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Polymère amphiphile fonctionnalisé par la méthionine
La présente invention concerne des nouveaux polymères amphiphiles à
squelette hydrophile et porteurs de groupements hydrophobes dont des
groupements
méthionine.
D'une manière générale, les polymères amphiphiles sont capables selon leurs
structures chimiques de former des nanoparticules de taille variable en milieu
aqueux.
Ainsi, des polymères dont le squelette est linéaire, hydrophile et porteur de
groupements
hydrophobes latéraux, peuvent former aisément des nanoparticules dans l'eau.
Ces
nanoparticules, selon le matériau de base utilisé pour leur fabrication,
peuvent être
biocompatibles et éventuellement biodégradables. Elles trouvent des
applications
notamment dans le domaine de la médecine pour la vectorisation des
médicaments.
Dans ce domaine, la société déposante développe depuis une dizaine d'années
des systèmes nanoparticulaires et microparticulaires à base de polyaminoacides
comportant
divers groupements hydrophobes et dénommés Medusâ .
Ainsi, la demande de brevet WO 2003/104303 de la société FLAMEL
TECHNOLOGIES décrit des polymères d'acide glutamique comportant des greffons
d'alpha-tocophérol qui forment dans l'eau des nanoparticules capables
d'associer
l'insuline. Dans la publication YP. Chan et al. Expert Opin. Drug. Deliv.2007,
4(4)
441-451, il est décrit que des formulations produites avec ces nanoparticules
et des
protéines telles que l'interféron alpha ou l'interleukine 2 permettent, après
une injection
sous-cutanée chez l'homme, d'obtenir des concentrations plasmatiques
mesurables pendant
une durée au moins égale à une semaine. De même, il est connu que des
polymères
amphiphiles, à base de pullulane et comportant des greffons de cholestérol
s'assemblent en
milieu aqueux pour former des nanoparticules qui sont aptes à associer de
façon réversible
des protéines telles que l'insuline (Akiyoshi et al. J. Controlled Release
1998, 54,
313-320). D'autres polymères analogues à base de chitosan ou dextran ont été
développés
notamment afin d'obtenir des films ou des implants d'hydrogels (WO 00/14155).
Comme il ressort de ce qui précède, les applications des polymères
amphiphiles dans le domaine de la formulation des protéines et des peptides
sont
nombreuses.
Malheureusement, l'obtention de formulations polymère amphiphile/protéine
stables en milieu aqueux pendant au moins deux ans à 5 C de meure un défi
majeur,
notamment au regard de la vulnérabilité de certaines protéines thérapeutiques
vis-à-vis de
l'oxydation.
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En effet, il est aujourd'hui largement reconnu que certains acides aminés tels
que la méthionine, la cystéine, l'histidine ou le tryptophane, composants de
nombreuses
protéines ou enzymes, peuvent s'oxyder lors de la formulation de celles-ci,
voire au cours
du temps. Pour des raisons évidentes, ce phénomène d'oxydation peut avoir des
conséquences néfastes sur l'activité biologique des principes actifs contenant
ces acides
aminés (Cleland et al. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier systems 1993, 10, 307-
377).
Pour prévenir cette oxydation indésirable, Takruri (US 5,272,135) a proposé en
1993, de mettre en oeuvre les protéines ou enzymes, comportant de la
méthionine dans leur
séquence, en les formulant avec de la méthionine. Ce concept est aujourd'hui
bien connu
de l'homme de l'art exerçant dans le domaine de la stabilisation des
formulations
contenant des protéines. Par exemple, la demande de brevet WO 2008/145323
décrit une
formulation d'interféron alpha contenant de 2 à 75 mM de méthionine et la
demande
US 2003/0104996 décrit des formulations d'érythropoïétine (EPO) ou
d'érythropoïétine
hyperglycosylée (NESP) dont la dégradation est limitée par l'ajout d'une
quantité de
méthionine allant jusqu'à 50 mM.
Néanmoins, cette alternative pour prévenir l'oxydation n'est pas totalement
satisfaisante.
Ainsi, la quantité de méthionine à associer à la protéine ou enzyme pour
garantir à celle-ci une stabilité à l'égard de l'oxydation est bien entendu
susceptible de
varier selon la nature de la protéine, sa concentration, le pH et d'autres
éléments de la
formulation. D'autre part, lorsque cette protéine ou ce peptide est déjà mis
en oeuvre sous
une forme associée avec un polymère amphiphile tel que défini précédemment,
l'efficacité
de la méthionine peut être altérée. Enfin, dans le cas particulier d'un
implant ou d'un gel
obtenu à partir d'un tel polymère amphiphile, la méthionine ajoutée peut
perdre de son
efficacité car elle ne peut pas être distribuée de façon homogène et pérenne
dans l'implant
ou le gel.
La présente invention vise précisément à suppléer aux insuffisances précitées.
Plus précisément, la présente invention a pour objectif de proposer un nouveau
type de polymère amphiphile, susceptible d'être mis en oeuvre à titre de
véhicule d'un
actif, et plus particulièrement de type protéine, peptide ou enzyme
naturellement sensible à
un phénomène d'oxydation, et qui soit précisément apte à garantir à un tel
actif une
stabilité contre ce phénomène.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est que ces polymères
soient en outre à caractère associatif et, à ce titre, puissent être utilisés
comme vecteurs de
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principes actifs, et donc manifestent une capacité à s'associer facilement
avec de nombreux
principes actifs et à les libérer in vivo.
