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VECTEURS DERIVES DE DENSOVIRUS POUR LE TRANSFERT DE GENE CHEZ
L'INSECTE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des méthodes de production de densovirus de
Junonia
coenia recombinants non réplicatifs permettant le transfert d'un gène codant
pour une toxine
dans un insecte et leur utilisation dans la lutte contre les insectes
ravageurs de culture.
ART ANTERIEUR
Les densovirus (DNV) sont des virus pathogènes capable de se répliquer de
manière
autonome et appartenant à la famille des parvovirus. Le génome des densovirus,
encapsidé
dans une capside icosahédrale non enveloppée, consiste en un ADN simple brin
linéaire
d'environ 6 kilobases de longueur et comprenant deux régions de séquences
codantes. L'une
de ces régions codantes comprend un cadre de lecture ouvert (ORF1) en 5'
codant pour les
quatre protéines de la capside (VP) sur un brin. L'autre région codante
comprend trois cadres
de lecture ouverts ORF2, ORF3 et ORF4 en 5' sur le brin complémentaire et
codant pour les
protéines non structurales (NS) du densovirus. Ces deux régions codantes sont
délimitées aux
extrémités 5' et 3' par des séquences terminales répétées inversées (ITRs)
avec une structure
en épingles à cheveux d'une longueur supérieure à 500 nucléotides et incluant
les promoteurs
responsables de l'expression des protéines VP et NS.
Les densovirus présentent la particularité intéressante de n'être pathogènes
qu'à
l'égard des invertébrés et notamment des insectes et crustacés. Il n'a en
effet pas été établi de
pathogénicité chez les mammifères et plus particulièrement les humains.
L'utilisation de tels
densovirus pour lutter contre les insectes ravageurs de culture présente donc
un grand intérêt.
Cet intérêt s'est vu confirmé par la possibilité d'insérer le génome de
densovirus dans des
plasmides bactériens, du fait de leur petite taille, favorisant de ce fait les
manipulations
génétiques ainsi que la production de densovirus recombinants.
Toutefois, la capacité des densovirus à se répliquer et se multiplier dans
l'environnement présente un inconvénient dans l'utilisation de densovirus pour
lutter contre
les insectes ravageurs de culture.
Dans le but de pallier à cet inconvénient, les inventeurs ont mis au point une
méthode
de production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants
dénuées de toute
capacité de réplication et exprimant en outre une toxine dans les cellules
d'insectes infectées.
COPIE DE CONFIRMATION
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Les densovirus de Junonia coenia (JcDNV) présentent la particularité de
bénéficier
d'un spectre d'hôte étendu à plusieurs espèces de lépidoptères, notamment
Aglaïs urticae L.
(Nymphalidae), Lymantria dispar L. (Lymantriidae), Bombyx mon i L.
(Bombycoïdae),
Mamestraoleracea, M brassicae L. (Noctuidae), Spodoptera exigua, S. littoralis
, S.
frugiperda (Noctuidae).
Les particules de JcDNV recombinants selon l'invention ne peuvent se répliquer
dans
l'environnement mais permettent de lutter contre les insectes ravageurs de
culture, et
notamment les lépidoptères, par l'expression d'une toxine dans les cellules
desdits insectes
après infection.
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1. Constructions pour la production de particules de JcDNV recombinants
et non
réplicatifs.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne un vecteur, lequel vecteur est dérivé
du
génome du densovirus Junonia Coenia, comprenant une séquence nucléotidique se
décomposant comme suit :
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée
(ITR) en 5'
comprenant au moins les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N 1, la
longueur de ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259
nucléotides ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière
opérationnelle à
un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et
(iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée
(ITR) en 3'
comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N 3, la
longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259
nucléotides,
de préférence ladite séquence nucléotidique ITR en 3' est complémentaire à la
séquence nucléotidique ITR en 5';
Ledit vecteur ne comprenant pas d'autres séquences nucléotidiques virales de
densovirus de Junonia coenia que les séquences ITRs selon (i) et (iii).
On entend par vecteur tout véhicule capable de faciliter le transfert d'une
séquence
nucléotidique dans une cellule, de préférence une cellule d'insecte. De
manière générale, les
vecteurs selon l'invention incluent, sans limitation, les plasmides, cosmides,
phagemides ou
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tout autre véhicule dérivé de sources virales ou bactériennes qui ont été
manipulées pour
l'insertion ou incorporation d'une séquence nucléotidique, par exemple, et
sans limitation, des
vecteurs de type baculovirus.
Par ailleurs, les vecteurs peuvent inclure des marqueurs de sélection de
manière à
permettre l'identification des cellules ayant bien intégré lesdits vecteurs.
De manière préférée, les vecteurs selon l'invention sont des vecteurs
plasmidiques,
également appelés plasmides. Les plasmides ont été largement décrits dans
l'art antérieur et
sont bien connus de l'Homme du métier (voir par exemple SANBROOK et al.,
"Molecular
Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press,
1989). A titre d'exemples, on peut citer les plasmides les plus communément
utilisés tels que
pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, et pBlueScript. Les plasmides peuvent
être
conçus par l'utilisation d'enzymes de restriction et de réactions de ligation
pour éliminer ou
ajouter des fragments d'ADN spécifiques. Les plasmides dans lesquels sont
insérées les
séquences nucléotidiques sont sous forme d'un ADN simple ou double brin,
linéaire ou
circulaire.
Les plasmides peuvent être délivrés aux cellules par transformation, selon la
méthode
décrite ci-dessous.
Le vecteur dérivé du densovirus de Junonia coenia peut être appelé vecteur
toxique en ce qu'il porte une séquence nucléotidique qui code pour une toxine
exprimée à
terme dans la cellule d'insecte infectée.
