un procédé nanofiltré
comprenant une obtenu par le
chromatographie procédé de
d'échange d'anions l'invention
en remplacement de
l'hydroxyapatite
Protéines totales 32,0 7,5 5,0 0,6
mg/ml
AS UI FIX/mg 0,8 0,2 5,9 0,4
FII UI/ml 40,0 8 35,0 4,8
FVII UI/ml 26,5 8,5 19,0 3,8
FIX UI/ml 25,5 5,5 27,8 4,2
FX UI/ml 40 8 29,2 4,7
Activité thrombique à Absence Absence
37 C à 6 heures
Activité thrombique à Absence Absence
25 C à 24 heures
Héparine UI / UI FIX 0,1 - 0,25 0,1 - 0,25
Antithrombine UI/ml Absence 0,5 - 1
Les résultats du tableau XIX montrent que la
chromatographie sur hydroxy-apatite céramique effectuée
dans le cadre du procédé de la présente invention permet
d'obtenir un taux de purification des protéines
dépendantes de la vitamine K très largement supérieur à
celui qui serait obtenu avec l'utilisation d'une seconde
résine échangeuse d'anions en remplacement de
l'hydroxyapatite de l'invention. Par ailleurs, L'ensemble
des facteurs dépendants de la vitamine K représentent 70
CA 02764584 2011-12-05
WO 2010/140140 PCT/IB2010/052497
à 80 % des protéines totales pour le concentré nanofiltré
obtenu par le porcédé de la présente invention, contre 15
à 17 % seulement pour un concentré qui serait produit en
utilisant une seconde résine échangeuse d'anions en
5 remplacement de l'hydroxyapatite.
On note également que les ratios respectifs des
facteurs de coagulation composant le complexe
prothrombique sont comparables dans les concentrés
10 obtenus par les deux procédés susmentionnés.
