Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
1
PROCEDE DE RAFFINAGE DU SQUALENE PRODUIT PAR MICROALGUES
La présente invention se rapporte à un procédé de
raffinage du squalène produit par voie fermentaire, à partir de
microorganismes, plus particulièrement de microalgues, plus
particulièrement encore celles issues de la famille des
Thraustochytriales sp.
On entend au sens de l'invention par microalgues de la
famille des Thraustochytriales sp. des microalgues appartenant
aux espèces Schizochytrium sp., Aurantiochytrium sp. et
Thraustochytrium sp.
Le squalène est un lipide présent dans tous les
organismes supérieurs, et est le précurseur commun des
hormones stéroïdes, aussi bien animales que végétales, et
de quelques vitamines, comme les vitamines D.
Il est présent dans de nombreuses membranes
cellulaires dont il assure ainsi la fluidité.
Cet hydrocarbure linéaire Insaturé, est un
isoprénoide à trente atomes de carbone et cinquante atomes
d'hydrogène, de formule :
2,6,10,15,19,23 ¨ Hexaméthyl -
2,6,10,14,18,22 - tétracosahexène, 030E50, c'est-à-dire qu'il
est constitué de 6 unités isoprènes, toutes en
conformation trans.
Il est, comme tous les terpènes, formé à partir du
pyrophosphate d'isopentyle qui se couple avec le
pyrophosphate de diméthylallyle pour fournir
successivement les pyrophosphates de géranyle, puis de
farnésyle, dont deux molécules se condensent après
réduction par le NADPH pour former du squalène sous
l'action de la squalène synthase.
Chez les végétaux et de nombreux microorganismes,
cette voie coexiste avec d'autres voies métaboliques
conduisant au phytoène, précurseur de la chlorophylle, de
pigments caroténoïdes et des terpènes dans les latex.
Le squalène, comme son dérivé époxydé sur la double
liaison terminale, possèdent la propriété de se transformer,
grâce à des enzymes spécialisées (les cyclases), et de manière
remarquablement réglo- et stéréosélective, en triterpènes
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
2
polycycliques d'une grande variété structurale : hopène et
diploptérol chez les eucaryotes et tétrahymanol chez les
protozoaires (triperpènes pentacycliques) ; lanostérol chez les
levures, les champignons et les mammifères et cycloarténol chez
les végétaux (triperpènes tétracycliques).
Les applications du squalène.
Le squalène est de longue date, notamment au Japon,
utilisé comme complément alimentaire.
C'est d'ailleurs un chimiste japonais, Mitsumaru
Tsujimoto, qui l'a découvert en 1906 et a déterminé sa
structure en 1916.
Il est considéré comme un antioxydant efficace, doté
de nombreuses vertus dans les médecines naturelles.
Parmi ses utilisations classiques, on trouve la
cosmétique, quoique l'on y utilise plus couramment son
dérivé hydrogéné, le squalane, qui ne s'oxyde pas, donc ne
rancit pas.
Lorsqu'il est de haute pureté, associé à des adjuvants
stimulants du système immunitaire, le squalène a été, et est
toujours, utilisé dans certains vaccins : sous forme d'émulsion
huile-dans-l'eau , il joue un rôle de tensioactif, augmentant
ainsi la réponse du vaccin.
On l'utilise dans les vaccins expérimentaux ciblant des
virus émergents, comme H5N1 et H1N1, mais surtout en association
avec les antigènes de la grippe saisonnière, dans la composition
des 22 millions de doses administrées depuis 1997 (le MF59 à
raison de 10 mg par dose de FLUADO), sans réactions post-
vaccinales sérieuses.
L'addition d'adjuvants, squalène ou sels d'aluminium
(utilisés depuis 1926), est actuellement nécessaire pour
certains vaccins qui, inactivés ou sous-unitaires, ne
contiennent pas les signaux permettant au système
immunitaire de mettre en uvre les mécanismes de défense
appropriés.
Le squalène évite le recours à des injections
répétées pour assurer une bonne protection.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
3
Ces usages du squalène renforcent la détermination de
l'homme du métier à disposer de procédés sécurisés de production
de squalène de haute pureté.
Par ailleurs, cette qualité peut ouvrir d'autres
voies d'application dans le domaine médical.
Le couplage chimique du squalène avec des analogues
nucléosidiques pourrait ainsi constituer à l'avenir un
progrès considérable dans le traitement de certains
cancers ou dans des maladies virales type VIH.
Les différentes sources du squalène.
Le squalène est classiquement extrait du foie de
requin des profondeurs.
Mais le foie accumule de nombreux composés toxiques,
comme les métaux lourds (dont le mercure) et autres
toxines liposolubles.
Les études toxicologiques ont montré qu'aux
concentrations utilisées dans les cosmétiques, le squalène et sa
forme hydrogénée, le squalane, ne présentent pas de toxicité et
ne sont pas irritants ou sensibilisants pour la peau humaine.
Cependant, le niveau de pureté du squalène est essentiel
lorsque utilisé dans le domaine médical, notamment comme
adjuvants aux vaccins.
Il est donc indispensable de disposer de squalène de
haute qualité, exempt d'impuretés (traces de métaux, notamment
de mercure, et d'autres toxines).
Un certain nombre de voies de production du squalène,
alternatives à son extraction à partir du foie de requin, sont
proposées dans la littérature.
En première alternative : il est possible de l'isoler de
l'huile d'olive, l'huile de palme, et dans d'autres huiles
céréalières ou provenant de l'amarante, des semences, du son de
riz, de germes de blé.
Cependant, l'inconvénient majeur est ici que le squalène
en est extrait en très faibles quantités, de l'ordre de 0,1 à
0,7 % en poids, et nécessite de nombreuses étapes de
purification lourdes et couteuses.
En seconde alternative, de premiers procédés de
production de squalène ont été proposés à partir de
CA 0286 9M8 2014-1()-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
microorganismes, plus particulièrement à partir de levures
naturelles ou levures recombinantes, notamment de type
Saccharomyces.
C'est ainsi que Saccharomyces cerevisiae est connue pour
sa capacité à produire du squalène, toutefois en très faible
quantité : de l'ordre de 0,041 mg/g de biomasse (BHATTACHARJEE,
P. et al, 2001, dans World J. Microb. alotechnol., 17, pp 811-
816).
L'optimisation de ces capacités de production a donc été
travaillée, par le biais de la recombinaison génétique.
Cependant, comme le présente la demande de brevet
WO 2010/023551 pour le domaine médical (production de squalène
d'une pureté supérieure à 97 % comme adjuvant de vaccins), cette
première alternative n'est industrialisable que si l'on peut
disposer de levures recombinantes hyperproductrices de squalène
(à plus de 15 % en poids de cellules sèches).