En conséquence, la présente invention vise, selon l'un de ses aspects, un
polymère amphiphile comportant un squelette hydrophile, caractérisé en ce que
ledit
squelette est porteur d'au moins un groupement latéral méthionine ou un de ses
dérivés et
de groupements latéraux hydrophobes distincts de ladite méthionine ou l'un de
ses dérivés.
De préférence, le ou les groupements méthionine et/ou groupements
hydrophobes sont disposés de façon aléatoire.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne l'utilisation
d'un
polymère tel que défini ci-dessus pour la vectorisation de principes actifs,
PA, notamment
des protéines, ou peptides sensibles à l'oxydation.
Selon encore un autre de ses aspects, elle concerne des nanoparticules
comprenant au moins un polymère conforme à l'invention, en association ou non
avec un
principe actif.
Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention vise une
composition contenant un polymère conforme à l'invention et un principe actif,
organisés
ou non à l'état de nanoparticules.
Dans le cadre de la présente description, le terme méthionine sera, sans
précision contraire, utilisé pour désigner soit le résidu méthionine soit un
dérivé de celui-ci
notamment tel que défini ci-après.
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes
association
ou associer employés pour qualifier l'interaction entre un ou plusieurs
principes actifs
et les polymères considérés selon l'invention signifient, en particulier, que
le ou les
principes actifs sont liés au(x) polymère(s) notamment par une interaction
hydrophobe
et/ou électrostatique, et/ou sont solubilisés par le ou les polymères.
Au sens de la présente invention, le terme latéral ou latéraux
signifie
que les groupements hydrophobes et méthionines sont disposés de manière à
figurer des
groupements pendants ou encore des greffons au niveau du squelette
linéaire.
Au sens de la présente invention, on entend signifier par aléatoire que
l'unité ou les unités monomères du polymère amphiphile de l'invention
porteuse(s) de
groupement(s) méthionine et celle(s) porteuse(s) de groupement(s)
hydrophobe(s) sont
réparties de manière irrégulière au sein du squelette hydrophile,
indépendamment de la
nature des unités adjacentes.
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Comme il ressort de ce qui suit, il est du mérite de la société déposante
d'avoir
mis au point une nouvelle famille de polymères amphiphiles, aptes à former des
systèmes
nanoparticulaires stables et dont le squelette hydrophile comporte d'une part
un ou
plusieurs greffons latéraux méthionine, et d'autre part plusieurs groupements
latéraux
hydrophobes distincts de la méthionine.
Le document WO 2008/094144 décrit déjà un polymère hydrophile de type
polyaspartique portant des greffons méthionine et/ou cystéine. Ce type de
polymère est
toutefois dénué de greffons hydrophobes distincts de la méthionine comme
requis selon
l'invention. Par ailleurs, il n'y est proposé qu'à des fins de traitement de
surface de
nanoparticules. Ce document n'est donc aucunement concerné par l'activité
antioxydante
de la méthionine et encore moins par la valorisation potentielle de celle-ci à
des fins de
mise au point d'un véhicule polymérique apte à préserver une stabilité contre
l'oxydation à
des actifs précisément sensibles à ce phénomène.
Contre toute attente, les inventeurs ont constaté que la présence de
méthionine
à l'état de greffon(s) au niveau d'un polymère amphiphile permet de conférer
audit
polymère une activité antioxydante significative, sans par ailleurs affecter
son aptitude,
d'une part à s'associer à un principe actif et, d'autre part, à s'organiser à
l'état de
nanoparticules lorsqu'il est mis en présence d'un milieu aqueux.
Qui plus est, le polymère considéré selon l'invention, se prête
avantageusement
à un ajustement en terme d'activité antioxydante au regard de son taux de
greffage en
méthionine. Cette possibilité de moduler le taux de greffage de la méthionine
est
particulièrement appréciable au regard du fait qu'elle permet d'ajuster
l'activité
antioxydante du polymère selon l'invention en fonction de la sensibilité à
l'oxydation de la
protéine ou du peptide devant être stabilisé(e) par ledit polymère.
POLYMERE AMPHIPHILE
- Squelette hydrophile
Comme précisé ci-dessus, le polymère amphiphile considéré selon l'invention
possède un squelette hydrophile.
Avantageusement, les polymères considérés selon l'invention possèdent un
squelette polymérique soluble dans l'eau, notamment à un pH compris entre 5 et
8.
Ce squelette peut notamment être choisi parmi un polymère ou copolymère
appartenant à la famille des polyaminoacides, des polysaccharides, des
polyacrylates ou
des polyméthacrylates.
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Conviennent à ce titre tout particulièrement,
- les polyaminoacides tels que les poly(acide glutamique) (de type alpha ou
gamma), les poly(acide aspartique) (de type alpha ou alpha/beta), les
polylysines (de type
alpha) ou des copolymères formés par combinaisons de ces mêmes acides aminés,
5 - les poly(acide acrylique) ou poly(acide méthacrylique), et
- les polysaccharides tels que le dextran ou l'un de ses dérivés tels que le
carboxyméthyl dextran ou l'hydroxyéthyl dextran ou des pullulanes.
