Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
1
NOUVELLES SOUCHES DE LEVURE DE PANIFICATION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne de nouvelles souches de levure de panification
large spectre,
c'est-à-dire des souches de levure performantes à la fois sur des pâtes dites
sans sucre et des
pâtes dites sucrées.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
Le document EP0511108 décrit des souches de levure large spectre obtenues par
un
programme de croisement de souches, couplé à des étapes de sélection. Les
haploïdes et les
souches hybrides issues de leur croisement sont sélectionnés sur la base d'une
activité
maltoperméase et une activité maltase élevées en présence de glucose (et en
l'absence de
maltose), et sur la base d'une activité invertase basse.
Le document JP9-149785 décrit des souches de levure de panification large
spectre obtenues
par hybridation dont l'une des souches parentes haploïdes est déficiente en
invertase. Les
souches obtenues sont ensuite sélectionnées sur la base d'une activité
invertase de 10 à 50
unités et d'une activité maltase d'au moins 40 unités permettant l'obtention
desdites souches
de levure large spectre. Selon ce document, une unité d'activité invertase
correspond à la
formation en une minute d'un milligramme de sucres réducteurs par gramme de
levure à 67%
d'humidité.
Par ailleurs, le document EP0511108 indique qu'il est possible d'abaisser
l'activité invertase
au moyen de la génétique moléculaire en disruptant un ou plusieurs gènes SUC,
de préférence
sur des haploïdes qui possèdent au maximum un ou deux gènes SUC.
Les différentes étapes de sélection, effectuées sur la base de plusieurs
critères et portant à la
fois sur les souches parentes, les haploïdes et les hybrides, permettent
d'améliorer les chances
d'obtenir une souche de levure large spectre. Toutefois, le procédé
d'obtention de souches de
levure large spectre tel que décrit dans le document EP0511108 est
relativement long et lourd
à mettre en uvre.
Le document EP0994192 décrit une nouvelle cassette d'excision pour une
utilisation chez la
levure. Cette cassette d'excision permet de ne laisser aucun ADN exogène dans
la levure.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
2
A titre d'exemple, le document EP0994192 décrit la disruption de trois copies
du gène SUC
en utilisant successivement trois cassettes d'excision comprenant chacune :
deux séquences
recombinogéniques encadrant deux séquences répétées directes (séquence
mosaïque), elles-
mêmes encadrant un marqueur de sélection négatif (gène suicide RTA) et un
marqueur de
sélection positif (kanamycine). La séquence mosaïque est une séquence d'ADN
non
hétérologue de Saccharomyces cerevisiae comportant 97 paires de base.
Le procédé d'excision décrit dans le document EP0994192 est utile pour
disrupter un nombre
limité de gènes. Toutefois, il n'est pas adapté à la disruption d'un nombre
plus important de
gènes : le procédé d'excision implique en effet de construire autant de
cassettes d'excision et
comprend autant d'étapes de disruption que le nombre de gènes à exciser. Le
procédé décrit
dans le document EP0994192 devient alors beaucoup trop long et lourd à mette
en oeuvre. De
plus, le procédé décrit dans le document EP0994192 ne permet pas la disruption
de plus de 4
copies du gène SUC, étant données la longueur de la séquence recombinogénique
utilisée et la
taille du gène SUC.
Il est utile pour un industriel de disposer de souches de levure large
spectre. En effet, il est
alors possible de produire sur une même installation et à partir d'une unique
souche de levure,
des levures destinées à une application sur pâte sans sucre et des levures
destinées à une
application sur pâte sucrée. L'utilisation d'une souche de levure large
spectre procure ainsi un
gain de temps et de place au sein de l'usine, et donc une meilleure
productivité.
La présente invention a pour objet de fournir un nouveau procédé rapide,
efficace et simple à
mettre en uvre pour obtenir de nouvelles souches de levure de panification
large spectre.
RESUME DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention est de fournir une souche de Saccharomyces
cerevisiae large
spectre, caractérisée en ce que :
- n copies d'un gène SUC sont inactivées, n étant un nombre entier tel que
l'activité
invertase de ladite souche est inférieure ou égale à 20 unités, et
- l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du
gène SUC est
inférieure à 80 unités.
Un deuxième objet de l'invention concerne un procédé d'obtention d'une souche
de
Saccharoinyces cerevisiae large spectre, comprenant les étapes de :
- sélection d'une souche de Saccharomyces cerevisiae présentant :
o une activité maltase inférieure à 80 unités, et
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
3
o une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans
sucre,
- inactivation de m copies d'un gène SUC de ladite souche sélectionnée, m
étant un
nombre entier tel que l'activité invertase de la souche sélectionnée et
inactivée est
inférieure ou égale à 20 unités.
Un troisième objet de l'invention concerne une souche de Saccharomyces
cerevisiae large
spectre susceptible d'être obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus.
Un quatrième objet de l'invention est une souche de levure dérivée d'une
souche telle que
définie ci-dessus, caractérisée en ce que ladite souche de levure dérivée est
une souche large
spectre présentant une activité invertase inférieure ou égale à 20 unités.
Un cinquième objet de l'invention est une levure obtenue par culture d'une
souche de levure
telle que définie ci-dessus ou d'une souche dérivée telle que définie ci-
dessus.
Un sixième objet de l'invention concerne l'utilisation d'une levure telle que
définie ci-dessus,
pour la fabrication de produits de panification.
Un septième objet de l'invention concerne l'utilisation d'une diminution de
l'activité
invertase pour obtenir une souche de levure large spectre à partir d'une
souche de levure
présentant une faible activité maltase et une force fermentative supérieure ou
égale à 110 ml
dans une pâte sans sucre.
TEXTE LIBRE DU LISTAGE DE SEQUENCES
La séquence SEQ ID NO: 2 est une séquence artificielle comprenant la séquence
loxP et des
régions flanquantes ( loxP and flanking regions ).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention a donc pour objet de fournir un nouveau procédé rapide,
efficace et
simple à mettre en oeuvre pour obtenir de nouvelles souches de levure de
panification large
spectre.
De manière surprenante et inattendue, les Inventeurs ont mis en évidence qu'il
est possible
d'obtenir des souches de levure large spectre à partir de souches de levure
présentant une
activité maltase basse.
Une souche de levure large spectre est une souche de levure performante à la
fois dans des
pâtes sans sucre et des pâtes sucrées.
Une pâte sans sucre désigne ici une pâte dans laquelle il n'a pas été ajouté
de sucre.
Dans une pâte sans sucre, les sucres présents proviennent de la farine.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
4
Une pâte sucrée désigne ici une pâte ayant une teneur en saccharose ajoute
supérieure ou
égale à 14% en masse par rapport à la masse de la farine, de préférence
supérieure ou égale à
20%.
Une pâte sucrée est par exemple une pâte ayant une teneur en sucre ajouté
égale à 25% ou
26% en masse par rapport à la masse de la farine.
La performance d'une souche de levure peut être évaluée en mesurant sa force
fermentative.
La force fermentative d'une souche de levure correspond au volume de CO2 (en
ml) produit
par la levure en fermentation dans des pâtons de farine.
Dans le cadre de la présente invention, la force fermentative d'une souche est
mesurée après
culture de ladite souche sur plaque de mélasse.
La culture d'une souche de levure sur plaque de mélasse est décrite dans
l'exemple 1.
La force fermentative est mesurée selon des techniques classiques connues de
l'homme du
métier, adaptées du protocole décrit par Burrows et Harrison dans Journal of
the Institute of
Brewing , Vol 65, 1959.
La force fermentative est notamment mesurée au moyen d'un fermentomètre ou
d'un
Risograph (par exemple National Manufacturing, Lincoln, Nebraska).
La force fermentative est mesurée ici sur des pâtons constitués de farine et
d'une suspension
de levures obtenues par culture de la souche sur plaque de mélasse, sur une
durée de 2 heures
(cf. exemple 1).
La suspension de levures est constituée de 150 mg de matières sèches de levure
pour une
mesure de la force fermentative en pâte sans sucre ou de 300 mg de matière
sèches de levure
pour une mesure de la force fermentative en pâte sucrée, dans 15 ml d'une
solution aqueuse à
27g/1 de NaCl et 4 g/1 de SO4(NH4)2.
Pour constituer les pâtons, le mélange de farine et de suspension de levures
est malaxé
pendant 40 secondes dans un pétrin, de manière à obtenir une pâte. La pâte est
ensuite placée
dans un récipient mis au bain-marie à 30 C. 13 minutes après le début du
malaxage, le
récipient contenant la pâte est fermé hermétiquement et le volume de gaz est
mesuré à 2
heures.
En l'absence d'indication contraire, la force fermentative correspond au
volume total de gaz
produit en ml, sur une durée de 2 heures, à 30 C.
Dans le cadre de la présente invention, la force fermentative d'une souche de
levure dans une
pâte sans sucre est mesurée dans une pâte contenant 20 g de farine.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
Dans le cadre de la présente invention, la force fermentative d'une souche de
levure dans une
pâte sucrée est mesurée dans une pâte contenant 6,5 g de saccharose et 25 g de
farine.