Or, l'obtention de ces cellules recombinantes nécessite
la mise en uvre de nombreuses étapes lourdes, longues et
complexes d'ingénierie métabolique, par la mise en uvre
d'outils de biologie moléculaire, conduisant à la stimulation
des voies de biosynthèse du squalène et à l'inhibition des voies
du catabolisme du squalène.
En effet, comme le rappelle d'ailleurs ladite demande de
brevet WO 2010/023551, les gènes impliqués dans la biosynthèse
du squalène sont multiples : incluant la mévalonate kinase, la
phosphomevalonate kinase, la
pyrophosphomevalonate
décarboxylase, l'isopentenyl pyrophosphate isomérase, la HMGR
(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA réductase), et la squalène
synthétase.
Pour les voies du catabolisme, les gènes codant pour de
nombreuses enzymes impliquées dans la conversion du squalène en
ergostérol incluant la squalène époxidase (ERG1), la lanostérol
synthétase, la C14-diméthylase, la d14-réductase, la C4-
méthyloxidase, la 04-décarboxylase (ERG26), la 3-cétoréductase,
la C24-méthyltransférase, la 08-isomérase, la C5-désaturase, la
d22-désaturase et la d24-réductase.
Par ailleurs, d'autres enzymes du catabolisme doivent
être également considérées : la LEU2 ([beta]-isopropylmalate
CA 0286 9M8 2014-1()-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
déshydrogénase), l'oxydosqualène cyclase, la zymostérol-24-
méthyltransférase et
l'ergosta-5,7,24(28)-triéno1-22-
déshydrogénase.
En troisième alternative aux procédés d'extraction à
5 partir de foies de requins, ont été proposés des procédés
prometteurs de production de squalène à partir de microalgues
notamment de la famille des Thraustochytriales (comprenant les
genres Thraustochytrium, Aurantiochytrium et Schizochytrium),
plus particulièrement Schizochytrium mangrovei ou Schizochytrium
limacinum.
Ces microalgues produisent par ailleurs du squalène en
conditions hétérotrophiques (absence de lumière ; apport de
glucose comme source carbonée), et peuvent donc être manipulées
aisément par l'homme du métier du domaine de la fermentation des
microorganismes.
Chez ces microalgues de la famille des
Thraustochytriales, le squalène est cependant le coproduit
d'autres composés lipidiques d'intérêt, tel l'acide
docosahexaénoïque (ou DHA), acide gras polyinsaturé de la
famille des 03.
Il apparaît ainsi que le squalène est surtout décrit
comme l'un des composants de la fraction insaponifiable des
huiles commerciales de DHA (à côté des caroténoïdes et des
stérols).
A titre de comparaison, la souche de Schizochytrium
mangrovei F31 produit du DHA à raison de 6,2 % en poids sec de
cellules, pour 0,017 % de squalène.
De ce fait, ces microorganismes qui produisent
naturellement du squalène le font en faibles quantités :
de l'ordre de 0,1 mg/g de biomasse, pour
Thraustochytrid ACEM 6063 (cf. LEWIS et al, Mar. Biotechnol.,
2001, pp 439-447),
- de l'ordre de 0,162 mg/g de biomasse, pour
Schizochytrium mangrovei FB1 (cf. JIANG et al, J. Agric. Food
Chem., 2004, 52, pp 1196-1200)
Toutefois, par l'optimisation des
productions
fermentaires, les spécialistes du domaine sont parvenus à
produire de l'ordre de :
CA 0286 9M8 2014-1()-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
6
- 1 mg à 1,2 mg de squalène par g de biomasse de
Thraustochytride ACEM 6063 (cf. QIAN Li et al, J. Agric. Food
Cher., 2009, 57, 4267-4272 ou LEWIS et al, dans Mar.
Biotechnol., 2001, 3, 439-447).
- 0,72 mg de squalène par g de biomasse de Schizochytrium
(cf. G. CHEN et al, New Biotechnology, 2010, 27-4, pp 382-369).
- 0,53 mg de squalène par g de biomasse
d'Aurantiochytrium mangrovei FB31 (cf. K. W. FAN et al, World J.
Microbiol. Blotechnol., 2010, 26-3, pp 1303-1309)
- 1,17 0,6 mg de squalène par g de biomasse de
Schizochytrium mangrovei (cf. C-J YUE et Y. JIANG, Process
Biochemisty, 2009, 44, 923-927).
La société demanderesse a elle aussi contribué à
améliorer encore la production de squalène par des microalgues
de la famille des Thraustochytriales sp. en proposant un procédé
permettant de produire le squalène à un niveau encore jamais
atteint dans la littérature du domaine, i.e. d'au moins 8 g de
squalène pour 100 g de biomasse (dans ses demandes de brevet
françaises en cours d'examen).
Ainsi, si les microalgues de la famille des
Thraustochytriales sp. permettent désormais de produire du
squalène en quantité appréciable, il est cependant encore
nécessaire de le raffiner pour répondre aux besoins
alimentaires, cosmétiques et surtout médicaux.
Un certain nombre de procédés de purification du squalène
sont proposés dans la littérature, ces procédés étant adaptés
cependant par l'homme du métier aux sources classiques de
production du squalène (animale, végétale ou microorganisme de
type levure).
Quatre technologies principales sont généralement mises
en uvre, seule ou en combinaison :
- la cristallisation,
- la chromatographie,
- la distillation ou
- l'extraction à l'aide de fluide supercritique (tel le
CO2 supercritique).
Comme il sera présenté ci-après, les deux dernières
technologies sont celles les plus souvent rencontrées.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
Pour la purification du squalène d'origine végétale, il
est par exemple revendiqué, dans la demande de brevet
US 2003/130532, un procédé d'extraction des insaponifiables
d'une huile végétale comprenant au moins une étape de
saponification par laquelle ladite huile est transformée en une
solution hydro-alcoolique, une étape d'extraction à contre
courant de la solution hydro-alcoolique par un solvant organique
tel que le chloro-1-butane, une étape de cristallisation des
stérols et/ou des alcools triterpéniques coproduits et enfin
l'isolement du squalène par distillation.
De préférence, l'huile végétale traitée est une huile
d'avocat ou de soja.
Dans la demande de brevet internationale WO 2010/004193,
également à partir de végétaux, pour éviter l'usage de solvants
organiques, il est par exemple décrit un procédé global
d'extraction des stérols, vitamine E, squalène et autres
hydrocarbures à partir des distillats de désodorisation d'huiles
végétales.
