Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
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Composition d'immunoglobulines G
L'invention concerne une composition d'immunoglobulines G comprenant du
mannitol, de la glycine et un détergent non ionique.
De nombreuses pathologies sont actuellement traitées par des compositions
d'immunoglobulines G (IgG). On peut citer par exemple les déficits
immunitaires
primitifs avec défaut de production d'anticorps, la maladie de Kawasaki, le
purpura
thrombopénique immunologique de l'enfant et de l'adulte, les déficits
immunitaires
secondaires avec défaut de production d'anticorps, en particulier la leucémie
lymphoïde chronique ou myélome associés à des infections à répétition,
l'infection
de l'enfant par le VIH associée à des infections bactériennes, les
neuropathies
motrices multifocales, le syndrome de Guillain-Barré, les infections aiguës
sévères
ou chroniques à Parvovirus B19, l'immunodéficience acquise ou
constitutionnelle,
la dermatomyosite cortico-résistante, la myasthénie aiguë, la
polyradiculonévrite
chronique idiopathique, le purpura thrombopénique immunologique, par exemple
associé à l'infection par le VIH, le syndrome de l'homme raide (Stiffman
syndrome), la neutropénie auto-immune, l'erythroblastopénie auto-immune
résistante, le syndrome d'anti-coagulation acquise par auto-anticorps, la
polyarthrite rhumatoïde, etc.
Au cours de ces dernières années, la très forte demande d'IgG a engendré des
situations de tension extrêmes sur les approvisionnements, pouvant aller
jusqu'à
des situations de pénurie en Europe et aux Etats Unis d'Amérique.
Dans ce contexte, il y a un besoin grandissant de produire des compositions
d'IgG, habituellement conditionnées à des pH acides et injectables par voie
intraveineuse, à partir par exemple de plasmas humains. Avec l'essor de ces
besoins en IgG, la stabilisation de ces compositions d'IgG injectables par
voie
intraveineuse (IgGIV) en vue de leur utilisation thérapeutique et de leur
conservation revêt un caractère fondamental.
A cet égard, on sait qu'il est nécessaire de stabiliser les IgGIV pour éviter
notamment la formation d'agrégats (oligomères et polymères) susceptibles
d'activer le système du complément avec des risques associés de réactions
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anaphylactiques. Par ailleurs, la présence de dimères dans les IgGIV a été
corrélée à des baisses de pression artérielle in vivo (Bleeker W.K. et al,
Blood, 95,
2 000, p. 6-18 6 1). D'autres dégradations physicochimiques peuvent également
intervenir au cours de la conservation des IgG comme, entre autres,
l'oxydation et
l'hydrolyse.
La stabilisation des IgG nécessite donc l'ajout de composés, classiquement
choisis parmi les sucres et les acides aminés, afin d'obtenir non seulement
des
compositions d'IgG non dégradées appropriées à un usage thérapeutique mais
également des compositions d'IgG présentant une stabilité accrue durant le
stockage.
La stabilisation des formes lyophilisées de compositions protéiniques et
notamment d'IgG, par l'ajout de stabilisants spécifiques, a fait l'objet de
très
nombreuses études.
Celles citées dans les publications scientifiques de M. Pikal, "Freeze-Drying
of
Proteins, Part 2 : Formulation Selection", Biopharm. 3(9); pp.26-30 (1990) et
de
Arakawa et al, Pharm. Res., 1991, 8(3), p. 285-291, montrent que l'ajout d'un
excipient dans des compositions protéiniques avant lyophilisation, augmente la
stabilité au cours de la lyophilisation et/ou la stabilité du produit
lyophilisé lors du
stockage. Parmi ces stabilisants, certains sont toutefois connus comme étant
des
agents précipitants de protéines supérieures à environ 100 kDa. Ainsi,
l'utilisation
de polyéthylène glycol (PEG) 3000-6000 est rédhibitoire dans la phase de
congélation en vue de la lyophilisation de compositions protéiniques
correspondantes. Osterberg et al (Pharm. Res., 1997, 14(7), p. 892-892) ont
montré l'efficacité d'un mélange d'histidine, de saccharose, d'un tensioactif
non
ionique et de chlorure de sodium pour la stabilisation des formes lyophilisées
du
facteur VIII recombinant et l'ajout de PEG n'en a pas amélioré la stabilité.