Selon un mode de réalisation particulier, le squelette hydrophile du polymère
amphiphile de l'invention est un polyaminoacide choisi parmi les poly(acide
glutamique),
les poly(acide aspartique), les polylysines, ou leurs copolymères.
Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple de
type poly(acide alpha-L-glutamique), poly(acide alpha-D-glutamique),
poly(acide gamma-
L-glutamique) et poly(alpha-L-lysine) de masses variables sont disponibles
commercialement.
Les polymères susceptibles de former le squelette hydrophile des polymères
amphiphiles de l'invention peuvent en outre être obtenus par des méthodes
connues de
l'homme de l'art.
Par exemple, la synthèse d'un polyglutamate de sodium de type alpha, peut
être réalisée via la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides
(NCA), comme
décrite, par exemple, dans l'article "Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans
l'ouvrage de H.R.
Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related Heterocycles"
Springer
Verlag (1987). Le dérivé de NCA est de préférence NCA-Glu-O-R3 (R3 = méthyle,
éthyle
ou benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolysés dans des conditions
appropriées pour
obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la
description
donnée dans le brevet FR 2 801 226 de la société déposante.
Ces polymères possèdent comme groupements activables des fonctions
carboxyliques, amines ou alcools. On peut donc envisager sans difficulté leur
greffage.
D'une manière générale, les polymères linéaires à squelette hydrophile sont
greffés en même temps ou en séquentiel par le ou les groupements hydrophobes
et la ou les
méthionine(s) ou dérivé(s) de méthionine.
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- Groupements hydrophobes et groupements méthionine
Suivant une caractéristique essentielle de l'invention, les polymères de
l'invention sont greffés d'au moins un groupement pendant méthionine (GM) et
de
groupements hydrophobes pendants différents de la méthionine (GH).
- Groupement méthionine (GM)
Au sens de la présente invention, l'expression dérivé de méthionine entend
plus particulièrement désigner les dérivés de substitution, notamment au
niveau de la
fonction amine ou carboxylique de la méthionine.
Il s'agit par exemple de la méthionine amide ou de l'ester éthylique de la
méthionine.
Ces composés sont plus particulièrement avantageux pour réaliser une réaction
de couplage via la fonction amine de la méthionine.
Il est évident que la méthionine comporte deux fonctions réactives - acide
carboxylique et amine primaire - et selon la réaction de couplage mise en
oeuvre, l'une ou
l'autre des fonctions doit être protégée.
La méthionine utilisable dans les polymères de l'invention peut être de
configuration L, D ou un mélange racémique.
Selon le type de greffage, la fonction de liaison est de type amide ou ester.
Le
groupement méthionine, une fois greffé sur le polymère, possède généralement
l'une des
trois structures ci-dessous :
YO
O NH Rb O Rb
HN N,, N
Ra O Rc O Rc
SMe SMe SMe
(I) (II) (III)
dans lesquelles
- Ra représente un groupement hydroxy (éventuellement déprotoné), NH2,
OMe, OEt, NHCH3 ou N(CH3)2,
- Rb et Rc représentent indépendamment un atome d'hydrogène, un méthyle ou
un éthyle,
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avec lorsque l'un des groupements Rb et Rc est un atome d'hydrogène, alors
l'autre groupement représente un groupement acyle de C1 à C6, et la
configuration de la
méthionine pouvant être L, D ou un mélange racémique.
- Groupements hydrophobes (GH)
Les groupements hydrophobes sont, en pratique et sans que cela ne soit
limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les amines, ces
composés
pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art, et leur greffage
mettant en
oeuvre des réactions analogues à celles requises pour le dérivé de la
méthionine.
Suivant une caractéristique préférée, le groupement hydrophobe (GH)
comporte de 5 à 30 atomes de carbone.
Ces groupements hydrophobes (GH) sont avantageusement et judicieusement
sélectionnés dans le groupe comprenant :
- les alkyles linéaires ou ramifiés en C5 à C30 comportant éventuellement au
moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
- les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 comportant éventuellement au
moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, et
- les (poly)cycliques en C1o à C30 comportant éventuellement au moins une
insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
Plus particulièrement, les groupements hydrophobes (GH) peuvent être, par
exemple, des groupements choisis dans le groupe comprenant :
- le dodécanoxy, le tétradécanoxy, l'héxadécanoxy, l'octadécanoxy, l'oleyloxy,
le tocophéryle ou le cholestéryle, l'aminohexyle, l'aminohéxadécyle et
l'aminooctadécyle,
- le lauryle, le myristyle, le palmityle et le stéaryle,
- un acide aminé hydrophobe tel que la leucine, la valine, la phénylalanine,
le
tryptophane ou la tyrosine ou un de leurs dérivés.
Quand le groupement hydrophobe est un acide aminé, il peut être un dérivé
correspondant à l'une des structures ci-dessous (IV), (V) ou (VI) dans
lesquelles Ra, Rb et
Rc correspondent aux définitions données précédemment et Rd correspond à un
résidu
d'acide aminé selon le type de polymère et la réaction de greffage mise en
oeuvre.