Après une estérification des acides gras libres, puis une
transesterification des acides gras combinés (glycérides et
stérides) par le même alcool court , trois distillations
successives permettent de récupérer successivement : les
hydrocarbures, puis les esters d'alkyle, et enfin les esters
d'alkyle les plus lourds avec le squalène.
Le troisième distillat sert ainsi à la production de
squalène qui sera isolé d'une première fraction, avec une
deuxième fraction d'hydrocarbures résiduels.
Le résidu de la troisième distillation servira à la
production des stérols et vitamine E.
Le procédé permet donc d'extraire chacun des quatre
insaponifiables sans aucun solvant d'origine pétrolière et de
revendiquer les labels de produits obtenus par des procédés
physiques et chimiques naturels.
Mais comme énoncé plus haut, ces procédés d'extraction du
squalène végétal restent des procédés difficilement
extrapolables à l'échelle industrielle, soit par la mise en
uvre de solvants toxiques, soit par un prix peu attractif.
CA 0286 9M8 20110-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
8
Quant aux procédés permettant la purification du squalène
produit par des microorganismes de type S. cerevisiae, ils
mettent classiquement en uvre des méthodes d'extraction par
solvant.
Une première étape d'extraction est généralement réalisée
au méthanol/chloroforme (2:1) sur les lipides récupérés après
lyse cellulaire, suivie d'une étape de chromatographie.
L'extraction par le CO2 supercritique est quant à elle
souvent préférée pour minimiser l'utilisation de solvants
organiques, comme le présente par exemple l'article de
BHATTACHARJEE et SINGHAL, dans World Journal of Microbiology and
Biotechnology, 2003, 19-6, pp 605-608.
On compte également de nombreux articles ou brevets
décrivant la mise en uvre de cette technologie pour extraire
surtout le squalène d'origine végétale (telles les demandes de
brevet JP 2005/087998 à partir d'huile de palme, ou US
2004/0015033 à partir d'huile d'olive).
Dans la demande de brevet internationale WO 94/026683, il
est présenté un procédé et un dispositif permettant de produire
du squalène à partir de résidus d'huile d'olive.
Ce procédé comprend les quatre étapes suivantes :
saponification, craquage, estérification des acides gras et
extraction par fluide supercritique.
Pour l'extraction par fluide supercritique, on utilise
cependant un produit préalablement estérifié avec des
catalyseurs métalliques qui est ensuite pulvérisé dans une tour
d'extraction haute pression munie de zones à températures
variables.
Ces procédés et dispositifs permettent d'obtenir du
squalène commercialisable d'une pureté de plus de 90%, mais sont
difficilement extrapolables à l'échelle industrielle à des coûts
attractifs.
Très peu de documents décrivent les modes préférentiels
de raffinage du squalène produit par des microalgues.
On peut trouver par exemple l'article scientifique de LU
et al, publié dans Journal of Chromatography, 2003, 994, 37-43,
qui vante les mérites de la chromatographie à haute vitesse et à
9
contre courant pour la séparation préparative et la purification du
squalène produit par Thraustochytrium ATCC 26185.
Selon ces auteurs, cette technologie a le mérite de proposer
une méthode bien plus efficace que la CLHP 5 (chromatographie Liquide
haute Pression) plus classique, car elle propose une partition
chromatographique unique liquide/liquide sans support solide (et donc
sans perte de matière par adsorption irréversible sur ledit support
solide).
Cependant, comme il est détaillé dans cet article, ce procédé
n'est envisageable qu'a l'échelle du laboratoire, et nécessite encore
une étape préalable d'extraction au méthanol/chloroforme.
Dans l'état de l'art, quelques travaux préliminaires
d'extraction par fluide supercritique ont été entrepris sur
Botryococcus braunii, Scenedesmus obliquus ou Torulaspora
delbrueckii.
Cependant, les conditions opératoires préconisées sont
également difficilement transposables à l'échelle industrielle. A la
connaissance de la société Demanderesse, aucun procédé efficace et
industrialisable de raffinage du squalène produit à partir de
microalgues, à l'aide de technologie de type fluide supercritique ou
distillation moléculaire, n'est réellement accessible à l'homme du
métier.
Soucieuse de mettre au point un procédé efficace de raffinage
du squalène produit par microalgues, la société Demanderesse a
développé ses propres recherches et a réussi adapter les technologies
d'extraction par fluide supercritique et de distillation moléculaire
de manière à garantir une richesse en squalène à plus de 95% de
préférence de plus de 97 % voire de l'ordre de 100 %.
Ce niveau de pureté permet l'utilisation du squalène ainsi
obtenu non seulement dans les domaines médicaux, mais permet
d'envisager également son hydrogénation aisée en squalane pour les
applications cosmétiques.
CA 2869358 2019-09-24
10
La présente invention est donc relative à un procédé de
préparation d'une composition de haute richesse en squalène produit
par fermentation de microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend
une étape de purification choisie dans le groupe constitué de
l'extraction par CO2 supercritique sur colonne de fractionnement
multiétagée fonctionnant à contre-courant avec reflux d'extrait, et
de la distillation moléculaire dite de court trajet .
La présente invention est aussi relative à un procédé de
préparation d'une composition à haute richesse en squalène produit
par fermentation de microorganismes, qui comprend :
1) une étape de préparation d'une biomasse de microalgues
appartenant à la famille des Thraustochytriales sp.,
2) une étape de traitement de la biomasse de manière à obtenir
une huile brute contenant au moins 10 % en poids de squalène et
3) une étape de purification choisie dans le groupe constitué
de l'extraction par CO2 supercritique sur colonne de fractionnement
multiétagée fonctionnant à contre-courant avec reflux d'extrait, et
de la distillation moléculaire dite de court trajet .
Les microorganismes sont préférentiellement des microalgues
appartenant à la famille des Thraustochytriales sp., plus
préférentiellement encore des microalgues appartenant aux espèces
Schizochytrium sp., Aurantiochytrium sp. et Thraustochytrium sp.
Au sens de l'invention, on entend par composition de haute
richesse en squalène , une composition présentant une richesse en
squalène de plus de 95% en poids, de préférence de plus de 97% en
poids, plus préférentiellement encore de l'ordre de 100% en poids.
Mise en uvre de deux étapes successives d'extraction par CO2
supercritique.