Une souche de levure large spectre au sens de l'invention est une souche de
levure qui a :
5 - une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte
sans sucre, et
- une force fermentative supérieure ou égale à 90 ml dans une pâte sucrée.
Une souche de levure large spectre préférée est une souche de levure qui a:
- une force fermentative supérieure ou égale à 120 ml, de préférence
supérieure ou
égale à 130 ml dans une pâte sans sucre, et
- une force fermentative supérieure ou égale à 95 ml, de préférence supérieure
ou
égale à 100 ml dans une pâte sucrée.
De manière surprenante et inattendue, les Inventeurs ont ainsi mis en évidence
qu'il est
possible de conférer un caractère large spectre à une souche de levure
uniquement en
diminuant son activité invertase et malgré le fait que ladite souche de levure
présente une
activité maltase basse.
La présente invention a ainsi pour objet des souches de levure large spectre,
caractérisée en ce
qu'elles présentent une activité invertase basse et en ce qu'elles sont
obtenues à partir d'une
souche de levure présentant une activité maltase basse.
.. La présente invention concerne uniquement des souches de Saccharomyces
cerevisiae.
Par la suite, on utilise donc indifféremment les termes souche de levure ou
souche de
Saccharomyces cerevisiae .
L'activité invertase est conférée par au moins une enzyme invertase.
L'invertase convertit une molécule de saccharose en une molécule de glucose et
une molécule
de fructose.
Une activité invertase basse désigne ici une activité invertase inférieure ou
égale à 20 unités,
l'activité invertase étant mesurée après culture de la souche de levure sur
plaque de mélasse
(cf exemple 1).
Une unité invertase correspond à 1 mole de sucre réducteur libérée en 5
minutes par mg de
matière sèche de levure, à 30 C et à pH 4,7, sans plasmolyse de la levure.
L'activité invertase peut être mesurée par des tests bien connus de l'homme du
métier.
Par exemple, l'activité invertase est mesurée de la manière suivante : une
quantité connue, de
l'ordre de quelques dizièmes de milligrammes, de matières sèches levure et du
saccharose à
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
6
une concentration 0,1 molaire sont mis en présence en milieu tamponné (tampon
acétate à 50
mM et à pH 4,7), le tout place dans un bain-marie à 30 C. Après 5 minutes
d'incubation, la
réaction d'inversion du saccharose est bloquée par ajout du réactif à l'acide
dinitrosalicylique
qui sert à doser, avec un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 540 nm,
les sucres
réducteurs formés par réaction colorimétrique.
Dans un mode de réalisation préféré, une souche de levure large spectre selon
l'invention
possède une activité invertase inférieure ou égale à 17 unités, de préférence
inférieure ou
égale à 15 unités.
L'activité maltase est mesurée ici en condition de répression, c'est-à-dire
après culture en
présence de glucose et en l'absence de maltose.
Une activité maltase basse désigne ici une activité inférieure à 80 unités,
l'activité maltase
étant mesurée après culture de la souche de levure sur plaque de mélasse, puis
mise en
incubation dans un milieu contenant du glucose, en l'absence de maltose (cf
exemple 1).
Une unité maltase correspond à 1 nanomole de p-nitrophénol libéré par minute
et par mg de
protéines.
L'activité maltase peut être mesurée par des tests bien connus de l'homme du
métier.
Par exemple, l'activité maltase est mesurée par dosage de la libération d'un
produit coloré, le
p-nitrophénol, suite à l'action de la maltase sur un substrat chromogénique,
le 4-nitrophényl-
.. -D-glucopyranoside, comme décrit dans Houghton-Larsen et Anders Brandt,
Appl. Environ.
Microbiol., 2006, p 7176-7182.
L'activité maltase est mesurée ici après culture de la souche de levure sur
plaque de mélasse
et mise en incubation, notamment pendant 4 heures, dans un milieu contenant du
glucose (cf
protocole décrit dans l'exemple 1).
Une caractéristique essentielle de l'invention réside en ce que la souche de
levure large
spectre présente une activité invertase basse.
La famille de gènes SUC de Saccharomyces comprend 6 gènes codant pour
l'invertase (SUC1
à SUCS et SUC7) qui sont localisés sur différents chromosomes.
Par le terme gène SUC , on désigne ici indifféremment les gènes SUC, SUC2,
SUC3,
SUC 4, SUCS ou SUC7.
Dans un mode de réalisation préféré, l'activité invertase basse est obtenue en
inactivant au
moins une copie d'un gène SUC.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
7
Une souche de Saccharomyces cerevisiae peut avoir dans son génome zéro, une ou
plusieurs
copies de chacun des gènes SUC1, SUC2, SUC3, SUC 4, SUCS ou SUC7.
La présente invention a ainsi pour objet une souche de Saccharomyces
cerevisiae large
spectre, caractérisée en ce que :
- n copies d'un gène SUC sont inactivées, n étant un nombre entier tel que
l'activité
invertase de ladite souche est inférieure ou égale à 20 unités,
- l'activité maltase de ladite souche avant inactivation des n copies du
gène SUC est
basse.
La présente invention a particulièrement pour objet une souche de
Saccharomyces cerevisiae
large spectre, caractérisée en ce que :
- n copies d'un gène SUC sont inactivées, n étant un nombre entier tel que
l'activité
invertase de ladite souche est inférieure ou égale à 20 unités, et
- l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du
gène SUC est
inférieure à 80 unités.
Une copie d'un gène SUC est inactivée lorsqu'elle n'est pas du tout traduite
en invertase ou
lorsqu'elle n'est pas traduite en une invertase fonctionnelle.
Une invertase fonctionnelle est une invertase qui est capable de convertir le
saccharose en
glucose et fructose.
L'expression n copies d'un gène SUC inactivées signifie que la somme du
nombre de
copies inactivées du gène SUC1, du gène SUC2, du gène SUC3, du gène SUC4, du
gène
SUCS et du gène SUC7 est égale à n.
Le nombre n de copies d'un gène SUC inactivées est nécessairement inférieur ou
égal au
nombre de copies du gène SUC présent dans la souche.
Par nombre de copies du gène SUC présent dans la souche, on entend la somme
du
nombre de copies du gène SUC, du gène SUC2, du gène SUC3, du gène SUC4, du
gène
SUCS et du gène SUC7.
Le nombre n de copies du gène SUC inactivées doit donc être suffisant pour
obtenir une
activité invertase inférieure ou égale à 20 unités.
La présente invention a particulièrement pour objet une souche telle que
définie ci-dessus,
caractérisée en ce que n est supérieur ou égal à 2, de préférence supérieur ou
égal à 4, plus
préférentiellement supérieur ou égal à 8.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
8
Des souches préférées selon l'invention présentent au moins 10 copies du gène
SUC
inactivées ou encore au moins 12 copies du gène SUC inactivées.
Lorsqu'une souche de levure présente une activité invertase nulle ou quasi
nulle, son
utilisation peut entraîner des problèmes de coloration du pain au cours de la
cuisson.
Aussi, la présente invention a de préférence pour objet une souche de levure
large spectre telle
que définie ci-dessus, caractérisée en ce que l'activité invertase de ladite
souche est supérieure
ou égale à 2 unités.
Les n copies du gène SUC peuvent être inactivées par tout moyen.
Chacune des n copies inactivées du gène SUC peut être inactivée par un ou
plusieurs moyens
différents.
Les n copies du gène SUC peuvent par exemple être inactivées par
l'inactivation de la
transcription d'au moins une copie d'un gène SUC, la délétion d'au moins une
copie d'un
gène SUC, l'insertion d'au moins une séquence dans au moins une copie d'un
gène SUC, la
disruption d'au moins une copie d'un gène SUC et/ou une mutation dans au moins
une copie
d'un gène SUC.
L'inactivation de la transcription d'une copie d'un gène SUC est par exemple
obtenue en
supprimant la séquence promotrice dudit gène SUC.
La délétion d'une copie d'un gène SUC signifie la délétion totale ou partielle
de la partie
codante d'une copie du gène SUC, éventuellement accompagnée de la délétion
totale ou
partielle de la séquence promotrice et/ou de la séquence terminatrice.
L'expression partie codante d'un gène est synonyme de phase ouverte de
lecture ou
ORF (Opening Reading Frame).
La phase ouverte de lecture commence par un codon d'initiation et se termine
par un codon
stop.
L'insertion d'au moins une séquence dans une copie d'un gène SUC signifie
qu'au moins une
séquence d'ADN est insérée dans la partie codante de la copie du gène SUC.
La séquence d'ADN insérée comprend au moins 1 paire de base.
Dans un mode de réalisation préféré, l'insertion d'au moins une séquence d'ADN
dans une
copie d'un gène SUC introduit un décalage du cadre de lecture. Le décalage du
cadre de
lecture empêche ainsi une traduction correcte de la copie du gène SUC.
Plusieurs séquences d'ADN peuvent être insérées dans la partie codante d'une
copie du gène
SUC.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
9
La disruption d'une copic d'un gène SUC signifie la délétion partielle ou
totale de la partie
codante du gène SUC, accompagnée d'une insertion d'au moins une séquence d'ADN
dans la
partie codante d'une copie du gène SUC.