En
outre, Guo et al (Biomacromol., 2002, 3(4), p. 846-849) précisent que la
lyophilisation de la peroxydase de raifort en présence de PEG, ne permet pas
d'en
conserver la structure native. La présence de PEG ne paraît donc pas
souhaitable.
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Des compositions d'IgGIV lyophilisées sont disponibles dans le commerce, par
exemple sous les noms de marques PolygamTM (American Red Cross), Gammar
IVTM (Armour Pharmaceutical Company) et VenoglobulinTMl (Alpha) contenant
comme stabilisants du glucose à 2%, du saccharose à 5% et du D-mannitol à 2%
respectivement.
La demande de brevet international WO 97/04801 décrit l'effet de stabilisation
de
formulations d'anticorps monoclonaux lyophilisés (de type immunoglobulines G
et
E) comprenant des excipients spécifiques. Parmi ces excipients, la combinaison
glycine/mannitol n'est pas retenue pour défaut d'efficacité au regard d'autres
combinaisons telles que saccharose/glycine et saccharose/mannitol.
On constate, toutefois, que des stabilisants appropriés aux formes
lyophilisées
des IgGIV peuvent être totalement inefficaces pour des compositions d'IgGIV
liquides.
Ainsi, les compositions d'IgGIV liquides, disponibles dans le commerce,
comprennent des stabilisants spécifiques différents de ceux utilisés pour la
forme
lyophilisée correspondante. A titre d'exemple, les compositions liquides
d'IgGIV
qui contiennent comme stabilisants du maltose à 10%, de la glycine de 0,16 à
0,24 M et du D-sorbitol à 5% sont respectivement connues sous les noms de
marque OctagamTM, (Octapharma), GamunexTM 10% (Talecris) et VenoglobulinTM
(Alpha).
La nature différente des composés utilisés pour la stabilisation des
compositions
d'IgG sous forme liquide et sous forme lyophilisée, a amené certains auteurs à
rechercher des stabilisants ou mélanges de stabilisants identiques permettant
de
conserver les compositions d'IgG sous les deux formes à la fois. A cet égard,
des
études récentes ont porté sur la stabilisation de compositions d'IgGIV, Vigam-
S et
Vigam Liquid (noms de marques de National Blood Authority, Angleterre)
liquides
et après lyophilisation (Vigam-S) comprenant un mélange identique de
stabilisants
à savoir l'albumine et le saccharose (K. Chidick et al, Vox Sanguinis, 77, 204-
209,
1999). Toutefois, la solution Vigam Liquid est conditionnée à un pH acide (pH
5)
ce qui présente l'inconvénient de transformer, par hydrolyse, le saccharose en
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sucres réducteurs (fructose et glucose) qui se condensent avec les résidus
aminés de la lysine des IgG et de l'albumine pour donner une base de Schiff
instable évoluant en des produits de Maillard (brunissement de la solution).
Il n'est
bien entendu pas satisfaisant d'utiliser des excipients qui évoluent au cours
de la
conservation des IgG car la maîtrise de la réaction n'est pas possible, une
fois
celle-ci initiée.
Par ailleurs, certains des stabilisants cités précédemment, comme le maltose
ou le
saccharose, ne peuvent être utilisés sans risques chez des sujets présentant
des
insuffisances rénales et/ou souffrant de diabète.
Afin de palier les inconvénients précédents, la Demanderesse a mis au point
une
formulation stabilisante unique, qui assure la stabilisation à la fois des
formes
liquides et lyophilisées des IgG. Une formulation particulièrement efficace
pour
stabiliser les compositions d'immunoglobulines est décrite dans la demande de
brevet internationale WO 2004/091656 déposée par la Demanderesse. Cette
demande de brevet divulgue une composition contenant 50 g/I d'IgG, 50 g/I de
mannitol, 10 g/I de glycine et 50 ppm de détergent, 50 ppm de détergent
correspond à une concentration de 50 mg/1 de détergent.