Dans ce premier mode préférentiel de réalisation du procédé
conforme à l'invention, on met en uvre un procédé caractérisé en ce
qu'il comprend les étapes suivantes :
1) préparer une biomasse de microalgues appartenant à la
famille des Thraustochytriales,
CA 2869358 2019-09-24
10a
2) traiter la biomasse de manière à obtenir une huile brute
contenant au moins 10% en poids de squalène, de préférence au moins
15 % en poids de squalène,
3) fractionner l'huile brute ainsi obtenue par contact avec un
fluide à pression supercritique sur colonne de fractionnement
multiétagee fonctionnant à contre-courant avec reflux d'extrait de
manière à produire un extrait présentant une richesse en squalène
compris entre 70 et 75 % et un raffinat présentant moins de 1,5% de
squalene,
4) mettre en contact l'extrait ainsi obtenu avec un fluide à
pression supercritique sur la même colonne de fractionnement
multiétagée fonctionnant à contre-courant avec reflux d'extrait que
celle de l'étape 3) de manière à obtenir une teneur en squalène
comprise entre 95 et 99 % en poids,
5) recueillir la composition de squalène ainsi obtenue.
CA 2869358 2019-09-24
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
11
La première étape de ce premier mode préférentiel
consiste à préparer une biomasse de microalgues appartenant à la
famille des Thraustochytriales.
Comme microalgues appartenant à la famille des
Thraustochytriales, les souches commercialisées suivantes sont
par exemple disponibles :
- Schizochytrium sp. référencée ATCC 20888,
- Aurantiochytrium sp. référencée ATCC PRA 276,
Par ailleurs, la société Demanderesse dispose également
de sa propre souche de production, une Schizochytrium sp.
déposée le 14 avril 2011 en France auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur
sous le n CNCM 1-4469 et également déposée en Chine auprès du
CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION de l'université de
Wuhan, Wuhan 430072, P.R. China sous le n M 209118.
La culture est réalisée en conditions hétérotrophiques.
Généralement, l'étape de culture comprend une étape de
préculture, pour revivifier la souche, puis une étape de culture
ou de fermentation proprement dite. Cette dernière étape
correspond à l'étape de production des composés lipidiques
d'intérêt.
Les conditions de culture de ces microalgues sont bien
connues dans le domaine.
Par exemple dans l'article de G. CHEN dans New
Biotechnology, 2010, 27-4, pp 382-389, on trouve un procédé
comprenant les étapes successives suivantes :
- partir de la souche maintenue sur milieu nutritif
gélosée comprenant du glucose, du glutamate monosodique, de
l'extrait de levures et des oligoéléments divers,
- réaliser une préculture en Erlenmeyers sur agitateur
orbital, à un pH de 6, à une température de 25 C afin d'obtenir
une biomasse revivifiée,
- ensemencer une autre série d'Erlenmeyers de production,
avec le même milieu de culture que celui utilisé en préculture,
avec d'environ 0,5 % (v/v) de la biomasse obtenue à l'étape
précédente, et maintenir la température à 25 C.
La seconde étape de ce premier mode préférentiel consiste
à traiter
la biomasse de manière à obtenir une huile brute
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
12
contenant au moins 10 % en poids de squalène, de préférence au
moins 15 % en poids de squalène.
Ces traitements peuvent être réalisés par toute méthode
connue par ailleurs de l'homme du métier, et la richesse de
squalène d'au moins 10 % en poids peut être obtenue à partir de
la souche CNCM 1-4469 décrite ci-dessus.
Comme il sera exemplifié ci-après, la société
Demanderesse recommande :
- d'ajuster la biomasse à une matière sèche comprise
entre 6 et 12 %, de préférence à une matière sèche
comprise entre 10 et 12 % avec de l'eau déminéralisée,
- de traiter la biomasse ainsi obtenue à l'aide d'une
enzyme de type alcalase de manière à rompre la paroi
cellulaire desdites microalgues,
- d'ajouter de l'éthanol à plus de 5 % (v/v), de
préférence d'environ 10 % (v/v) dans le mélange
réactionnel (forme émulsion huile dans eau)
- de centrifuger le mélange réactionnel ainsi obtenu
afin de séparer l'huile de la phase aqueuse,
- de récupérer la phase supérieure huileuse enrichie en
squalène.
Cet enrichissement s'entend d'une teneur en squalène d'au
moins 10 % en poids, de préférence d'au moins 15 % en poids.
La troisième étape de ce premier mode préférentiel
consiste à fractionner l'huile brute ainsi obtenue par contact
avec un fluide à pression supercritique sur colonne de
fractionnement multiétagée fonctionnant à contre-courant avec
reflux d'extrait de manière à produire un extrait présentant une
richesse en squalène compris entre 70 et 75 % et un raffinat
présentant moins de 1,5 % de squalène
A la connaissance de la société Demanderesse, cette
conduite particulière d'extraction du squalène, à l'aide d'une
colonne de fractionnement multiétagée fonctionnant à contre-
courant avec reflux d'extrait, n'a jamais été exploitée pour du
squalène produit par fermentation de microorganismes en général,
et pour des microorganismes de type microalgues appartenant à la
famille des Thraustochytriales en particulier.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
13
La société Demanderesse a ainsi tiré partie de la
différence importante de solubilité entre le squalène
(hydrocarbure non polaire) et les triglycérides constituant les
lipides de l'huile dans le dioxyde de carbone à pression
supercritique, le squalène étant beaucoup plus soluble que les
triglycérides.
Pour ce faire, la société Demanderesse a trouvé que
l'utilisation d'une colonne de fractionnement multiétagée
fonctionnant à contre-courant avec un reflux d'extrait, colonne
dotée d'un garnissage structuré, permettait d'atteindre de façon
inattendue le squalène à haute pureté avec un excellent
rendement par rapport à l'huile de départ.
Il est connu de l'homme de l'art que l'extraction par un
fluide à pression supercritique conduit à des extraits de très
grande qualité.
L'un des avantages principaux des procédés mettant en
uvre les fluides à pression supercritique réside dans la
facilité de réaliser la séparation entre le solvant (le fluide)
et les extraits et solutés, ainsi qu'il a été décrit dans de
nombreuses publications et, pour certains aspects importants de
mise en uvre, dans le brevet français FR 2584618.
L'un des autres avantages importants des fluides
supercritiques réside dans leur sélectivité adaptable vis-à-
vis des composants d'un mélange.
Cette très haute sélectivité est liée aux propriétés
particulières des fluides supercritiques, et particulièrement de
celles du dioxyde de carbone à pression supercritique : Le
pouvoir solvant peut être finement réglé en jouant sur la
pression et la température du fluide.
La société Demanderesse a vérifié que des conditions
douces sont les plus sélectives car le solvant est d'autant
plus sélectif que son pouvoir solvant est plus faible.
