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Génomes lentiviraux chimériques non intégratifs comme vaccins innovants contre
le HIV-1
La présente invention a pour objet des acides nucléiques comprenant des
génomes rétroviraux chimériques non intégratifs comprenant les séquences
terminales
répétées (STR, ou LTR pour Long Terminal Repeat en anglais) 5' et 3' du
lentivirus
caprin : virus de l'Arthrite-Encéphalite Caprine (VAEC, ou CAEV pour Caprine
Arthritis
Encephalitis Virus en anglais) ou d'un autre rétrovirus ne s'intégrant pas
dans les cellules
humaines et au moins un gène viral d'un autre rétrovirus. L'invention concerne
également
un vecteur comprenant un tel acide nucléique, une composition immunogène ou
vaccinale
comprenant ledit vecteur ou ledit acide nucléique, ainsi que leur utilisation
pour le
traitement et/ou la prévention d'une infection par un rétrovirus ou une
maladie induite par
un agent pathogène.
A l'heure actuelle, le développement de vaccins efficaces contre les
infections
rétrovirales est un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.
Récemment, il a
été développé des vaccins basés sur l'utilisation de vecteurs ayant la
capacité d'exprimer
des protéines immunogènes chez l'hôte vacciné. Ces vecteurs vaccinaux, après
amplification dans des bactéries, sont purifiés et directement injectés chez
l'hôte
nécessitant une vaccination. Le vecteur est ainsi pris en charge par les
cellules de l'hôte,
les protéines immunogènes sont exprimées et présentées aux molécules du
complexe
majeur d'histocompatibilité de classe I et II, permettant ainsi de générer des
réponses
immunes contre ces protéines immunogènes. Les premiers tests de vaccination à
l'aide
de vecteur vaccinaux rétroviraux ont permis de montrer qu'une immunisation
contre le
virus du sarcome de Rous (Chebloune et al., 1991, J Virol, 65, 5374-5380), le
virus de la
maladie de New Castle (Cosset, Bouquet et al., 1991, Virology 185, 862-866)
puis de
l'influenza (Robinson, Hunt et Webster, 1993, Vaccine, 11(9) : 957-960) était
possible
chez le poulet.
Cette approche vaccinale est particulièrement intéressante pour lutter contre
le
virus de l'immunodéficience humaine (VII-1). Le syndrome de l'immunodéficience
acquise
(SIDA) continue aujourd'hui d'être un problème de santé publique mondial avec
plus de
33 millions d'individus infectés, et avec plus de 2 millions de décès et près
de 3 millions
de nouvelles infections par an. L'Afrique est le continent le plus affecté,
mais l'infection
grandit rapidement en Asie et dans certains pays d'Europe de l'Est, ce
phénomène étant
certainement dû au manque de moyens pour la détection précoce et au manque de
traitement de l'infection. De plus, du fait de limitations d'ordre économique,
de nombreux
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patients infectés par le VIH dans les pays en développement ne bénéficient
d'aucun
traitement, et contribuent donc à la dissémination massive de l'infection.
L'impact
économique du SIDA sera donc certainement très important au cours des
prochaines
années. En Europe, le SIDA reste une des pathologies transmissibles la plus
importante,
avec environ 1 million de personnes vivant avec le SIDA et plus de 20000
nouvelles
infections par an en Europe de l'Ouest et en Europe Centrale ; et avec environ
1.5
millions de personnes vivant avec le SIDA et plus de 200000 nouvelles
infections par an
en Europe de l'Est. Le développement d'un vaccin prophylactique stoppant cette
infection
reste donc une priorité.
Malgré de nombreux efforts, il n'existe, à ce jour, aucun vaccin sécuritaire
et
satisfaisant permettant la protection de l'homme contre l'infection par le VIH
ou contre la
pathogénèse induite par ce virus. Néanmoins, les nombreuses recherches
effectuées ont
permis d'accumuler de précieuses connaissances pour comprendre les échecs des
stratégies vaccinales utilisées jusqu'à présent, et de définir les propriétés
requises d'un
vaccin induisant des réponses immunes protectrices contre les lentivirus
responsables du
SIDA.
Le vaccin doit notamment induire une réponse lymphocytaire T CD8+, qui est
associée au contrôle du virus lors de la primo-infection, et dont la présence
a été montrée
comme étant indispensable pour le contrôle de la charge virale chez les
primates non-
humains infectés (Jin et al., 1999, J Exp Med, 189 :991-998). De plus, des
lymphocytes T
cytotoxiques (LTC) sont présents chez des patients non-progresseurs à long
terme
(LTNP) (Rinaldo et aL, 1995, J Virol, 69 : 5838-5842), ou encore chez des
sujets exposés
mais non infectés par le VIH (Makedonas et aL, 2002, AIDS, 16 : 1595-1602).
Ces
éléments et d'autres, montrent l'importance de telles réponses dans le
contrôle de la
réplication virale et/ou la prévention de la maladie.
De plus, la vaccination doit induire une réponse de cellules T CD4+, qui sont
indispensables pour la stimulation et le maintien de la réponse à base de
lymphocytes T
CD8+ anti-VIH (Kalams et al., 1999, J Viral, 73: 6715-6720). Les cellules T
CD4+ sont
aussi indispensables pour la mise en place et le maintien de la réponse à base
d'anticorps produits par les lymphocytes B (LB). Il a ainsi été montré que des
macaques
infectés par le VIS et déplétés en LB contrôlaient moins bien leur charge
virale que des
singes témoins (Johnson et aL, 2003, J Virol, 77 : 375-381). Au vu de ces
résultats et des
précédents, il semble donc nécessaire qu'un vaccin contre le VIH doive
stimuler les
réponses B et T du système immunitaire.
Parmi les nombreuses stratégies vaccinales testées se trouve celles faisant
intervenir des lentivirus dits atténués. Il a ainsi été montré que ceux-ci
permettent
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d'induire de manière reproductible la meilleure protection contre les virus
d'épreuve
homologues et hétérologues (Yankee et aL, 2009, Virology, 383 : 103-111;
Genesca,
McChesney et Miller, 2009, J Intem Med, 265: 67-77; Reynolds et aL, 2008, J
Exp Med,
205: 2537-2550; Amara et aL, 2005, J Virol, 79 : 15356-15367; Whitney et
Ruprecht,
2004, Curr Opin Infect Dis, 17: 17-26). Cependant, du fait de leur intégration
irréversible
dans le génome de l'hôte et de la probabilité d'infection récurrente liée à
des latences
provirales, ces virus sont pathogéniques chez certains adultes et chez les
nouveaux-nés
(Desrosiers, 1994, AIDS Res Hum Retroviruses, 10 :331-332; Hofmann-Lehmann et
al.,
2003, A1DS, 17: 157-166; Baba et aL, 1999, Nat Med, 5: 194-203; Baba et aL,
1995,
Science, 267: 1820-1 825 ; Yankee et al., 2009, Virol, 383: 1 03-1 1 1 ). Pour
des raisons
d'éthique et de sécurité, ces lentivirus atténués ne peuvent donc en aucun cas
être
utilisés en l'état chez l'homme.
La vaccination ADN basée sur des vecteurs viraux n'a quant à elle jamais été
associée à un développement de pathologies, ni chez l'homme, ni chez les
animaux, et
de ce fait est plus sécuritaire. Cependant, testés chez le singe, ces vecteurs
se sont
avérés être incapables de protéger les animaux contre une infection
expérimentale (Liu et
al., 2006, Virology, 351 :444-454 ; Singh et aL, 2005, J Virol, 79 : 3419-
3428).
Il existe donc le besoin de nouveaux vecteurs vaccinants permettant d'exprimer
les antigènes lentiviraux à des niveaux plus élevés tant en quantité qu'en
qualité, dans
l'objectif d'induire des réponses protectrices contre les virus pathogéniques.
Les inventeurs ont préalablement décrit des génomes viraux infectieux
comprenant un génome viral complet incluant les LTR du CAEV ainsi qu'un ou
deux
gènes d'un autre génome rétroviral (Bouzar et al., 2007, Virology, 364(2) :269-
280;
Bouzar et aL, 2004, Virology, 326(1) :47-56; Bouzar et aL, 2003, Virology,
309(1) :41-52;
Yuhai et al., 2009, Retrovirology, 6(2) :22). Ces génomes ont été utilisés
pour étudier les
mécanismes de la pathogénèse induite par les rétrovirus hautement
pathogéniques de
l'homme et des singes.
Les inventeurs ont découvert que l'utilisation des séquences terminales
répétées
(STR, ou LTR pour en anglais Long Terminal Repeat) du virus de l'Arthrite-
Encéphalite
Caprine (VAEC, ou CAEV en anglais pour Caprine Arthritis Encephalitis Virus)
permettait
d'améliorer l'expression de génomes rétroviraux vaccinants et l'induction de
réponses
protectrices contre les rétrovirus pathogéniques, tout en évitant leur
intégration dans les
cellules hôtes. Les inventeurs ont en particulier démontré que les Séquences
Terminales
Répétées (LTR) du virus de l'arthrite-encéphalite caprine (CAEV) permettaient
l'expression constitutive des gènes leur étant associés et n'étaient pas
dépendantes du
gène tat viral du CAEV, plus particulièrement de la protéine du gène tat viral
du CAEV,
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pour exprimer les gènes d'un génome viral auquel elles sont fusionnées,
permettant ainsi
une expression forte d'antigènes viraux. Les inventeurs ont ainsi développé
des génomes
chimériques, entre les lentivirus des primates de type SIV et VIH (ou H IV en
anglais pour
Human Immunodeficiency Virus) et le CAEV, qui ont les propriétés d'être non
intégratifs et
non réplicatifs, tout en étant capables d'effectuer un cycle de réplication
pour exprimer
tous les antigènes du HIV et du SIV présents dans les génomes. Les inventeurs
ont
démontré que la transfection de ces génomes dans des cellules de primates
(HEK293)
permet l'expression de toutes les protéines des gènes présents et que ces
protéines sont
assemblées en particules virales capables d'effectuer un cycle unique
d'infection (i.e. un
pseudo-cycle) dans des cellules cibles, sans intégration du génome viral dans
ces cellules
cibles. L'immunisation de souris NOD/SCID humanisées avec des cellules
mononuclées
humaines a démontré la présence de fortes réponses immunes humorales et
cellulaires
spécifiques contre les antigènes viraux.
Définitions
Par µ, acide nucléique , on entend la forme polymérique ester phosphate des
ribonucléosides (adénosine, guanosine, uridine ou cytidine ; "molécules
d'ARN") ou des
désoxyribonucléosides (désoxyadénosine, désoxyguanosine, désoxythymidine ou
désoxycytidine ; "molécules d'ADN") sous forme monocaténaire ou sous forme
d'une
hélice bicaténaire. Des hélices bicaténaires ADN-ADN, ADN-ARN et ARN-ARN sont
possibles. Le terme acide nucléique, et en particulier molécule d'ADN ou
d'ARN, ne se
réfère qu'à la structure primaire ou secondaire de la molécule, et ne se
limite aucunement
à des formes tertiaires particulières. Ainsi, ce terme comprend l'ADN
bicaténaire que l'on
trouve, entre autres, dans les molécules d'ADN linéaire ou circulaire (par
exemple,
fragments de restriction), les virus, les plasmides et les chromosomes.
Lorsque l'on
évoque la structure de molécules d'ADN bicaténaire particulières, les
séquences peuvent
être décrites ici conformément à la convention normale qui ne donne la
séquence que
dans la direction 5' vers 31e long du brin non transcrit de l'ADN (c'est-à-
dire le brin ayant
une séquence homologue à l'ARNm).
Dans le contexte de l'invention, , un acide nucléique comprenant un génome
rétroviral chimérique non intégratif désigne un acide nucléique qui comprend
les
séquences d'acide nucléique agissant en cis d'au moins deux rétrovirus, ledit
acide
nucléique n'étant pas capable de s'intégrer dans le génôme d'une cellule hôte.
L'acide
nucléique inclut les Séquences Terminales Répétées (LTR) en 5' et en 3' d'un
premier
rétrovirus, et au moins un gène viral d'un deuxième rétrovirus.
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Par "rétrovirus", on entend un virus dont le génome consiste en une molécule
d'ARN et qui comprend une transcriptase inverse, i.e. un membre de la famille
des
Retroviridae. Les rétrovirus sont divisés en trois genres : oncovirus,
lentivirus et
spumavirus. Les oncovirus sont notamment composés des espèces suivantes : le
virus de
5 la leucémie murine (MLV), le virus de la leucose aviaire (ALV), le virus
du Sarcome de
Rous (VSR, ou RSV en anglais pour Rous Sarcoma Virus), ou le virus Mason-
Pfizer
simien. Les lentivirus sont composés des espèces suivantes : le virus de
l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1, ou HIV-1 en anglais pour Human
Immunodeficiency Virus type 1), le virus de l'immunodéficience humaine de type
2 (VIH-2,
ou HIV-2 en anglais pour Human Immunodeficiency Virus type 2), le virus de
l'immunodéficience simienne (VIS, ou SIV en anglais pour Simian
Immunodeficiency
Virus), le virus de l'immunodéficience féline (VIF, ou FIV en anglais pour
Feline
Immunodeficiency Virus), le virus de l'immunodéficience bovine (VIB, ou BIV en
anglais
pour Bovine Immunodeficiency Virus), le virus Maedi Visna (VMV) du mouton, le
virus de
l'Arthrite-Encéphalite Caprine (CAEV) ou le virus de l'anémie infectieuse
équine (VAIE, ou
EIAV en anglais pour Equine Infectious Anemia Virus). Le spumavirus peut être
le HFV.
Lorsque le rétrovirus est le HIV-1, il peut être de n'importe quel sérogroupe,
par exemple
de sérogroupe M (sérotype A-D, F-H, J, K), 0, N ou P. Lorsque le rétrovirus
est le HIV-2,
il peut être de n'importe quel sérogroupe, par exemple de sérogroupe A ou B.
Par c< gène viral , on entend un gène présent dans un génome rétroviral. Dans
le
contexte de l'invention, le gène viral peut être le gène gag, pol, vif, vpx,
vpr, nef, tat, rev,
vpu ou env.