Lors de la disruption d'une copie d'un gène SUC, la séquence d'ADN insérée
comprend au
moins 1 paire de base, de préférence au moins 30 paires de base.
La disruption d'une copie d'un gène SUC conduit par exemple à l'insertion
d'une séquence
d'ADN de 103 paires de base.
De préférence, la copie du gène SUC inactivée par disruption présente une
délétion d'au
moins 1% de la phase ouverte de lecture du gène SUC, de préférence au moins
10%, plus
préférentiellement au moins 20%, plus préférentiellement encore au moins 50%.
La copie du gène SUC inactivée par disruption peut également présenter une
délétion d'au
moins 60% de la phase ouverte de lecture du gène SUC ou au moins 70% de la
phase ouverte
de lecture du gène SUC.
Une souche de levure large spectre selon l'invention peut comprendre des
copies du gène
SUC inactivées par disruption présentant des pourcentages de délétion de la
phase ouverte de
lecture du gène SUC différents.
La mutation dans une copie d'un gène SUC est de préférence une mutation qui
introduit un
codon stop dans la région codante ou une mutation qui modifie au moins un
acide aminé du
site actif de l'invertase.
Dans un mode de réalisation avantageux, lorsque l'inactivation du gène SUC est
obtenue par
disruption ou insertion, cette inactivation ne conduit pas à l'expression d'un
peptide, d'un
polypeptide ou d'une protéine chimère.
Par peptide, polypeptide ou protéine chimère , on entend un peptide,
polypeptide ou
protéine qui n'existe pas dans la souche de Saccharomyces cerevisiae sauvage
et qui est
obtenu par transcription puis traduction d'une partie de séquence provenant de
la souche et
d'une partie ou de la totalité de la séquence d'ADN insérée.
La présente invention a particulièrement pour objet une souche telle que
définie ci-dessus,
caractérisée en ce qu'au moins une copie d'un gène SUC est inactivée par
disruption.
Une souche préférée selon l'invention est caractérisée en ce qu'au moins 8
copies du gène
SUC sont inactivées par disruption, de préférence au moins 10 copies.
Des souches préférées selon l'invention présentent 10, 11 ou 12 copies du gène
SUC
inactivées par disruption.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
Les souches larges spectre selon l'invention sont généralement obtenues par
inactivation d'un
nombre élevé de copies du gène SUC.
Comme indiqué par la suite, les Inventeurs ont mis au point un procédé
original permettant
d'effectuer rapidement, efficacement et facilement une disruption multicopies
du gène SUC.
5 Lorsqu'une souche large spectre est obtenue par le procédé selon
l'invention en utilisant la
technique cre-lox, il reste au moins une séquence d'ADN exogène dans la
souche.
La présente invention a ainsi pour objet une souche telle que définie ci-
dessus, caractérisée en
ce qu'elle comprend au moins une séquence d'ADN exogène.
10 Une séquence d'ADN exogène correspond à une séquence d'ADN qui n'est pas
présente dans
le génome d'une souche de Saccharomyces non génétiquement modifiée.
La séquence d'ADN exogène provient de préférence de l'inactivation d'une copie
du gène
SUC par disruption ou insertion.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la séquence d'ADN
exogène ne
comprend pas de gène de résistance à un antibiotique.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la séquence d'ADN
exogène n'est pas
une séquence codante.
De plus, la séquence d'ADN exogène n'est de préférence pas traduite, en
totalité ou partie, en
un peptide, polypeptide ou une protéine chimère.
Dans un mode de réalisation préféré, la séquence d'ADN exogène comprend une
séquence
lox.
Une séquence lox préférée selon l'invention est la séquence loxP de 34 paires
de base
suivante :
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT (SEQ ID NO:1).
Une séquence d'ADN exogène préférée est la séquence de 103 paires de base
suivante :
TGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAAC TTC GTATAATGTA
TGCTATACGAAGTTATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTGGCCTATGCG
(SEQ ID NO: 2).
La séquence SEQ ID NO: 2 comprend la séquence loxP de séquence SEQ ID NO:1
(représentée en caractères gras) et des régions flanquantes.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
11
Une souche de levure large spectre selon l'invention comprend de préférence le
même
nombre de séquences exogènes que le nombre de copies du gène SUC inactivées
par
disruption.
Une souche de levure large spectre selon l'invention comprend en particulier
le même nombre
de séquences exogènes SEQ ID NO: 2 que le nombre de copies du gène SUC
inactivées par
disruption.
La présente invention a plus particulièrement pour objet une souche telle que
définie ci-
dessus, choisie parmi la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro 1-
4339, la souche
déposée auprès de la CNCM sous le numéro 1-4340 et la souche déposée auprès de
la CNCM
sous le numéro 1-4338.
Les souches 1-4339, 1-4340 et 1-4338 ont été déposées en vertu du traité de
Budapest le 8
juillet 2010 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes), 25
rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France.
La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le
numéro
1-4339 est caractérisée en ce que :
- 10 copies d'un gène SUC sont inactivées par disruption, son activité
invertase étant
inférieure ou égale à 15 unités, et
- l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du
gène SUC est
inférieure à 70 unités.
La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le
numéro
1-4339 comprend 10 séquences SEQ ID NO: 2, au niveau des dix copies du gène
SUC
inactivées par disruption.
La souche de Saccharornyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le
numéro
1-4340 est caractérisée en ce que :
- 11 copies d'un gène SUC sont inactivées par disruption, son activité
invertase étant
inférieure ou égale à 15 unités, et
- l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du
gène SUC est
inférieure à 70 unités.
La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le
numéro
1-4340 comprend 11 séquences SEQ ID NO: 2, au niveau des onze copies du gène
SUC
inactivées par disruption.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
12
La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le
numéro
1-4338 est caractérisée en ce que :
- 12 copies d'un gène SUC sont inactivées par disruption, son activité
invertase étant
inférieure ou égale à 15 unités, et
- l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du
gène SUC est
inférieure à 70 unités.
La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le
numéro
1-4338 comprend 12 séquences SEQ ID NO: 2, au niveau des douze copies du gène
SUC
inactivées par disruption.
Les souches de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposées à la CNCM sous
les
numéros 1-4339, 1-4340 et 1-4338 ne comportent pas de séquence exogène autre
que les
séquences SEQ ID NO: 2.
En particulier, les souches de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposées
à la CNCM
sous les numéros 1-4339, 1-4340 et 1-4338 ne comportent pas de gène de
résistance à un
antibiotique.
Les souches de levure large spectre selon l'invention, et en particulier les
souches déposées à
la CNCM sous les numéros 1-4339, 1-4340 et 1-4338 ont été obtenues par un
procédé original
qui est à la fois rapide, efficace et simple à mettre en oeuvre.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'obtention d'une souche
de
Saccharomyces cerevisiae large spectre, comprenant les étapes de :
- sélection d'une souche dc Saccharomyces cerevisiae présentant :
o une activité maltase inférieure à 80 unités, et
o une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans
sucre,
- inactivation de m copies d'un gène SUC de ladite souche sélectionnée, m
étant un nombre
entier tel que l'activité invertase de la souche sélectionnée et inactivée est
inférieure ou
égale à 20 unités.
L'activité maltase, l'activité invertase et la force fermentative sont telles
que définies ci-
dessus.
L'étape de sélection comprend de préférence la sélection d'une souche de
Saccharomyces
cerevisiae présentant une force fermentative supérieure ou égale à 120 ml dans
une pâte sans
sucre, plus préférentiellement supérieure ou égale à 130 ml dans une pâte sans
sucre.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
13
L'expression m copies d'un gène SUC inactivées signifie que la somme du
nombre de
copies inactivées du gène SUC, du gène SUC2, du gène SUC3, du gène SUC4, du
gène
SUCS et du gène SUC7 est égale à m.
Le nombre m de copies d'un gène SUC inactivées est nécessairement inférieur ou
égal au
nombre de copies du gène SUC présent dans la souche.
Par nombre de copies du gène SUC présent dans la souche, on entend la somme
du
nombre de copies du gène SUC, du gène SUC2, du gène SUC3, du gène SUC4, du
gène
SUCS et du gène SUC7.
Le nombre m de copies du gène SUC inactivées doit donc être suffisant pour
obtenir une
.. activité invertase inférieure ou égale à 20 unités.
Le procédé selon l'invention permet ainsi d'obtenir des souches de levure
large spectre telles
que définies ci-dessus, c'est-à-dire des souches de levure qui ont :
- une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans
sucre, et
- une force fermentative supérieure ou égale à 90 ml dans une pâte sucrée.
La présente invention a particulièrement pour objet un procédé tel que défini
ci-dessus,
caractérisé en ce que l'étape d'inactivation de m copies d'un gène SUC
comprend
l'inactivation de la transcription d'au moins une copie d'un gène SUC, la
délétion d'au moins
une copie d'un gène SUC, l'insertion d'au moins une séquence dans au moins une
copie d'un
gène SUC, la disruption d'au moins une copie d'un gène SUC et/ou une mutation
dans au
moins une copie d'un gène SUC.
Les différents moyens d'inactivation d'une copie du gène SUC sont tels que
définis ci-dessus.