La société Demanderesse recommande ainsi d'utiliser
préférentiellement le dioxyde de carbone pur, plutôt
qu'additionné de co-solvant qui augmenterait son pouvoir
solvant.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
14
Il est choisi également une pression d'opération comprise
entre 10 et 50 MPa, préférentiellement comprise entre 15 et 25
MPa, et une température comprise entre 40 et 8000.
Le fluide à pression supercritique est pompé à haute
pression par une pompe et porté à la température souhaitée dans
un échangeur de chaleur avant d'être injecté en pied de colonne
à un débit maintenu constant et affiché sur un débitmètre
massique.
La charge est injectée via une pompe haute pression au
milieu de la colonne dotée d'un garnissage structuré, entre les
sections 1 et 2, ou 2 et 3, ou 3 et 4, comptées à partir du bas
de la colonne, à un débit maintenu constant et affiché sur un
débitmètre massique.
Le fluide chargé de l'extrait sort en tête de colonne
après quoi il est partiellement décomprimé vers 6 MPa et envoyé
vers plusieurs étages de séparation, comportant notamment des
séparateurs cycloniques montés en série, dont le corps est
réchauffé par circulation d'eau dans une double-enveloppe.
L'extrait liquide est récupéré en pied de ces séparateurs
tandis que le fluide à l'état gazeux est ensuite recyclé de
façon classique : condensation dans un condenseur refroidi vers
0 à 5 C, stockage intermédiaire dans un ballon tampon dont le
niveau de liquide est maintenu constant par alimentation en
fluide frais depuis un stockage extérieur, pompage à haute
pression et réchauffage à la température désirée.
Le raffinat est évacué en pied de colonne via une vanne
de détente pilotée par une sonde de niveau maintenant ainsi
l'interface huile-fluide dans la partie inférieure de la
colonne ; afin d'éviter des à-coups de pression préjudiciables
au fractionnement dans la colonne, ce raffinat est recueilli
dans deux récipients-décanteurs en série, la pression dans le
premier étant maintenue à une valeur inférieure d'environ 1 à 4
MPa en-dessous de la pression régnant dans la colonne.
Ces récipients permettent ainsi le soutirage du raffinat
sans à-coups avec des pertes minimales de fluide dissous dans le
raffinat.
Comme l'a montré la société Demanderesse, la mise en
uvre d'un contact multiétagé à contre-courant du fluide de
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
séparation et de la charge liquide permet de tirer parti au
mieux de cette sélectivité du fluide utilisé.
Par ailleurs, le reflux d'extrait contribue notablement à
l'amélioration de la sélectivité globale de l'opération de
5 fractionnement.
Le reflux d'extrait est ici provoqué et est soigneusement
contrôlé par l'établissement d'un gradient thermique le long de
la colonne lorsque le diamètre de celle-ci permet un bon
transfert de chaleur aux parois, entre d'une part le fluide en
10 contact avec la charge et d'autre part, l'eau chaude circulant
dans la double-enveloppe divisée en plusieurs sections
indépendantes pour permettre la mise en uvre de ce gradient.
En effet, la solubilité de la plupart des composés
organiques dans le dioxyde de carbone à pression supercritique,
15 fixée dans une zone allant de la pression critique (soit 7,4
MPa) à 30 MPa, diminue lorsque la température augmente ; ainsi,
quand le fluide monte dans la colonne à contre-courant de
l'huile, on peut le réchauffer et provoquer ainsi la démixion
d'une partie de l'extrait et son reflux en mélange avec l'huile.
Si l'on utilise des colonnes de diamètre supérieur à
200 mm, le transfert de chaleur aux parois devient insuffisant
et il est préférable de mettre en uvre un reflux externe
d'extrait, une partie de l'extrait étant séparé en tête de
colonne par décompression partielle du fluide sortant de la
colonne, cette fraction d'extrait liquide étant alors
recomprimée par une pompe et injectée en tête de colonne.
Par ailleurs, les fluides à pression supercritique
présentent d'excellentes propriétés de transfert de chaleur et
de matière, bien supérieures à celles des liquides, contribuant
à l'excellente sélectivité observée.
La quatrième étape de ce premier mode préférentiel
consiste à mettre en contact l'extrait ainsi obtenu avec un
fluide à pression supercritique sur la même colonne de
fractionnement multiétagée fonctionnant à contre-courant avec
reflux d'extrait que celle de l'étape 3) de manière à obtenir
une teneur en squalène comprise entre 95 et 99 % en poids.
Cette étape d'enrichissement en squalène est conduite
dans des conditions similaires à celles de l'étape précédente,
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
16
mais dans des conditions de pression et de températures
légèrement différentes.
Il est ainsi choisi une pression d'opération comprise
entre 10 et 30 MPa, de préférence ici comprise entre 10 et 20
MPa, et des températures comprises entre 40 et 80 C.
La cinquième étape de ce premier mode préférentiel
consiste enfin à recueillir la composition de squalène ainsi
obtenue.
Comme il sera exemplifié ci-après, la composition ainsi
purifiée peut contenir une teneur en squalène supérieure ou
égale à 97 %.
Mise en uvre de la distillation moléculaire.
Dans un second mode préférentiel de réalisation du
procédé conforme à l'invention, on met en uvre un procédé
caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
1) préparer une biomasse de microalgues appartenant à la
famille des Thraustochytriales,
2) traiter la biomasse de manière à obtenir une huile
brute contenant au moins 10 % en poids de squalène, de
préférence au moins 15 % en poids de squalène,
3) éventuellement raffiner l'huile brute ainsi obtenue
par un enchaînement d'étapes de dégommage, désacidification,
décoloration et désodorisation,
4) extraire le squalène par distillation moléculaire dite
de "court trajet" de manière à obtenir une fraction légère
présentant une teneur en squalène supérieure à 60 % en poids, de
préférence supérieure à 80 % en poids,
5) raffiner cette fraction légère par un enchaînement
d'étapes de saponification, séparation biphasique, lavage,
décoloration et désodorisation, de manière à obtenir un raffinat
présentant une teneur en squalène comprise entre 95 et 100 %,
6) recueillir la composition de squalène ainsi obtenue.
La première et seconde étape de ce second mode
préférentiel du procédé conforme à l'invention sont identiques à
la première et à la seconde étape du premier mode préférentiel
présenté ci-avant.
L'huile brute ainsi obtenue est constituée de glycérides
(triglycérides majoritaire), d'insaponifiables
(squalène
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
17
majoritaire) et éventuellement d'acides gras libres et de
phospholipides en proportions moindres.
Cette huile brute peut préalablement subir un raffinage
grossier avant son extraction du squalène par distillation
moléculaire.