Le terme séquence nucléotidique se réfère à une séquence d'ADN (par exemple
un
cDNA ou de l'ADN génomique ou synthétique) ou à une séquence d'ARN (par
exemple un
ARN messager ou encore de l'ARN synthétique), aussi bien qu'à des analogues
d'ADN ou
ARN contenant des analogues de nucléotides non naturels, des liens
internucléotidiques non
naturels ou encore les deux. De manière préférée, ladite séquence
nucléotidique est une
séquence ADN. Les séquences nucléotidiques peuvent présenter toute
conformation
topologique, telle que linéaire ou circulaire.
On entend par séquences terminales répétées inversées , plus connues sous le
nom
d' Inverted Terminal Repeats ou ITRs, les séquences avec une structure en
épingle à
cheveux situées aux extrémités 5' et 3' du génome du densovirus de Junonia
coenia
(respectivement SEQ ID N 1 et SEQ ID N 3). Ces séquences ITRs d'une longueur
de 518
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nucléotides sont connues pour leur implication dans le phénomène
d'encapsidation du
génome viral ainsi que pour leur rôle dans la réplication du génome viral.
Les séquences ITRs selon l'invention présentent la particularité d'avoir été
partiellement délétées. Les séquences minimales d'ITRs du vecteur selon
l'invention
conservent ainsi leur fonction d'encapsidation du génome dans les protéines
structurales de la
capside. L'absence de toutes autres séquences d'origine virale sur le vecteur
empêche la
réplication du vecteur de manière autonome.
De manière préférée, la séquence nucléotidique ITR en 5' ne comprend pas plus
de
225 nucléotides de la séquence SEQ ID N 1, à titre d'exemples pas plus de 200
ou 175
nucléotides, et de manière plus préférée pas plus de 160 nucléotides de la
séquence SEQ ID
N 1.
De manière encore plus préférée, la séquence ITR en 5' consiste en les
nucléotides 1 à
149 de la séquence SEQ ID N 1 (SEQ ID N 2).
De manière préférée, la séquence nucléotidique ITR en 5' ne comprend pas plus
de
225 nucléotides de la séquence SEQ ID N 3, à titre d'exemples pas plus de 200
ou 175
nucléotides, et de manière plus préférée pas plus de 160 nucléotides de la
séquence SEQ ID
N 3.
De manière encore plus préférée, la séquence ITR en 3'consiste en les
nucléotides 369
à 518 de la séquence SEQ ID N 3 (SEQ ID N 4).
On entend par toxine une molécule présentant une activité toxique sur une
cellule,
laquelle activité toxique peut entraîner une mort cellulaire mais également
une perturbation
d'une ou plusieurs fonctions cellulaires, lesquelles perturbations cellulaires
sont susceptibles
d'entraîner chez un organisme des retards de croissance ou la mort dudit
organisme.
Le terme organisme désigne tout insecte infecté par les particules de
JcDNV
recombinantes et non réplicatives.
Selon un mode de réalisation particulier, une toxine selon l'invention peut
être un
polypeptide vecteur d'une toxicité dans la cellule dans laquelle il est
exprimé. Cette toxicité
provoque notamment des effets néfastes tels qu'une destruction de la cellule,
de ses
composants ou de ses fonctions. Ainsi, on pourra utiliser des polypeptides
connus pour leur
activité toxique vis-à-vis des insectes, et notamment les lépidoptères,
tels que des
polypeptides toxiques provenant du venin de divers animaux (neurotoxine de
venin de
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scorpion AaH-IT1, toxines des glandes de venin de guêpes parasitoïdes, etc),
ou encore des
polypeptides toxiques produits par des plantes ou microorganismes telles que
la ricine ou les
toxines Cry de Bacillus thuringiensis (Bt Kurstaki 1970, Bt aizawai 1989).
De manière préférée, on utilisera la neurotoxine de venin de scorpion AaH-IT1
de
séquence protéique SEQ ID N 5.
Selon un autre mode de réalisation, une toxine selon l'invention peut être une
molécule d'acide nucléique ADN ou ARN, tel que l'ARN interférent (ARNi),
ladite molécule
ayant une activité inhibitrice à l'encontre de l'expression d'un gène
déterminé. Cette activité
se traduit notamment par la dégradation rapide d'un ARN messager ciblé et
conduit à
l'extinction de la transcription du gène ciblé.
De manière préférée, on choisira une toxine présentant une stabilité moyenne.
Par
stabilité moyenne, on entend une toxine se dégradant en moins de 7 jours, en
moins de un jour
ou en moins de 7 heures.
Egalement de manière préférée, on choisira une toxine ne présentant pas
d'activité
toxique à l'égard des cellules dans lesquelles sont produites les particules
de densovirus de
Junonia coenia recombinantes et non réplicatives selon l'invention.
On entend par liée de manière opérationnelle à un promoteur le lien par
lequel un
promoteur est situé de manière contigüe à une séquence nucléotidique d'intérêt
pour contrôler
l'expression de ladite séquence. En l'occurrence, le promoteur est ici lié de
manière
opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour la toxine pour en
contrôler son
expression.
A titre d'exemples de promoteurs permettant l'expression d'une toxine dans les
cellules d'insectes, on peut utiliser des promoteurs ubiquitaires tel que le
promoteur Actine
A3 de Bombyx mon i de séquence SEQ ID N 6.ou encore des promoteurs
spécifiques d'un
tissu.
De manière préférée, le promoteur permettant l'expression d'une toxine du
vecteur
selon l'invention est un promoteur inductible de manière à pouvoir réguler
l'expression de
ladite toxine en administrant, simultanément ou non, le vecteur et l'inducteur
dudit promoteur.