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8
Y O
O NH Rb O Rb
HN N,, N~,
Y~-R. O Rc O Rc
Rd Rd Rd
(IV) (V) (VI)
Alternativement, la ou les méthionine(s) ou dérivé(s) de méthionine et/ou les
groupements hydrophobes peuvent être lié(e)(s) au squelette polymérique via un
espaceur
permettant de les relier à la chaîne de polymère. Cet espaceur est
avantageusement divalent
et appartient au groupe comportant notamment les unités acide aminé, les
dérivés des
aminoalcools, les dérivés des diamines, les dérivés diols et les dérivés des
hydroxyacides.
Selon un mode particulier de l'invention, le squelette hydrophile du polymère
amphiphile est un poly(L)glutamate de sodium, et le groupement hydrophobe un
groupement tocophéryle d'origine synthétique et, de préférence, le dérivé de
la méthionine
est la méthionine amide ou l'ester éthylique de la méthionine.
En conséquence, les polymères amphiphiles préférés de l'invention peuvent
être schématisés par le fait qu'ils sont formés d'une séquence de structure
générale (I)
suivante
* A A A
a b c
1 E I n 1 E Ip
GM GH (I)
dans laquelle,
- A représente des unités monomériques de la chaîne de polymère hydrophile,
- GM représente la méthionine ou un de ses dérivés,
- GH représente un groupement hydrophobe, et
- E et E' représentent un groupement espaceur avec n et p représentant
indépendamment l'un de l'autre 0 ou 1,
avec a, b et c étant des entiers différents de zéro,
les groupements hydrophobes GH et les groupes méthionines GM étant répartis
de façon aléatoire.
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Avantageusement, le pourcentage molaire en groupements hydrophobes est
figuré par le rapport c/(a+b+c) et le pourcentage molaire en groupement
méthionine est
figuré par le rapport b/(a+b+c).
Le taux de greffage molaire en motifs hydrophobes dans les polymères selon
l'invention, varie avantageusement de 2 à 30 %, et de préférence de 5 à 20 %.
Le taux de greffage molaire, en motif(s) méthionine dans les polymères selon
l'invention, varie de 0,5 à 20 %.
Pour ce qui est du rapport molaire a/a+b+c, il varie entre 40 et 97,5 %.
Avantageusement, les polymères selon l'invention ont une masse molaire en
poids qui se situe entre 2 000 et 200 000 g/mole, et de préférence entre 5 000
et
100 000 g/mole.
Selon une autre variante, les polymères selon l'invention peuvent être
également porteurs d'au moins un greffon de type polyéthylène glycol.
De préférence, la masse molaire du polyéthylène glycol est de 1 000 à
5 000 Da. Le groupement de type polyéthylène glycol peut être représenté
schématiquement selon l'une des structures suivantes
Me O /O
n
Me v / O"~\N'~'
n H
O
Me v / O
n
O
De préférence, le pourcentage molaire de greffage en polyéthylèneglycol varie
de 1 à 10 %. Ce motif peut être directement lié ou non au squelette hydrophile
du polymère
selon l'invention.
PROCEDE DE PREPARATION DU POLYMERE AMPHIPHILE
Pour ce qui est de la méthionine, le greffage de sa fonction amine peut être
réalisé aisément par couplage de celle-ci avec une fonction carboxylique
présente sur le
squelette du polymère amphiphile, en présence d'un agent de couplage tel qu'un
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carbodiimide et d'un catalyseur tel que la diméthylaminopyridine. Cette
réaction peut être
réalisée dans un solvant organique ou en phase aqueuse. Dans le deuxième cas,
on utilisera
de préférence un carbodiimide hydrosoluble. La fonction carboxylique peut être
laissée
libre ou protégée par un groupement formant une liaison ester ou amide.
5 Ainsi, lorsque le polymère possède des fonctions amines ou alcools, le
greffage
de la méthionine se fait alors via la fonction carboxylique, en ayant protégé
au préalable la
fonction amine de la méthionine par un groupement acyle ou par diméthylation.
Ces
réactions sont bien connues de l'homme de l'art et l'ouvrage de G. Hermanson
(Bioconjugate Techniques 2eme édition 2008, Elsevier), par exemple, décrit ces
10 méthodologies.
Pour leur part, les groupements hydrophobes (GH) pendants peuvent êtres liés
au polymère via une fonction amide, ester, carbonate ou carbamate, selon la
nature de la
fonction activable du polymère et celle du greffon.
De préférence, la liaison est de type amide ou ester comme pour le dérivé
méthionine. Dans ce cas, le greffage du dérivé méthionine et du groupement
hydrophobe
peut se faire simultanément.
Pour l'obtention d'un polyaminoacide greffé avec des groupements
hydrophobes, on réalise une réaction de couplage entre le groupement
hydrophobe
comportant une fonction réactive amine ou alcool et le polymère comportant des
fonctions
acide carboxylique en présence d'un agent de condensation tel que le
diisopropylcarbodiimide et d'un catalyseur tel que la diméthylaminopyridine.