Les souches de levure large spectre selon l'invention sont de préférence des
souches de levure
industrielles.
Les souches de levure industrielles sont généralement polyploïdes, voire
aneuploïdes.
S'agissant du gène SUC, une souche industrielle peut comprendre par exemple au
moins 12
copies du gène SUC.
L'inactivation d'un nombre relativement élevé de copies du gène SUC peut donc
être
nécessaire pour obtenir une activité invertase inférieure à 20 unités.
La présente invention a particulièrement pour objet un procédé tel que défini
ci-dessus,
caractérisé en ce que m est supérieur ou égal à 2, de préférence supérieur ou
égal à 4, plus
préférentiellement supérieur ou égal à 8.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
14
La présente invention a par exemple pour objet un procédé tel que défini ci-
dessus, caractérisé
en ce que m est supérieur ou égal à 10. Par exemple, m est égal à 10, 11 ou
12.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, au moins 4 copies du
gène SUC sont
inactivées par disruption, de préférence au moins 8 copies du gène SUC, plus
préférentiellement au moins 10 copies du gène SUC. Par exemple, 10, 11 ou 12
copies du
gène SUC sont inactivées par disruption.
L'invention a pour objet de fournir un procédé rapide, efficace et simple de
mise en oeuvre
pour obtenir des souches de levure large spectre, quel que soit le nombre de
copies du gène
SUC à inactiver par disruption.
Cependant, il est connu qu'une variabilité génétique existe entre les
différents membres de la
famille de gènes SUC, au niveau des séquences adjacentes de la partie codante
du gène
(Carlson et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2894-2902).
Aussi, si on souhaite utiliser les séquences en amont et en aval des gènes SUC
pour inactiver
plusieurs copies du gène SUC, il est nécessaire de construire des cassettes de
disruption
spécifiques pour chacun des 6 membres de la famille de gènes SUC et utiliser
au moins 6 jeux
de séquences de recombinaison homologue.
Afin d'éviter un procédé nécessitant de construire de nombreuses cassettes de
disruption, les
Inventeurs ont alors décidé de choisir les séquences d'ADN homologues dans la
partie
.. codante du gène SUC.
Toutefois, les Inventeurs ont mis en évidence, de manière inattendue, une
variabilité
génétique dans la séquence codante des membres de la famille de gènes SUC
entre différentes
souches de Saccharomyces cerevisiae.
Par exemple, la séquence SEQ ID NO: 3 correspondant à la partie codante du
gène SUC de
référence YIL162W possède 92% d'identité avec la séquence de la partie codante
d'un gène
SUC de la souche déposée le 24 février 2005 à la CNCM sous le numéro 1-3399.
Or, de manière surprenante et inattendue, le procédé selon l'invention permet
d'utiliser un
même jeu de séquences de recombinaison homologue pour inactiver par disruption
différentes
copies du gène SUC, indépendamment de la souche de saccharomyces cerevisiae
utilisée.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé tel que défini ci-dessus,
caractérisé en ce
que l'étape d'inactivation comprend :
- une étape a) de transformation de ladite souche sélectionnée avec une
cassette
de disruption comprenant un marqueur de sélection,
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
- une étape b) de sélection des souches transformées ayant
intégré la cassette de
disruption,
- une éventuelle étape c) d'élimination du marqueur de sélection.
La cassette de disruption comprend un marqueur de sélection, ainsi que des
séquences
5 .. promotrices et terminatrices permettant son expression.
L'homme du métier sait quels marqueurs de sélection sont appropriés pour une
utilisation
chez la levure.
Le marqueur de sélection est de préférence un gène de résistance à un
antibiotique.
Le marqueur de sélection est par exemple choisi parmi le gène de résistance à
la kanamycine,
10 blasticidine, phléomycine, hygromycine et nourséothricine.
La cassette de disruption comprend deux séquences de recombinaison homologues
qui
encadrent le marqueur de sélection.
Une séquence de recombinaison homologue est ici une séquence homologue d'une
séquence
de la partie codante de la copie du gène SUC ou d'une séquence adjacente à la
partie codante
15 .. du gène SUC.
De préférence, la séquence de recombinaison homologue est homologue d'une
séquence de la
partie codante de la copie du gène SUC.
Une séquence de recombinaison homologue comprend par exemple entre 40 et 60
paires de
base, de préférence entre 45 et 55 paires de base.
Une séquence de recombinaison homologue est par exemple choisie parmi :
- la séquence située de la base 1 à 51 de la séquence SEQ ID NO: 3,
- la séquence située de la base 1549 à 1599 de la séquence SEQ ID NO: 3,
- la séquence située de la base 54 à 104 de la séquence SEQ ID NO: 3,
- la séquence située de la base 1497 à 1547 de la séquence SEQ ID NO: 3,
- la séquence située de la base 110 à 159 de la séquence SEQ ID NO: 3, et
- la séquence située de la base 1442 à 1491 de la séquence SEQ ID NO: 3.
L'étape b) de sélection des souches transformées ayant intégré la cassette de
disruption est
effectuée en sélectionnant les souches sur la base du marqueur de sélection.
Lorsque le marqueur de sélection est un gène de résistance à un antibiotique,
l'étape b) est
effectuée en sélectionnant les souches capables de se multiplier sur un milieu
contenant
l'antibiotique. Seules les souches transformées ayant intégré la cassette de
disruption
contenant le gène de résistance à cet antibiotique sont capables de se
multiplier sur le milieu
contenant l'antibiotique.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
16
Le procédé selon l'invention comprend de préférence une étape c) d'élimination
du marqueur
de sélection.
L'étape c) d'élimination du marqueur de sélection peut se produire par
excision spontanée
chez la levure.
Afin de favoriser l'excision spontanée, le marqueur de sélection est de
préférence placé entre
deux séquences répétées directes (SRD).
L'étape c) d'élimination du marqueur de sélection est de préférence effectuée
de manière
dirigée par des techniques bien connues de l'homme du métier.
Par exemple, l'étape d'élimination est effectuée avec la technique cre-lox.
Dans ce cas, la
cassette de disruption comprend deux séquences lox encadrant le marqueur de
sélection. Le
marqueur de sélection est alors éliminé en utilisant la recombinase Cre.
La présente invention a ainsi particulièrement pour objet un procédé tel que
défini ci-dessus,
caractérisé en ce que la cassette de disruption comprend un marqueur de
sélection encadré par
deux séquences lox, lesdites séquences lox étant encadrées par deux séquences
de
recombinaison homologue.
La séquence lox est par exemple la séquence loxP de séquence SEQ ID NO: 1.
Lorsque plus d'une copie du gène SUC doivent être inactivées par disruption,
il est
avantageux d'utiliser des cassettes de disruption différentes, afin de
diminuer la durée de
l'étape d'inactivation.
Les cassettes de disruption peuvent différer entre elles par la nature du
marqueur de sélection
et/ou la ou les séquences de recombinaison homologue.
Par exemple, l'utilisation de cassettes de disruption avec une ou deux
séquences de
recombinaison homologue différentes entre elles permet d'éviter que la
disruption se
reproduise au niveau d'une copie déjà inactivée par disruption.
Par ailleurs, l'utilisation de cassettes de disruption avec des marqueurs de
sélection différents
permet d'effectuer les étapes de transformation et de sélection de manière
séquentielle avec
les différentes cassettes, puis d'éliminer les différents marqueurs en une
seule étape.
Ainsi, le procédé selon l'invention permet de diminuer la durée de l'étape
d'inactivation.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé tel que défini ci-dessus,
caractérisé en ce
qu'il comprend au moins une fois la série d'étapes suivante :
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
17
- au moins deux répétitions de l'étape a) de transformation suivie de l'étape
b)
de sélection, et
- une étape c) d'élimination des marqueurs de sélection.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention a pour
objet un procédé
tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que chaque étape a) de
transformation est effectuée
avec une cassette de disruption comprenant un marqueur de sélection différent
et bu au moins
une séquence de recombinaison homologue différente.
La présente invention a particulièrement pour objet un procédé tel que défini
ci-dessus,
caractérisé en ce qu'il comprend trois fois ladite série d'étapes et en ce
qu'au moins deux
séries comprennent quatre répétitions de l'étape a) de transformation suivie
de l'étape b) de
sélection
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention a pour objet un
procédé
d'obtention d'une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre, comprenant
les étapes
suivantes :
- sélection d'une souche de Saccharomyces cerevisiae présentant :
o une activité maltase inférieure à 80 unités et
o une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans
sucre,
- inactivation de m copies d'un gène SUC de ladite souche sélectionnée, m
étant un nombre
entier tel que l'activité invertase de la souche sélectionnée et inactivée est
inférieure ou
égale à 20 unités,
l'étape d'inactivation comprenant au moins deux fois la série d'étapes
suivante :
o quatre répétitions de l'étape a) de transformation de ladite souche
sélectionnée
avec au moins une cassette de disruption comprenant un marqueur de sélection,
suivie de l'étape b) de sélection des souches transformées ayant intégré
ladite
cassette de disruption, et
o une étape c) d'élimination des marqueurs de sélection,
et comprenant une fois la série d'étapes suivante :
o au moins deux répétitions de l'étape a) de transformation avec au moins
une
cassette de disruption comprenant un marqueur de sélection, suivie de l'étape
b) de
sélection des souches transformées ayant intégré ladite cassette de
disruption, et
o une étape c) d'élimination des marqueurs de sélection.