Une ou plusieurs des étapes suivantes peuvent être
envisagées :
- Dégommage : qui permet l'élimination des phopholipides
par précipitation en milieu acide ;
- Désacidification : qui assure la neutralisation des
acides gras libres par l'emploi d'une base ;
- Décoloration : classiquement mise en uvre par charbon
actif ;
- Désodorisation : par distillation sous vide, dite
"stripping" vapeur.
Ces étapes de raffinage sont les étapes couramment
utilisées en raffinage d'huile végétale.
La quatrième étape de ce second mode préférentiel du
procédé conforme à l'invention consiste à extraire le squalène
par distillation moléculaire dite de "court trajet" de manière à
obtenir une fraction légère présentant une teneur en squalène
supérieure à 60 % en poids, de préférence supérieure à 80 % en
poids.
Le squalène de l'huile brute éventuellement raffinée est
extrait par distillation moléculaire.
Pour un vide poussé, inférieur à 0,1 mbar, le point
d'ébullition du squalène est de l'ordre de 200 C.
Ce vide poussé permet de limiter la température et ainsi
limiter les risques de dégradation/polymérisation du squalène.
De plus, le temps de séjour est maintenu très faible,
inférieur à une minute.
Dans ce barème pression-température-durée de contact, la
fraction triglycérides (haute masse moléculaire) n'est pas
volatile.
Ainsi, la société Demanderesse a trouvé que dans ces
conditions, la distillation moléculaire dite de "court trajet"
est une technologie particulièrement appropriée à la séparation
de ces deux fractions majoritaires triglycérides et squalène.
CA 0286 9M8 2014-1()-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
18
Les conditions opératoires recommandées par la société
Demanderesse sont les suivantes.
A partir du réservoir d'alimentation inerte à l'azote,
l'huile est pompée à travers un premier circuit thermostaté dans
une gamme de 25 à 100 C vers le dégazeur (élimination des traces
d'eau et solvant).
En sortie du dégazeur l'huile est pompée dans la chambre
d'évaporation ("court trajet") à travers un circuit thermostaté
dans une gamme de température de 50 à 150 C.
La température de l'évaporateur est ajustée dans une
gamme de 150 à 250 C.
Le condenseur est réglé dans une gamme de température de
0 à 50 C.
La pression dans la chambre d'évaporation est ajustée
dans une gamme de 10-2 à 10-4 mbar.
Le distillat contenant majoritairement le squalène et le
résidu contenant majoritairement les triglycérides sont
acheminés via les circuits de collecte vers les cuves de
stockage inertées.
La teneur en squalène dans la fraction légère du
distillat est supérieure à 60 % en poids, de préférence
supérieure à 80 % en poids.
La cinquième étape de ce second mode préférentiel du
procédé conforme à l'invention consiste à raffiner cette
fraction légère par un enchaînement d'étapes de saponification,
séparation biphasique, lavage, décoloration et désodorisation,
de manière à obtenir un raffinat présentant une teneur en
squalène comprise entre 95 et 100 %.
La saponification est effectuée préalablement afin
d'hydrolyser les glycérides résiduels éventuellement entraînés
au cours de la distillation mais également d'hydrolyser les
stérols estérifiés.
Ces derniers, alors sous forme libres (plus polaires)
seront plus facilement éliminés au cours des étapes suivantes.
La saponification est réalisée à la potasse éthanolique à
une température d'environ 80 C sur une durée de 0,5 à 2h.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
19
Après refroidissement, les deux phases du mélange issues
de la saponification peuvent être alors séparées par décantation
ou centrifugation.
Une émulsification est susceptible de complexifier la
séparation, un ajout d'eau peut alors faciliter la séparation.
La phase éthanolique concentre les acides gras libres
mais également une partie des impuretés polaires générées. La
phase huile concentre le squalène.
La phase squalène séparée après saponification est lavée
à l'eau.
Plusieurs lavages successifs peuvent être réalisés.
Une eau basique (potassée ou sodée) peut être utilisée
pour entrainer les impuretés de saponification résiduelles lors
du/des premier(s) cycles(s) de lavage.
Le lavage se termine lorsque que le surnageant issu du
lavage à l'eau est à pH neutre.
Entre chaque cycle, les phases (eau de lavage et
squalène) sont séparées par décantation ou centrifugation.
A ce stade, la fraction squalène est purifiée d'une
partie des stérols ainsi que des glycérides (mono-di-
triglycérides) résiduels.
Une étape supplémentaire de décoloration peut être
réalisée à ce stade afin de réduire la coloration jaunâtre.
Cette étape de décoloration est effectuée sur charbon
actif de façon similaire à la décoloration classiquement
utilisée en raffinage d'huile végétale.
Le raffinage de la fraction squalène se termine par une
étape de désodorisation.
La désodorisation est réalisée par "stripping" vapeur
sous vide à chaud (150 - 200 C) sur une durée de 0,5 à lh.
Le squalène ainsi purifié est stocké sous atmosphère
contrôlée (inertée à l'azote idéalement).
Un ajout d'antioxydants peut être favorable à la
stabilisation de cette fraction.
L'invention concerne également l'utilisation d'une
composition de squalène obtenue par la mise en uvre d'un
procédé selon l'invention, dans les domaines cosmétique,
pharmaceutique et médical.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
L'Invention concerne en outre un procédé de préparation
d'une composition enrichie en squalane par hydrogénation de la
composition de squalène de haute pureté obtenue par la mise en
uvre d'un procédé selon l'invention, ainsi que l'utilisation de
5 cette composition de squalane dans le domaine cosmétique.
L'Invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui
suivent, lesquels se veulent illustratlfs et non limitatifs.
Exemple 1. Préparation d'une huile contenant au moins
10 10 % en poids de squalène par fermentation d'une microalgue
appartenant à la famille des Thraustochytriales, en fermenteur
de 20 1
Cet exemple illustre le procédé d'extraction d'une huile
15 enrichie en squalène produite par fermentation de la microalgue
Schizochytrium sp. appartenant à la société Demanderesse
(déposée le 14 avril 2011 en France auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur
sous le n'CNCM 1-4469).
20 La fermentation a été conduite ici en deux phases de
préculture successives préalables avant la phase de culture /
production proprement dite en réacteur de 20 1.
Pour cette expérimentation, l'ajout des vitamines a été
assuré dans le premier milieu de préculture, mais a été
optionnel dans le second milieu de préculture et en production.