Comme pour de nombreux médicaments injectables, les excipients des
compositions d'IgIV peuvent induire des effets secondaires indésirables plus
ou
moins importants. Ces effets secondaires sont souvent dus aux excipients eux-
mêmes qui peuvent être responsables, par exemple, de réactions allergiques. A
titre d'exemple, lorsqu'on administre 300 mL d'un concentré d'IgIV de la
composition décrite dans la demande WO 2004/091656, la quantité d'excipient
administrée au patient sera de 15 g de mannitol, 3 g de glycine et 15 mg de
détergent.
Par ailleurs, il est connu que lorsque l'on augmente la concentration en
immunoglobuline d'une composition d'IgG, il peut se former des oligomères et
polymères dans ladite composition. Les oligomères et polymères sont
susceptibles d'activer le système du complément avec des risques associés de
réactions anaphylactiques. Ces oligomères et polymères sont également
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susceptibles d'induire des hypotensions chez le patient traité. Ceci n'est pas
souhaitable et strictement contrôlé du point de vue réglementaire. Pour éviter
l'apparition d'oligomères et polymères lorsque l'on augmente la concentration
en
immunoglobuline d'une composition d'IgG, il faut généralement augmenter
également la concentration en excipients. Cette augmentation de la
concentration
en excipients permet de stabiliser la composition d'IgG. En effet les
excipients ont
une fonction stabilisante et leur quantité est généralement corrélée à la
quantité
de principe actif, notamment lorsque le principe actif est une
immunoglobuline.
Partant de la composition stable décrite dans WO 2004/091656 contenant 50g/I
d'IgG, 50 g/I de mannitol, 10 g/I de glycine et 50 ppm de détergent, la
Demanderesse s'est aperçu de manière surprenante que :
(i) non seulement il était possible d'obtenir une composition stable d'IgG à
une
concentration de 100 g/I 20 g/I d'IgG tout en conservant les mêmes
excipients et
sans augmenter la concentration desdits excipients ,
(ii) mais en plus, qu'il était possible d'obtenir une composition stable d'IgG
à une
concentration de 100 g/I 20 g/I en diminuant la concentration d'au moins un
des
excipients (glycine, mannitol ou détergent).
Ainsi la composition stable mise au point par la Demanderesse présente deux
avantages majeurs par rapport à la composition déjà décrite dans WO
2004/091656:
- Premièrement, le fait d'avoir une plus grande concentration en IgG, c'est-à-
dire une plus grande quantité de principe actif pour un même volume,
permet d'administrer aux patients un volume moindre de ladite composition.
Le temps d'administration est donc significativement réduit, ce qui se traduit
par moins de contrainte pour les patients traités.
- Deuxièmement, le fait d'administrer un volume moindre de ladite
composition sans augmenter la concentration desdits excipients, de
préférence en diminuant la concentration d'au moins un desdits excipients,
se traduit par une diminution importante de la quantité d'excipients
administrée au patient.
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Par conséquent, pour une même quantité d'IgG, le volume d'une composition de
concentration en IgG de 100 g/I sera deux fois moins important que le volume
d'une composition de concentration en IgG de 50 g/I. Il en résulte qu'à
concentration en excipients identique, la quantité d'excipients administrée
avec la
composition de concentration en IgG de 100 g/I sera deux fois moins importante
que la quantité d'excipients administrée avec la composition de concentration
en
IgG de 50 g/I. Le risque d'induire des effets secondaires liés aux excipients
est
donc significativement réduit.
L'invention concerne une composition d'immunoglobulines G comprenant du
mannitol, de la glycine et un détergent non ionique caractérisée en ce que la
concentration en immunoglobulines G est de 100 g/I 20 g/I.