Le vecteur selon l'invention ne comprend pas d'autres séquences nucléotidiques
virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITR selon (i) et
(iii). Ce vecteur est
en effet construit à partir d'un vecteur comprenant le génome complet du
densovirus de
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Junonia coenia de séquence SEQ ID N 7. Ainsi, outre les séquences
nucléotidiques des ITRs
en 5' et 3', le vecteur selon l'invention ne comprend pas d'autres séquences
nucléotidiques de
la séquence SEQ ID N 7.
Un deuxième objet de l'invention concerne une méthode de production de
particules
du densovirus Junonia coenia (JcDNV) recombinants et non réplicatifs, ladite
méthode
comprenant les étapes suivantes :
1) transformation d'au moins une cellule d'insecte avec :
a) Un vecteur tel que décrit ci-dessus ;
b) Au moins un second vecteur de complémentation comprenant :
(i) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines structurales VP1
(SEQ
ID N 8), VP2 (SEQ ID N 9), VP3 (SEQ ID N 10) et VP4 (SEQ ID N 11) du
densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences
nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à un promoteur, de
préférence le promoteur P9 de JcDNV, et
(ii) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines non structurales
NS1
(SEQ ID N 13), NS2 (SEQ ID N 14) et NS3 (SEQ ID N 15) du densovirus de
Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées
de manière opérationnelle à un promoteur, de préférence le promoteur P93 de
JcDNV,
(iii) Ledit au moins second vecteur ne comprenant pas les séquences terminales
répétées inversées (ITRs) en 5' et en 3' du vecteur tel que défini
précédemment.
2) récolte des particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non
réplicatifs.
Le second vecteur selon l'invention constitue un vecteur de complémentation,
également connu sous le nom de vecteur helper , c'est-à-dire un vecteur
portant les
diverses fonctions ou éléments manquants au vecteur porteur de la séquence
nucléotidique
codant pour une toxine, telles que les séquences nucléotidiques codant pour
les protéines
nécessaires à l'encapsidation (NS) ou les protéines formant la capside (VP),
nécessaires à la
production d'une particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non
réplicatif.
Les protéines structurales, aussi connues sous le nom de viral proteins
(VP),
constituent les protéines de la capside du densovirus. Elles sont au nombre de
4 : VP1, VP2,
VP3 et VP4, ayant respectivement les séquences protéiques suivantes : SEQ ID N
8, SEQ ID
N 9, SEQ ID N 10 et SEQ ID N 11. De préférence, le promoteur utilisé pour
l'expression
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desdites protéines structurales VP est le promoteur P9 de densovirus de
Junonia coenia de
séquence SEQ ID N 12.
Les protéines non structurales, aussi connues sous le nom de non structural
proteins (NS), participent à la réplication et à l'assemblage des protéines
structurales VP
pour la formation de la capside. Ces protéines non-structurales sont au nombre
de trois : NS1,
NS2 et NS3, ayant respectivement les séquences protéiques suivantes : SEQ ID N
13, SEQ
ID N 14 et SEQ ID N 15. De préférence, le promoteur utilisé pour l'expression
desdites
protéines non structurales NS est le promoteur P93 de JcDNV de séquence SEQ ID
N 16.
On entend par dérivé une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide
présentant un pourcentage d'identité d'au moins 95 % avec la séquence
polypeptidique d'une
protéine structurale (VP) ou non structurale (NS) de densovirus de Junonia
coenia telles que
définies précédemment.
Par pourcentage d'identité entre deux séquences polypeptidiques , on entend
le
pourcentage d'acides aminés identiques, entre deux séquences devant être
comparées, obtenu
avec le meilleur alignement possible desdites séquences. Ce pourcentage est
purement
statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties
aléatoirement sur toute la
longueur des séquences d'acides aminés.
Par meilleur alignement possible ou alignement optimal , on entend
l'alignement
permettant d'obtenir le pourcentage d'identité le plus élevé. Les comparaisons
de séquences
entre deux séquences d'acides aminés sont habituellement réalisées en
comparant lesdites
séquences après que celles-ci aient été alignées selon le meilleur alignement
possible ; la
comparaison est alors réalisée sur des segments de comparaison de façon à
identifier et
comparer des régions de similarité. Le meilleur alignement possible pour
effectuer une
comparaison peut être réalisé en utilisant l'algorithme d'homologie globale
développé par
SMITH et WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), en utilisant
l'algorithme
d'homologie locale développé par NEDDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48,
p:443,
1970), en utilisant la méthode de similarité développé par PEARSON et LIPMAN
(Proc.
Nad. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des programmes
d'ordinateur basés sur
de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, Genetics
Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), en utilisant les
algorithmes
d'alignement multiples MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol.
32, p:1792,
2004). Pour obtenir le meilleur alignement possible, on utilisera de
préférence le programme
BLAST avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage
d'identité est
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déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale, lesdites
séquences
pourront comprendre des additions ou des délétions au regard de la séquence de
référence de
sorte d'obtenir le meilleur alignement possible entre ces deux séquences. Le
pourcentage
d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques entre
les deux
séquences, en divisant le nombre obtenu par le nombre total de positions
comparées et en
multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité
entre ces deux
séquences.
Comme précisé ci-dessus, la séquence terminale répétée inversée (ITR) en 5'
comprenant au moins les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N 1, la
longueur de
ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides, n'est
comprise dans
aucun vecteur de complémentation tel que défini ci-dessus.
De la même manière, la séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR)
en
position 3' comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ
ID N 3, la
longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259
nucléotides, n'est
comprise dans aucun vecteur de complémentation.
Deux vecteurs selon l'invention ne partagent pas de séquences de plus 100
paires de
base, de plus de 50 paires de base ou de plus de 25 paires de base qui
partagent plus de 50%
d'identité, 30% d'identité ou 20% d'identité.