Les cassettes de disruption de chaque série comportent de préférence les mêmes
séquences de
recombinaison homologue et des marqueurs de sélection différents.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
18
Les cassettes de disruption entre les différentes séries comportent de
préférence une ou les
deux séquences dc recombinaison homologue différentes.
Le procédé selon l'invention nécessite par exemple la construction de 4
plasmides comportant
chacun un marqueur de sélection différent.
Douze cassettes de disruption peuvent alors être obtenues simplement, en
utilisant
uniquement trois jeux d'amorces différentes qui comprennent les séquences de
recombinaison
homologue.
La présente invention a également pour objet une souche de Saccharomyces
cerevisiae large
spectre susceptible d'être obtenue ou obtenue par le procédé tel que défini ci-
dessus.
La présente invention a également pour objet toutes les souches dérivées des
souches de
levure large spectre selon l'invention et qui partagent les mêmes propriétés.
Par l'expression souche dérivée , on désigne une souche dérivée par toute
transformation
quelle qu'elle soit, comme par exemple un ou plusieurs croisements et/ou une
ou plusieurs
mutations et/ou une ou plusieurs transformations génétiques.
Une souche dérivée par croisement peut être obtenue par croisement d'une
souche selon
l'invention avec la même souche, ou une autre souche selon l'invention, ou une
autre souche
quelconque.
Une souche dérivée par mutation peut être une souche qui a subi au moins une
mutation
spontanée dans son génome ou au moins une mutation induite, par exemple par
mutagenèse.
La ou les mutations de la souche dérivée sont silencieuses ou non.
Par l'expression mutagenèse , on désigne à la fois la mutagenèse classique
obtenue par
rayonnements ou par des agents chimiques mutagènes, et la mutagenèse
insertionnelle par
transposition ou par intégration d'un fragment d'ADN exogène.
La mutagenèse par rayonnements comprend l'utilisation de rayonnements UV, X,
ou gamma.
Les agents chimiques mutagènes sont par exemple l'EMS (éthyl-méthyl
sulfonate), l'EES
(éthyl-éthyl sulfonate), la nitrosoguanidine, l'acide nitreux, l'aflatoxine
Bi, l'hydroxylamine,
la 5-bromo uracile, la 2-amino purine, la proflavine et/ou l'acridine orange.
Une souche dérivée par transformation génétique est une souche dans laquelle a
été introduit
un ADN exogène.
Ledit ADN exogène peut être apporté par un plasmide.
Ledit ADN exogène est de préférence intégré dans le génome de la levure.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
19
La présente invention a ainsi pour objet une souche de levure dérivée d'une
souche telle que
définie ci-dessus, caractérisée en ce que ladite souche dérivée est une souche
large spectre
présentant une activité invertase inférieure ou égale à 20 unités.
L'invention a également pour objet un procédé de transformation d'une souche
de levure
large spectre selon l'invention, pour obtenir une souche dérivée telle que
définie ci-dessus,
ledit procédé de transformation comprenant une étape de transformation de
ladite souche par
au moins un croisement et/ou au moins une mutation et/ou au moins une
transformation
génétique.
La présente invention concerne également des souches de levure susceptibles
d'être obtenues
par le procédé de transformation tel que défini ci-dessus.
La présente invention a particulièrement pour objet une levure obtenue par
culture d'une
souche de levure telle que définie ci-dessus ou par culture d'une souche de
levure dérivée telle
que définie ci-dessus.
Les levures sont produites à partir de souches de levure large spectre selon
l'invention,
notamment comme décrit dans le livre de référence Yeast Technology , 2ème
édition,
1991, G. Reed et T.W. Nagodawithana, publié par Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-
442-
31892-8.
La multiplication des levures, à l'échelle industrielle, comprend en général
au moins les deux
premières étapes de l'ensemble des étapes suivantes :
- multiplication d'une souche de levure en plusieurs stades, d'abord en semi-
anaérobiose, puis en aérobiose,
-
séparation par centrifugation de la levure ainsi produite de son milieu de
culture, pour
obtenir une crème de levure liquide contenant environ entre 12 et 25% de
matière
sèche, voire une quantité plus élevée de matière sèche si la crème de levure
est
mélangée avec des produits osmolytes,
- filtration de la crème de levure liquide ainsi obtenue, en général sur un
filtre rotatif
sous vide, pour obtenir une levure fraîche déshydratée contenant de 26% à 35%
de
matière sèche,
- malaxage de ladite levure fraîche déshydratée, pour obtenir une masse
homogène,
- extrusion de la levure ainsi obtenue, pour obtenir :
o une levure pressée sous forme de pains de levure fraîche ou de levure
fraîche
émiettée, contenant environ 30% de matière sèche, ou
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
o une levure sous forme de particules, en général de granules, si la levure
est
destinée à être séchée,
- éventuellement, séchage de manière ménagée, dans un courant d'air chaud, par
exemple par fluidisation, des particules de levures obtenues par extrusion
pour
5 obtenir de la levure sèche.
L'étape de séchage est de préférence un séchage rapide ménageant en présence
d'un
émulsifiant.
Parmi les émulsifiants pouvant être utilisés lors de l'étape de séchage, on
peut choisir le
monostéarate de sorbitan, utilisé par exemple à une concentration d'environ
1,0% (en poids
10 sur le poids de levure sèche).
Les levures selon l'invention peuvent être utilisées sous toute forme
possible.
Par exemple, la présente invention a pour objet une levure telle que définie
ci-dessus,
caractérisée en ce qu'elle est sous forme de crème de levure, de levure
pressée, de levure
sèche ou de levure surgelée.
15 Les levures fraîches sont caractérisées par une teneur élevée en eau en
comparaison aux
levures sèches. Les levures fraîches englobent les crèmes de levure et les
levures pressées.
Les crèmes de levure, appelées également levures liquides , sont des
suspensions aqueuses
de cellules de levure présentant une viscosité de type crème.
Par crème de levure, on comprend une suspension liquide, typiquement une
suspension
20 aqueuse, de cellules vivantes de levure, ladite suspension ayant une
teneur en matière sèche
d'au moins 12% en masse, généralement comprise d'environ 12 à environ 50% en
masse
(définition étendue de crème de levure).
Dc préférence, la crème de levure répond à la définition au sens strict, c'est-
à-dire qu'elle
présente une teneur en matière sèche comprise d'environ 12 à environ 25% en
masse, de
préférence d'environ 14 à environ 22% en masse.
Parmi les levures pressées, on distingue les levures pressées en bloc compact,
appelées
également pains de levure qui sont caractérisées par une teneur en matière
sèche comprise
d'environ 26% à environ 35%, et les levures pressées en granules qui sont
caractérisées par
une teneur en eau comprise d'environ 21% à environ 35%.
Les levures sèches sont caractérisées par une teneur en matière sèche
supérieure à environ
92%.
Les levures surgelées sont caractérisées par une teneur en matière sèche
comprise d'environ
74% à environ 80%.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
21
Les levures scion l'invention issues de la culture de souches de levure large
spectre sont
performantes sur des pâtes sans sucre et des pâtes sucrées, en particulier des
pâtes sucrées
contenant un pourcentage élevé de saccharose.
Les levures selon l'invention sont ainsi utiles en tant qu'agent de
fermentation pour la
fabrication de produits de panification obtenus à partir de pâtes sans sucre
ou de pâtes sucrées.
La performance d'une levure peut être évaluée en panification par une mesure
du temps
d'apprêt (également appelé proof time).
Le temps d'apprêt est défini comme le temps nécessaire pour que la pâte
boulangère atteigne
une certaine hauteur dans le moule correspondant au développement de la pâte
souhaitée pour
qu'elle soit mise au four.
Les levures produites à partir des différentes souches de levure large spectre
selon l'invention
permettent d'obtenir un temps d'apprêt comparable à une souche de référence en
pâte normale
et à une souche de référence en pâte sucrée (cf. exemple 2).
Les levures issues des souches de levure large spectre selon l'invention
donnent par exemple
des valeurs de temps d'apprêt comprises entre les valeurs de temps d'apprêt
obtenues avec
deux souches adaptées à une pâte sucrée de référence sur pâte sucrée (cf.
exemple 2), en
panification selon un schéma direct avec 25 % de saccharose.
La présente invention a ainsi également pour objet l'utilisation d'une levure
telle que définie
ci-dessus, pour la fabrication de produits de panification.
Les levures obtenues par culture des souches large spectre selon l'invention
peuvent être
utilisées dans des procédés de panification de type schéma direct (NO-T1ME
DOUGH) et de
type schéma indirect ( SPONGE and DOUGH ), dans des pâtes sans sucre ou
sucrées, avec
ou sans inhibiteur de moisissures. Leur utilisation n'est cependant pas
limitée aux applications
spécifiques décrites ci-dessus et ci-après.