Cette
réaction peut se faire dans un solvant tel que le diméthylformamide (DMF), le
diméthylsulfoxyde (DMSO) ou la N-méthylpyrrolidone (NMP). Idéalement le
greffage de
la méthionine est réalisé en même temps. Les liaisons formées sont des
liaisons ester ou
amide.
Les réactifs de couplage tels que les chloroformiates peuvent également être
utilisés pour la formation de liaisons amides (voir par exemple l'ouvrage de
Bodanszky
Principles of Peptide Synthesis Springer Verlag 1984 pour des exemples
d'agents de
couplages). Le taux de greffage est contrôlé chimiquement par la
stoechiométrie des
constituants et réactifs et/ou le temps de réaction.
S'agissant d'un polymère comportant des groupements amines tels que la
polylysine ou le dextran comportant par ailleurs des groupements alcool, les
groupements
hydrophobes considérés sont alors porteurs de groupements acide carboxylique.
Les
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liaisons formées après couplage sont notamment des liaisons ester, amide,
carbonate ou
carbamate.
A titre d'exemples, nous décrivons ci-après plusieurs types de polymères
amphiphiles pouvant comporter à la fois des groupements hydrophobes GH et des
groupements méthionine GM, et la façon de les obtenir selon des modes
opératoires
indiqués dans la littérature.
Pour ce qui le concerne, un polymère de type pullulane greffé par le
cholestérol
peut être synthétisé selon le mode opératoire décrit dans le brevet US
6,566,516. On
prépare ensuite un dérivé ayant un isocyanate réactif en faisant réagir un
diisocyanate avec
une méthionine dont la fonction acide est protégée par un -NH2 (amide) ou un
-OMe (ester). Ce mode opératoire est classique et est décrit dans l'exemple 1
du même
brevet. Le greffage peut être réalisé selon le mode opératoire décrit dans
l'exemple 2.
Enfin, un polymère de type dextran greffé par un groupement lauroyle et un
dérivé de la méthionine peut être obtenu en faisant réagir le polymère dextran
avec le
chlorure d'acide de l'acide laurique et le chlorure d'acide de la N-
acétylméthionine dans la
N-méthylpyrrolidone. Le mode opératoire pour l'obtention de dextran greffé par
le
groupement lauroyle est décrit dans le brevet US 5,750,678 (exemple 1).
De même, un polyacrylate comportant la stéarylamine et la méthionine amide
peut être préparé selon le mode opératoire décrit dans le brevet US 6,607,714
en ayant la
méthionine amide présente en quantité désirée lors de l'étape de greffage.
Un poly(gamma)glutamate comportant un ester de la phénylalanine et un ester
de la méthionine peut être également préparé selon le protocole décrit par
Matsusaki et al.
Chem. Letters 2004, 33, 398-399. On peut greffer simultanément sur un acide
poly(gamma-glutamique) dans l'eau un mélange d'un ester éthylique de la
méthionine et
un ester éthylique de la phénylalanine en présence d'un carbodiimide soluble
dans l'eau.
Enfin, une polylysine comportant un groupement stéaroyle, la
N-acétylméthionine et une chaîne polyéthylène glycol peut être préparée selon
le mode
opératoire décrit par Brown et al., Bioconjugate Chem 2000, 11, 880-891. Dans
ce mode
de réalisation, le dérivé méthionine à greffer sur la polylysine contient le
groupement
hydroxysuccinimide sur le carboxylate et un acétyle sur la fonction amine.
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PRINCIPE ACTIF (PA)
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les principes actifs, PA,
susceptibles d'être associés à un polymère selon l'invention sont choisis
parmi les
protéines, ou peptides, c'est-à-dire des PA sensibles au phénomène
d'oxydation.
Plus particulièrement, ce sont des peptides ou des protéines comportant dans
leur séquence au moins une méthionine. En effet, les méthionines sont
particulièrement
susceptibles à l'oxydation.
Dans cette catégorie, les protéines telles que l'hormone de croissance, les
interférons, les protéines facteurs de coagulation telles que le facteur VII,
facteur VIII et
facteur IX, l'EPO, le GCSF et les anticorps monoclonaux sont connues pour être
facilement oxydées. Ces protéines peuvent éventuellement comporter au moins
une chaîne
polyéthylène glycol.
Les techniques d'association d'un ou de plusieurs PA à un polymère amphiphile
selon l'invention, sont décrites notamment dans le brevet US 6,630,171.
Elles consistent à incorporer au moins un principe actif dans le milieu
liquide
contenant des polymères de l'invention chargés en, ou associés avec, un ou
plusieurs
principe(s) actif(s). Cette incorporation peut être réalisée de la manière
suivante : mise en
solution aqueuse du polymère, puis ajout du principe actif, sous forme solide
ou en
solution aqueuse.
De préférence, le principe actif est choisi dans le groupe comprenant : les
protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes
polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylène glycol (PEG): "protéines-
PEGylées"].
NANOPARTICULES
Avantageusement, les polymères considérés selon l'invention en association ou
non avec un PA, notamment tel que défini ci-dessus, sont aptes à former
spontanément des
nanoparticules lorsqu'ils sont mis en dispersion dans un milieu aqueux de pH
allant de 5 à
8, notamment dans l'eau.