Dans la suite de la description, la composition selon l'invention comprenant
100 g/I
g/I d'immunoglobulines G peut également être appelée composition d'IgG
10%
15 La composition selon l'invention est caractérisée par une concentration en
immunoglobulines G de 100 g/L 20 g/I, c'est-à-dire que la composition selon
l'invention peut présenter une concentration en immunoglobulines G comprise
entre 80 g/I et 120 g/I. Avantageusement la composition selon l'invention
présente
une concentration en immunoglobulines G de 100 g/I 10 g/I, de préférence 100
20 g/I 5 g/I, de préférence 100 g/I.
La glycine, anciennement appelée glycocolle ou acide aminoacétique est le plus
simple des acides aminés. De préférence, la concentration en glycine de la
composition selon l'invention est comprise entre 4 g/I et 10 g/I.
Le mannitol ou 1,2,3,4,5,6-hexanehexol (C6H14O6) est un polyol ou sucre-
alcool"
similaire au xylitol ou au sorbitol. Le mannitol a été choisi par la
Demanderesse
sur des critères de stabilité à des pH acides de conditionnement des
compositions
d'IgG, ce qui évite des réactions de Maillard sur les immunoglobulines G, sur
des
critères de compatibilité pharmaceutique et sur des critères relatifs à leur
action
stabilisante des compositions d'immunoglobulines sous forme liquide. La
concentration en mannitol suffisante pour stabiliser la composition selon
l'invention
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est inférieure ou égale à 50 g/I. De préférence, la concentration en mannitol
de la
composition selon l'invention est comprise entre 20 g/l et 50 g/I. Toutes les
formes
du mannitol peuvent être utilisées.
Un détergent non-ionique approprié utilisé dans la composition selon
l'invention
est avantageusement choisi parmi le Tween 80 ou polysorbate 80
(polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate), le Tween 20
(polyoxyéthylènesorbitanne-monolaurate), le Triton X 100 (octoxinol 10) et le
Pluronic F68 (polyéthylènepolypropylène glycol). De préférence, le Tween 80 ou
le Triton X100 sont utilisés. Les détergents non ioniques peuvent également
être
combinés entre eux. De préférence, le détergent est présent à une
concentration
comprise entre 20 et 100 mg/l, de préférence entre 30 et 60 mg/l, de
préférence
entre 40 et 60 mg/1 et de préférence entre 40 et 50 mg/l. De préférence le
détergent est le polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate (polysorbate 80).
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise entre 30 et 60, de préférence
entre 40 et 50mg/I de polysorbate 80, de préférence 50mg/I.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention comprend,
ou
est de préférence constituée de
- 100 g/l d'IgG
- 32 g/l de mannitol
- 7 g/l de glycine
- 50 mg/1 de polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate (polysorbate 80).
De préférence la composition de l'invention présente un pH de 4,6 0,2.
La composition d'IgG 10% selon l'invention peut comprendre, outre le mannitol,
la
glycine et un détergent non ionique, au moins un autre additif. Cet additif
peut
aussi bien représenter un composé choisi parmi les différentes catégories de
stabilisants classiquement utilisés dans le domaine technique de l'invention,
tels
que les tensioactifs, les sucres et les acides aminés, qu'un excipient ajouté
à la
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formulation afin d'en ajuster, par exemple, le pH, la force ionique etc.
Alternativement, la composition d'IgG 10% selon l'invention ne comprend pas
d'autres excipients que lesdits mannitol, glycine et détergent non ionique.
Une
telle composition d'IgG 10% exclusivement constituée de ces trois composés
selon l'invention, présente l'avantage d'offrir une bonne stabilisation des
compositions d'IgG 10% et une réduction des durées et des coûts de préparation
à l'échelle industrielle grâce à la présence d'un nombre minimal efficace
d'excipients ainsi que la présence d'une quantité minimale efficace
d'excipients.
La composition selon l'invention est avantageusement sous forme liquide.