Selon un mode de réalisation préféré, les séquences nucléotidiques codant pour
:
(i) les
protéines structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 du densovirus de Junonia
coenia ou leurs dérivés, et
(ii) les protéines non structurales NS1, NS2 et NS3 du densovirus de
Junonia
coenia ou leurs dérivés
sont portées par au moins deux vecteurs distincts.
On entend par transformation toute méthode permettant le transfert d'un
gène, de
préférence, dans une cellule d'insecte. La transformation des cellules
d'insectes peut être
réalisée en utilisant les méthodes connues de l'Homme de l'art telles que
l'utilisation de la
transfection ou de la transduction.
De manière préférée, on utilise la transfection pour transférer les séquences
nucléotidiques dans les cellules d'insectes. On entend par transfection
l'introduction
d'ADN dans une cellule eucaryote. La transfection des cellules peut être
réalisée par
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l'utilisation de Phosphate de calcium, de liposomes ou vecteurs lipidiques
tels que la
Lipofectamine (INVITROGEN), d'agents polycationiques hautement branchés.
La récolte des particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs peut être
effectuée
selon le protocole suivant, ledit protocole n'étant pas limitatif : quatre
jours post-transfection,
les cellules et les surnageants de culture ont été récoltés pour subir trois
cycles de
congélation/décongélation suivi d'un traitement ménager aux ultrasons. Par la
suite, les
surnageants sont clarifiés pendant 10 minutes à 5000 g, puis les particules
virales sont
concentrées par ultracentrifugation à 175 000 g dans un rotor Beckman SW4lti
pendant 2h à
4 C. Les particules virales sont resuspendues dans du PBS.
Un troisième objet de l'invention concerne une cellule d'insecte comprenant :
a) un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel
que
défini ci-dessus ;
b) un ou plusieurs vecteurs de complémentation tels que définis ci-dessus.
Ladite cellule d'insecte est notamment utilisée pour la production de
particules de
densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs selon la méthode
décrite
précédemment.
Une cellule d'insecte selon l'invention présente les caractéristiques d'être
cultivable et
transformable. Ladite cellule est également capable, après transformation avec
les vecteurs
selon l'invention, de répliquer le densovirus recombinant, mais aussi
d'exprimer les protéines
virales (VP) et non structurales (NS) pour produire des particules de
densovirus de Junonia
coenia recombinants et non réplicatifs.
A titre d'exemples de cellules d'insectes, on peut utiliser les cellules
suivantes :
- Sf9 (Spodoptera frugiperda)
- High5 (Trichoplusia ni)
- Ld (Lymantria dispar)
A titre d'exemples de conditions de culture des cellules d'insecte, on peut
utiliser les
conditions suivantes :
- Sf9 (Spodoptera frugiperda) cultivées à 26 C en milieu TC100
(INVITROGEN,
USA) + 10% SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques
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- High5 (Trichoplusia ni) cultivées à 26 C en milieu Grace (INVITROGEN,
USA) + 10
% SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques.
- Ld (Lymantria dispar) cultivées à 26 C en milieu TC100 (INVITROGEN, USA)
+
10% SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques.
Un quatrième objet de l'invention concerne un kit pour la production de
particules de
densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs selon la méthode
définie
précédemment comprenant :
a) Un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel
que décrit
ci-dessus ; et
b) Au moins un vecteur de complémentation tel que défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré, le kit de production de particules de
JcDNV
recombinants et non réplicatifs de la présente invention comprend :
a) Un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel
que décrit
ci-dessus ; et
b) Au moins deux vecteurs de complémentation distincts tels que définis ci-
dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, le kit de production de particules
de
densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs comprend en outre
des cellules
d'insectes telles que définies ci-dessus.
Un cinquième objet de l'invention concerne une particule de densovirus de
Junonia
coenia recombinant et non réplicatif susceptible d'être obtenue selon la
méthode définie
précédemment et constituée d'une capside contenant une séquence nucléotidique
qui
comprend:
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée
(ITR) en 5'
telle que définie précédemment ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière
opérationnelle à
un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et
(iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée
(ITR) en 3'
telle que définie précédemment ;
et obtenue par la méthode de production décrite précédemment.
On entend par particule de densovirus de Junonia coenia recombinant une
particule virale produite à partir d'un génome de densovirus modifié. En
l'occurrence, le
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génome du densovirus de Junonia coenia recombinant selon l'invention a été
modifié par la
délétion partielle des séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et
3' pour
maintenir au minimum la fonction d'encapsidation de ces séquences, ainsi que
par la
suppression de la totalité des séquences virales de JcDNV comprises entre les
deux séquences
ITRs. Par ailleurs, une séquence nucléotidique codant pour une toxine a
également été insérée
entre les séquences ITRs partiellement délétées.
On entend par particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non
réplicatif une particule virale de densovirus de Junonia coenia recombinant
ne possédant pas
la capacité de répliquer son génome en vue d'une production de densovirus à
partir de son
seul matériel génétique ou de celui de la cellule hôte.
Les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs
sont
produites dans la méthode décrite précédemment à partir du vecteur porteur de
la séquence
nucléotidique codant pour une toxine avec l'aide du (des) vecteur(s) de
complémentation
porteur(s) des séquences virales nécessaires à l'encapsidation et à la
réplication virale. Ainsi,
en l'absence de ces vecteurs de complémentation exprimant les protéines
structurales et non
structurales, les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants ne
peuvent se
répliquer.
Un sixième objet de l'invention concerne une utilisation de particules de
densovirus de
Junonia coenia recombinants et non réplicatif tels que définies ci-dessus en
tant qu'agent de
lutte contre les lépidoptères.