Un schéma direct ne comporte pratiquement pas de première fermentation entre
un pétrissage
intensif et la division de la pâte, les pâtons obtenus étant fermentés en
moule entre 35 C et
40 C, puis cuits.
Un schéma SPONGE and DOUGH est un procédé de panification comprenant deux
étapes de fermentation :
- une première étape, appelée SPONGE , qui correspond à la fermentation
d'une pâte
comprenant 50 à 70% de la farine totale mise en oeuvre, une partie de l'eau et
la totalité de
la levure, pendant plusieurs heures, en général environ quatre heures,
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
22
- une seconde étape, appelée DOUGH , dans laquelle le SPONGE obtenu après
la
fermentation ci-dessus est combine avec le reste de la farine, le reste de
l'eau et les autres
ingrédients de la pâte, le mélange ainsi constitué est pétri, divisé, mis en
moule et
fermenté, puis cuit, cette seconde fermentation en moule correspondant à
l'apprêt et sa
durée étant le temps d'apprêt.
Les pourcentages sont exprimés en pourcentages dits du boulanger, le
pourcentage dit du
boulanger étant une méthode de calcul appliquée aux rapports des ingrédients
dans laquelle la
masse totale de la farine représente toujours 100% et la masse des autres
ingrédients de la pâte
est calculée par rapport à cette masse de farine.
L'invention vise encore une pâte boulangère contenant une levure selon
l'invention.
La pâte boulangère peut être une pâte sans sucre, une pâte légèrement sucrée
ou une pâte
sucrée, le sucre étant de préférence ajouté sous forme de saccharose.
L'expression pâte légèrement sucrée désigne des pâtes ayant une teneur en
sucre ajouté
inférieure à 14% en masse par rapport à la masse de la farine, de préférence
inférieure ou
égale à 12% en masse par rapport à la masse de la farine.
L'invention vise encore un procédé de préparation d'une pâte boulangère
comprenant une
étape de fermentation par une levure selon l'invention.
.. L'invention vise encore un procédé de préparation d'un produit cuit de
panification
comprenant une étape de cuisson d'une pâte boulangère telle que définie ci-
dessus.
L'invention vise enfin un produit de panification susceptible d'être obtenu
par le procédé tel
que défini ci-dessus.
Ainsi, en jouant uniquement sur le paramètre activité invertase, les
Inventeurs ont obtenu des
souches de levure large spectre.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une diminution de
l'activité
invertase pour obtenir une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre à
partir d'une
souche de Saccharomyces cerevisiae présentant une faible activité maltase et
une force
fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter.
Les exemples décrivent en particulier l'obtention des souches de levure large
spectre selon
l'invention, et l'évaluation en panification des levures obtenues à partir de
ces souches.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
23
EXEMPLE 1: OBTENTION DE SOUCHES DE LEVURE LARGE SPECTRE SELON
L'INVENTION
Matériel et Méthodes
(i) Culture sur plaque de mélasse
Une pré-culture de la souche de levure est réalisée en ensemençant 0,3 mg de
la souche de
levure sur une boîte de Pétri de diamètre 90 mm contenant 20 ml de milieu YEG
(à 2% de
glucose). Le milieu YEG contient 20 g/1 de glucose, 5 g/1 d'extrait de levure
et 30 g/1 d'agar.
Après 16 heures d'incubation à 30 C, les cellules de levure contenues sur la
boîte de Pétri
sont récoltées.
Les cellules de levure récoltées à l'issue de la pré-culture sont ensemencées
sur des boîtes de
Pétri de 140 mm de diamètre contenant de la mélasse, à raison de 2 mg de
matière sèche de
levure par boîte. Le milieu mélasse contient 5 g/1 de mélasse, 0,5 g de
(NH4)2HPO4, 12,7
g/1 de K2SO4, 5,8 g/1 de Na2SO4, 30 g/1 d'agar, à pH5-5,5. Après 20h
d'incubation à 30 C,
les cellules de levure contenues sur les boîtes de Pétri sont récoltées et
lavées. Les cellules de
levure sont remises en suspension dans 20 ml d'eau déminéralisée.
(ii) Disruption multicopies du gène SUC
Souche de départ
La disruption de plusieurs copies du gène SUC est effectuée sur une souche de
.. Saccharomyces cerevisiae sélectionnée sur les critères suivants :
- une activité maltase inférieure à 80 unités, et
- une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans
sucre.
La souche qui est sélectionnée est appelée par la suite souche de départ .
La souche de départ est la souche déposée à la CNCM le 24 février 2005 sous le
numéro I-
3399.
La souche de départ sélectionnée a une force fermentative supérieure à 130 ml
dans une pâte
sans sucre et une activité maltase inférieure à 70 unités (cf tableau 2).
Le nombre de copies du gène SUC présent dans cette souche de départ est évalué
à au moins
12 copies par PCR quantitative.
Construction des cassettes de disruption
Etant donné le nombre élevé de copies du gène SUC présent dans la souche de
départ, 3 séries
de cassettes de disruption sont construites, chaque série ayant des séquences
de
recombinaison homologue identiques.
24
Par ailleurs, chaque série comporte 4 cassettes de disruption qui diffèrent
par la nature du
marqueur de sélection utilisé (kanamycine, blastycidine, phléomyeine et
hygromycine).
Les séquences de recombinaison homologue utilisées sont les suivantes :
- pour la lèrc série de disruption :
O la séquence située de la base 1 à 51 de la séquence SEQ ID NO: 3 et
O la séquence située de la base 1549 à 1599 de la séquence SEQ ID NO: 3,
- pour la 2. '" série de disruption :
O la séquence située de la base 54 à 104 de la séquence SEQ ID NO: 3 et
0 la séquence située de la base 1497 à 1547 de la séquence SEQ ID NO: 3,
- pour ta 3'' série de disruption :
O la séquence située de la base 110 à 159 dc la séquence SEQ ID NO: 3 et
O la séquence située de la base 1442 à 1491 de la séquence SEQ ID NO: 3.
Les amorces utilisées pour construire les cassettes de disruption de chaque
série comprennent
ainsi :
- une des séquences de recombinaison homologue ci-dessus, et
- une séquence d'une vineaine de bases permettant une hybridation de part et
d'autre
d'une région comprenant les séquences loxP encadrant le gène de résistance
(kanamycine, phléomychle, hygromycine ou blastycidine) des plasmides suivants
plUG6, pUG66, pUG-hygro, pUG-blast.
Le plasmide pUG6 comporte en effet le Renie de résistance à la kanamycine, le
plasmide
pUG66 le gène de résistance à la phléomycine, le plasmide pUG-hygro le gène de
résistance à
Ehygrornycine et le plasmide pUG-blast le gène de résistance à la
blastycidine.
La cassette de disruption est construite en effectuant une amplification PCR
avec le couple
d'amorce de chaque série sur chacun des plasmides p11G6, pUG66, pUG-hygro, pUG-
blast.
L'amplification PCR pour construire l'ensemble des cassettes de disruption a
été réalisée
grâce à l'enzyme DyNAzymee (Finnzyme), selon les recommandations du
fournisseur et en
utilisant les cycles de température suivants : 94 C pendant 5 min, 94 C
pendant 30 s, 55 C
pendant 30 s, 72 C pendant 1 min 30 (ces trois dernières étapes sont répétées
de manière à
effectuer 25 cycles) et enfin un cycle final d'élongation à 72 C pendant 10
min.
E.,es cassettes amplifiées sont purifiées individuellement sur colonne (Kit
nucico spin extract
lu TM
FI) et sont dosées après élution sur un appareil Nanodrop.
CA 2822536 2017-09-08
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
Disruption
Les levures sont transformées avec la cassette de disruption choisie par la
méthode de
l'acétate de lithium (Schiestl et Gietz, 1989).
5 La sélection des transformants est effectuée sur boîte de milieu YEG (20
g/L glucose, 5 g/L
d'extrait de levure, 30 g/1 agar) contenant une concentration appropriée
d'antibiotique en
fonction du gène de résistance utilisé comme marqueur de sélection.
Elimination des marqueurs de sélection
10 Des transformants sont transformés avec un plasmide comprenant le gène
de résistance à la
nourseothricine et le gène de la recombinase Cre, par la méthode de l'acétate
de lithium
(Schiestl et Gietz, 1989).
Des clones transformants devenus résistants à la nourséothricine sont
sélectionnés et cultivés
sur une nuit en présence d'un milieu YE contenant 20 g/1 de galactose, afin
d'induire
15 l'expression de la recombinase Cre présente sur le plasmide.
10 pl de cette culture sont ensemencés dans un milieu YEG frais. Après 24h de
culture en
condition non sélective en vue de favoriser la perte du plasmide, un étalement
sur boite
gélosée YEG est réalisé. Une centaine de clones est analysée pour vérifier la
perte effective de
la résistance aux 4 marqueurs antibiotiques des cassettes de disruption
(kanamycine,
20 phléomycine, hygromycine ou blastycidine) et de la résistance à la
nourseothricine apportée
par le plasmide comprenant la recombinase.
Les clones qui ont perdu toute résistance à ces antibiotiques sont analysés
afin de vérifier que
cette étape particulière n'a pas affecté la croissance et le rendement de
production de levures à
partir des clones sélectionnés.