Le gène gag signifiant < group specific antigen code pour la
polyprotéine
précurseur Gag qui est clivée pour donner les protéines structurelles
fondamentales des
rétrovirus, que sont les protéines de capside, les protéines de la
nucléocapside, et les
protéines de la matrice. Par exemple, la protéine Gag du HIV est le précurseur
de la
protéine de capside p24, des protéines de la nucléocapside p6 et p7, et de la
protéine de
matrice p17. A titre d'exemple non limitatif, le gène gag est le gène gag du
HIV-1 (NCBI
gene ID N 155030, mise à jour du 20 août 2011), du HIV-2 (NCBI gene ID N
14900001,
mise à jour du 27 août 2011), du SIV (NCBI gene ID N 956108, mise à jour du 27
août
2011) ou du FIV (NCBI gene ID N 1489988, mise à jour du 20 août 2011).
Le gène pol code pour une transcriptase inverse, une intégrase et une
protéase. A titre d'exemple non limitatif, le gène pol est le gène pol du HIV-
1 (NCBI gene
ID N 155348, mise à jour du 27 août 2011), du HIV-2 (NCBI gene ID N 1490001,
mise à
jour du 27 août 2011), du FIV (NCBIgene ID N 1489989, mise à jour du 27 août
2011) ou
du SIV (NCBI gene ID N 956107, mise à jour du 20 août 2011).
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Le gène vif ou viral infectivity factor code pour une protéine requise
pour la
production de virions infectieux. A titre d'exemple non limitatif, le gène vif
est le gène vif
du HIV-1 (NCBI gene ID N 155459, mise à jour du 7 août 2011), du HIV-2 (NCBI
gene ID
N 1724712, mise à jour du 21 janvier 2010), du FIV (NCBI gene ID N 1724709,
mise à
jour du 7 février 2010) ou du SIV (NCBI gene ID N 1490005, mise à jour du 21
janvier
2010).
Le gène vpr code pour la protéine virale R qui joue un rôle important dans
l'arrêt du cycle cellulaire en phase G2 et dans la régulation du transport du
complexe de
pre-intégration du cytoplasme vers le noyau, la réplication virale. A titre
d'exemple non
limitatif, le gène vpr est le gène vpr du HIV-1 (NCBI gene ID N 155807, mise à
jour du 7
août 2011), du HIV-2 (NCBI gene ID N 1724718, mise à jour du 21 janvier 2010)
ou du
SIV (NCBI gene ID N 956112, mise à jour du 15 janvier 2011).
Le gène <, vpx code pour la protéine virale X et est apparenté au gène vpr.
A titre
d'exemple non limitatif, le gène vpx est le gène vpx du HIV-2 (NCBI gene ID N
1724714,
mise à jour du 19 mars 2011) ou du SIV (NCBI gene ID N 1490006, mise à jour du
16
juillet 2011).
Le gène µ< nef code pour la protéine myristylée de 27 à 25 kDa, appelée
Facteur
de Régulation Négative, qui joue un rôle clé dans la déplétion des lymphocytes
CD4 in
vivo. A titre d'exemple non limitatif, le gène nef est le gène nef du HIV-1
(NCBI gene ID
N 156110, mise à jour du 7 août 2011), du HIV-2 (NCBI gene ID N 1724715, mise
à jour
du 19 mars 2011) ou du SIV (NCBI gene ID N 1490008, mise à jour du 2 juillet
2011).
Le gène tat code pour une protéine de 86 à 101 acides aminés, appelée
Trans-Activator of Transcription , qui augmente le taux de transcription du
génome
rétroviral. A titre d'exemple non limitatif, le gène tat est le gène tat du
HIV-1 (NCBI gene
ID N 155871, mise à jour du 20 août 2011), du HIV-2 (NCBI gene ID N 1724713,
mise à
jour du 7 février 2010) ou du SIV (NCBI gene ID N 956113, mise à jour du 7
février 2010).
Le gène rev code pour une protéine appelée Regulator of Virion
Expression qui permet l'exportation de l'ARN viral du noyau vers le
cytoplasme. A titre
d'exemple non limitatif, le gène rev est le gène rev du HIV-1 (NCBI gene ID N
155908,
mise à jour du 7 août 2011), du HIV-2 (NCBI gene ID N 1724716, mise à jour du
21 mai
2011) ou du SIV (NCBI gene ID N 1490003, mise à jour du 15 janvier 2011).
Le gène c< vpu code pour une protéine appelée Viral Protein U qui est
impliquée dans le bourgeonnement viral et l'amélioration de la libération des
virions. A
titre d'exemple non limitatif, le gène vpu est le gène vpu du HIV-1 (NCBI gene
ID
N 155945, mise à jour du 7 août 2011) ou du SIV (NCBI gene ID N 2828723, mise
à jour
du 21 janvier 2010).
7
Le gène env code pour la protéine précurseur gp160 qui est maturée et
clivée
pour donner les protéines de l'enveloppe gp120 et gp41. A titre d'exemple non
limitatif, le
gène env est le gène env du HIV-1 (NCBI gene ID N 155971, mise à jour du 7
août 2011),
du HIV-2 (NCBI gene ID N 1724717, mise à jour du 18 juin 2011), du FIV (NCBI
gene ID
N 1489987, mise à jour du 18 juin 2011) ou du SIV (NCBI gene ID N 1490007,
mise à
jour du 18 juin 2011).
Au sens de la présente demande, le terme comprend ou comprenant
désigne selon un mode particulier consiste en ou consistant en .
Acide nucléique
Les inventeurs ont démontré que les Séquences Terminales Répétées (LTR) du
virus de l'arthrite-encéphalite caprine (CAEV) permettaient l'expression
constitutive des
gènes leur étant associés et n'étaient pas dépendantes du gène tat viral pour
exprimer les
gènes d'un génome viral auquel elles sont fusionnées, permettant ainsi une
expression
forte d'antigènes viraux. De plus, les inventeurs ont montré que la seule
présence de ces
LTR empêchait l'intégration d'un génome rétroviral hétérologue auquel elles
sont
fusionnées.
L'invention concerne donc un acide nucléique comprenant un génome rétroviral
chimérique non-intégratif, dans lequel ledit génome rétroviral chimérique
comprend :
- les Séquences Terminales Répétées (LTR) en 5' et en 3' d'un premier
rétrovirus,
ledit premier rétrovirus étant un lentivirus, tel que le virus de l'Arthrite-
Encéphalite Caprine
(CAEV), le virus Maedi Visna (VMV) du mouton, le virus de l'anémie infectieuse
équine
(EIAV), ou un oncovi rus ou un spumavirus, et
- au moins un gène viral d'un deuxième rétrovirus, ledit deuxième rétrovirus
n'étant
pas le premier rétrovirus.
L'invention concerne donc un acide nucléique comprenant un génome rétroviral
chimérique, dans lequel ledit génome rétroviral chimérique comprend :
- les séquences terminales répétées (LTR) en 5' et en 3' d'un premier
rétrovirus, ledit premier rétrovirus étant le virus de l'Arthrite-Encéphalite
Caprine (CAEV),
et
- au moins un gène viral d'un deuxième rétrovirus, ledit deuxième rétrovirus
n'étant pas le premier rétrovirus, et dans lequel l'une des conditions
suivantes est en
outre vérifiée :
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7a
a) le génome rétroviral chimérique comprend les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr,
nef,
tat, rev, vpu et env dudit deuxième rétrovirus, ledit deuxième rétrovirus
étant le HIV-1,
dans lequel ledit gène pol est un gène pol délété des séquences codant
l'intégrase (in),
b) le génome rétroviral chimérique comprend les gènes tat, rev, vpu et env
dudit
deuxième rétrovirus, ledit deuxième rétrovirus étant le HIV-1, et comprend en
outre les
gènes gag, pol, vif, vpx, vpr et nef d'un troisième rétrovirus, ledit
troisième rétrovirus étant
le SIV, dans lequel ledit gène pol est un gène pol délété des séquences codant
l'intégrase
(in) ou
c) le génome rétroviral chimérique comprend les gènes gag, pol, vif et env
dudit
deuxième rétrovirus, ledit deuxième rétrovirus étant le FIV, dans lequel ledit
gène pol est
un gène pol délété des séquences codant l'intégrase (in).
Les séquences LTR utilisées proviennent de préférence d'un rétrovirus qui ne
s'intègre pas dans le génome d'un hôte> ou patient , ledit hôte ou
patient étant un
hôte ou patient dans le génome duquel les deuxième et/ou troisième rétrovirus
peuvent
s'intégrer. Par exemple, lorsque le premier rétrovirus est le CAEV, ledit hôte
ou patient
n'est pas un caprin mais peut être un homme, un singe, un chat, ou un cheval,
ou lorsque
le premier rétrovirus est le EIAV, ledit hôte ou patient n'est pas un cheval
mais peut être
un homme, un singe, un chat, ou un ovin, ou lorsque le premier rétrovirus est
le VMV,
ledit hôte ou patient n'est pas un ovin mais peut être un homme, un singe, un
chat, ou un
cheval.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le premier rétrovirus
est
le virus de l'Arthrite-encéphalite Caprine ou CAEV. Le CAEV est un rétrovirus
de type
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lentivirus de la chèvre qui s'apparente au virus de l'immunodéficience humaine
(HIV),
mais qui ne provoque pas de pathologie de type SIDA chez son hôte.
Par Séquences Terminale Répétées (LTR en anglais), on désigne une
séquence permettant le contrôle de la transcription, c'est-à-dire comprenant
un enhancer,
un promoteur, un ou plusieurs signal(ux) d'initiation de la transcription, un
ou plusieurs
signal(ux) de terminaison de la transcription, un ou plusieurs signal(ux) de
poly-
adénylation. Dans le contexte de l'invention, les LTR du CAEV comprennent un
enhancer,
un promoteur et un signal d'initiation de la transcription ainsi qu'un signal
de terminaison
de la transcription et un signal de poly-adénylation. De manière préférée, les
LTR en 5' et
en 3' du CAEV sont identiques et comprennent ou consistent en la séquence SEQ
ID
NO : 3.
Dans d'autres modes de réalisation, les LTR du Virus Maedi Visna (VMV) ou
celles du lentivirus des équidés EIAV sont utilisées. La LTR en 5' du VMV
comprend ou
consiste en la séquence se trouvant en position 1 à 161 de la Séquence de
Référence
NCBI NC 001452.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La LTR en 3' du VMV
comprend
ou consiste en la séquence se trouvant en position 9106 à 9202 de la Séquence
de
Référence NCBI NC 001452.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La LTR en 5' de
l'EIAV
comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 61 à 381 de la
Séquence
de Référence NCBI NC 001450 (mise à jour du 11 mars 2010). La LTR en 3' de
l'EIAV
comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 7269 à 8289 de la
Séquence de Référence NCBI NC 001450 (mise à jour du 11 mars 2010).
Dans encore d'autres modes de réalisation, les LTR d'un oncovirus, tel que le
virus de la leucémie murine (MLV), le virus de la leucémie aviaire (ALV), le
virus du
Sarcome de Rous (RSV), ou le virus Mason-Pfizer simien, ou les LTR d'un
spumavirus,
tel que le HFV sont utilisés. La LTR en 5' du MLV comprennent ou consistent en
la
séquence se trouvant en position 1 à 210 de la Séquence de Référence NCBI
NC 001702.1 (mise à jour du 5 février 2011). La LTR en 3' du MLV comprend ou
consiste
en la séquence se trouvant en position 5735 à 8135 de la Séquence de Référence
NCBI
NC 001702.1 (mise à jour du 5 février 2011). La LTR en 5' de l'ALV comprend ou
consiste en la séquence se trouvant en position 1 à 594 de la Séquence de
Référence
NCBI NC 015116.1 (mise à jour du 18 avril 2011). La LTR en 3' de l'ALV
comprend ou
consiste en la séquence se trouvant en position 5338 à 7489 de la Séquence de
Référence NCBI NC 015116.1 (mise à jour du 18 avril 2011). La LTR en 5' du RSV
comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 22 à 102 de la
Séquence
de Référence NCBI NC 001407.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La LTR en 3'
du
RSV comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 9058 à 9292 de
la
CA 02848484 2014-03-12
WO 2013/037841 PCT/EP2012/067863
9
Séquence de Référence NCBI NC 001407.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La
LTR
en 5' du virus Mason-Pfizer simien comprend ou consiste en la séquence se
trouvant en
position 26 à 123 de la Séquence de Référence NCBI NC 001550.1 (mise à jour du
8
décembre 2008). La LTR en 3' du virus Mason-Pfizer simien comprend ou consiste
en la
séquence se trouvant en position 7573 à 7811 de la Séquence de Référence NCBI
NC 001550.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La LTR en 5' du HFV comprend ou
consiste en la séquence se trouvant en position 1 à 1760 de la Séquence de
Référence
NCBI NC 001364.1 (mise à jour du 22 avril 2009). La LTR en 3' du HFV comprend
ou
consiste en la séquence se trouvant en position 11487 à 13246 de la Séquence
de
Référence NCBI NC 001364.1 (mise à jour du 22 avril 2009).
Les inventeurs ayant montré que les Séquences Terminales Répétées (LTR) du
virus de l'arthrite-encéphalite caprine (CAEV) n'étaient pas dépendantes du
gène tat viral
pour exprimer les gènes d'un génome viral auquel elles sont fusionnées,
avantageusement, l'acide nucléique selon l'invention ne contient pas le gène
tat dudit
premier rétrovirus.
Dans le contexte de l'invention, le deuxième rétrovirus est différent du
premier
rétrovirus. Il peut être un oncovirus, un lentivirus ou un spumavirus. Ainsi
par exemple,
lorsque les LTR du CAEV sont utilisés, le second rétrovirus n'est pas le CAEV.
De
manière préférée, le deuxième rétrovirus est un oncovirus, tels que le virus
de la leucémie
murine (MLV), le virus de la leucose aviaire (ALV), le virus du Sarcome de
Rous (RSV),
ou le virus Mason-Pfizer simien, un lentivirus, tel que le virus de
l'immunodéficience
humaine de type 1 (HIV-1), le virus de l'immunodéficience humaine de type 2
(HIV-2), le
virus de l'immunodéficience simienne (SIV), le virus de l'immunodéficience
féline (FIV) ou
le virus de l'anémie infectieuse équine (EIAV), ou un spumavirus, tel que le
HFV. De
manière particulièrement préférée, le deuxième rétrovirus est le HIV-1, le HIV-
2, le SIV ou
le FIV.