D'une manière générale, la formation de nanoparticules est due à une
auto-association entre une multitude de chaînes de polymères avec ségrégation
des
groupements hydrophobes dans des nanodomaines. Une nanoparticule peut contenir
un ou
plusieurs nanodomaines hydrophobes.
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La taille des nanoparticules de polymère peut varier de 1 à 1 000 nm, en
particulier de 5 à 500 nm, notamment de 10 à 300 nm, et plus particulièrement
de 10 à
200 nm, voire de 10 à 100 nm.
APPLICATIONS
Comme précisé ci-dessus, les polymères amphiphiles de l'invention sont
susceptibles d'être utilisés de plusieurs façons selon la nature des
groupements
hydrophobes, leur pourcentage molaire en méthionine et leur degré de
polymérisation. Les
méthodes de mise en forme d'un polymère pour l'encapsulation d'un principe
actif sous les
diverses formes visées par l'invention sont connues de l'homme de l'art.
Pour plus de détails, on pourra consulter, par exemple, ces quelques
références
particulièrement pertinentes :
- formulation d'une protéine avec un polyaminoacide comportant des
groupements hydrophobes sous formes de nanoparticules ou de microparticules :
WO 00/30618, WO 2005/051418, WO 2007/141344, WO 2008/025425,
WO 2008/135561,
- formulation d'une protéine avec un pullulane comportant un groupement
hydrophobe tel que le cholestérol : US 6,566,516.
Selon un autre de ses aspects, l'invention vise une composition notamment
pharmaceutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire comprenant au moins
un
polymère tel que défini ci-dessus et au moins un principe actif, notamment
susceptible
d'oxydation. Il s'agit plus particulièrement d'une protéine, d'un peptide ou
d'une enzyme
sensible à l'oxydation.
En particulier, la protéine, le peptide ou l'enzyme contient au moins une
méthionine dans sa séquence.
Selon une variante de réalisation, ce polymère associé ou non à un PA, peut
être à l'état de nanoparticules.
Selon un mode de réalisation, la composition de l'invention peut se présenter
sous la forme d'un gel, d'une solution, d'une suspension, d'une émulsion, de
micelles, de
nanoparticules, de microparticules, d'un implant, d'une poudre, d'une
suspension, d'un
lyophilisat ou d'un film, et de préférence sous la forme de nanoparticules,
microparticules,
gels ou films.
Avantageusement, elle est apte à assurer un profil de libération régulée dudit
actif en fonction du temps.
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Suivant l'une de ses formes particulièrement préférées, la composition,
chargée
ou non en principe(s) actif(s), est une suspension colloïdale stable de
nanoparticules et/ou
de microparticules et/ou de micelles dans une phase aqueuse.
Des microparticules peuvent être obtenues par diverses méthodes telles que la
coacervation en présence d'un agent d'agrégation (ions divalents ou trivalents
ou
polyélectrolytes), précipitation par changement de pH ou de la force ionique,
extraction/évaporation, par atomisation ou par lyophilisation.
La composition selon l'invention, dès lors qu'elle est pharmaceutique, peut
être
administrée par voie orale, pulmonaire, parentérale, nasale, vaginale,
oculaire, sous-
cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intra péritonéale,
intracérébrale ou
buccale.
Selon un autre mode de réalisation, la composition peut éventuellement
contenir un excipient pour l'ajustement du pH et/ou de l'osmolarité et/ou pour
améliorer la
stabilité et/ou comme agent antimicrobien. Ces excipients sont bien connus de
l'homme de
l'art (se référer à l'ouvrage : Injectable Drug Developement, P.K. Gupta et
al. Interpharm
Press, Denver, Colorado 1999).
Les exemples et figure figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et
non
limitatif du domaine de l'invention.
Figure 1 : Représentation graphique des taux en protéine oxydée mesurés à TO
et après 2 mois T(2 mois) à 5 C, selon l'exemple 5, pour une formulation
d'interféron
alpha-2b formulé avec le polymère de l'exemple 1 conforme à l'invention
(formulation 5),
et pour une formulation comparative d'interféron alpha-2b formulé avec la
méthionine
(formulation de référence).
EXEMPLE I
Synthèse d'un polyglutamate de sodium comportant des greffons d'alpha-
tocophérol et de la méthionine
Un polyglutamate greffé statistiquement avec 5 % d'alpha-tocophérol
racémique est synthétisé selon le mode opératoire décrit dans la demande WO
03/104303
(exemple 1). 5 g du polymère sous sa forme polyacide est mis en solution à 70
C dans
77 mL de DMF. Après dissolution du solide, la solution obtenue est refroidie à
0 C.
108 mL de chloroformiate d'isobutyle et 92 ml de N-méthylmorpholine sont
ajoutés, puis
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la suspension blanche obtenue est agitée à 0 C pendant 10 min. En parallèle,
536 mg de
chlorhydrate de l'ester éthylique de la méthionine (MetOEt.HC1) sont mis en
solution dans
8,2 mL de NMP puis 349 mL de triéthylamine sont ajoutés. Ce mélange est ajouté
à la
suspension de polymère activé, et le mélange réactionnel est agité à 0 C
pendant 1 h.