Dans le cadre de l'invention, les compositions d'IgG liquides signifient des
solutions aqueuses de compositions d'IgG polyclonales, directement obtenues
par
fractionnement du plasma humain, Le milieu aqueux représente de l'eau pour
préparation injectable (eau PPI) pouvant contenir des excipients
pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec les IgG. Les compositions
d'IgG peuvent au préalable subir des étapes spécifiques
d'inactivation/élimination
de virus, tel qu'un traitement solvant détergent, une pasteurisation et/ou une
nanofiltration. La composition selon l'invention comprend des IgG qui peuvent
être
polyclonales ou monoclonales. Les IgG peuvent être isolées à partir du sang
humain ou animal ou produites par d'autres moyens, par exemple par des
techniques de biologie moléculaire, par exemple dans des systèmes cellulaires
bien connus de l'homme du métier. La composition selon l'invention est
particulièrement adaptée aux IgG hautement purifiées. Avantageusement, les IgG
de la présente invention sont obtenues par fractionnement du plasma humain.
Des
méthodes de fractionnement préférées du plasma humain sont décrites par Cohn
et al (J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946), Kistler et al. (Vox Sang., 7, 1962,
414-
424), Steinbuch et al (Rev. Franç. Et. Clin. et Biol., XIV, 1054, 1969) et
dans la
demande de brevet WO 94/9334, ces documents sont incorporés par référence
dans leur globalité. Une méthode de préparation d'une composition
d'immunoglobulines G est également décrite dans la demande de brevet WO
02/092632, incorporée par référence dans sa globalité.
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La composition d'IgG 10% de l'invention sous forme liquide et/ou sous forme
lyophilisée peut en outre être à usage thérapeutique et notamment injectable
par
voie intraveineuse, parentérale ou sous-cutanée. La composition d'IgG 10% de
l'invention, sous forme liquide après un stockage durant une période de 6 mois
à
5 C ou à 25 C présente un taux de polymères bien en deçà des normes fixées par
la Pharmacopée Européenne (3%), avantageusement inférieur à environ 0,3%.
La composition de l'invention peut être une composition pharmaceutique, c'est-
à-
dire adaptée à un usage thérapeutique.
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans toutefois en
limiter la
portée.
LEGENDE DES FIGURES:
La figure 1 est un graphe représentant la mesure de la turbidité sur les
compositions testées stressées et non stressées.
La figure 2 est un graphe représentant le pourcentage d'activité anti-HBs des
lots
durant les 6 mois de stabilité aux 2 températures de stockage par rapport à
T0.
La figure 3 est un graphe représentant l'activité anti-complémentaire des
solutions
après stress d'agitation ou sans stress (NS) en fonction de la dose de
détergent
ajoutée.
EXEMPLES :
Exemple I: Préparation des compositions d'IgG 10% à tester
Une composition d'IgG a été obtenue selon la méthode développée par la
Demanderesse dans la demande de brevet internationale WO 2007/077365 ou
WO 02/092632. Cette composition, contenant environ 100 g/l d'IgG (IgG 10%),
est
ajustée à un pH compris entre 4,6 et 4,8.
A cette composition d'IgG 10%, on ajoute le mannitol, la glycine et le
Polysorbate
80 seuls ou en mélange dans les concentrations précisées au Tableau 1.
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Tableau 1: Caractéristiques des solutions test
Composition en Composition F1 Composition F2 Composition F3
excipients
IgG (g/I) 100 100 100
Glycine (g/I) 22,5 7 7
Mannitol (g/I) 0 32 32
Polysorbate 80 0 0 40
(g/I)
pH final 4,6 0,1 4,6 0,1 4,6 0,1
Exemple 2 : Stress appliqués aux compositions
Les compositions de l'exemple 1 (F1, F2 et F3) sont ensuite soumises à
différents
essais de stress thermique, d'agitation et d'oxydation.
Le stress thermique est effectué selon la publication de P. Fernandes et al,
Vox
Sanguinis, 1980,39, p. 101-112. En résumé, des échantillons de 5 ml de
solution
test sont placés dans des flacons en verre sertis de 10 ml et sont ensuite
chauffés
au bain-marie à 60 C pendant 2 heures.
Le stress d'agitation est effectué comme décrit dans la publication de H.
Levine et
al, Journal of Parental Science & technology, 1991, vol. 45, n 3, p. 160 165.