De manière préférée, ledit au moins un gène viral dudit deuxième rétrovirus
est
sélectionné parmi les gènes gag, pot, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et
env. Dans un
aspect particulier, ledit génome rétroviral chimérique comprend au moins deux,
trois (par
exemple les gènes gag, pol, vif, ou les gènes gag, pol, env), quatre, cinq,
six, sept, huit,
neuf, dix gènes viraux dudit deuxième rétrovirus. Avantageusement ledit génome
rétroviral chimérique comprend le gène tat dudit deuxième rétrovirus. De
manière encore
plus préférée, ledit génome rétroviral chimérique comprend l'ensemble des
gènes gag,
pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit deuxième rétrovirus.
CA 02848484 2014-03-12
WO 2013/037841 PCT/EP2012/067863
Dans un particulièrement aspect préféré, ledit génome rétroviral chimérique
comprend les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env du SIV,
du HIV-1, HIV-
2 ou du FIV. Dans un aspect encore préféré, ledit génome rétroviral chimérique
comprend
ou consiste en la séquence du génome rétroviral du SIV (SEQ ID NO : 4), du
génome
5 rétroviral du HIV-1 (SEQ ID NO: 2), du génome rétroviral du HIV-2 (SEQ ID
NO: 5), ou
du génome rétroviral du FIV (SEQ ID NO : 6).
Les génomes rétroviraux chimériques du SIV, du HIV-1, du HIV-2 et du FIV sont
respectivement schématiquement représentés dans les figures 1 à 4.
10 Dans un mode de réalisation particulier, ledit génome rétroviral
chimérique
comprend en outre au moins un gène viral d'un troisième rétrovirus, ledit
troisième
rétrovirus n'étant pas le premier rétrovirus, c'est-à-dire étant différent
dudit premier
rétrovirus. Ainsi, par exemple, lorsque les LTR du CAEV sont utilisés, ledit
troisième
rétrovirus n'est pas le CAEV. Ledit troisième rétrovirus peut être choisi
parmi l'un des
rétrovirus tels que définis ci-dessus.
Lorsque ledit génome rétroviral chimérique comprend au moins un gène viral
d'un
deuxième rétrovirus et au moins un gène viral d'un troisième rétrovirus,
lesdits deuxième
rétrovirus et troisième rétrovirus sont différents. Lesdits deuxième
rétrovirus et troisième
rétrovirus peuvent être ou ne pas être de genre différents, par exemple
lesdits deuxième
et troisième rétrovirus peuvent être chacun un oncovirus, un lentivirus, ou un
spumavirus,
ou lesdits deuxième et troisième rétrovirus peuvent être respectivement (i) un
lentivirus et
un spumavirus, ou inversement un spumavirus et un lentivirus, (ii) un
oncovirus et un
lentivirus, ou inversement un lentivirus et un oncovirus, ou (iii) un
spumavirus et un
oncovirus, ou inversement un oncovirus et un spumavirus.
Préférentiellement, lorsque ledit génome rétroviral chimérique comprend au
moins
un gène viral d'un deuxième rétrovirus et au moins un gène viral d'un
troisième rétrovirus,
lesdits deuxième rétrovirus et troisième rétrovirus sont chacun un lentivirus,
et de manière
préférée, ledit lentivirus est sélectionné parmi le H IV-1, le HIV-2, le SIV,
le FIV ou l'EIAV.
De manière encore plus préférée, le deuxième rétrovirus et le troisième
rétrovirus sont
des lentivirus d'espèce, de sérogroupe, ou de sérotype différents. Ainsi, par
exemple
lorsque ledit deuxième rétrovirus est le HIV-1, ledit troisième rétrovirus est
le HIV-2, ou
encore lorsque ledit deuxième rétrovirus est le HIV-1 de sérogroupe M, ledit
troisième
rétrovirus est le HIV-1 de sérogroupe 0, ou encore lorsque ledit deuxième
rétrovirus est le
HIV-1 de sérogroupe M et de sérotype 1, ledit troisième rétrovirus est le HIV-
1 de
sérogroupe M et de sérotype B.
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WO 2013/037841 PCT/EP2012/067863
11
De manière préférée, ledit au moins un gène viral dudit troisième rétrovirus
est
sélectionné parmi les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et
env. Dans un
aspect particulier, ledit génome rétroviral chimérique comprend en outre au
moins deux,
trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf ou dix gènes viraux dudit troisième
rétrovirus,
avantageusement dont le gène tat
De manière encore plus préférée, ledit génome rétroviral chimérique comprend
en
outre l'ensemble des gènes gag, pot, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env
dudit troisième
rétrovirus, c'est-à-dire que le ledit génome rétroviral chimérique comprend
l'ensemble des
gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit deuxième
rétrovirus et
l'ensemble des gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit
troisième
rétrovirus.
Ledit génome rétroviral chimérique peut donc comprendre un gène viral dudit
deuxième rétrovirus et neuf gènes viraux dudit troisième rétrovirus, ou deux
gènes viraux
dudit deuxième rétrovirus et huit gènes viraux dudit troisième rétrovirus, ou
trois gènes
viraux dudit deuxième rétrovirus et sept gènes viraux dudit troisième
rétrovirus, ou quatre
gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et six gènes viraux dudit troisième
rétrovirus, ou
cinq gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et cinq gènes viraux dudit
troisième
rétrovirus, ou six gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et quatre gènes
viraux dudit
troisième rétrovirus, ou sept gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et trois
gènes viraux
dudit troisième rétrovirus, ou huit gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et
deux gènes
viraux dudit troisième rétrovirus, ou neuf gènes viraux dudit deuxième
rétrovirus et un
gène viral dudit troisième rétrovirus. A titre d'exemples non limitatifs,
ledit génome
rétroviral chimérique peut donc comprendre le gène gag dudit deuxième
rétrovirus et les
gènes pot, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus
; ou les gènes
gag et pol dudit deuxième rétrovirus et les gènes vif, vpx, vpr, nef, tat,
rev, vpu et env
dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes gag, pol, vif dudit deuxième
rétrovirus et les
gènes vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou les
gènes gag, pot,
vif, vpx dudit deuxième rétrovirus et les gènes vpr, nef, tat, rev, vpu et env
dudit troisième
rétrovirus ; ou gag, pol, vif, vpx, vpr dudit deuxième rétrovirus et les gènes
nef, tat, rev,
vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes gag, pot, vif, vpx, vpr,
nef dudit
deuxième rétrovirus et les gènes tat, rev, vpu et env dudit troisième
rétrovirus ; ou les
gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat dudit deuxième rétrovirus et les gènes
rev, vpu et env
dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes gag, pot, vif, vpx, vpr, nef, tat,
rev dudit deuxième
rétrovirus et les gènes vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes
gag, pot, vif,
vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu dudit deuxième rétrovirus et le gène env dudit
troisième
rétrovirus.
12
Dans aspect particulièrement préféré, ledit génome rétroviral chimérique
comprend les gènes gag, pol, vif, vpx et vpr dudit deuxième rétrovirus et les
gènes nef,
tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus.
Dans un aspect encore plus préféré, ledit génome rétroviral chimérique
comprend
les gènes gag, pol, vif, vpx et vpr du SIV et les gènes nef, tat, rev, vpu et
env du HIV-1, ou
inversement les gènes gag, pol, vif, vpx et vpr du HIV-1 et les gènes nef,
tat, rev, vpu et
env du SIV. Dans un autre aspect particulièrement préféré, ledit génome
rétroviral
chimérique comprend les gènes gag, pol, vif, vpx et vpr du HIV-1 et les gènes
nef, tat, rev,
vpu et env du H IV-2, ou inversement les gènes gag, pol, vif, vpx et vpr du
HIV-2 et les
gènes nef, tat, rev, vpu et env du HIV-1. Dans un aspect encore plus préféré,
ledit
génome rétroviral chimérique comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 7
(une
représentation schématique de ce génome rétroviral chimérique se trouve en
figure 5).
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque le gène pol est présent dans
le
génome rétroviral chimérique, ledit gène pol est un gène pol délété des
séquences codant
l'intégrase (in). De manière préférée, ledit gène pol est délété de la
séquence SEQ ID
NO : 8 (séquence de l'intégrase du SIV), SEQ ID NO : 9 (séquence de
l'intégrase du HIV-
1), SEQ ID NO: 10 (séquence de l'intégrase du HIV-2), ou SEQ ID NO: 11
(séquence de
l'intégrase du FIV).
Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit génome
rétroviral
comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO :
13,
SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15.
Les génomes rétroviraux chimériques comprenant ou consistant en la séquence
SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 14 ou SEQ ID NO : 15
sont respectivement schématiquement représentés en figures 6 à 10.
L'invention concerne également un vecteur comprenant un acide nucléique selon
l'invention.
L'invention concerne également un vecteur recombinant comprenant l'acide
nucléique selon l'invention.
Le terme vecteur>) désigne un élément extrachomosonnique par lequel une
séquence d'ADN ou d'ARN (i.e. un gène étranger ) peut être introduite dans
une
cellule hôte, de manière à transformer l'hôte et à permettre l'expression
(i.e. transcription
et traduction) de la séquence introduite. L'élément extrachromosomique peut
être une
CA 2848484 2019-02-15
12a
séquence auto-réplicative, une séquence de phage ou une séquence
nucléotidique, un
ADN ou ARN simple ou double brin, un plasmide, un cosmide. Un vecteur contient
typiquement l'ADN d'un agent transmissible, dans lequel un ADN étranger est
inséré et un
marqueur de sélection. Un moyen commun d'insérer un fragment d'ADN dans un
autre
segment d'ADN implique l'utilisation d'enzymes, appelées enzymes de
restriction, qui
clivent l'ADN au niveau de sites spécifiques (groupes spécifiques de
nucléotides), appelés
15
25
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13
sites de restriction. Généralement, l'ADN étranger est inséré au niveau d'un
ou plusieurs
sites de restriction du vecteur ADN, et ensuite transporté par le vecteur dans
une cellule
hôte avec l'ADN de l'agent transmissible. Un segment ou une séquence d'ADN
comprenant un ADN ajouté ou inséré, tel qu'un vecteur, peut aussi être appelé
c< une
construction d'ADN . Un type commun de vecteur est un << plasmide , qui
généralement
est une molécule autonome d'ADN double-brin, généralement d'origine
bactérienne, qui
peut facilement accepter un ADN additionnel (étranger) et qui peut facilement
être
introduit dans une cellule hôte appropriée. Un nombre important de vecteurs,
incluant les
plasmides, ont été décrits pour la réplication et/ou l'expression dans
différents hôtes
eucaryotes et procaryotes. Dans le contexte de l'invention, le vecteur
comporte un
marqueur de sélection, tel qu'un gène de résistance à un antibiotique, et un
acide
nucléique selon l'invention. De manière préférée, le gène de résistance est un
gène de
résistance à l'ampicilline ou à la kanamycine.
Les acides nucléiques et/ou le vecteur selon l'invention peuvent être utilisés
pour
transformer ou transfecter une cellule ou un organisme hôte, i.e. pour
l'expression du
génome rétroviral chimérique selon l'invention.
Le terme << cellule hôte'> désigne n'importe quelle cellule de n'importe quel
organisme qui est sélectionnée, modifiée, transformée, transfectée,
transduite, cultivée,
ou utilisée ou manipulée d'une façon ou d'une autre, pour la production d'une
substance
par la cellule, par exemple pour l'expression d'un gène, d'une séquence d'ADN,
d'une
protéine, d'un virion par la cellule. Dans le contexte de l'invention, la
cellule hôte est une
cellule mammifère. Des cellules hôtes appropriées incluent, sans être
limitant, les cellules
HEK293, les lignées lymphocytaires T CD4+ humaines CEMx174 et M8166, les
lymphocytes T CD4+ humains, les lymphocytes T CD8+ humains, les cellules
mononucléées du sang humain.
La transformation de la cellule ou de l'organisme hôte par l'acide nucléique
et/ou
le vecteur selon l'invention peut être réalisée selon les techniques standards
connues de
l'homme du métier, comme par exemple par transfection, électroporation,
microinjection,
transduction, fusion de cellules, DEAE-Dextran, précipitation au phosphate de
calcium, ou
utilisation de pistolet à gènes, ou un transporteur de vecteur d'ADN (voir par
exemple, Wu
et al., 1992, J Biol Chem 267 :963-967; Wu et aL, 1988, J Biol Chem 263 :14621-
14624;
Hartmut et al., demande de brevet canadienne No. 2 012 311, publiée le 15 mars
1990).
14
Composition immunogène ou vaccinale et leurs utilisations
L'acide nucléique ou le vecteur selon l'invention peuvent être utilisés dans
un but
immunogène ou vaccinal.
Ainsi, l'invention concerne également une composition immunogène ou vaccinale
comprenant un acide nucléique ou un vecteur selon l'invention.
Ainsi, l'invention concerne également une composition immunogène ou vaccinale
comprenant l'acide nucléique ou le vecteur selon l'invention et un véhicule
pharmaceutiquement acceptable.
Dans le contexte de la présente demande, le terme vaccinal est relatif à la
vaccination prophylactique ou thérapeutique.
Par composition immunogène ou vaccinale, on entend une composition permettant
d'induire une réponse immune contre un rétrovirus tel que défini précédemment.
Par
réponse immune, on entend une réponse faisant intervenir les lymphocytes T,
par
exemple les lymphocytes T CD4+ et CD8+, et les lymphocytes B.
Selon un mode de réalisation, la composition immunogène ou vaccinale selon
l'invention est monovalente, Le. elle permet une réponse immune contre un seul
rétrovirus, par exemple contre le HIV-1 ou le HIV-2.
Selon un autre mode de réalisation, la composition immunogène ou vaccinale
selon l'invention est multivalente, i.e. elle permet une réponse immune contre
plusieurs
rétrovirus, par exemple contre le HIV-1 et le HIV-2 ou plusieurs agents
pathogènes, par
exemple contre le HIV-1 et le VHC (HCV en anglais pour Hepatitis C Virus).
Dans ce cas
le vecteur vaccinant exprime les antigènes de l'un et de l'autre agent
pathogène.