5 Après ajout d'l mL d'HCl concentré (35 %) puis 50 mL d'eau, le mélange est
neutralisé
avec de la soude 1N. La solution obtenue est diafiltrée contre de l'eau salée
(0,9 %) puis de
l'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 150 mL. Le taux de greffage
molaire de
l'ester éthylique de la méthionine, déterminé par HPLC après hydrolyse acide
du
polymère, est de 1,7 % des unités monomères.
EXEMPLE 2
Synthèse d'un polyacrylate de sodium comportant des greffons d'alpha-
tocophérol et de la méthionine.
Étape 1 : Purification du polyacide acrylique commercial (Degacryl 4779L)
75 g de solution de DEGACRYL 4779L (vendu par la société Evonik) sont
dilués avec 1425 g d'eau puis diafiltrés contre 8 volumes d'eau. La solution
obtenue est
ensuite lyophilisée. La masse moléculaire moyenne Mn, mesurée par
chromatographie
d'exclusion stérique, est de 33,6 kDa en équivalent PMMA (polyméthacrylate de
méthyle)
et l'indice de polydispersité est de 2,4.
Étape 2 : Synthèse de l'ester alanine a-tocophérol (A1aVE)
A une solution de 21,1 g de N-Boc alanine, 40 g d'a-tocophérol et 0,57 g de
diméthylaminopyridine (DMAP) dans 400 mL de dichlorométhane sont ajoutés
goutte à
goutte 22 mL de N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC). Après agitation à 20 C
pendant
22 h, le mélange réactionnel est successivement lavé avec une solution d'HCl
0,1 N, de
l'eau, une solution à 5 % de bicarbonate de sodium et enfin de l'eau. La phase
organique
est évaporée à sec et l'huile obtenue est solubilisée dans 400 mL d'une
solution 4 M d'HCl
dans le dioxanne. Après 4 h d'agitation à température ambiante, le mélange
réactionnel est
évaporé à sec et cristallisé dans l'éthanol. Le chlorhydrate d'AlaVE (33,8 g
d'une poudre
blanche) ainsi préparé est analysé par RMN du proton dans le CDC13 et présente
un spectre
conforme à sa structure chimique.
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Étape 3 : Greffage de l'AlaVE et de la méthioninamide sur le polyacide
acrylique purifié
2,25 g d'AlaVE sont solubilisés dans 58 mL de DMF et 0,58 mL de
triéthylamine. En parallèle, 19 mg de chlorhydrate de méthioninamide sont
solubilisés dans
2 mL de DMF et 0,27 mL de triéthylamine. 5 g de DEGACRYL purifié (étape 1)
sont mis
en solution dans 125 mL de N,N-diméthylformamide (DMF) et 0,25 g de 4-
diméthylaminopyridine (DMAP). Cette solution est refroidie à 15 C, et on
ajoute
successivement la suspension d'AlaVE/triéthylamine, la solution de
MetNH2/NEt3, puis
1,66 mL de N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC). Le mélange réactionnel est
agité une
nuit à 15 C. Après ajout d'une solution d'HCl 35 % (0,56 mL) dilué dans 6 mL
de DMF,
le mélange réactionnel est neutralisé avec de la soude 1 N dans 200 mL d'eau.
La solution
obtenue est purifiée par diafiltration et concentrée jusqu'à un volume
d'environ 200 mL.
Le pourcentage d'AlaVE déterminé par RMN du proton dans du TFA-d est de
6 % et celui de méthioninamide greffée déterminé par HPLC après hydrolyse est
de 5,5
des unités monomères.
EXEMPLE 3
Synthèse d'un polyglutamate de sodium comportant des greffons
d'octadécylamine et de la méthionine
5 g d'un polyglutamate de DP 100 sont solubilisés à 80 C dans 110 mL de
DMF. Après dissolution du solide, une solution de 95 mg de 4-
diméthylaminopyridine
(DMAP) dans 1 mL de DMF est ajoutée, le mélange est agité à 80 C pendant 18 h,
puis
refroidi à 15 C. A une solution de 286 mg de chlorhydrate de méthioninamide
dans 5 mL
de DMF sont ajoutés 220 gL de triéthylamine et la solution est agitée à
température
ambiante. Une solution de 1,04 g d'octadécylamine dans 11 mL de DMF, la
solution
précédente, 189 mg de DMAP dans 1 mL de DMF, puis 1,26 mL de
diisopropylcarbodiimide (DIPC) sont successivement ajoutés à la solution de
polyglutamate dans le DMF. Le mélange réactionnel est agité à 15 C pendant 24
h, puis la
réaction est arrêtée en ajoutant une solution de 0,3 mL d'HCl concentré (35
%), 0,3 mL
d'eau et 5 mL de DMF. La solution est versée dans 500 mL d'eau et neutralisée
avec de la
soude 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre de l'eau salée (0,9 %)
puis de l'eau, et
concentrée. Les taux de greffage molaire de l'octadécylamine et de la
méthioninamide,
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déterminés par RMN du proton dans le TFA-d, sont respectivement de 10 et 4 %
des unités
monomères.