Le génome des particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs selon
l'invention
comprend une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un
promoteur, ladite
séquence nucléotidique codant pour une toxine. Ladite toxine pourra être
exprimée dans les
cellules d'insectes infectées et constitue le moyen de lutte de ces particules
de densovirus à
l'encontre des lépidoptères ravageurs de culture.
Un septième objet de l'invention concerne une composition comprenant les
particules
de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que
décrites
précédemment.
De manière préférée, ladite composition selon l'invention comprend également
un
inducteur du promoteur lié de manière opérationnelle à la séquence
nucléotidique codant pour
une toxine lorsque ledit promoteur est un promoteur inductible.
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Un huitième objet de l'invention concerne une utilisation d'une composition
telle que
décrite précédemment en tant que moyen de lutte contre les lépidoptères.
Un neuvième objet de l'invention concerne un procédé de traitement des
plantes, ledit
procédé comprenant une étape d'épandage de particules de densovirus de Junonia
coenia
recombinants et non réplicatifs tels que décrites précédemment sur les
cultures de plantes.
De préférence, les plantes traitées selon ledit procédé de traitement sont le
riz, maïs,
coton, soja, sorgho, canne à sucre, tomate, poivron, luzerne.
De manière préférée, la séquence codant pour la toxine est sous le contrôle
d'un
promoteur inductible et le procédé de traitement des plantes selon l'invention
comprend une
étape d'épandage du composé inducteur dudit promoteur simultanément,
antérieurement ou
postérieurement à l'étape d'épandage des particules de densovirus de Junonia
coenia
recombinantes et non réplicatives telle que décrite précédemment.
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Exemple 1 Constructions
Toutes les constructions réalisées sont dérivées du plasmide pBRJ-H contenant
la
séquence complète infectieuse du densovirus de Junonia coenia (JcDNV) (SEQ ID
N 7), à
savoir les gènes structuraux (VP) et non structuraux (NS) délimités de part et
d'autre par les
séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' (Figure 1) (Jourdan
et al., 1990,
Virology, von 79, p:403-409; Rolling, 1992, Thèse de doctorat de l'université
d'Aix-
Marseille II, pp153).
a) Constructions des plasmides de complémentation
Les vecteurs de complémentation portent les gènes structuraux (VP) sous le
contrôle
d'un promoteur et/ou les gènes non structuraux (NS) également sous le contrôle
d'un
promoteur sans toutefois porter les séquences ITRs.
Le plasmide porteur des gènes NS et VP sans les séquences ITRs, nommé plasmide
pJA, est dérivé du plasmide pBRJ-H par délétion des régions terminales
répétées inversées
(ITRs) au niveau du site FspI (Li, 1993, Thèse de doctorat de l'Université
Montpellier II.
pp.124). Dans cette construction, les gènes structuraux (VP) et non
structuraux (NS) de
JcDNV sont sous contrôle de leur propre promoteur, P9 et P93, respectivement.
Afin d'obtenir une construction portant uniquement les gènes non structuraux
(NS),
une délétion des gènes structuraux (VP) a été effectuée par digestion du
plasmide pJA par les
enzymes de restriction BamHI et HpaI (position 38 pb à 2162 pb) puis par
religation avec la
T4 DNA ligase (INVITROGEN, USA), générant ainsi le plasmide pJAAVP (Figure
1.a).
De la même manière, un plasmide portant uniquement les gènes structuraux (VP)
a été
obtenu en effectuant une délétion des gènes non structuraux (NS) par digestion
du plasmide
pJA par les enzymes de restriction BsmI et KpnI (position 2732 pb à 5211 pb)
générant le
plasmide pJAANS (Figure 1.b).
b) Constructions du vecteur d'encapsidation
Les régions terminales répétées inversées (ITRs) aux extrémités du génome
viral sont
vraisemblablement requises pour l'encapsidation. Différentes constructions
portant un
génome recombinant ont été développées afin de déterminer les séquences
minimales ITRs
nécessaires à l'encapsidation. Dans un premier temps, des constructions
portant uniquement
les ITRs, sont obtenues par digestion du plasmide pBRJ-H au niveau des sites
BstEII
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(position 337 pb à 6028 pb) ou BamHI (position 446 pb à 5920 pb), délétant
ainsi la partie du
génome viral codant pour les NS et les VP.
Par la suite, un premier vecteur recombinant a été construit par clonage d'une
cassette
d'expression A3GFP contenant le gène codant pour la Green Fluorescent
Protein (GFP)
sous contrôle du promoteur Actine de Bombyx mon i A3 (SEQ ID N 6) au niveau
des sites de
restriction des enzymes BstEII et BamHI du plasmide pBRJ-H dont le génome
viral a été
délété. La cassette d'expression A3GFP utilisée provient du plasmide pASA3-
GFP, vecteur
d'expression de lépidoptères (Bossin, 1998, Thèse de l'Université Montpellier
II, pp. 240)
(Figure 1.c). Le vecteur généré constitue ainsi un des génomes recombinant à
encapsider. Les
constructions correspondantes sont nommées pITR-A3GFP-BstEII et pITR-A3GFP-
BamHI.
Le vecteur plasmidique recombinant contenant le gène codant pour la protéine
fluorescente rouge, DsRed2, a été construit à partir du vecteur pITR-A3GFP-
BstEII par
délétion du gène rapporteur GFP au niveau des sites de restriction BamHI et
Notl. Le gène
DsRed2 a été amplifié, à partir du plasmide pDsRed2 (CLONTECH, USA), par PCR à
l'aide
d'amorces intégrant les sites de restriction BamHI et Notl puis inséré à la
place du gène de la
GFP. Cette construction a été nommée pITR-A3DsRed2-BstEII.