Ainsi,
on place des échantillons de 5 ml de solution test dans des flacons en verre
sertis
de 10 ml protégés de la lumière, puis chaque flacon est mis en position
couchée
sur un agitateur IKA Vibrax XR (provenant de chez Fisher Scientific, France),
et
est ensuite agité à 500 tours par minute pendant 18 heures à température
ambiante.
Le stress d'oxydation est réalisé sur des échantillons de 10 ml de solution
test
placés dans des flacons en verre de 30 ml. On ajout du peroxyde d'hydrogène
(H202) dans chaque échantillon de manière à obtenir une concentration finale
en
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[H2O2] égale à 9 mM. Après bouchage et homogénéisation des flacons, ceux-ci
sont incubés 1 h à 25 C.
Exemple 3 : mesure de la turbidité
Chacune des compositions de l'exemple 1 (F1, F2 et F3) est soumise ou non à un
stress tel que défini à l'exemple 2. Une mesure de la turbidité est réalisée
sur
chaque échantillon. Plus les valeurs de turbidité mesurées sont faibles, plus
les
solutions d'IgG sont stables face au stress appliqué.
Les différents résultats de mesure obtenus après l'application des différents
stress
précédents, sont présentés dans le Tableau 2.
Tableau 2
Turbidité (NTU*)
Solution test Avant stress Après stress Après stress Après stress
d'agitation thermique d'oxydation
F1 3,0 11,9 16,2 4,1
F2 2,8 12,4 13,8 4,5
F3 2,7 2,7 9,5 2,7
*NTU : Normalized Turbidity Units
Les résultats montrent que la turbidité de la composition F3 est la seule à ne
pas
évoluer après les stress d'agitation et d'oxydation. C'est aussi la valeur la
moins
élevée après le stress thermique (Figure 1).
Exemple 4: Mesure de l'activité anti complémentaire (AAC) (Méthode 2.6.17
de la pharmacopée européenne)
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Les compositions F1, F2 et F3, stressées ou pas, sont soumises au test d'AAC
(Méthode 2.6.17 de la pharmacopée européenne) avant et après chaque stress tel
que décrit dans l'exemple 2. Ce test décrit l'aptitude des immunoglobulines à
activer le système du complément, une activation trop puissante du complément
pouvant nuire à la tolérance du produit lors de son injection. Les solutions
oxydées
n'ont pas été données à analyser, la présence d'eau oxygénée perturbant le
dosage.
Le tableau 3 présente les l'AAC des solutions avant et après stress.
Tableau 3
AAC (%)
Solution test Avant stress Après stress Après stress
d'agitation thermique
F1 80 100 52
F2 61 100 51
F3 42 43 51
Seule la formulation F3 est conforme à la norme de la Pharmacopée européenne
au départ et après agitation. Les formulations F1 et F2 ont une AAC non
conforme
dans tous les cas étudiés.
Exemple 5 : aspect visuel
Chacune des compositions de l'exemple 1 (F1, F2 et F3) sont soumises ou non à
un stress tel que défini à l'exemple 2. On observe ensuite au travers d'une
mireuse pharmacopée (Méthode 2.9.20 de la pharmacopée européenne) l'aspect
visuel de chacun des échantillons. L'aspect visuel permet de détecter la
présence
de particules de grandes tailles dans la composition. L'apparition de telles
particules traduit une dénaturation de la solution protéique.
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Tableau 4
Aspect visuel
Solution test Avant stress Après stress Après stress Après
d'agitation thermique oxydation
F1 sans agrégats agrégats agrégats sans agrégats
F2 sans agrégats agrégats agrégats sans agrégats
F3 sans agrégats sans agrégats sans agrégats sans agrégats
Seule la formulation F3 ne présente pas d'agrégats visibles dans tous les cas
étudiés et supporte l'agitation et l'oxydation sans modification apparente.