Selon un autre mode de réalisation, la composition immunogène ou vaccinale
selon l'invention est polyvalente. Une telle composition immunogène ou
vaccinale peut
être obtenue en combinant plusieurs compositions immunogènes ou vaccinales
monovalentes selon l'invention. La composition immunogène ou vaccinale peut en
outre
comprendre au moins un autre vaccin, Le. un virus vivant atténué, un virus
inactivé ou
une sous-unité virale, contre un autre virus, tel qu'un virus sexuellement
transmissible,
comme par exemple le virus de l'hépatite B, le virus de l'hépatite C ou le
papillomavirus.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition immunogène ou vaccinale
selon l'invention comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Un véhicule pharmaceutiquement acceptable désigne n'importe quel
véhicule dans lequel la composition immunogène ou vaccinale selon l'invention
peut être
formulée. Cela inclut une solution saline telle qu'un tampon phosphate salin.
En général,
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14a
un diluant ou un véhicule est choisi selon le mode et la voie
d'administration, et
selon la pratique pharmaceutique standard. Un véhicule pharmaceutiquement
acceptable
inclut, sans limitation, des échangeurs d'ions, l'aluminium, du stéarate
d'aluminium, la
lécithine, les systèmes de délivrance de médicaments auto-émulsionnants tels
que le D-
a-tocopherol polyethyleneglycol 1000 succinate, des surfactants utilisés sous
forme de
dosage _____________________________________________________________
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25
35
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pharmaceutique tels que les Tweens ou d'autres matrices de délivrance
polymériques,
des protéines du sérum telles que l'albumine humaine, des substances tampon
telles que
les phosphates, la glycine, l'acide sorbique, le sorbate de potassium, des
mélanges de
glycérides d'acides gras saturés de végétaux, de l'eau, des sels ou des
électrolytes, tels
5 que le sulfate de protamine, le phosphate d'hydrogène disodique, le
phosphate
d'hydrogène de potassium, le chlorure de sodium, les sels de zinc, la silice
colloïdale, le
trisilicate de magnésium, la polyvinylpyrrolidone, des substances à base de
cellulose, le
polyéthylène glycol, la carboxyméthylcellulose de sodium, les polyacrylates,
les cires, les
bloc de polymères de polyéthylène-polyoxypropylène et la graisse de laine. Les
10 cyclodextrines tels que les A-, B-, et g-cyclodextrines, ou des dérivés
chimiquement
modifiées tels que hydroxyalkylcyclodextrines, y compris 2-et 3-hydroxypropyl-
b-
cyclodextrines, ou d'autres dérivés solubilisés peuvent également être
avantageusement
utilisé pour améliorer la délivrance des compositions selon l'invention.
Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir un adjuvant. Tout
15 adjuvant ou mélange d'adjuvants pharmaceutiquement acceptable
classiquement utilisé
dans le domaine des vaccins peut être utilisé à cette fin. On peut citer à
titre d'exemples
d'adjuvants appropriés les sels d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium
ou le
phosphate d'aluminium et le DC-Chol. Tout adjuvant ou mélange d'adjuvants
pharmaceutiquement acceptable classiquement utilisé dans le domaine des
vaccins peut
être utilisé à cette fin. On peut citer à titre d'exemple d'adjuvant approprié
les sels
d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium et le
DC-Chol.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir des gènes adjuvants, c'est-
à-
dire des gènes qui expriment des protéines qui vont jouer le rôle d'adjuvants
en
augmentant l'immunogénicité des protéines virales exprimées. Par exemple les
gènes qui
codent pour les cytokines telles que les interleukines (II) [IL-2, IL12, IL-
15,...ou le GM-
CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)]. Ces gènes adjuvant
sont soit
incorporés dans le plasmide vaccinal, soit co-injectés sous forme de plasmides
d'expression séparés.
N'importe quelle méthode d'administration connue de l'homme du métier peut
être
utilisée. En particulier, l'acide nucléique, le vecteur, la composition
immunogène ou
vaccinale selon l'invention peuvent être administrés par voie orale, par
inhalation, ou par
voie parentérale (en particulier par injection intradermique, sous cutanée,
intraveineuse,
intramédullaire ou intramusculaire). Lorsque la voie parentérale est utilisée,
l'acide
nucléique, le vecteur, la composition immunogène ou vaccinale selon
l'invention peuvent
être sous forme de solutions et suspensions injectables, conditionnés en
ampoules ou en
flasques. Les formes pour une délivrance parentérale sont généralement
obtenues en
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mélangeant l'acide nucléique, le vecteur, la composition immunogène ou
vaccinale selon
l'invention avec des tampons, d'émulsifiants, des stabilisants, des
conservateurs, des
agents solubilisants. Selon des techniques connues, ces mélanges peuvent
ensuite être
stérilisés et conditionnés sous formes d'injections intradermique, sous
cutanée,
intraveineuse, intramédullaire ou intramusculaire. L'homme du métier peut
utiliser des
tampons basés sur des sels de phosphate organique en tant que tampon. Des
exemples
d'agent émulsifiants incluent la méthylcellulose, l'acacia, la
carboxymethylcellulose de
sodium. Des exemples de stabilisants incluent le sulphite de sodium, le
métasulfite de
sodium, et des exemples de conservateurs incluent le P-hydroxybenzoate de
sodium,
l'acide sorbique, le crésol et le chlorocrésol. L'acide nucléique, le vecteur,
la composition
immunogène ou vaccinale peuvent également être sous forme lyophilisée.
La solution d'ADN vaccinale peut être injectée directement ou bien administrée
par
électroporation in vivo en utilisant un électroporateur commercial ou bien
encapsulée
dans des liposomes ou des nanoparticules ou en utilisant tout procédé de
transfection in
vivo qui permet une meilleure introduction de l'ADN vaccinal dans les cellules
de l'hôte
vacciné.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un acide nucléique selon
l'invention, un
vecteur selon l'invention et/ou une composition immunogène ou vaccinale selon
l'invention pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une
infection par un
rétrovirus.
Par prévenir ou prévention , on entend l'inhibition d'une infection
rétrovirale,
i.e. empêcher le rétrovirus de provoquer une infection, ou prévenir la
propagation du
rétrovirus à l'intérieur d'un sujet infecté ou d'un sujet à l'autre.
Par traiter ou traitement, on entend la limitation de la sévérité de la
maladie,
la prévention des infections récurrentes, i.e. limiter la réactivation des
infections latentes
ou persistantes, et pallier les symptômes des infections par un rétrovirus. Le
rétrovirus est
tel que défini précédemment, et de manière préférée le rétrovirus est le H IV-
1, le H IV-2 ou
le FIV.
Le terme patient ou c< sujet ou µ< hôte désigne un mammifère humain ou
non-humain, ou un oiseau. Préférentiellement, le patient est un primate, un
murin (souris),
un félin (chat), un canin, un équidé (un cheval), un oiseau, un humain,
incluant les
femmes, les hommes, les adultes et les enfants.
La présente invention concerne également une méthode de vaccination ou de
traitement d'un sujet le nécessitant comprenant l'administration d'une
quantité
prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique selon
l'invention,
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17
ou d'un vecteur selon l'invention, ou d'une composition immunogène ou
vaccinale selon
l'invention.
Une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace désigne une
quantité d'acide nucléique, de vecteur ou de composition immunogène ou
vaccinale
permettant de conférer un effet thérapeutique ou prophylactique sur le sujet
traité. L'effet
thérapeutique peut être objectif (i.e. mesurable par des tests ou des
marqueurs) ou
subjectif (i.e. le sujet donne une indication d'un effet ou ressent un effet).
Une quantité
effective peut varier d'environ 0,01 g/Kg à 5000 g/Kg, alternativement
d'environ 0,1 to à
1000 g/Kg, alternativement d'environ 1 à 500 g/Kg. Les quantités effectives
vont aussi
varier selon la voie d'administration, l'utilisation ou non de méthode de
transfection in vivo,
la taille et le poids du sujet, ainsi que selon la possibilité d'une co-
utilisation avec d'autres
agents.
Dans le contexte de l'invention, le mode d'administration de l'acide nucléique
selon
l'invention, ou du vecteur selon l'invention, ou de la composition immunogène
ou
vaccinale selon l'invention peut être réalisée par voie intraveineuse, sous
cutanée,
intradermique, intramédulaire, ou intramusculaire.
L'invention va être expliquée plus en détail par les exemples suivants, sans
en
limiter sa portée.
DESCRIPTIF DES FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la
séquence SEQ
ID NO : 2.
Figure 2 : Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la
séquence SEQ
ID NO : 4.
Figure 3 : Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la
séquence SEQ
ID NO : 5.
Figure 4 : Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la
séquence SEQ
ID NO : 6.
Figure 5: Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la séquence
SEQ
ID NO : 7.
Figure 6: Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la séquence
SEQ
ID NO : 1.
Figure 7: Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la séquence
SEQ
ID NO : 12.
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WO 2013/037841 PCT/EP2012/067863
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Figure 8 : Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la
séquence SEQ
ID NO :13.
Figure 9 : Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la
séquence SEQ
ID NO : 14.
Figure 10: Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la
séquence SEQ
ID NO :15.
Figure 11 : Représentation schématique de la construction du génome du CAEV,
du
plasmide pSHIVKu2, pCA-LTR-SHIVKu2IN- et du pA4SHIVKu2.
Figure 12: Evaluation du nombre de lymphocytes T sécrétant l'IFN-y des souris
Balb/c.
Cellules de rates de souris immunocompétentes BALB/c témoins et immunisées
avec
pA4SHIVKu2 et pCA-LTR-SHIVKu2IN- et stimulées par les peptides Gag, Env et le
pool
peptidique Tat+Rev+Nef. Le nombre de spots a été calculé pour 1 million de
PBMCs.
Figure 13: Évaluation du nombre de Lymphocytes T humains sécrétant l'IFN-y
chez les
souris NOD/SCID-hu immunisées. Cellules de rates de souris immunodéficientes
reconstituées par les cellules mononucléées du sang humain et immunisées avec
pA4SHIVKu2 ou pCA-LTR-SHIVKu2IN- ou pSHIVKu2 sont stimulées par les peptides
Gag,
Env et par le pool peptidique Tat+Rev+Nef. Le nombre de spots a été calculé
pour 1
million de PBMCs et normalisé à 20%.
Figure 14 : Représentation de la préparation du vecteur CA-LTR-SHIVKu2-IN-.
Figure 15 : Représentation schématique du vecteur CA-LTR-SHIVKu2.
Figure 16 : Représentation schématique du vecteur CA-LTR-SHIVKu2-IN-.
Figure 17 : Représentation de la préparation du vecteur CAL-HIV-IN-.
Figure 18: Représentation schématique du vecteur CAL-H IV-IN-.
DESCRIPTIF DES SEQUENCES
- SEQ ID NO: 1 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique
comprenant
les LTR du SAEV et le génome du SH IV délété des séquences codant l'intégrase.
- SEQ ID NO: 2 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique
comprenant
les LTR du CAEV et le génome du HIV-1.
- SEQ ID NO : 3 représente la séquence du LTR du CAEV.
- SEQ ID NO: 4 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique
comprenant
les LTR du CAEV et le génome du SIV.
- SEQ ID NO: 5 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique
comprenant
les LTR du CAEV et le génome du HIV-2.
- SEQ ID NO: 6 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique
comprenant
les LTR du CAEV et le génome du FIV.
19
- SEQ ID NO: 7 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique
comprenant
les LTR du CAEV et le génome du SHIV.
- SEQ ID NO : 8 représente la séquence de l'intégrase du SIV.
- SEQ ID NO : 9 représente la séquence de l'intégrase du HIV-1.
- SEQ ID NO: 10 représente la séquence de l'intégrase du HIV-2.
- SEQ ID NO: 11 représente la séquence de l'intégrase du FIV.
- SEQ ID NO: 12 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique
comprenant
les LTR du CAEV et le génome du HIV-1 délété des séquences codant l'intégrase.
- SEQ ID NO: 13 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique
comprenant
.. les LTR du CAEV et le génome du H IV-2 délété des séquences codant
l'intégrase.
- SEQ ID NO: 14 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique
comprenant
les LTR du CAEV et le génome du FIV délété des séquences codant l'intégrase.
- SEQ ID NO: 15 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique
comprenant
les LTR du CAEV et le génome du SIV délété des séquences codant l'intégrase.
- SEQ ID NO: 16 représente la séquence du vecteur pCA-LTR-SHIVKu2.
- SEQ ID NO: 17 représente la séquence du vecteur pCA-LTR-SHIVKu2-IN-.
- SEQ ID NO: 18 représente la séquence du vecteur CAL-H IV-IN-.
EXEMPLES
1. Matériel et méthodes
1.1. Les vecteurs vaccinants (Figure 11)
1.1.1. Vecteurs pCA-LTR-SH IVKu2 et pCA-LTR-SH N-
Le vecteur CA-LTR-SHIVKu2 contient le génome du Virus de l'Immunodéficience
Simienne et Humaine (SHIV) délété des LTR du SIV et remplacés par les LTR du
CAEV.
Le SHIV contient un génome chimérique composé de celui du VIS-nnac239 dans
lequel
les gènes tat, env et rev du SIV ont été délétés et remplacés par les gènes
vpu, tat, env et
rev du HIV-1. Le vecteur porte donc les gènes vpr, vpx, gag, pol, vif et nef
de SIV et les
gènes tat, rev, vpu et env de HIV-1 sous le contrôle transcriptionnel des LTR
en 5' et 3' du
CAEV. Le gène pol a été délété des séquences codantes de l'intégrase (in). Le
vecteur
vaccinant pCA-LTR-SHIVKu2 non délété des séquences codantes de l'intégrase
consiste
en la séquence SEQ ID NO: 16 (Figure 15). Le vecteur pCA-LTR-SHIVKu2-IN-,
délété des
séquences codantes de l'intégrase consiste en la séquence SEQ ID NO: 17
(Figure 16).
La construction du vecteur CA-LTR-SHIVKu2-IN- a été réalisée de la manière
suivante (Figure 14). Le vecteur SHIV-Ku2 a été digéré avec EcoR1 et Nar1,
puis le
fragment LTR de 0.8 kb a été enlevé. Le vecteur CAEV-pBSCA a ensuite été
digéré avec
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EcoR1 et Narl et le fragment LTR de 0.5 kb a été purifié. Les deux fragments
ont ensuite
ont subi une ligation. Le vecteur SHIV-1LTRCA a ensuite été digéré avec Stul
et Aval et
le fragment LTR de 0.8 kb a été enlevé. Le LTR en 3' du CAEV a été amplifié
avec des
amorces Stul et Aval , les produits de la PCR ont été digérés par Stul et Aval
et le
fragment LTR de 0.5 kb a été purifié. Les deux fragments ont subi une ligation
pour
générer le CAL-SHIV Ku2. Enfin une digestion avec Kpnl et Accl dans le gène
pot a été
réalisée pour enlever 314 pb du gène de l'intégrase du SHIV pour générer le
CAL-SHIV
Ku2-IN-.