Les milieux de préculture présentaient alors la
composition présentée dans les tableaux I et II suivants :
Tableau I
Milieu de la première préculture
Glucose 3
Extraits de levure 0,4
Glutamate de sodium 6,42
Na Cl 1,25
MgSO4 0,4
KC1 0,05
CaCl2 0,01
NaHCO3 0,05
KH2PO4 0,4
Mélange vitamines 0,14
Oligo-éléments 0,8
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
21
Tableau II
Milieu de la seconde préculture
Glucose 8,57
Glutamate de sodium 6,42
Extraits de levure 0,64
Na Cl 2
KH2PO4 0,64
MgSO4 2,29
CaCl2 0,03
NaHCO3 0,03
Na2 SO4 0,03
Mélange de vitamines 0,14
Oligo-éléments 0,2
D'une manière générale on a utilisé de l'anti-mousse
Clerol FBA3107 à 1 m1/1. Eventuellement on a utilisé 50 mg/1
de Pénicilline G "sodium sait" afin d'éviter la croissance de
bactéries contaminantes.
Le glucose a été stérilisé avec le KH2PO4 et séparément du
reste du milieu car on a
évité ainsi la formation d'un
précipité (Ammonium-Phosphate-Magnésium). Le mélange des
vitamines et les oligo-éléments ont été ajoutés après filtration
stérilisante. La composition du milieu de culture / production
est donné par le tableau III suivant.
Tableau III
Glucose Ajout à TO 7,5
Urée 1
Extraits de levure 1,2
Na Cl 0,25
KH2004 0,96
MgSO4 1,2
CaCl2 0,12
NaHCO3 0,12
KCL 0,08
Ajout du mélange de vitamines 0,4
Oligo-éléments 0,56
La composition des mélanges de vitamines et des
oligoéléments est donnée dans les tableaux IV et V suivants :
Tableau IV
Mélange vitamines g/L
B1 45
B6 45
B12 0.25
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
22
Tableau V
Oligo-éléments g/L
1\411C12 2h20 8.60
CoC12 6H20 0.2
NiSO4 6H20 7.50
Na2Mo04 2H20 0.15
ZnSO4 7H20 5.70
Cu 0o4 5h20 6.50
FeSO4 7 H20 32.00
ZnC12 1.50
Conditions de précultures
La première préculture a été réalisée en Erlenmeyers de
500 ml munis de baffles, dans lesquels on a ajouté une goutte
d'antimousse CLEAROL FBA 3107 commercialisé par la société
COGNIS GmbH Dusseldorf.
Le milieu de culture a été filtré après dissolution
complète de ses constituants, complété éventuellement avec de la
pénicilline G "sodium sait" à raison de 0,25 mg/l.
L'Inoculation a été réalisée par prélèvement de colonies
de microalgues cultivées en boîte de Pétri (à raison d'une oese
de 10 pl).
L'Incubation a duré 24 à 36 heures, à une température de
28 C, sous agitation à 100 rpm (sur agitateur orbital).
La biomasse décantant (ou adhérant à la paroi), on a pris
bien soin de prélever 3 à 5 ml après avoir bien agité
l'Erlenmeyer.
Pour la seconde préculture, on a utilisé des Erlenmeyers
de 2 1, muni de baffles et de tuyauterie.
On a ajouté une goutte d'antimousse et l'extrait de
levures dans 100 ml d'eau.
L'ensemble des constituants du milieu a été filtré après
dissolution dans 300 ml d'eau déminéralisée. On pouvait
éventuellement ajouter de la pénicilline G "sodium salt" et au
préalable dans l'Erlenmeyer une goutte d'antimousse avant sa
stérilisation.
L'ensemencement s'est fait ensuite avec 3 à 5 ml de la
première préculture.
L'Incubation a été réalisée à 28 C pendant encore 24 à 36
heures, sous agitation à 100 rpm.
CA 02869358 2014-10-02
23
Production en réacteur de 20 1
La culture proprement dite a été réalisée de la manière
suivante en réacteur de 20 1.
- stérilisation du milieu pour partie dans le réacteur,
et séparément pour l'autre partie de manière à éviter
la formation d'un précipité,
- ensemencement réalisé à partir de la biomasse produite
en fin de seconde préculture à raison de 0,5 % v/v du
milieu de culture,
- culture maintenue à 30 C
- taux de transfert d'oxygène fixé à 35 - 40 mmoles/l/h,
- aération de 0,2 à 0,3 VVM,
- pH initial > 5,5.
- alimentation du glucose dès que la concentration est >
20 %, de manière à maintenir une concentration en
glucose comprise entre 15 et 70 g/1.
Le tableau VI suivant présente les résultats obtenus la
Schizochytrium sp. de la société Demanderesse.
Tableau VI :
Essais
Température des précultures
28
( C)
Température de culture
(C)
Titre en squalène en fin de
4,4
culture (g/1)
Biomasse (g/1) 54
g/ 10C g de squalène sur
8,2
biomasse sèche
Récupération de la biomasse
La biomasse extraite du fermenteur et lavée des solubles
interstitiels par succession de deux séries de concentration par
centrifugation (5 minutes à 5000 g) et dilution de la biomasse
(à raison de 1/3 Vculot / Veau).
La concentration cellulaire sèche sur la matière sèche
brute totale est de 95 %.
La matière sèche est ensuite ajustée à 12 % avec de l'eau
distillée.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720
PCT/FR2013/050812
24
Obtention de l'huile brute enrichie en squalène
La biomasse lavée est agitée dans un réacteur labo de
type Fermenteur 2 1 (tel que ceux commercialisés par la société
Interscience) équipé avec une hélice marine et chicanes.
Ce système permet de limiter l'émulsification du lysat
cellulaire généré tout en permettant un bon mélange
indispensable pour l'action de l'enzyme lytique.
La température est ajustée à 60 C et le pH est régulé à
environ 8 avec de la soude.
Ces conditions sont optimales pour l'activité de l'enzyme
Alcalase (Novozymes) ajoutée à hauteur de 1%/sec.
La durée de la lyse est fixée à 4 h.
En fin de
lyse, on ajoute 10 % d'éthanol ( V..-thano I /Vlysat
dans le mélange réactionnel (émulsion huile dans eau) maintenue
15 min supplémentaires sous agitation.
Le lysat est centrifugé 5 minutes à 12000g. L'huile,
contenant le squalène, ayant déphasé en surface est ainsi
extraite.
Exemple 2 : Préparation d'une huile contenant au moins
10 % en poids de squalène par fermentation d'une microalgue
appartenant à la famille des Thraustochytriales, en fermenteur
de 1 m3
A partir d'une production effectuée dans un fermenteur de
1 m3 (conditions de fermentations similaires à celles de
l'exemple 1), la biomasse est extraite du fermenteur par une
pompe volumétrique SEEPEX alimentant une sédicanteur Flottweg
S3E.