Exemple 6 : Mesure DLS (Dynamic Light Scattering)
Chacune des compositions de l'exemple 1 (F1, F2 et F3) sont soumises ou non à
un stress tel que défini à l'exemple 2. Les échantillons sont ensuite analysés
dans
un appareil mesurant la taille des particules par diffusion dynamique de la
lumière
(nanosizer Malvern). L'appareil permet de mesurer l'intensité de rayonnement
de
stokes émis par les particules de taille comprise entre 0,6 nm et 6 pm. Les
particules > 100 nm correspondent aux agrégats de protéines. Le tableau 4
présente l'intensité relevée pour chaque échantillon pour des particules de
taille >
100 nm (et < à 6 pm).
Tableau 5
DLS :% intensité des particules de taille > 100 nm
Solution test Avant stress Après stress Après stress Après
d'agitation thermique oxydation
F l 0 40* 49* 0
F2 0 46* 77* 3
F3 0 6 78 0
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Seules les solutions oxydées et la formulation F3 agitée sont pratiquement
identiques aux solutions non stressées.
* A noter que les valeurs obtenues pour F1 et F2 avec le stress d'agitation et
le
stress thermique sont erronées car elles ne prennent pas en compte les
particules
> 6 pm (limite haute des particules pouvant être détectées) présente dans les
échantillons. Ces particules > 6 pm sont nombreuses et observées à l'ceil nu
(voir
exemple 4).
Exemple 7 : Stabilité des compositions (6 mois)
Pour étudier la stabilité d'une formulation d'IgG selon l'invention,
concentrée à
10%, 3 lots laboratoire (LLO1, LL02 et LL03, issus de différents lots d'IgG à
5%)
ont été fabriqués et mis en stabilité à 5 C et 25 C pour une durée de 6 mois.
La formulation des lots est pratiquement telle que définie dans la composition
F3
de l'exemple 1 c'est-à-dire à une concentration finale en protéines de 100
g/l, en
mannitol de 32 g/l, en glycine de 7 g/l et en polysorbate 80 de 40 + 5 mg/l.
Les mesures de turbidité et d'AAC sont effectuées et l'aspect visuel est
évalué sur
chacun des lots comme décrit dans les exemples précédents.
Quatre autres paramètres sont également mesurés au cours du temps : le dosage
des anticorps contre l'antigène de surface de l'hépatite B (activité anti-HBs)
selon
la Pharmacopée Européenne (2.7.1), l'intégrité de la fonction Fc selon la
Pharmacopée Européenne (2.7.9), le dosage de l'activateur de prékallikréine
(pKa) et de la kallikréine et le dosage de la distribution de taille
moléculaire (ou
DTM).
Résultats :
= Turbidité, AAC, intégrité de la fonction Fc, teneurs en pKa et kallikréine
et
aspect visuel pour chaque lot LL01, LL02 et LL03 au cours du temps :
CA 02771681 2012-02-21
WO 2010/076537 15 PCT/FR2009/052714
La turbidité, l'aspect, la fonction Fc, les teneurs en pré-kallikréine et
kallikréine
sont stables à 5 C et à 25 C dans les 3 lots et n'évoluent pas de manière
significative.
Il n'y a par ailleurs, pas de variation significative des résultats d'activité
anti-
complémentaire qui restent tous dans la norme de la Pharmacopée Européenne.
= Activité anti-HBs des lots LL01, LL02 et LL03 au cours du temps :
A chaque échéance, le pourcentage d'activité anti-HBs est calculé par rapport
à
TO de la manière suivante :
Pourcentage d'activité (%/TO) = (100 X Tx)/T0 avec Tx = activité à l'échéance.
La figure 2 donne une représentation des résultats obtenus en pourcentage
d'activité anti-HBs durant les 6 mois de stabilité aux 2 températures de
stockage.
L'activité anti-HBs des solutions en stabilité à 25 C diminue dès 1 mois dans
les 3
lots pour devenir non conforme aux spécifications internes fixées ( 20 %)
pour les
LL01 et LL03, tandis que l'activité anti-HBs n'évolue pas de manière
significative à
5 C. Ce phénomène de baisse de l'activité anti-HBs est comparable à celui
observé sur l'IgG 5 % et n'est donc pas lié à la concentration des Ig.