Schéma de disruption
Trois séries de disruption sont effectuées.
Lors de chaque série de disruption, les 4 cassettes de disruption sont
utilisées de manière
séquentielle : transformation avec la première cassette et sélection des
transformants sur la
base du marqueur de sélection correspondant, transformation avec la deuxième
cassette et
sélection des transformants sur la base du marqueur de sélection
correspondant,
transformation avec la troisième cassette et sélection des transformants sur
la base du
marqueur de sélection correspondant, puis transformation avec la quatrième
cassette et
sélection des transformants sur la base du marqueur de sélection
correspondant.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
26
Les 4 marqueurs de sélection sont ensuite éliminés en une seule étape, par
action d'une
recombinase.
A l'issue de chaque série de disruption, les transformants obtenus sont
analysés par PCR pour
vérifier l'intégration de la cassette de disruption à un locus SUC.
(iii) Dosage de l'activité invertase
La souche de levure est cultivée sur plaque de mélasse comme indiqué ci-dessus
au (i).
L'activité invertase est mesurée comme décrit dans Sumner et Howell (J. Biol.
Chem., 1935,
108, 51-54).
Une quantité connue, de l'ordre de quelques dizièmes de milligrammes, de
matières sèches
levure et du saccharose à une concentration 0,1 molaire sont mis en présence
en milieu
tamponné (tampon acétate à 50 mM et pH 4,7), le tout placé dans un bain-marie
à 30 C.
Après 5 minutes d'incubation, la réaction d'inversion du saccharose est
bloquée par ajout du
réactif à l'acide dinitrosalicylique qui sert à doser, avec un
spectrophotomètre à une longueur
d'onde de 540 nm, les sucres réducteurs formés par réaction colorimétrique.
L'activité invertase est exprimée en unité invertase, une unité invertase
correspondant à 1
fflole de sucre réducteur libéré, correspondant en l'occurrence à une demi-
micromole de
saccharose inverti, en 5 minutes par mg de matière sèche de levure, à 30 C et
à pH 4,7, sans
plasmolyse de la levure.
(iv) Dosage de l'activité maltase
L'activité maltase est mesurée par dosage de la libération de p-nitrophénol
suite à l'action de
la maltase sur un substrat chromogénique, le 4-nitro-phényl-a-D-
glucopyrannoside, comme
décrit dans Houghton-Larsen et Anders Brandt, Appl. Environ. Microbiol., 2006,
p 7176-
7182.
La souche de levure est cultivée sur plaque de mélasse comme indiqué ci-dessus
au (i).
La suspension de levure est centrifugée et les cellules sont ensemencées à
raison de 1 mg de
matière sèche par ml dans un milieu YPG contenant 2 % de glucose. Après 4
heures
d'incubation, sous agitation, à 30 C, les cellules sont récoltées et une
suspension cellulaire à
20 mg de matière sèche de levure par ml est préparée. 1 ml de ladite
suspension cellulaire est
prélevé pour broyer les cellules. Après le broyage des cellules, le surnageant
est alors
récupéré pour le dosage de l'activité maltase.
Le surnageant obtenu est dilué entre 5 et 400 fois pour le dosage. 1,4 ml de
substrat à une
concentration de 4 mM dans un tampon phosphate à pH 6,8 est ajouté à 100 il
d'une dilution
27
de surnageant. Après 10 minutes d'incubation à 30 C, la réaction est stoppée
par ajout de 1 ml
d'une solution de Na2CO3 à 10%. La solution est centrifugée pendant 5 minutes
à 4000
tours/minute et l'absorbance du surnageant est mesurée à 400 nm.
La concentration en p-nitrophénol dans le surnageant est déduite des valeurs
d'absorbance
obtenues avec une gamme de p-nitrophénol entre 100 à 800 muerai.
Les résultats sont ensuite exprimes en unité maltase, une unité maltase
correspondant à 1
nmol de p-nitrophénol libéré par minute et par mg de protéines.
(v) Mesure des forces fermentatives
La force fermentative des souches de levure est mesurée dans une pâte sans
sucre et une pâte
sucrée.
Les souches de levure sont cultivées sur plaque de mélasse comme indique ci-
dessus au (i).
Les levures ainsi obtenues sont mises en suspension, à raison de 150 mg de
matières sèches
dc levure pour une mesure en pâte sans sucre ou de 300 mg de matière sèches de
levure pour
une mesure en pâte sucrée, dans 15 ml d'une solution aqueuse à 27gil de NaC1
et 4 g/I de
804(N114)2.
La pâte sans sucre contient 20 g de farine et la pâte sucrée contient 6,5 g de
saccharose et 25
g de farine.
Pour constituer les pâtons, le mélange de farine (avec ou sans saccharose) et
ladite suspension
de levures sont malaxés pendant 40 secondes dans un pétrin, de manière à
obtenir une pâte
qui est ensuite placée dans un récipient mis au bain-marie à 30 C. 13 minutes
apres le début
du malaxage, le récipient contenant la pâte est fermé hermétiquement.
Le volume de dégagement gazeux est mesuré au cours de la 1' heure et au cours
de la 2'
heure. au moyen d'un Risograph (National Manufacturing, Lincoln, Nebraska). On
indique
ensuite le volume total en ml sur 2 heures à 30 C.
Résultats
(i) Disruption multicopies du gène SUC
Les deux séquences de recombinaison homologue de la première série comprennent
le codon
d'initiation ATG et le codon stop de SUC2. Après un évènement de double
recombinaison
homologue avec insertion de la cassette de disruption au locus ciblé, 1497 pb
du gène SUC
ciblé sont délétées.
Les cassettes de disruption de la deuxième série permettent, selon le môme
principe, la
délétion de 1392 pb du gène SUC au niveau du locus ciblé.
CA 2822536 2017-09-08
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
28
Les deux séquences de recombinaison homologue dc la deuxième série étant
situées dans la
région du gène SUC délétée par utilisation des cassettes disruption de la
première série,
l'évènement de double recombinaison homologue ne peut se produire qu'au niveau
d'un locus
SUC n'ayant pas subi de disruption.
De la même façon, les cassettes de disruption de la troisième série permettent
la délétion de
1173 pb du gène SUC au niveau du locus ciblé. Les deux séquences de
recombinaison
homologue de la troisième série étant situées dans la région du gène SUC
délétée par
utilisation des cassettes disruption de la deuxième série, l'évènement de
double
recombinaison homologue ne peut se produire qu'au niveau d'un locus SUC
n'ayant pas subi
de disruption.
La première série permet de disrupter 94% de l'ORF d'un gène SUC, la seconde
série 87% et
la troisième série 73%.
Des souches présentant jusqu'à 12 copies du gène SUC inactivées par disruption
sont ainsi
obtenues. Les souches sont désignées par le caractère A , suivi d'un chiffre
indiquant le
nombre de copies du gène SUC inactivées par disruption.
Les souches testées par la suite sont les suivantes : A4, A8, A9, A10, Ail,
Al2.
(ii) Dosage de l'activité invertase des souches obtenues
L'activité invertase des différentes souches obtenues, ainsi que celle de la
souche de départ est
mesurée comme indiqué dans la partie Matériel et Méthodes.
L'activité invertase de 3 souches témoin présentant une activité large spectre
(T1, T2 et T3)
est également mesurée.
A partir de 8 copies du gène SUC inactivées par disruption, l'activité
invertase est diminuée
.. de plus d'un facteur 20 (cf tableau la).
Les souches qui ont au moins 8 copies du gène SUC inactivées par disruption
ont une activité
invertase inférieure à 20 unités.
Tableau la
Souche de levure Activité invertase (en unités)
Souche de départ 314
A4 + marqueur 72
A8 + marqueur 13
A9 + marqueur 14
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
29
Tableau lb
Souche de levure Activité invertase (en unités)
Souche de départ 343
A10 + marqueur 11
A10 10
Ail + marqueur 8
Ail 12
Al2 + marqueur 9
A 1 2 10
Tl 27
T2 10
T3 11
A partir de 10 copies du gène SUC inactivées par disruption, la disruption
d'une ou deux
copies supplémentaires ne permet pas de diminuer davantage l'activité
invertase (cf tableau
lb).
L'activité invertase mesurée sur les souches avant l'élimination des marqueurs
antibiotiques permet de montrer que l'étape d'élimination des marqueurs n'a
pas d'effet sur
l'activité invertase des souches (cf tableau lb).
Les souches témoin T2 et T3 présentent une activité invertase semblable aux
différentes
souches obtenues. La souche témoin Tl présente quant à elle un niveau
d'activité invertase un
peu plus élevé (cf tableau lb).
(iii) Dosage de l'activité maltase
L'activité maltase de la souche de départ est bien inférieure à 80 unités.
Tableau 2
Souche de levure Activité maltase (en unités)
Souche de départ 63
A10 131
Ail 135
Al2 225
SPS 36
Tl 575
T2 551
T3 542
De manière surprenant, l'activité maltase de souches A10, Ah1 et Al2 selon
l'invention est
augmentée (entre 120 et 230 unités).