1.1.2. Vecteurs pSHIVKu2 et A4SH1VKuz
Les plasmides pSH1VKu2 et pA4SH1VKu2 sont des plasmides utilisés comme
témoins. Leurs constructions ont été décrites dans de nombreuses publications
(Liu ZQ et
al., 2006, Ramakrisna Hegde et al., 2005).
1.2 Production de l'ADN vaccinal
1.2.1. Culture bactérienne
Les bactéries E. coli K12 (JM109) contenant le plasmide sont mises en pré-
culture
dans 5 ml de milieu LB contenant 0,05 mg/mi de kanamycine puis incubées une
nuit à
30 C sous agitation à 150 tr/min (tpm). A partir de la pré-culture, la
suspension
bactérienne est diluée au 100 000ème dans du milieu LB, puis 50 pl de la
dilution sont
étalés sur la surface de l'agar/LB/Kanamycine contenu dans une boîte de pétri
qui est
ensuite incubée à 32 C pendant une nuit. Les colonies isolées développées sur
l'agar de
la boite de pétri sont ensemencées dans 5 ml de milieu liquide LB contenant
0,05 mg/m1
de kanamycine et mises en culture sous agitation à 150 tpm à 30 C durant une
nuit. Une
fraction (1m1) de la culture est utilisée pour une extraction rapide de l'ADN
à l'aide du kit
Mini-prepTM de Macherey-NagelTM ou Qiagen, selon le protocole recommandé, puis
l'ADN
extrait est séparé sur gel d'agarose à 1% pour vérifier sa qualité. Les
bactéries
correspondant à l'ADN jugé satisfaisant sont utilisées pour ensemencer les
cultures de 1
L qui sont cultivées dans les mêmes conditions que précédemment, pour
l'isolement
d'ADN en maxipréparation.
1.2.2. Maxi-préparation : extraction plasmidique
Les bactéries cultivées sous agitation (150 tpm) à 30 C pendant une nuit sont
récoltées en culot par centrifugation (4000 g, 4 C, 15 min) et le culot est
resuspendu dans
8 ml du tampon de resuspension (Tris-HCI 50mM pH8, EDTA 10mM). Les cellules
sont
ensuite lysées par addition de 8 ml de tampon de lyse alcalin (NaOH 200mM, 1%
SOS)
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pour libérer l'ADN plasmidique. Le lysat est neutralisé par adjonction de 8 ml
de tampon
de neutralisation (acétate de potassium 3M pH 5,5). Le mélange est ensuite
incubé 5 min
dans la glace puis centrifugé 15 minutes à 15 000g à 4 C. La solution
contenant l'ADN est
transvasée dans une colonne préalablement équilibrée permettant de retenir
l'ADN
plasmidique. La colonne est lavée trois fois avec le tampon de lavage puis
l'ADN est élué
et précipité avec de l'isopropanol. Le culot d'ADN précipité est obtenu par
centrifugation
(30 min, 15 000 g à 4 C). L'ADN est ensuite lavé avec 2 ml d'éthanol 70% et
centrifugé 10
min à 4 C à 15 000g pour enlever les excès d'impuretés et de sels puis le
culot est séché
et resuspendu dans un volume approprié d'eau ultrapure.
La concentration de la solution d'ADN est alors déterminée par
spectrophotométrie
à une longueur d'onde A égale à 260 nm puis la qualité du plasmide est
vérifiée par
migration électrophorétique sur un gel d'agarose 1%. La taille du plasmide et
l'intégrité du
plasmide sont vérifiées sur gel d'agarose après digestion par des enzymes de
restriction
Bam H1 et Eco R1 par exemple.
1.2.3. Vérification du plasmide pCA-LTR-SHIVKu2-IN-_ par digestion enzymatique
Une fraction aliquote de 0,5 g du plasmide est soumise à digestion avec 2
unités
d'enzymes EcoR1, BamH1 ou Sph1 pendant 60 minutes à 37 C dans du tampon 1X
approprié pour chaque enzyme, et dans un volume final de 200. Le profil de la
digestion
est vérifiée par migration électrophorétique dans un gel d'agarose 1% avec un
tampon
TAE 1X et révélé par du bromure d'éthidium (BET) et observation du gel sous
UV.
1.3 Cultures cellulaires et traitements:
1.3.1. Modèles cellulaires et conditions de cultures
Les lignées cellulaires ont été obtenues auprès du National Institutes of
Health
AIDS Research and Reference Reagent Program aux États Unis. Les cellules sont
cryoconservées dans 10% de diméthyle sulfoxide (DMSO), à -170 C dans l'azote
liquide.
Elles sont décongelées puis cultivées dans des flacons de culture.
Les cellules HEK293T (Human Embryonic Kidney 293 immortalisé) constituent
une lignée permanente de cellules de rein d'embryon humain. Elles sont
utilisées du fait
qu'elles sont très faciles à transfecter, avec des efficacités de transfection
très élevées qui
peuvent atteindre les 100%. Le génome lentiviral est exprimé fortement dans
ces cellules
et les protéines s'assemblent en particules infectieuses et leur co-culture
avec les cellules
indicatrices (CEM ou M8166) permet la formation de syncytia typiques. Les
cellules
HEK293T sont adhérentes, cultivées en monocouche à la surface des flasques
dans du
milieu MEM supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF), 1% de
pénicilline
22
=
5,000 Unit/mi streptomycine 5,000 pg/m1 et 1% de gentamycine 10 mg/ml. Les
cellules
sont maintenues à 37 C sous atmosphère humide à 5% de CO2. Le milieu de
culture est
changé tous les trois jours. Pour effectuer des sous-cultures, le milieu
nutritif est éliminé,
les cellules sont lavées avec d PBS/EDTA et incubées 1 minute à 37 c en
présence de
trypsine 0,5%-EDTA 0.01%. Après décollement des cellules, un volume de milieu
MEM
est immédiatement ajouté aux cellules puis les cellules sont homogénéisées et
transférées dans de nouvelles flasques.
Les cellules CEMx174 et M8166 sont des lignées de lymphocytes T CD4+
humaines qui sont permissives à l'infection par les lentivirus humains et
simiens et
forment des effets cytopathogènes (ECP) typiques. Elles sont non adhérentes et
sont
cultivées dans du milieu RPMI supplémenté par 10% de SVF, 1% de pénicilline-
streptomycine et 1% de gentamycine. Les cellules sont maintenues à 37 C sous
atmosphère humide à 5% de CO2. Le milieu est changé tous les trois jours en
effectuant
une étape de centrifugation à 1500g pendant 5 minutes. Le culot est ensuite
resuspendu
par aspirations et refoulements successifs dans un volume approprié de milieu
de culture.
1.3.2. Évaluation fonctionnelle avec test biologique in vitro
Transfection des HEK293T avec les plasmides pCA-LTR-SHIVKu2-IN- ou pSHIVKu2
La méthode de transfection utilisée est la méthode avec ExGen500TM. Le
ExGen500TM (Euromedex, France) est composé d'un polymère cationique à base de
polyéthylènimine linéaire. Ce polymère possède une très grande densité de
charge
cationique permettant de former des complexes avec l'ADN par liaisons
ioniques. Ces
complexes ExGen500/ADN sont alors capables d'interagir avec les membranes
plasmiques des cellules généralement anioniques (interaction via les
protéoglycanes
sulfatés). Il s'ensuit une endocytose des complexes par les cellules et leur
transport vers
des endosomes/lysosomes. Par sa capacité de protonation à pH acide, le
ExGen500
permet de tamponner le milieu des vésicules acides empêchant ainsi la
dégradation de
l'ADN transfecté. Cette propriété provoque aussi un choc osmotique, qui permet
à l'ADN
d'être libéré dans le cytoplasme de la cellule. Le ExGen500 favorise ensuite
le transport
de l'ADN vers le noyau et évite sa dégradation par les nucléases
cytoplasmiques.
Cinq pg de l'ADN du plasmide sont ajoutés à 350 pl de solution de NaCI 150 mM
et à 15 pl de ExGen 500. Le mélange est incubé 40 minutes à température
ambiante.
Puis le mélange est ajouté dans les flasques contenant les HEK-293T
recouvertes de
milieu fraichement renouvelé.
Infection des CEMx174 et amplification du stock viral
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Les HEK-293T transfectées par l'ADN du pCA-LTR-SHIVKu2-IN- ou du pSHIVKu2
sont mises en co-culture avec les CEMx174, et à partir de 48 heures les
CEMx174
développent des signes d'infection se traduisant par la formation d'ECP qui
résultent de la
fusion des CEMx174 pour former des syncitia. Les CEMx174 infectées sont
transférées
dans une nouvelle flasque en présence de CEMx174 fraiches pour amplifier le
virus qui
est récolté dans le surnageant.
Production virale
La récolte du stock viral s'effectue à partir de 48 heures à l'aide d'une
seringue,
puis les débris cellulaires sont éliminés par passage à travers un filtre de
diamètre 0,22 m
avant d'être mis dans des tubes qui sont stockés à -80 C.
Inoculation des cellules par le virus
Une fraction aliquote (10-100 pl) du surnageant de virus est utilisée pour
inoculer
les cellules cibles afin d'évaluer son infectiosité par le développement
cytopathique ou par
détection d'expression de gènes marqueurs.
Titration du virus sur des cellules non adhérentes
Le surnageant contenant du virus est dilué de dix en dix (dilutions
successives)
dans du milieu pour obtenir des dilutions de 10-1 à 10-6 qui sont utilisées
pour inoculer en
quadriplate des puits contenant 1.105 cellules par puits dans 0,5 à 1 ml de
milieu RPMI
dans une plaque de 24 puits. Les cellules ainsi inoculées sont incubées à 37 C
et 5% de
CO2 et entretenues par changement de milieu tous les 3 jours. Elles sont
observées
régulièrement pour le développement d'ECP.
1.4. Microscopie électronique de cellules HEK293T transfectées avec le pCA-LTR-
SHIVKu2-1N-
Dans l'objectif d'examiner si les protéines produites par le génome vaccinal
pCA-
LTR-SHIVKu2-IN- s'assemblaient en particules virales, les inventeurs ont
réalisé des
études morphologiques par microscopie électronique (ME).
Les échantillons de cellules HEK293T transfectées avec le pCA-LTR-SHIVKu2-IN-,
pSHIVKu2 ou A4SHIVKu2 sont fixés dans une solution de glutaraldéhyde 2.5%
diluée dans
un tampon cacodylate (0,1M de cacodylate de sodium). Ils sont ensuite post-
fixés, à 4 C,
dans du tampon cacodylate contenant 1% de tetraoxyde d'Osmium (0s04), pendant
60
minutes. Les échantillons sont ensuite incubés pendant la nuit à 4 C à
l'obscurité dans de
l'acétate d'uranyle à pH 4. Les échantillons sont ensuite plongés dans des
bains
24
successifs de 10 minutes d'éthanol dilué respectivement à 30%, 60%, 90% et
100%.
Ensuite les échantillons sont immergés pendant deux heures dans un mélange
50/50
d'éthanol pur et de résine EPDXYTM (8 ml de DDSA, 7 ml de MNA, de 13 ml
d'EpoxyTm).
Les échantillons sont ensuite placés deux heures dans de la résine Epoxy pure
avant
d'être inclus dans des capsules BeemTM et mis à polymériser pendant 48 heures
à 60 C.
Des coupes ultrafines de ces régions sont effectuées à l'aide d'un couteau en
diamant à l'aide d'un ultra microtome. Ces coupes de 70 nm d'épaisseur sont
déposées
sur des grilles en cuivre pour être observées sous une tension de 80kV à
l'aide d'un ME à
transmission Jeol 1200 EXTM.
1.5. Immunisation des souris avec l'ADN vaccinal pCA-LTR-SHIVKu2-IN-.
1.5.1. Humanisation et vaccination des souris NOD/SCID
Les souris âgées de 6 semaines sont irradiées avec une dose de 120 Centigray
de
rayonnement gamma pendant 50 secondes.
Humanisation des souris avec des PBMC du sang humain
Le sang total prélevé sur citrate de sodium est centrifugé (2000g, 10 min, 20
C)
pour récupérer la couche de cellules blanches entre le plasma et les cellules
rouges. Les
cellules sont diluées 3 fois dans du PBS/EDTA, déposées délicatement au-dessus
d'un
coussin de FicollTM (milieu de séparation des lymphocytes) puis centrifugé 45
minutes à
2000g à 20 C. Les PBMC sont récupérées, lavées plusieurs fois dans du PBS/EDTA
et
resuspendues dans du PBSx1 puis 50.106 PBMC dans 0,1 ml sont injectés pour
chaque
souris par voie intra-péritonéale.
Immunisation des souris
Après 48-72h post-humanisation, les souris SCID-hu sont injectées par voie
intramusculaire (IM) avec 50 pg d'ADN du pCA-LTR-SHIVKu2-IN-, pSHIVKu2 ou
pA4SHIVKu2. Les souris BALB/c âgées de 6-8 semaines sont directement
immunisées par
injection IM avec 100 pg de chacun des ADNs.
1.5.2. Méthode d'évaluation de la réponse humorale
Test ELISA en Sandwich Abnova:
Ce test est basé sur la détection des anticorps dirigés contre les antigènes
viraux
qui sont fixés au fond des puits de la plaque 96 puits. Les sérums à tester
(récupérés à
.. différents temps post-immunisation), les contrôles positifs et négatifs
sont déposés dans
les puits. Les Ac anti-HIV éventuellement présents se fixent sur les antigènes
viraux.
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Après plusieurs lavages des puits pour éliminer l'excès et les fixations non
spécifiques,
est rajouté un Ac secondaire de détection qui porte une molécule de biotine
qui interagit
avec la streptavidine couplée à l'enzyme HPRO. Les complexes antigène/Ac
formés
seront alors détectés par addition du substrat de l'enzyme, le TMB, qui
donnera
5 naissance à une réaction colorée. La coloration est traduite en densité
optique par lecture
avec un photomètre lecteur d'ELISA.