Le vecteur plasmidique recombinant contenant le gène codant pour la
neurotoxine du
scorpion Androctonus australis (AaH-IT1) (SEQ ID N 5) obtenu à partir du
plasmide pcD-
Tox (Bougis et al., 1989) a été construit selon la même méthode que pour le
vecteur pITR-
A3DsRed2-BstEII. Le vecteur généré a été nommé pITR-A3AaH-IT1-BstEII.
Exemple 2 Lignée cellulaire et test de multi-transfection
Les particules de JcDNV recombinants ont été produites par multi-transfection
en
cellules d'insectes. La lignée cellulaire d'insecte Lymantria dispar, IPLB-Ld
652 (Ld),
(Goodwin et al., 1978, In vitro Vol.14, n 6, p:485-94; 1985, Techniques in the
life sciences,
cell biology," Vol. Cl, "techniques in setting up and maintenance of tissue
and cell cultures."
Separate C109, 28 pp., Elsevier, County Clare, Ireland ou Techniques in the
Life Sciences,
Setting Up and Maintenance of Tissue and Cell Cultures, Elsevier Scientific
Publishers
Ireland, Ltd., (1985) pp. C109/1-C109/28), a été maintenue à 26 C en milieu de
culture
TC100 (Invitrogen, USA) complémenté avec 10% de sérum de veau foetal et 1%
d'antibiotiques/antimycotiques (Sigma, USA).
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Les différentes réactions suivantes de co-transfection des cellules Ld ont été
réalisées
avec le réactif de transfection Fugene HD (Roche Diagnostics, USA) selon les
instructions
du fournisseur :
- Bi-transfection avec le vecteur de complémentation pJA portant les gènes
NS et VP et
un vecteur recombinant d'encapsidation pITR-A3GFP ou pITR-A3DsRed2 ou pITR-
A3AaH-IT1, selon un ratio de 1:1 ou 1:2;
- Tri-transfection avec les vecteurs de complémentation pJAANS porteur des
gènes VP
et pJAAVP porteur des gènes NS ainsi qu'avec un vecteur recombinant
d'encapsidation pITR-A3GFP ou pITR-A3DsRed2 ou pITR-A3AaH-IT1, selon un
ratio de 1:1:1 ou 1:1:2.
L'efficacité de transfection a été déterminée par observation au microscope à
fluorescence des cellules Ld transfectées avec la construction pITR-A3GFP et a
montré
qu'elle est au maximum de 30%.
Exemple 3 Production des particules de JcDNV
Quatre jours post-transfection, les cellules et les surnageants de culture ont
été récoltés
pour subir trois cycles de congélation/décongélation suivi d'un traitement
ménager aux
ultrasons. Par la suite, les surnageants sont clarifiés pendant 10 minutes à
5000 g, puis les
particules virales sont concentrées par ultracentrifugation à 175000 g dans un
rotor Beckman
SW4lti pendant 2h à 4 C. Les particules virales sont resuspendues dans du PBS.
Afin de vérifier la présence et la concentration de particules virales, une
partie de la
précédente suspension est déposée sur une grille porte-objet afin de réaliser
des colorations
négatives (acide phosphotungstique 2%, pH 7.0).
Une étape de visualisation en Microscopie Electronique à Transmission (MET) a
permis de confirmer la production de particules virales par les cellules.
Exemple 4 Caractérisation des particules virales de JcDNV
Afin de vérifier que l'ADN encapsidé correspond bien à la construction
attendue (cassette
d'expression A3GFP notamment), l'ADN viral a été extrait des particules
virales puis digéré
par DpnI. Une étape d'amplification par PCR a par la suite été réalisée sur
les ADN digérés
en utilisant des amorces spécifiques de la cassette d'expression A3GFP,
amorces sens : 5'-
ATTTACTAAggTgTgCTCgAACAgT-3' (SEQ ID N 17) et amorce antisens: 5'-
TACTTgTACAgCTCgTCCATgCCg-3' (SEQ ID N 18). Les résultats montrent une
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amplification spécifique à partir de l'ADN extrait des particules virales et
aucune
amplification dans le contrôle plasmidique (pASA3-GFP) digéré par Dpnl. Ces
résultats
confirment que le génome recombinant a bien été amplifié et encapsidé dans des
cellules
transfectées.
Exemple 5 Analyse des virus recombinants
Les suspensions de particules virales obtenues dans l'exemple 3 ont été
utilisées pour infecter
des cellules Ld. Ainsi, des cellules Ld, cultivées en milieu TC100 complet,
ont été préparées
en plaque 96 puits de manière à être à 80% de confluence à 24h de culture. Le
lendemain, le
milieu de culture des cellules a été retiré et 50 1 de particules virales
purifiées ont été
ajoutées. Les cellules sont incubées pendant 1h à 26 C avec l'inoculum. Par la
suite, du
milieu TC100 complet a été ajouté et les cellules sont maintenues dans une
étuve à 26 C
jusqu'à observation.
Après infection, la fluorescence des cellules Ld a été contrôlée
quotidiennement. Les
résultats montrent que l'expression des gènes rapporteurs fluorescents (GFP et
DsRed2) est
détectée dès 4 jours post-infection dans environ 15% des cellules.
Exemple 6 Validation du caractère non réplicatif des particules virales
Afin de confirmer le caractère non réplicatif des particules virales isolées,
le
surnageant de culture des cellules infectées dans l'exemple 5 a été récolté et
soumis au même
protocole que celui de l'exemple 3 (clarification, ultracentrifugation et
resuspension du culot
dans du PBS). Un volume de cette suspension a été utilisé pour infecter de
nouvelles cellules
Ld avec un protocole identique à celui utilisé dans l'exemple 4. De la même
manière, la
fluorescence des cellules Ld a été suivie de manière régulière après
l'infection.