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
L'activité maltase d'une souche adaptée à une pâte sucrée (SPS) est de 40
unités et celle des
souches large spectre témoin supérieure à 500 unités.
(iv) Mesure des forces fermentatives
5 Le caractère large spectre des souches obtenues est évalué en mesurant
les forces
fermentatives dans une pâte sans sucre et dans une pâte sucrée.
Les forces fermentatives des souches témoin large spectre Ti à T3, de la
souche de départ et
d'une souche adaptée à une pâte sucrée (SPS) sont également évaluées.
La souche adaptée à une pâte sucrée est, par définition, performante sur pâte
sucrée, mais
10 n'est pas adaptée à des pâtes sans sucre.
Le tableau 3 indique les forces fermentatives dans une pâte sans sucre et le
tableau 4 dans une
pâte sucrée.
Tableau 3
Souche testée lère heure 2ème heure Total 2 heures
Souche de départ 52 85 137
SPS 37 58 95
A 1 0 + marqueur 52 92 144
A 1 0 52 92 144
Ail + marqueur 51 92 143
Ail 57 90 147
Al2 + marqueur 47 91 138
Al2 52 94 146
Ti 67 87 154
T2 59 85 144
T3 68 88 156
15 Les souches présentant plusieurs copies du gène SUC inactivées par
disruption et la souche de
départ présentent des forces fermentatives similaires dans une pâte sans sucre
au cours de la
première heure, qui sont bien supérieures à celle de la souche adaptée à une
pâte sucrée, mais
inférieures aux souches large spectre témoin (cf tableau 3).
La force fermentative des souches présentant plusieurs copies du gène SUC
inactivées par
20 disruption, au cours de la deuxième heure, dans une pâte sans sucre est
supérieure à celle de la
souche de départ et à celle des souches large spectre témoin (cf tableau 3).
Elles sont
également nettement supérieures à la force fermentative de la souche adaptée à
une pâte
sucrée.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
31
La force fermentative des souches présentant plusieurs copies du gène SUC
inactivées par
disruption, sur la totalité des 2 heures, dans une pâte sans sucre, est
légèrement supérieure à la
souche de départ et nettement supérieure à la souche adaptée à une pâte
sucrée, et se situe au
niveau des valeurs obtenues pour les souches large spectre témoin (cf tableau
3).
Les souches présentant plusieurs copies du gène SUC inactivées par disruption
présentent
donc un profil de force fermentative dans une pâte sans sucre bien
particulier, qui présente des
différences à la fois vis-à-vis de la souche de départ, de la souche adaptée à
une pâte sucrée et
des souches large spectre témoin.
Tableau 4
Souche testée lère heure 2ème heure Total 2 heures
Souche de départ 15 37 53
SPS 45 79 124
A 1 0 43 84 127
Ail + marqueur 41 83 124
A 1 1 45 84 129
Al2 + marqueur 36 74 109
Al2 35 73 108
Ti 48 80 127
T2 37 65 103
T3 46 67 113
Le tableau 4 indique les forces fermentatives obtenues en pâte sucrée.
La force fermentative des souches présentant plusieurs copies du gène SUC
inactivées par
disruption, des souches large spectre témoin et de la souche adaptée à une
pâte sucrée (SPS)
est largement supérieure à celle de la souche de départ.
Les souches A10, Ail, la souche adaptée à une pâte sucrée (SPS) et la souche
large spectre
témoin Ti donnent des forces fermentatives similaires dans une pâte sucrée, au
cours de la
première heure, de la deuxième heure et sur la totalité des 2 heures.
La souche Al2 et les témoins large spectre T2 et T3 ont des forces
fermentatives légèrement
inférieures.
Les résultats obtenus montrent que les souches de levure A10, All et Al2 sont
des souches de
levure selon l'invention qui ont des propriétés large spectre très
intéressantes.
Les souches de levure A10, Ail et Al2 correspondent respectivement aux souches
déposées à
la CNCM sous les numéros 1-4339, 1-4340 et 1-4338.
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
32
EXEMPLE 2: EVALUATION DES LEVURES OBTENUES A PARTIR DES SOUCHES
SELON L'INVENTION EN PANIFICATION
Matériel et Méthodes
(i) Production de levures
Les levures sont produites à partir des souches de levure selon l'invention
dans des
fermenteurs de 20 litres, en mode semi-continu, comme décrit dans le livre de
référence
Yeast Technology , 2ème édition, 1991, G. Reed et T.W. Nagodawithana, publié
par Van
Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
Les levures sont produites sous la forme de levure liquide et de levure
pressée.
(ii) Essais de panification
Les levures ainsi obtenues sont évaluées dans une application selon un schéma
direct, dans
une pâte contenant une concentration élevée en saccharose (25% de saccharose
en
pourcentage du boulanger).
La recette utilisée est indiquée dans le tableau 5 ci-dessous.
L'améliorant apporte le mélange d'oxydants et de réducteurs, les enzymes ainsi
que les
émulsifiants classiques permettant une optimisation du processus de
fabrication de ce schéma
de panification direct, une bonne qualité et une bonne conservation des pains
obtenus.
Tableau 5
Ingrédients Quantités (% du boulanger)
Farine 100
Eau 46
Levure 6
Matières grasses 7,5
Améliorant 1
Saccharose 25
Sel 1,7
Le protocole appliqué est le suivant :
1. Peser les ingrédients solides,
2. Mesurer la température ambiante et la température de la farine,
3. Régler la température de l'eau de manière à obtenir une température de pâte
de 27 C +/-
0,5 C,
4. Placer les ingrédients dans une cuve Mac Duffy d'un pétrin HobartA200 ,
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386 PCT/FR2011/052916
33
5. Mélanger les ingrédients secs en 1 vitesse pendant 1 min, puis ajouter la
matière grasse,
l'eau et la levure,
6. Démarrer le pétrissage selon le programme suivant :
* en 1 vitesse pendant 5 min,
* laisser reposer pcndant 4 min,
* en 2111e vitesse pcndant 5 min,
7. Obtenir une pâte ayant une température de 27 C +/- 0.5 C,
8. Prélever 50 g de pâte, bouler sommairement et placer dans un pot de
Risograph ; placer
ledit pot dans un bain-marie à 30 C, brancher le pot à l'appareil de mesure et
lancer la
mesure pendant 2 heures,
9. Effectuer le pointage de la masse dans une ambiance à 22 C pendant 10 min,
10. Diviser en pâtons de 320 g,
11. Bouler et couvrir,
12. Laisser reposer pendant 10 min,
13. Façonner la pâte,
14. Mettre en moules les pâtons de 320 g (dimensions des moules : base de
185x75 mm; haut
du moule de 200x90 mm; hauteur du moule de 75mm),
15. Déterminer le temps d'apprêt dans un incubateur Stéricult0 à 35 C et 90%
d'humidité
relative, le temps d'apprêt étant le temps entre la mise dans l'incubateur et
le moment où
la pâte atteint une hauteur de 85mm dans le moule,
16. Cuire dans un four à balancelle REEDO à 180 C pendant 21 min,
17. Mesurer le volume des pains après un refroidissement d'au moins une heure.
Les paramètres évalués sont :
- le temps d'apprêt, exprimé en pourcentage par rapport à une levure de
référence,
- le volume spécifique du pain (volume du pain rapporté à la masse, VS),
exprimé
en pourcentage par rapport à une levure de référence, et
- le dégagement gazeux (DG) mesuré au Risograph à 2h à 30 C, à partir d'un
pâton
de 50g, exprimé en pourcentage par rapport à une levure de référence.
Résultats
Les levures produites à partir de la souche de levure Al 1 sont évaluées dans
une application
contenant beaucoup de saccharose (schéma direct avec 25% saccharose).
CA 02822536 2013-06-20
WO 2012/085386
PCT/FR2011/052916
34
Le tableau 6 présente les résultats obtenus avec des levures issues de la
souche Al 1 selon
l'invention, en comparaison avec la souche de départ et deux souches adaptées
à une pâte
sucrée (SPS1 et SPS2).
La souche SPS1 est une souche standard parmi les souches adaptées à une pâte
sucrée, et la
.. souche SPS2 est la meilleure souche adaptée à une pâte sucrée du Demandeur.
Tableau 6
Souche utilisée Levure Temps d'apprêt VS (%) DG (IV
)
(9/0)
Souche de Levure liquide +20 -13 -26
départ Levure pressée +29 -20 -36
Souche Ail Levure liquide -13 +9 +27
Levure pressée -11 +9 +24
SPS1 Levure pressée -1 +1 -1
5P52 Levure pressée -24 +26 +47
Les pourcentages sont calculés par rapport aux valeurs obtenues avec une
levure de référence.
Comme attendu, les levures issues de la souche de départ ne sont pas du tout
adaptées à une
panification en pâte sucrée.
Les levures issues de la souche Ail selon l'invention donnent des valeurs de
temps d'apprêt,
volume spécifique du pain et dégagement gazeux qui se situent entre les
valeurs obtenues
avec les levures issues de la souche SPS1 et celles obtenues avec les levures
issues de la
souche SPS2.
Les levures issues de la souche All sont donc appropriées pour une utilisation
dans des pâtes
sucrées.