Les réactifs et produits sont amenés à température ambiante. Les contrôles
négatifs et positifs (100 I) fournis dans le kit, les blancs (1000) et les
échantillons de
sérum 10 et 50 iii sont déposés dans les puits dans un volume final de 1000.
La plaque
10 est incubée pendant 30 minutes à 37 C, puis rincée avec la solution de
lavage. La
solution d'Ac secondaire diluée au centième est ajoutée (100 I) dans tous les
puits sauf
dans les blancs. La plaque est ensuite recouverte avec du papier parafilm et
incubée 20
minutes à 37 C. Une solution A et B de TMB est ajouté après une étape de
lavage et la
plaque est incubée 15 min à température du laboratoire. Pour stopper l'étape
de
15 coloration, 1000 de H2SO4 à 2N sont ajoutés par puits. La lecture de la
plaque est faite à
450 nm.
Sont considérés comme positifs, les échantillons ayant une valeur d'absorbance
égale ou supérieure à la valeur seuil, la valeur seuil étant déterminée selon
la formule
suivante : Cutoff Value= NCx 0,100 avec NCx = la moyenne des valeurs
d'absorbance
20 des deux contrôles négatifs.
Test de séro-neutralisation
Cette technique se base sur la capacité des Ac séroneutralisants (séro-N) à
inhiber l'infection de cellules sensibles au virus. Pour la détection et
l'évaluation des Ac
25 séro-N sériques, une quantité constante de virus infectieux est mise en
contact avec des
dilutions en série du sérum à tester, puis le mélange est inoculé à une
culture cellulaire
permissive sur microplaques et incubé 3 à 5 jours. Le virus est le plus
souvent une
souche cytopathogène, et par conséquent l'absence ou la réduction en nombre
d'ECP
traduit la présence d'Ac dans le sérum testé.
Le stock viral SHIVKu2 est dilué au millième dans du RPMI (le volume de
surnageant du virus est déterminé pour 100 TCID50, qui correspond à la
dilution de virus
pour laquelle 50% des puits présentent des syncitia) et les sérums récupérés
des souris
NOD/SCID témoins, humanisées et vaccinées avec pCA-LTR-SHIVKu2-IN- ou pSHIVKu2
sont dilués dans le même milieu (aux dilutions 10, 20, 40, 80, 160 et 320). Le
virus dilué
et les dilutions de sérum sont mélangés dans une plaque 96 puits (100 1/puits)
et le
mélange est mis à incuber 1h à 4 C. Le mélange est ensuite déposé sur des
cellules
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M8166 (1.105 cellules/puits) préalablement mise en culture dans une plaque de
24 puits.
Dans cette expérience, le contrôle positif est représenté par le virus
provenant du
pSHIVKu2 sans sérum et le contrôle négatif correspond aux cellules seules.
Méthode d'évaluation de la réponse cellulaire : Test Elispot
Ce test a pour but de mettre en évidence et d'évaluer la proportion de
lymphocytes
T (LT) qui sécrète l'IFN-y en réponse spécifique à une stimulation
antigénique.
Les souris sont préalablement profondément anesthésiées puis le sang total et
la
rate sont prélevés. Les rates des souris sont mises dans du milieu RPMI dans
la glace. Le
sang dans des tubes sec est utilisé pour isoler le sérum. Les splénocytes sont
isolés suite
à un broyage de la rate dans une boite de pétri entre une paire de lames en
présence de
PBS et d'EDTA 1%. Les cellules sont lavées 2 fois dans du PBS/EDTA
(centrifugation
2000g, 5 min à 20 c) afin de purifier et d'enrichir en splénocytes. Avant
d'ensemencer les
puits avec les cellules, la plaque est lavée avec du PBS puis incubée 30 min
avec
PBS+SVF 10% à température du laboratoire. Les cellules (5.105 splénocytes)
sont
ensemencées dans chaque puits, et sont inoculées avec des pools de peptides
des
protéines Gag, Env, Tat, Rev et Nef à une concentration finale de 2 g/ml. Des
contrôles
positifs (CD3-2 inclus dans le kit) et négatifs, sont ajoutés à l'essai. La
plaque est
recouverte d'une pochette d'aluminium et est mise à incuber à 37 C pendant 19
heures.
Les cellules et peptides sont lavés, puis l'Ac monoclonal anti-IFN-y biotinylé
(7-b6-biotin)
est ajouté, et la plaque est recouverte et incubée pendant 2h à température
ambiante. La
streptavidine diluée dans du PBS contenant 0,5% de SVF est ajoutée
(1000/puits) et la
plaque est incubée lh à température ambiante. Le TMB, substrat révélateur, est
ajouté
par la suite après une autre étape de lavage, puis la plaque est lavée et
séchée après
émergence de spots bleus. La lecture de la plaque est faite à la loupe
binoculaire au
grossissement *40.
Les critères de positivité d'un puits sont déterminés pour chaque condition en
calculant la moyenne du nombre de spots des duplicats, ainsi que les écarts-
types. Le
nombre de spots est calculé pour 1 million de PBMC et est normalisé à 20% pour
les
données obtenues chez les souris NOD/SCID. Le test est considéré comme étant
positif
si la valeur de la moyenne des spots est supérieure à 10 spots par million de
PBMC qui
correspond à la moyenne de spots obtenus avec les contrôles de culture.
1.6. Examens phénotypiques et fonctionnels des cellules T spécifiques de
l'antigène par cytométrie en flux
1.6.1. Isolement des cellules mononuclées périphériques
27
Les cellules mononuclées du sang périphérique humain sont préparées comme
indiqué ci-dessus. Les splénocytes des rates de souris isolés selon le
protocole décrit ci-
dessus sont aussi resuspendus dans le milieu AIM V sans sérum pour la culture
et tests
de cytométrie.
1.6.2. Stimulation antigénique et mise en culture des cellules
Pour examiner si les cellules spécifiques de l'antigène sont capables de
proliférer
et de produire des cytokines et des molécules lytiques, les splénocytes et les
PBMCs sont
marqués au CFSE (1 pg/ml) pendant 10 min à 37 C, puis les cellules sont lavées
avec du
PBS 1X pour éliminer l'excès. Les cellules marquées sont ensemencées dans des
puits
profonds de plaques de 96 puits à raison de 2.106/puits dans 1 ml de milieu
AIM V, puis
stimulées avec les différents pools de peptides (Gag, Env et Tat+Rev+Nef) à
raison de 2
pg/ml en présence des Ac de co-stimulation anti-CD49 et 0028. Des cellules
sans
peptides sont utilisées comme contrôle négatif et des cellules additionnées de
phytohémaglutinine (PHA) 2pg/m1 sont utilisées comme contrôle positif. Les
cellules sont
cultivées pendant 5 jours (37 C sous humidité) puis restimulées avec les mêmes
pools de
peptides pendant 6 heures avant de les marquer. Les cellules sont récoltées
par
centrifugation (2000g, 5 min, 4 C), resuspendues dans 100 pl de PBS et d'abord
marquées avec les Ac de surface (CD3, CD4 et CD8) [Pacific Blue anti-human CD3
(5 pl),
PE anti-human CD4 (10 pl) et APC/Cy7 anti-human CD8 (10 pl)] pendant 30 min à
température ambiante. Les cellules sont ensuite centrifugées et lavées au PBS
1X puis
fixées et perméabilisées dans 100 pl de Cytofix CytopermTM de BD. Les cellules
sont
ensuite incubées pendant 20 minutes à 4 C avec les Ac anti-human IFN-y PE-
Cy7 et
Alexa Fluor 647TM anti-human Granzyme ATM (5 pl) pour les marquages
cytoplasmiques. Les cellules sont enfin lavées avec du PBS et fixées avec de
la PFA 4%
avant l'acquisition et l'analyse au cytomètre de flux.
1.6.3. Instrumentation
Un cytomètre en flux LSRIITM de chez BD relié au logiciel BD FACSDiva6TM a été
utilisé. Cet instrument permet de mesurer jusqu'à 13 paramètres de
fluorescence et deux
paramètres physiques que sont la taille FSC (FonNard Scatter) et la complexité
ou
granulosité SSC (Side Scatter). L'instrument est équipé de trois lasers. Le
laser bleu
émettant à 488nm peut exciter indépendamment plusieurs fluorochromes (FITC,
PE, PE-
Cy7). Le laser rouge qui émet à 633nm peut exciter les fluorochromes APC et
APC-Cy7.
Et enfin le laser violet qui émet à 405nm peut exciter le fluorochrome Pacific
Blue.
CA 2848484 2019-02-15
CA 02848484 2014-03-12
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28
1.7. Immunisation des macaques
Un total de 12 macaques cynomolgus est utilisé dans cette étude. Six macaques
constituent le groupe contrôle et les six autres le groupe des vaccinés. Les
animaux ont
été immunisés par une seule double injection d'ADN par la voie intra-
musculaire
(4mg/animal) et 1 mg/animal par électroporation (EP).
Les raisons de cette stratégie d'immunisation par une dose unique du vaccin
sont
multiples. Une des raisons principales c'est de ne pas perturber la
génération, maturation
et amplification des cellules T mémoires par les cellules T effectrices
primaires associées
à chaque étape de ré-immunisation.
Les animaux immunisés ont subi un suivi longitudinal (1 fois par semaine
pendant
4 semaines puis 1 semaine sur 2 jusqu'à la semaine 32, puis 1 semaine sur 4
pendant 10
mois pour examiner les réponses immunes induites par le vaccin. Les
échantillons de
sang prélevés aux semaines -2 et -1 avant l'immunisation ont été utilisés pour
examiner
d'éventuelles réponses basales. Les cellules mononucléées du sang
périphériques
(PBMC) sont isolées et utilisées pour évaluer les réponses des cellules T par
le test
ELISPOT IFN-A, par marquages de surface et intracytoplasmique, et analyse par
cytométrie de flux.
2. Résultats
2.1. Vérification qualitative et quantitative de la construction du plasmide
pCA-LTR-
SHIVKu2-IN-
2.1.1. Présence du plasmide pCA-LTR-SHIVKu2-IN-
Lorsque l'ADN plasmidique a été isolé à partir d'une culture bactérienne
polyclonale obtenue d'une pré-culture en milieu LB utilisée pour ensemencer un
gros
volume de milieu liquide de LB, une proportion importante d'épisome est
observée autour
de 2000pb. Le profil éléctrophorétique met également en évidence la présence
d'une
seule bande d'ADN autour de 14 000 pb (qui en théorie fait 13 739 pb)
correspondant au
plasmide.
Lorsque l'ADN est isolé à partir d'une culture bactérienne réalisée d'abord
sur
boîte de pétri pour obtenir des colonies isolées, ces colonies ayant été
utilisées pour la
préculture et la culture en masse servant à l'isolement et purification de
l'ADN plasmidien,
le profil éléctrophorétique obtenu après séparation de 0.5 g d'ADN montre
l'absence
d'épisome et met en évidence trois bandes d'ADN de haut poids moléculaire,
correspondant aux formes circulaires, enroulées et superenroulées du plasmide
pCA-
LTR-SHIVKu2-IN-. La pureté et l'évaluation quantitative des ADN plasmidiques
de nos
deux préparations ont été vérifiées par spectrophotomètrie. Les valeurs des
mesures de
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WO 2013/037841 PCT/EP2012/067863
29
l'absorbance aux longueurs d'ondes 230, 260 et 280 ont été utilisées pour
déterminer les
rapports 260/280 qui étaient de 1,75 et 1,82 et à 260/230 de 2,04 et 1,92
respectivement,
témoignent d'une qualité satisfaisante de notre ADN. Les concentrations d'ADN
sont
respectivement de 545 ig/m1 et 765 pg/ml.
2.1.2. Digestion enzymatique du pCA-LTR-SHIVKu2-IN-
Le profil de la digestion du plasmide avec EcoR1 révèle la présence de deux
bandes d'environ 5000 et 7500 pb provenant des coupures au niveau des deux
sites
EcoRI, trois bandes avec Bam H1 de 2400 pb, 4900pb et 7400pb résultant des
coupures
au niveau des deux sites Bam H1, et une bande avec Sph1 située à 10 000pb
résultant
de la coupure au niveau du site unique Sph1. Une bande supplémentaire de 2400
pb est
également observée avec la digestion BamH1 et elle résulterait de l'épisome.
2.2. Evaluation de la fonctionnalité : Effet de l'ADN plasmidien sur les
cellules
Les cellules HEK293T ont été transfectées avec un plasmide contrôle pCG-GFP
exprimant la GFP, le plasmide pSHIVKu2, puis avec le plasmide pCA-LTR-SHIVKu2-
IN-.
Les cellules transfectées avec le plasmide pCG-GFP ont permis d'estimer
l'efficacité de
transfection par évaluation du nombre de cellules GFP+.
Pour vérifier que les cellules HEK293T transfectées avec pCA-LTR-SHIVKu2-IN-
ou pSHIVKu2 produisent des virions qui induisent des syncitia typiques, ces
cellules ont
été mises en co-culture avec des CEMx174, puis l'apparition des ECP a été
suivie par
observation sous le microscope. L'une et l'autre co-culture ont produit des
ECP
caractéristiques.
Pour vérifier que le virus SHIVKu2 produit par les cellules transfectées se
réplique
plusieurs fois, le surnageant des cellules transfectées a été utilisé pour
infecter la lignée
lymphocytaire T CD4+ humaine M8166. Les résultats obtenus avec le SHIVKu2,
montrent
clairement qu'il infecte et induit des ECP surtout avec la lignée cellulaire
hautement
permissive M8166. Ces ECP apparaissent dès 48 heures mais aussi à des stades
tardifs.
Puis pour vérifier que l'ADN du vecteur vaccinal pCA-LTR-SHIVKu2-IN- ne permet
qu'un seul cycle de réplication (comme il est délété du gène in), le
surnageant récupéré
contenant le virus CA-LTR-SHIVKu2-IN- a été inoculé une première fois, puis
une seconde
fois à des M8166 en culture. La première inoculation a produit des ECP à
partir de 48
heures et au bout de 76 heures ils étaient plus nombreux. Le surnageant de ces
cellules
infectées a été récupéré et inoculé une nouvelle fois à des M8166.