Les résultats n'ont montré aucune trace de fluorescence permettant de
confirmer le
caractère non réplicatif des particules obtenues.
Exemple 7 Transfert de gènes à des insectes ravageurs
Pour confirmer l'efficacité des particules obtenues précédemment (cf exemple
3),
celles-ci ont été injectées à des larves de noctuelle Spodoptera frugiperda
âgées de 7 jours
après éclosion (début du 4ème stade de développement) à l'aide d'un micro-
injecteur.
Plusieurs groupes de 10 à 15 larves, identifiés comme suit, ont été utilisés :
- Groupe GFP auquel a été injecté 10 I de particules recombinantes codant
pour la
protéine GFP
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- Groupe DsRed auquel a été injecté 10 I de particules recombinantes
codant pour la
protéine DsRed2
- Groupe AaH-IT1 auquel a été injecté 10 I de particules recombinantes
codant pour la
toxine de scorpion AaH-IT1
- Groupe contrôle positif auquel a été injecté 10 1 de particules de JcDNV
sauvages
purifiées, produites après transfection de cellules Ld avec le plasmide
infectieux
pBRJ-H
- Groupe contrôle négatifauquel a été injecté 10 1 de PBS.
Après injection, les larves ont été nourries sur milieu artificiel et
maintenues dans une
étuve à 26 C, pendant 6 jours. Un suivi du poids et de la mortalité a été
réalisé
quotidiennement. Les larves mortes au cours de l'expérience ont été stockées à
-20 C pour
des analyses ultérieures.
A 6 jours post-infection (PI), les hémocytes ont été prélevés au niveau d'une
fausse
patte à l'aide d'une aiguille de diamètre 0,2 mm. L'hémolymphe de chaque larve
a été
récupérée et mise en culture en plaque 96 puits avec 100 1 de milieu de
culture TC100, 1 %
antibiotiques et 0,03 M PTU (N-phenylthiourea). Les hémocytes ont été
observés dès 4h
post-culture au microscope à fluorescence.
Après récupération des hémocytes, les larves ont été en partie disséquées de
manière à
isoler les différents tissus suivants : l'intestin, les trachées, les
ganglions nerveux et
l'épiderme. Les différents organes ont été observés directement au microscope
à fluorescence.
a) Délivrance dans l'insecte des particules recombinantes GFP et DsRed
Les hémocytes des larves des groupes GFP, DsRed, contrôle positif et négatif
ont été
observés au microscope à fluorescence dès 4h après la mise en culture (6 jours
PI). Un signal
fluorescent vert et rouge a été observé dans certains hémocytes des larves
injectées avec les
particules codant la GFP et la DsRed, respectivement. Aucune fluorescence n'a
été observée
chez les contrôles positif et négatif
Après dissection, les tissus ont été montés sur lames et observés au
microscope à
fluorescence. Une fluorescence spécifique verte et rouge est observée dans les
trachées des
larves infectées respectivement par les particules recombinantes GFP et DsRed.
Aucune
fluorescence spécifique n'est observée dans les trachées des larves des
groupes contrôles
positif et négatif
b) Effet pathogène des particules recombinantes AaH-IT1
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Les larves du groupe contrôle positif, auxquelles ont été injecté le JcDNV
natif, sont
mortes dès J+3 et jusqu'à J+6 PI (98 % de mortalité). Peu de mortalité (15 %)
a été observée
chez les larves du groupe AaH-IT1 auxquelles ont injectées des particules
recombinantes
codant pour la toxine de scorpion. Le développement des larves a été altéré
(mues et prise de
poids). En effet, nous avons observé une différence significative (test t
student, p < 0,005)
entre le poids des larves du groupe contrôle négatif et celui des larves du
groupe AaH-IT1.
Aucune mortalité n'a par ailleurs été observée dans le groupe contrôle négatif
Exemple 8 Vérification du caractère non réplicatif in vivo
Les larves infectées avec les particules recombinantes ont été sacrifiées à 6
jours post-
infection. La partie restante des larves, stockée à -20 C, a été broyée dans
du PBS. Les
surnageants ont été clarifiés 10 minutes à 5000 g puis injectés à raison de 10
tl dans des
larves de noctuelle Spodoptera frugiperda âgées de 7 jours après éclosion à
l'aide d'un micro-
injecteur. Après injection, les larves ont été nourries sur milieu artificiel
et maintenues dans
une étuve à 26 C, pendant 6 jours.
A 6 jours post-infection, les hémocytes ont été prélevés au niveau d'une
fausse patte et
l'hémolymphe de chaque larve a été mise en culture en plaque 96 puits avec 100
I de milieu
de culture TC100, 1 % antibiotiques et 0,03 M PTU (N-phenylthiourea). Les
hémocytes ont
été observés dès 4h post-culture au microscope à fluorescence.
Après récupération des hémocytes, les larves ont été en partie disséquées de
manière à
isoler les différents tissus suivants : l'intestin, les trachées, les
ganglions nerveux et
l'épiderme. Les différents organes ont été observés directement au microscope
à fluorescence.
Aucune fluorescence n'a été observée dans les hémocytes et les trachées des
larves
injectées avec les broyats clarifiés de larves positives en primo-infection.