EXEMPLE 4
Etude de la stabilité de l'hormone de croissance formulée avec le polymère de
l'exemple 1
La formulation est préparée par simple mélange d'une solution de polymère 1
ajustée en pH (HC1 ou NaOH) et en osmolalité (NaC1) à environ pH 7,0 et 300
mOsm/Kg
et d'une solution de protéine, pour obtenir une concentration finale de 0,7
mg/mL en
hormone de croissance et 22 mg/mL en polymère 1. Dans ces conditions, la
formulation
contenant le polymère 1 a une concentration équivalente en méthionine
d'environ 2,4 MM.
La solution de polymère a préalablement été filtrée à travers un filtre de 0,2
m. La
formulation finalement obtenue est agitée pendant une nuit à température
ambiante puis est
divisée, une partie étant placée dans un réfrigérateur à 5 C. On mesure par
chromatographie liquide (HPLC) le taux d'hormone de croissance oxydée dans les
échantillons selon les conditions suivantes : Colonne Symmetry300 C18 (Waters
; 150 x
4,6 mm ; 3,5 m), débit : 0,8 mL/min, détection UV : 220 nm, température de la
colonne de 55 C, tampon phosphate de potassium 25 mM pH=6,5 / Propanol - 1
comme
éluant.
Deux résidus méthionine sont sensibles à l'oxydation dans l'hormone de
croissance : la méthionine en position 14 et la méthionine en position 125.
Ces deux
produits de dégradation sont pris en compte dans la quantification de
l'oxydation.
Les taux en protéine oxydée mesurés à TO et après 2 mois T(2 mois) à 5 C sont
donnés dans le tableau 1 suivant :
TABLEAU I
TO T(2 mois) à 5 C
Polymère 1 2,7 3,3
Protéine sans polymère 3,3 10,7
EXEMPLE 5
Etude de la stabilité de l'interféron alpha 2b formulé avec le polymère de
l'exemple 1
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La formulation (formulation 5) est préparée par simple mélange d'une solution
de polymère de l'exemple 1 ajustée en pH et en osmolalité (à environ pH 6,5 et
300 mOsm/Kg) et d'une solution de protéine, pour obtenir une concentration
finale de
0,3 mg/mL en interféron alpha 2b et 22 mg/mL en polymère. Dans ces conditions,
la
formulation contenant le polymère 1 a une concentration équivalente en
méthionine
d'environ 2,4 mM. La solution de polymère a préalablement été filtrée à
travers un filtre de
0,2 m. La formulation finalement obtenue est agitée pendant une nuit à
température
ambiante puis placée dans un réfrigérateur à 5 C.
On prépare dans des conditions similaires une solution de la protéine avec une
concentration équivalente de méthionine pour comparaison (formulation de
référence). On
mesure par chromatographie liquide (HPLC), le taux de forme oxydée
(correspondant à
l'oxydation de la méthionine en position 111) selon les conditions
chromatographiques
suivantes : Colonne YMC C30 (Interchim ; 250 x 4,6 mm ; 3 m), débit : 1
mL/min,
détection fluorimétrique : excitation à 280 nm et émission à 340 nm,
température de la
colonne de 20 C, eau/acétonitrile/TFA comme éluant.
Les taux en protéine oxydée mesurés à TO et après 2 mois T(2 mois) à 5 C sont
reportés sur la figure 1.
Des exemples 4 et 5, on peut conclure que l'utilisation d'un polymère selon
l'invention permet de réduire plus efficacement le taux de protéine oxydée
lors de la
formulation et/ou de maintenir un taux faible dans le temps.
EXEMPLE 6
Préparation de microparticules à partir du polymère de l'exemple 1 et un
polymère de l'art antérieur ne contenant pas de méthionine liée.
Pour certaines applications, la fabrication d'une formulation comportant des
microparticules de polymères et un principe actif est préférée (par exemple
dans la
demande WO 2007/141344 de la demanderesse). On fabrique une formulation
microparticulaire selon l'exemple 18 de la demande WO 2007/141344, autrement
dit, à
partir d'un polymère PO polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol, de l'IFN
et de la
méthionine sous forme libre.
On prépare dans des conditions similaires, une formulation microparticulaire à
partir de l'IFN et du polymère de l'exemple 1 conforme à l'invention,
comprenant des
greffons d'alpha-tocophérol et des greffons méthionine.
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On dose la quantité de méthionine dans les microparticules. Les résultats sont
reportés dans le tableau 2 suivant.
TABLEAU 2
Concentration Concentration Concentration finale en
polymère initiale en méthionine méthionine après
(mg/mL) (mM) formulation (mM)
Polymère de l'exemple 1 9 mg/mL 1 mm 1 mM (aucune perte)
Polymère de l'art 15 mg/mL 2.4 mM 0.1 mM (96% de perte)
antérieur
Il est donc démontré qu'il y a une perte importante de la méthionine dans la
formulation de microparticules selon la demande WO 2007/141344, qui n'est pas
observée
lorsque le polymère 1 conforme à l'invention est utilisé. De plus,
l'utilisation d'un
polymère selon l'invention permet une distribution homogène de la méthionine
dans les
particules, quelle que soit leur taille.