= DTM :
Malgré une légère hausse au cours du temps, notamment à 25 C, les taux de
polymères et de fragments restent dans les limites d'alerte (< 1 % pour les
polymères et < 3 % pour les fragments).
A 6 mois le taux des dimères avoisine les 10 % et reste aussi dans les limites
d'alerte fixées (< 13 %).
En conclusion, les trois lots de laboratoire d'IgG 10 % sont stables 6 mois à
5 C et
C sur les paramètres étudiés. On observe néanmoins une baisse de l'activité
25 anti-HBs à 25 C qui semble corrélée à l'augmentation du taux de fragments.
CA 02771681 2012-02-21
WO 2010/076537 16 PCT/FR2009/052714
Exemple 8 : dose optimale de détergent
Une étude quantitative du détergent est réalisée pour déterminer la dose
optimale
pour assurer la stabilité du produit.
On travaille sur des solutions à 100 g/l en protéines formulées à 7 g/l en
glycine,
32 g/l en mannitol et à des doses croissantes de polysorbate 80 de 0 à 100
mg/1
par pas de 10 mg/1 (soit un total de 10 échantillons testés). Le pH de ces
solutions
est ajusté à 4,6.
Les mesures de turbidité et d'AAC sont effectuées et l'aspect visuel est
évalué sur
chaque échantillon comme décrit dans les exemples précédents.
= Turbidité et aspect visuel :
Seule la formulation sans polysorbate 80 présente une modification de son
aspect
visuel après agitation et une turbidité très élevée: il y a apparition
d'agrégats.
= AAC :
Les résultats montrent que l'activité anti-complémentaire (AAC) est non
conforme
à la norme de la pharmacopée européenne pour les échantillons dosés à 10 et 20
mg/1 de polysorbate 80 (Figure 3).
Une limite inférieure de 30 mg/1 de polysorbate est donc retenue car
l'activité anti-
complémentaire reste conforme pour des concentrations supérieures à 30 mg/l.
Entre 40 et 100 mg/1 de polysorbate 80, l'activité anti-complémentaire, ainsi
que
tous les autres paramètres testés, restent constants.
Exemple 9 : Stabilité d'une formulation à 50mg/l polysorbate 80
Trois lots de la formulation suivante ont été préparés :
- 100 g/l d'IgG
- 32 g/l de mannitol
CA 02771681 2012-02-21
WO 2010/076537 17 PCT/FR2009/052714
- 7 g/I de glycine
- 50 mg/1 de polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate (polysorbate 80).
Le pH est ajusté à 4,6 0,2.
La stabilité de ces trois lots a été testée à 5 C et à 25 C, pendant 18 mois.
Pour cela, les paramètres suivants ont été contrôlés.
Tableau 6 :
analyses Valeurs attendues
Aspect de la solution limpide ou légèrement opalescent, incolore ou légèrement
jaune,
sans particules visibles
pH 4,6 0,2
Turbidité (NTU) pas d'évolution / To
Polymères (%) < 1,0 %
Dimères (%) < 13,0 %
Monomères (%) NA
Fragments (%) < 3,0 %
AAC(%) <_50%
Anti-HBs (UI/ml) 20 % valeur à To
IgG (g/I) pas d'évolution / To
IgG1 (g/I) pas d'évolution / To
IgG2 (g/I) pas d'évolution / To
IgG3 (g/I) pas d'évolution / To
IgG4 (g/I) pas d'évolution / To
pKa (UI/ml) <_ 35 UI/ml
Kallicréine (UI/ml) < 2 UI/ml
Fonction Fc (%) >_ 60 %
Les trois lots se sont montrés stables à 5 C, les paramètres mesurés étant
conformes aux spécifications de la Pharmacopée Européenne après 18 mois de
stockage.
Les trois lots se sont montrés stables à 25 C également, les paramètres
mesurés
étant conformes aux spécifications de la Pharmacopée Européenne après 18 mois
de stockage, seul le taux de fragments a présenté une hausse et l'activité
anti-
HBs a présenté une baisse, mais qui reste conforme aux spécifications de la
Pharmacopée Européenne.