Contrairement à
l'inoculation précédente, aucun ECP n'est visible ni à 48 ni à 76 heures post-
inoculation.
CA 02848484 2014-03-12
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Ces résultats permettent de conclure que le pCA-LTR-SHIVKu2-IN- permet de
transduire
une seule fois les cellules cibles en culture.
La présence des ECP typiques, suggère que l'ADN plasmidique s'est répliqué
dans les cellules HEK293T et a produit des virions CA-LTR-SHIVKu2-IN-. Les ECP
de la
5 première infection témoignent de l'infectivité de la lignée de LT CD4+
humaine M8166 par
les particules produites, et leur absence lors de la deuxième infection
témoigne du déficit
de réplication productive dans ces cellules.
2.3. Analyse en microscopie électronique de la morphogenèse des particules
10 virales dans les cellules HEK293T transfectées avec le CA-LTR-SHIVKu2-1N-
Il a ensuite été déterminé si les protéines produites par le génome vaccinal
pCA-
LTR-SHIVKu2-1N- s'assemblaient correctement en particules virales dans les
cellules
HEK293T. La morphologie des cellules HEK293T transfectées avec le plasmide pCA-
LTR-SHIVKu2-1N- a été examinée par ME.
15 Les résultats ont montré que les particules virales sont présentes à
la surface des
cellules sous forme de bourgeons et de particules virales matures qui se sont
détachées
des cellules. Ainsi, les protéines virales du vaccin pCA-LTR-SHIVKu2-IN-
s'assemblent
pour donner des particules virales qui bourgeonnent à l'extérieur des
cellules.
20 2.4. Test in vivo du vaccin sur les souris SCID humanisées et sur les
souris BALB/c
2.4.1. Evaluation de la réponse humorale chez les souris SCID-hu vaccinées
avec le
pCA-LTR-SHIVKu2-1N-
Les échantillons de sérum des souris immunisées, prélevés à environ 1 mois
post-
immunisation sont examinés pour la présence d'Ac qui se lient spécifiquement
aux
25 antigènes du virus à l'aide d'un test ELISA commercial. Les résultats de
cette analyse
sont synthétisés dans le tableau 1 (ci-dessous). Ces résultats montrent
qu'environ la
moitié des échantillons provenant des souris immunisées avec l'ADN vaccinal
pCA-LTR-
5HIVKu2-1N-, comme ceux immunisées avec l'ADN du SHIVKu2, possèdent des
proportions
moins élevées de positifs (44% et 37% respectivement) contrairement à ceux
provenant
30 des souris immunisées avec le pâ4SHIVKu2 (50%). Ces résultats démontrent
la capacité
de l'ADN vaccinal pCA-LTR-5HIVKu2-IN- à induire des réponses humorales chez
les
souris NOD/SC1D-hu. Un échantillon sur trois de sérum des souris immunisées
avec le
p4SHIVKu2, a sa valeur de DO supérieure à celles obtenues avec les
échantillons de
sérums de souris immunisées avec le pCA-LTR-5HIVKu2-1N- et le pSHIVKu2. Ce
plasmide
est non réplicatif, les protéines du virus restent associées à la membrane des
cellules
transfectées et donc devrait induire moins d'Ac.
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CA-LTR
SFIIVKu2- Contrôle Contrôle
Échantillons A4SHIV IN- SHIV témoins positifs négatifs Blancs
Nombre
d'échantillon 6 16 19 2 2 2 2
Nombre de
positivité 3 7 7 2 2 2 2
Intervalle de
positivité 0,3- 1,823 0,26 - 0,9 0,34 - 1,64 0,01 -0,19 1,9 - 2,2 0,15 -
0,16 0,01- 0,03
d'absorbance
Tableau 1 : Détection d'Ac dans les échantillons de sérums de souris SCID
témoins,
SCID-hu et SCID-hu immunisées avec pA4SHIVKu2, pCA-LTR-SHIVKu2-IN- et pSHIVKu2
et
des contrôles.
2.4.2. Analyse de l'activité neutralisante par séro-neutralisation
Les sérums de souris SCID-hu vaccinées avec les plasmides pCA-LTR-SHIVKu2-
IN- ou SHIVKu2 sélectionnés sont ceux dont la DO a été trouvée positive par
ELISA. A
cause de la faible quantité de sérum, certains échantillons à forte valeur de
DO pour le
test ELISA, n'ont pu être examinés par séro-neutralisation. Un échantillon de
sérum de
souris SCID-hu et vaccinées avec le pCA-LTR-SHIVKu2-IN- trouvé négatif a
également été
utilisé pour le test ELISA pour s'assurer de la fiabilité du test.
Echantillons
CA-LTR-SHIVKu2-IN- (3 échantillons) SHIV (1 échantillon)
Dilutions Neutralisation intervalle
d'ECP neutralisation Intervalle ECP
10 +++/+++ 5 - 9 +++ 4
++/++ 14 - 19 ++ 12
40 +/- 25 - 44 ++ 20
80 +/- 27 - 49 ++ 15
160 +/- 31 - 57 26
320 +/- 28 - 69 44
Tableau 2: Analyse de l'activité neutralisante des sérums des souris
immunisées. Des
15 dilutions (1/10, 1/20,...1/320) ont été mélangées avec du virus SHIVKu2
(100 TCID50),
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incubées puis utilisées pour inoculer des cellules M8166. Au bout de 5 jours
post-
inoculation les EPC induits sont énumérés et utilisés pour évaluer l'activité
séro-
neutralisante. Légende: +++ correspondent à une forte neutralisation, ++
neutralisation
assez élevée, + moins de neutralisation, ¨ aucune action de neutralisation.
Pour les CA-
LTR-SHIVKu2, deux types d'échantillons sont représentés, un type d'échantillon
ayant un
profil moins neutralisant par rapport aux deux autres échantillons.
Le nombre d'ECP obtenu est plus élevé dans les cellules M8166 infectées par le
virus SHIVKu2 incubé sans sérum (76 ECP) ou avec le sérum de la souris non
immunisée
(42 ECP) (contrôles négatifs), ce qui nous a permis de fixer le seuil de
négativité de
neutralisation virale à 42 ECP (données non représentées dans le tableau). Par
contre, le
nombre d'ECP devient quasiment nul lorsque le virus est incubé avec du sérum
dilué au
1/10 des souris immunisées avec l'ADN du CA-LTR-SHIVKu2-IN- ou SHIVKu2. Ce
nombre
augmente au fur et à mesure qu'on augmente la dilution des sérums indiquant un
effet
dose. Par exemple avec le sérum d'une souris immunisée avec pCA-LTR-SHIVKu2-IN-
à
la dilution 1/10 on obtient 5 ECP, alors qu'à la dilution 1/320 on obtient une
valeur de 69
ECP, valeur similaire à celle du contrôle sans sérum.
2.4.3. Évaluation de l'immunogénicité du pCA-LTR-SHIVKu2-IN- chez les souris
BALB/c
vaccinées
Pour étudier l'immunogénicité du vaccin pCA-LTR-SHIVKu2-IN- chez les souris
BALB/c, les animaux ont été injectés avec une dose unique de 100 g d'ADN par
voie
intramusculaire. La proportion de cellules de la rate (splénocytes)
spécifiques des
antigènes a été examinée par ELISPOT. Les résultats de cetteviraux et
secrétant l'IFN-y
étude démontrent bien la capacité des ADN utilisés à induire des réponses
immunes
spécifiques dirigés contre tous les antigènes étudiés (Figure 12). Les
réponses T
cellulaires avec le plasmide pA4SHIVKu2 sont deux fois plus élevées qu'avec le
plasmide
pCA-LTR-SHIVKu2-IN-. Cette petite différence d'efficacité entre les deux ADNs
pourrait
être liée à une meilleure qualité de l'ADN du pA4SHIVKu2 que du pCA-LTRSHIVKu2-
IN-.
Ces résultats permettent néanmoins de connaître le niveau de base des réponses
immunes induites par ces vaccins chez les souris normales et permettent de
faire la
comparaison avec les réponses immunes obtenues chez la souris SCID-hu.
2.4.4. Evaluation de la réponse cellulaire chez les souris NOD/SCID-hu
immunisées avec
les différents ADNs.
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Les souris NOD/SCID-hu ont été immunisées par injection intramusculaire avec
une seule dose de 50 g d'ADN du CA-LTR-SHIVKu2-IN-, II4SHIVKu2 ou SHIVKu2,
puis les
splénocytes ont été utilisés pour examiner la réponse immune par ELISPOT pour
évaluer
la proportion de cellules spécifiques de l'antigène et produisant l'IFN-y.
Comme le montre
la figure 13, il y a un nombre important de cellules T produisant de l'INF-y
humain en
réponse à une stimulation par les antigènes Gag, Env ou Tat+Rev+Nef sous forme
de
peptides du SIV ou du HIV. Il est intéressant de noter que les réponses
obtenues après
immunisation avec le pCA-LTR-SHIVKu2-IN- sont quasi-similaires à celles
obtenues avec
pSHIVKu2 et qui sont toutes les deux très nettement supérieures à celles
obtenues après
immunisation avec le pA4SHIVKLJ2. La prédominance des réponses induites par le
pCA-
LTR-SHIVKu2 est contre les antigènes Gag et Tat+Rev+Nef.
L'ensemble de ces résultats démontre que l'ADN du pCA-LTR-SHIVKu2 est très
immunogénique chez les souris NOD/SCID-hu et qu'il induit préférentiellement
des
réponses contre les antigènes connus pour être associés à la protection contre
les virus
pathogéniques.
2.5. Examens phénotypiques et fonctionnels des cellules T spécifiques de
l'antigène par cytométrie en flux
2.5.1. Monomarquaqe effectué à jour zéro (réalisé le jour de récupération des
rates de
souris)
Ces mono-marquages servent d'une part, à examiner que les anticorps choisis
détectent bien les cibles, et d'autre part à évaluer la présence et la
proportion des cellules
humaines dans les rates des souris SCID-hu.
Les lymphocytes non marqués des souris humanisées et non humanisées ont été
analysés en cytométrie en flux pour mesurer la fluorescence à l'état basale
des cellules
(contrôle négatif).
La détection des LT CD3+ est effectuée avec Ac anti-CD3 humain couplé au
fluorochrome "Pacific Blue". Ces cellules forment un pic à 102 dans le profil
des cellules
isolées chez les souris SCID-hu vaccinées avec le plasmide pCA-LTR-SHIVKu2-IN-
. Ce
pic n'est pas présent dans les cellules récupérées chez les souris SCID non
hu.
Pour les cellules mono-marquées avec l'Ac anti-CD4+ (PE anti-human CD4), que
ce soit pour le témoin ou pour notre échantillon testé, aucun pic significatif
n'a été
observé. Ceci serait dû à l'Ac anti-CD4 utilisé qui serait non fonctionnel.
Pour la détection des LT CD8+, un Ac monoclonal anti-CD8 humain couplé au
fluorochrome APC/Cy7 a été utilisé. Il permet la mise en évidence d'un pic
situé entre 102
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et 103 dans le profil des cellules isolées chez les souris SCID-hu vaccinées
avec pCA-
LTR-SHIVKu2-IN- et non chez les souris SCID non hu.
La proportion de lymphocytes produisant les molécules de GRA n'a pu être
évaluée du fait qu'aucune différence de pic n'a été observée sur les cellules
issues de
souris immunisées et non immunisées marquées avec l'Ac anti-GRA A couplé à
l'Alexa
Fluor 647.
Par contre, les cellules marquées avec l'Ac anti-IFN-y humain couplé au
fluorochrome PE-Cy7 ont montré un net pic situé à 102 avec les cellules de
souris SCID-
hu vaccinées avec pCA-LTR-SHIVKu2-IN- qui est absent avec les cellules des
souris SCID
non-hu non immunisées.
2.5.2. Phénotypaqe et fonctions des cellules T chez les animaux immunisées.
Pour examiner le phénotype et les fonctions des cellules T spécifiques des
antigènes du virus, les cellules marquées au CFSE sont incubées pendant 5
jours avec
les peptides (Gag, Env et Tat+Rev+Nef), puis re-stimulées pendant 6 heures
avec les
mêmes peptides. Les cellules sont ensuites marquées avec les Ac et examinées
comme
ci-dessus indiqué.
Les résultats de cette analyse montrent la présence de cellules CD3+ et CD8+
qui
produisent de l'IFN-y et qui possèdent des molécules de GRA surtout avec les
cellules
provenant de souris NOD/SCID-hu vaccinées. En effet, au moins 6% des LT CD8+
produisent IFN-y et 1,7% produisent le GRA A chez les souris NOD/SCID-hu
immunisées,
contre seulement 2,5% et 0,6% respectivement chez les souris contrôles. Ces
résultats
démontrent la présence de cellules CD3+ CD8+ activées, productrices de GRA et
d'IFN-y
qui correspond à une réponse immune cellulaire effectrice induite par notre
vaccin pCA-
LTR-SH IVKu2-IN-.
2.6. Analyse des réponses immunitaires et humorales chez les macaques
2.6.1. Analyse des réponses immunitaires des cellules T par le test ELISPOT
IFN-A
Une fraction des cellules mononucléées isolées à partir des échantillons de
sang
prélevés a été utilisée pour évaluer les proportions de cellules secrétant
l'IFN-A en
réponse à la stimulation par les antigènes viraux Gag, Pol, Env et Tat+Rev+Nef
à l'aide
d'un kit commercial. Les résultats des 20 premières semaines d'analyse sont
présentés
dans le tableau 3. Ils démontrent clairement qu'à la suite d'une seule
administration du
vecteur vaccinal CAL-SHIV-IN-, tous les animaux ont développé des réponses
immunes
cellulaires caractérisées par des cellules spécifiques des antigènes, qui
sécrètent l'IFN-A.
Ces réponses sont hétérogènes selon les animaux qui possèdent des haplotypes
CMH-1
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différents les uns des autres. Les réponses immunes sont caractérisées par la
présence
d'un premier pic de réponse primaire à 2-4 semaines post-immunisation (PI),
puis des
réponses plus tardives à partir 8-10 semaines PI, et ce en l'absence d'une
seconde
immunisation. Il est très intéressant de noter que l'intensité du second pic
est souvent
5 bien plus importante que celle du 1 er pic surtout pour l'animal BX80 où
le nombre de
cellules secrétant l'IFN-A est multiplié par 3.