Exemple 9 Production de particules de Densovirus recombinants non réplicatifs
en
système d'expression Baculovirus
Le système d'expression Baculovirus est communément employé pour la production
de grandes quantités de protéines recombinantes en raison de sa facilité
d'utilisation et de son
haut niveau d'expression. Le principe de production des particules de
Densovirus
recombinants non réplicatifs en système d'expression Baculovirus repose sur:
i) le
clonage des séquences d'intérêts du Densovirus dans un vecteur d'expression
commercialement disponible, pFastBacTM1,
ii) la production de Baculovirus recombinants en utilisant le système
Bac-to-Bac
(Baculovirus Expression System, INVITROGEN, USA) et enfin
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iii)
la purification des particules de Densovirus recombinants non réplicatifs
néoformées.
Selon le même principe que développé initialement, à savoir la multi-
transfection de
cellules d'insectes par trois plasmides portant les gènes structuraux, non
structuraux et le
génome recombinant, trois Baculovirus recombinants seront produits et
serviront à la multi-
infection de cellules d'insectes.
1) Constructions
Toutes les constructions réalisées sont dérivées du plasmide pBRJ-H contenant
la
séquence complète infectieuse du Densovirus de Junonia coenia (JcDNV), à
savoir les gènes
structuraux (VP) et non structuraux (NS) délimités de part et d'autre par les
séquences
terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' (Jourdan et al., 1990,
Virology, vol.179,
p:403-409; Rolling, 1992, Thèse de doctorat de l'université d'Aix-Marseille
II, pp153
a- Constructions des vecteurs d'expression portant les séquences de
complémentation
Les vecteurs d'expression dit de complémentation portent les gènes structuraux
(VP)
sous le contrôle d'un promoteur ou les gènes non structuraux (NS) également
sous le contrôle
d'un promoteur sans toutefois porter les séquences ITRs.
Le vecteur d'expression porteur des gènes NS sans les séquences ITRs, nommé
pFastBac-NS, est obtenu après amplification par PCR des séquences NS incluant
le promoteur
homologue P93, à l'aide d'amorces intégrant les sites de restriction NotI et
XhoI (séquences
soulignées) :
P93 NS_pFastBAC F = 5'-ATAAgCggCCgTTATTgTgACCTCgTTTgA-3' (SEQ ID
N 19) et
NS_pBAC_R = 5'-CCgCTCgAgTTAAAATgTAATATTATATTTACTCAATAAA-
3'(SEQ ID N 20).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites NotI-XhoI du site de multi-
clonage
du vecteur d'expression pFastBacTm 1 . L'expression des gènes non structuraux
(NS) est faite
sous contrôle du promoteur homologue P93.
Le vecteur d'expression porteur des gènes VP sans les séquences ITRs, nommé
pFastBac-VP, a été obtenu après amplification par PCR des séquences VP, à
l'aide d'amorces
intégrant les sites de restriction Notl et Xhol (séquences soulignées) :
VP_pFastBAC_F = 5'- ATAAgCggCCgCATgTCTTTCTACACggCCgggT -3' (SEQ ID
N 21) et
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VP_pFastBAC_R = 5'- CCgCTCgAgTTAAACgTTACCAATAgTAgCTCCA -3'(SEQ ID
N 22).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites Notl-Xhol du site de multi-
clonage
du vecteur d'expression pFastBacTml.
L'expression des gènes structuraux (VP) a été faite sous contrôle du promoteur
hétérologue fort polyhédrine (pin-i).
b- Constructions du vecteur d'expression portant le génome à encapsider
Le vecteur d'expression, nommé pFastBac-ITR-A3GFP, porte les régions ITRs de
JcDNV encadrant la cassette d'expression A3-GFP. Cette construction dérive du
plasmide
pITR-A3GFP-BstEII déjà décrit. Ainsi la séquence incluant les régions ITRs et
la cassette
d'expression a été amplifiée par PCR à l'aide d'amorces intégrant les sites
EcoRI et Xhol
(séquences soulignées) :
A3GFP_pFastBAC_F = 5'- CCgGAATTCCgTgTATgAAATCTAACAATgCgCTC -3'
(SEQ ID N 23) et
A3GFP_pFastBAC_R = 5'- CCgCTCgAggTACTgCCgggCCTCTTgCgggATg -3' (SEQ ID
N 24).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites EcoR1-Xhol du site de
multi-
clonage du vecteur d'expression pFastBacTml.
Les vecteurs d'expression pFastBac-NS, pFastBac- VP et pFastBac-ITR-A3GFP ont
été transformées en cellules compétentes DH10Bac afin de générer les Bacmides
recombinants (BAC-NS, BAC-VP et BAC-ITRA3GFP).
2) Production des Baculovirus recombinants
Des premiers stocks viraux à faible titre sont générés par transfection de
cellules
d'insectes, Sf9, avec l'ADN des bacmides recombinants. L'expression des
protéines NS, VP
et GFP est évaluée par Western-Blot.
L'amplification des Baculovirus recombinants et la génération de stocks viraux
à haut
titre sont effectuées à partir des stocks à faible titre par passage en séries
en cellules
d'insectes. Le titre viral de chaque Baculovirus recombinant est également
estimé par PCR
quantitative puis confirmer par dosage en plaque.
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3) Production des Densovirus recombinants non réplicatifs par multi-infection
de
cellules d'insectes, Sf9, avec les trois Baculovirus recombinants
Les stocks de Baculovirus recombinants à haut titre sont utilisés pour multi-
infectées
des cellules d'insectes Sf9. Des particules de Densovirus recombinants non
réplicatifs ainsi
que des Baculovirus sont produits lors de cette infection.
La purification des particules de DNVs est effectuée par la chaleur. En effet,
les
Baculovirus sont des virus enveloppés et donc peu résistant à la chaleur
contrairement aux
Densovirus qui sont des virus non enveloppées. Ce procédé de purification est
utilisé en
routine par les équipes du GENETHON. Une fois la purification effectuée les
particules
produites sont caractérisées et validées selon le même procédé qu'utilisé
précédemment.