36
Semaine post-Immunisation
o
1 2 3 4 6 8 10 12
14 16 18 20 1.)
=
Animal Ag Nombre de spots/million de PBMC en réponse aux
antigènes (Ag) s-
t.à
,
Gag 208 821 666 472 317 504 538 474
226 574 621 862 t.à
-,
ce
Pol 0 105 17 350 15 32 0 97
27 11 11 168
BX80
s-
Env 0 84 1 7 124 625 753 67
36 41 48 132
TRN 0 64 0 107 137 1238 1663 1084
728 1215 800 1752
Gag 0 565 1033 443 147 0 488 377
69 152 96 298
Pol 0 33 75 193 0 0 340 145
19 0 0 12
BX83
Env 0 87 49 72 0 0 1035 60
40 25 9 20
'
TRN 0 51 204 116 0 0 731 393
195 224 143 432 n
Gag 0 1279 703 752 300 380 161 427
155 461 91 1269 0
Pol 1 88 36 24 15 5 8 80
0 19 9 44 m
co
e
BX84 Env 1 340 85 105 48 57 21 72 13
96 57 217 co
e
co
TRN 0 205 73 128 27 416 417 761
59 272 79 228 p.
IV
0
Gag 16 388 1989 1220 813 885 840 1795
0 85 472 1344 H
e
i
Pol 0 205 17 45 8 0 13 0
0 0 7 120 0
Lo
i
BX72 Env 7 79 57 56 12 168 56 5 0
0 12 132 1-
m
TRN 5 35 161 192 92 692 445 736
0 25 119 587
Gag 8 668 163 213 45 52 76 555
24 83 80 227
Pol 0 548 60 20 0 31 0 104
132 1 0 59
BX78 Env 0 491 68 97 437 181 0 259 24
15 19 73
TRN 3 296 279 39 0 84 824 685
17 69 39 275 ro
n
1-q
Tableau 3 : Récapitulatif des proportions de cellules T sécrétrices de la
cytokine interféron gamma (IFN-A) en réponse à la stimulation par t=1
ro
les antigènes viraux (Gag, Pol, Env et Tat+Rev+Nef) exprimés par le vaccin
chez les singes vaccinés. Les chiffres correspondent aux
s-
bà
,
nombres de cellules sécrétrices formant un spot par million (106) de cellules
mononucléées du sang périphérique (PBMC). Les semaines
c,
zo
d'analyse sont rapportées en haut du tableau.
t.à
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WO 2013/037841 PCT/EP2012/067863
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2.6.2. Analyse des réponses immunitaires des cellules T par cytométrie de flux
multiparamétrique chez les singes vaccinés
Les résultats des analyses par cytométrie de flux multiparamétrique viennent
confirmer ceux obtenus par ELISPOT en révélant que tous les animaux ont
développé
une réponse composée de cellules T qui prolifèrent et qui sont spécifiques de
tous les
antigènes exprimés par le vecteur vaccinal (Tableau 4). Ces réponses sont
hétérogènes
entre les animaux et révèlent aussi une première phase de réponse primaire qui
s'étend
jusqu'à environ 8 semaines PI, suivie d'une phase de contraction (2-4
semaines) puis une
phase de réémergence. Ce suivi longitudinal de la réponse immune par
cytométrie de flux
multiparamétrique est poursuivi jusqu'à l'épreuve virulente par le virus
d'épreuve
SIVmac251 qui est réalisé à la semaine 52.
Proportion de cellules T qui prolifèrent en réponses aux
Animaux Ag
antigènes (Ag)
T Semaine Semaine Semaine Semaine
ype
(-1) (3-6) (8-20) (22-26)
CD8+ 0.5 3.6 0.4 1.5
Gag
CD4+ 0.1 0.1 0.1 0.4
CD8+ ND 0.6 0.2 0.7
Pol
CD4+ ND 0.7 0.1 0.6
CD8+ 0.3 0.5 0.1 1.4
BX80 Env CD4+ 0.5 1.3 0.2 0.5
TRN CD8+ 0 4.8 0.8 1.6
CD4+ 0.3 1.2 0.2 0.5
T Semaine Semaine Semaine Semaine
ype
(-1) (2) (8-20) (22-26)
CD8+ 0.2 1.7 0.5 1.6
Gag
CD4+ 0.1 0.6 0.4 0.9
CD8+ ND ND 0.3 0.7
Pol
CD4+ ND 0.3 0.2 0.5
CD8+ 0.1 ND 0.5 1.2
BX83 Env
CD4+ 0.3 ND 0.3 0.7
TRN CD8+ 0.4 1.5 0.6 2.3
CD4+ 0.2 0.8 0.3 0.5
Semaine Semaine Semaine Semaine
Type (-1) (3-6) (8-22) (24-26)
CD8+ 0.1 1.1 0.3 2.6
Gag
CD4+ 0.1 0.3 0.1 0.8
CD8+ ND 0.3 0.2 0.7
BX84 Pol
CD4+ ND 0.3 0.2 0.5
CD8+ 0.1 1.1 0.3 0.9
Env
CD4+ 0.2 0.8 0.3 0.7
CD8+ 0 1.3 0.7 1.1
TRN
CD4+ 0.2 0.8 0.3 0.5
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Animaux Ag Proportion de cellules T qui prolifèrent en réponses
aux
antigènes (Ag)
Semaine Semaine Semaine Semaine
Type (-1) (3-6) (8-20) (22-26)
G CD8+ 0 4.2 0.7 3.0
ag
CD4+ 0 0.6 0.2 0.4
CD8+ ND 0.7 0.2 0.7
BX72 Pol
CD4+ ND 1.3 0.1 0.1
CD8+ 0.2 1.0 0.5 0.6
Env
CD4+ 0.3 1.4 0.5 2.3
TRN CD8+ 0.1 0.9 0.3 1.5
CD4+ 0.1 1.7 0.4 0.9
Semaine Semaine Semaine Semaine
Type (-1) (3-6) (8-18) (20-32)
CD8+ 0 3.4 1.1 3.7
Gag
CD4+ 0.1 1.3 0.6 2.9
Pol CD8+ ND 1.1 0.3 1.1
BX78 CD4+ ND 0.6 0.2 1.3
CD8+ 0.2 1.4 0.4 1.2
Env
CD4+ 0.3 0.6 0.6 2.5
TRN CD8+ 0.3 1.9 0.8 2.1
CD4+ 0.3 1.2 0.5 2.1
Tableau 4: Récapitulatif des valeurs des cellules T CD4+ et CD8+
prolifératrices en
réponse aux stimulations antigéniques au moment des phases d'expansion
primaire, de
contraction et enfin de réémergence ou d'expansion secondaire chez les singes
vaccinés.
Les semaines correspondantes à chacune des phases sont indiquées. Les nombres
correspondent aux pourcentages de cellules T spécifiques de chacun des
antigènes qui
prolifèrent en réponse à la stimulation par rapport aux nombre total de
cellules T.
2.6.3. Analyse de la réponse humorale chez les macaques
La détection des anticorps anti-antigènes du SHIV a été réalisée par un kit
ELISA
commercial qui permet de détecter les anticorps anti-Env du HIV-1. L'examen
longitudinal
des sérums récoltées à chaque point de prélevement de sang a montré la
présence
d'anticorps anti-Env à partir de la semaine 20 PI chez l'animal BX80 et à
partir de la
semaine 8 pour l'animal BX73. La présence d'anticorps dans les sérums positifs
a été
confirmée par Western blot contre les protéines du SH IV montrant un fort
signal contre la
protéine Gag-p27 ainsi qu'un signal contre les glycoprotéines gp160/gp120.
2.6.4. Conclusion
Ces résultats démontrent clairement qu'une seule injection d'ADN vaccinal (CAL-
SH IV-IN-) permet d'induire des réponses immunes cellulaires T et humorales
(anticorps).
Les réponses cellulaires T sont dirigées contre tous les antigènes viraux
exprimés par le
vecteur vaccinal. Elles sont persistantes et poursuivent un schéma classique
d'expansion,
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contraction et mémorisation. La présence de cellules T mémoires de type
central et
effecteur mémoires a été confirmée par le phénotypage.
2.7. Construction et analyse fonctionnelle d'un nouveau vecteur exprimant
l'ensemble des antigènes du HIV-1 : le vecteur CAL-HIV-IN-
A partir du génome du vecteur CAL-SHIVKu2-IN-, les gènes gag, pol, vif, vpx et
vpr
du SIV ont été délétés suite à la double digestion avec les enzymes Nar1 et
Sph1, et le
gène nef du SIV a été délété suite à la digestion partielle avec l'enzyme Nru1
et la
digestion totale avec l'enzyme Not 1. Le fragment restant a ensuite été
purifié. Ce
fragment, portant les gènes tat, rev et env du HIV encadrés par les LTR du
CAEV et
véhiculés par le plasmide pET, a été utilisé pour introduire le fragment de
5kb portant les
gènes gag, pol, vif, vpx et vpr du HIV-1 et le fragment de 620 pb portant le
gène nef du
HIV-1, et générer le vecteur CAL-HIV-IN- (Figure 17). Le vecteur CAL-H IV-IN-,
délété des
séquences codantes de l'intégrase consiste en la séquence SEQ ID NO : 18.
2.7.1. Evaluation de la fonctionnalité : Effet de l'ADN plasmidien sur les
cellules
L'ADN de ce vecteur a été introduit dans les cellules GHOST-CXCR4 et HEK-293
T par transfection utilisant le ExGen et le protocole préconisé par le
fabricant. Les cellules
GHOST-CXR4 transfectées sont alors devenues fluorescentes attestant de
l'expression
des protéines virales du H IV-1 par le vecteur vaccinal et plus
particulièrement la protéine
Tat qui transactive l'expression du gène GFP (Green Fluorescent Protein) sous
le controle
de la LTR du HIV.
Le surnageant des cellules HEK-293T transfectées par le vecteur vaccinal CAL-
HIV-IN- a été utilisé pour inoculer les cellules T CD4+ indicatrices M8166 qui
ont
développé des effets cytopathiques caractéristiques de l'infection par HIV.
Ces résultats
apportent la preuve que les protéines exprimées par le vecteur vaccinal se
sont
assemblées en particules virales permettant l'infection des cellules
indicatrices M8166.
Ces cellules avec les effets cytopathiques n'ont pas produit de virus capable
d'infecter à
nouveau les cellules indicatrices M8166 et induire des effets cytopathiques.
Ce résultat
indique le CAL-HIV-IN- est associé a un cycle unique de réplication en
l'absence
d'intégration.
Pour évaluer les protéines virales produites après transfection, les
surnageants
des cellules HEK-293T transfectées avec le vecteur vaccinal, ont été récoltés
24h, 48h et
72h post transfection puis examinés pour la présence d'antigènes Gag p24 par
ELISA.
Les mesures des quantités de cette protéine sont rapportées dans le tableau 5.
Elles
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démontrent une accumulation croissante de cette protéine allant de 10Ong/m1 à
24h
jusqu'à 135ng/mlà 72h post transfection.
24h 48h 72h
Concentration Gag p24 10Ong/m1 11Ong/m1
135ng/m1
Tableau 5 : Evaluation de la protéine Gag p24 du H IV-1 secrétée dans le
surnageant des
5 cellules HEK 293T transfectées par le vecteur vaccinal CAL-H IV-IN-.
Quantification de la
protéine p24 accumulée dans le surnageant des cellules HEK 293T après 24, 48
and 72 h
post transfection avec l'ADN du vecteur CAL-HIV-IN-.
2.7.2. Immunisation de souris BALB/C et caractérisation des réponses immunes
induites
10 Trois groupes de souris BALB/c (6 par groupe) de 6 semaines ont été
utilisés : 2
groupes ont été utilisés pour une immunisation et le troisième groupe est un
groupe
contrôle. Les 2 groupes de souris immunisées ont été injectés avec
100pg/souris d'ADN
du vecteur CAL-HIV-IN- par la voie intra-musculaire. Les animaux d'un groupe
ont été
sacrifiés à 2 semaines et l'autre à 3 semaines post immunisation (PI). Les
souris contrôles
15 ont été sacrifiées à 2 semaines Pl. Les rates de chacune des souris ont
été prélevées, les
splénocytes ont été isolés puis utilisés soit pour le test ELISPOT soit pour
l'analyse en
cytométrie de flux multiparamétrique comme ci-dessus décrit. Les résultats de
l'analyse
par ELISPOT sont reportés dans le tableau 6. Ils démontrent la présence de
cellules
spécifiques de tous les antigènes qui secrètent de l'IFN-A. La majorité de ces
cellules sont
20 spécifiques des antigènes Gag et Tat+Rev+Nef. Les réponses des semaines
2 et 3 post
immunisation sont sensiblement similaires.
Milieu sans peptide Gag Tat+Rev+Nef Env
2 semaines 10 45 50 17
3 semaines 5 35 55 15
Tableau 6 : Récapitulatif des résultats de l'analyse par ELISPOT sur les
splénocytes de
souris BABL/c immunisées avec le vecteur vaccinal CAL-HIV-IN- à 2 et 3
semaines post-
25 immunisation. Les splénocytes isolés des rates de souris immunisées avec
100pg par
souris en intra-musculaire ont été examinés par le test ELISPOT IFN-A pour
évaluer le
nombre de cellules T secrétant cette cytokine en réponse aux stimulations avec
les pools
de peptides (Gag, Env et Tat+Rev+Nef, TRN). Les moyennes de nombres de spots
pour
chaque antigène et pour les 6 souris examinées après 2 et 3 semaines post-
immunisation
30 sont reportées.
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Les résultats de l'analyse par cytométrie de flux (Tableau 7) démontrent des
réponses immunes en cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques de tous les antigènes
exprimés par le vecteur vaccinal CAL-HIV-IN-.
Milieu sans peptide Gag Tat+Rev+Nef Env
CD3+CD4+ 0.16 0.26 0.40 0.18
CD3+CD8+ 0.20 0.27 0.50 0.25
Tableau 7: Récapitulatif des résultats de l'analyse par cytométrie de flux
multiparamétrique. Les chiffres correspondent aux pourcentages de cellules T
spécifiques
de chacun des antigènes qui prolifèrent en réponse à la stimulation
antigénique par
rapport au nombre total de cellules T.