La biomasse est de cette façon concentrée à 200 g/l.
Le concentrat est dilué dans une cuve 1 m3 avec de l'eau
décarbonatée (1 volume d'eau / volume de concentrât) puis
reconcentrée par la même opération que celle décrite
précédemment pour obtenir 620kg de biomasse lavée et concentrée
à 110 g/l.
La biomasse est maintenue sous agitation à 150 rpm dans
une cuve 1 m3, et est chauffée à 60 C.
Le pH est alors ajusté à 8 à la potasse 45 %.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
L'enzyme, l'Alcalase 2,4L FG de NOVO, est ajoutée à
hauteur de 1 % (/biomasse sèche). Les paramètres de lyse sont
maintenus pendant 6 h.
La qualité de la lyse est suivie au microscope optique et
5 par centrifugation d'échantillons (2 min, 10000 g).
En fin de lyse, 60 1 d'éthanol (-10 % vol/vol) sont
ajoutés dans la cuve maintenue à 60 C sous agitation.
De la même façon que dans l'exemple 1, La température est
ensuite relevée à 80 C et on centrifuge ensuite sur module de
10 centrifugation ALPHA LAVAL CLARA 20, configuré en mode
concentrateur à 3 sorties.
Cette configuration est particulièrement bien adaptée
pour la séparation d'un mélange triphasique de type
solide/liquide/liquide.
15 La mise en rotation à 9 600 tr/min permet d'atteindre
environ 10 000 g.
L'alimentation en lysat cellulaire est réalisée à l'aide
d'une pompe volumétrique à un débit de 100 à 400 1/h.
L'interface entre la phase lourde et la phase légère est
20 déplacée en réglant la contrepression en sortie phase lourde.
La fréquence d'autodébourbage est réglée sur une
fréquence de 2 à 15 min.
13 kg d'huile brute riche en squalène sont ainsi
récupérés avec un rendement de plus de 50 %.
Exemple 3 : Extraction du squalène par distillation
moléculaire
Une huile brute contenant 21,8 % de squalène est obtenue
par extraction à partir d'une biomasse de microalgues préparée
selon l'exemple 2.
A partir du réservoir d'alimentation inerte à l'azote,
8 kg d'huile sont pompés à 3,5 kg/h vers le dégazeur à une
température de 120 C.
En sortie du dégazeur, l'huile traverse la chambre
d'évaporation ("court trajet") à travers un circuit maintenu à
85 C. La température de l'évaporateur est ajustée à 220 C.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
26
Le condenseur est réglé sur une température de 20 C. Le
vide dans la chambre d'évaporation est poussé au maximum (< 10-3
mbar).
Le distillat contenant le squalène et le résidu contenant
les triglycérides sont acheminés via les circuits de collecte
vers les cuves de stockage inertées. A ce stade, environ 1,5 kg
de distillat et 6 kg de résidu sont récupérés.
La teneur en squalène (pourcentage massique issu d'une
analyse par RMN) dans le distillat est égale à 94 %.
La teneur en squalène du résidu est inférieure à 2 %.
La suite des opérations de raffinage est réalisée ici à
partir d'un échantillon de 10 g de squalène extrait par
distillation moléculaire comme décrit précédemment :
L'opération de saponification est effectuée en milieu
potassé (2N) en respectant le rapport 1/2 (mhuil,. Mpotasse
éthanolique) avec solvant éthanolique (rapport 9/1 (m
eLhanoirne,,) =
Le milieu de saponification est maintenu à 80 C en reflux
pendant 45 min.
La teneur en acide gras libre augmente ainsi de 0,29 à
3,1 (a
_,eq. acide oléique % ghuile) =
Ces acides gras libres proviennent en partie de
l'hydrolyse des stérols estérifiés.
Les deux phases du mélange de saponification
partiellement émulsifié sont séparées par centrifugation (10 min
à 25 000 g).
La phase huile extraite (squalène) est lavée à l'eau
légèrement potassée (rapport 3/1 (m.a.,/mhuil.).
Le lavage est répété à l'eau pure jusqu'à obtenir un
surnageant à pH neutre.
La séparation entre chaque étape de lavage est réalisée
par centrifugation 10 min à 25 000 g.
7 g de squalène sont obtenus à ce stade avec un rendement
de 7(r-,.
La fraction purifiée par saponification est décolorée au
charbon actif (5 %/huile) sous agitation puis, le charbon actif
est séparé par filtration à 0,2 pm.
L'étape finale de désodorisation est réalisée par
stripage vapeur à 180 C sous vide pendant 30 min.
CA 02869358 2014-10-02
WO 2013/156720 PCT/FR2013/050812
27
Le squalène purifié ainsi obtenu présente une pureté
proche de 98 %.
La résolution de l'analyse RMN ne permet pas d'obtenir
une valeur précise de pureté mais permet d'évaluer le taux
d'élimination des impuretés aux alentours de 75 %.
Exemple 4. Raffinage du squalène par la mise en uvre de
deux étapes successives d'extraction par CO2 supercritique
On a utilisé 200 litres d'huile renfermant plus de 15 %
de squalène produites à partir d'algues Schizochytrium cultivées
dans un fermenteur de 10 rlr' selon des conditions opératoires
voisines des exemples 1 et 2.
Cette huile contient plus particulièrement des
triglycérides principalement avec des acides gras :
- à chaînes courtes en C14, 016 pour 27%,
- à chaînes longues en 020 et surtout en 022 pour 43% et
à côté de cette quantité importante d'insaponifiables
essentiellement constitués de squalène (-15,5%).
L'objectif consiste à obtenir d'une part du squalène
purifié à plus de 95% et, d'autre part, une huile débarrassée de
squalène.
Le procédé de fractionnement mis en uvre selon
l'invention comprend donc deux étapes que l'on peut résumer
ainsi :
- Etape 1 : Fractionnement de l'huile brute par contact
avec un fluide à pression supercritique délivrant un extrait
riche en squalène et un raffinat débarrassé de squalène ;
- Etape 2 : Purification du squalène par fractionnement
de l'extrait obtenu à l'étape 1, par contact avec un fluide à
pression supercritique ;
Ce fractionnement repose sur la différence importante de
solubilité entre le squalène (hydrocarbure non polaire) et les
triglycérides constituant les lipides de l'huile, le squalène
étant beaucoup plus soluble que les triglycérides.
Les deux étapes de fractionnement sont opérées sur une
colonne de fractionnement à garnissage fonctionnant à contre-
courant avec reflux interne d'extrait.
CA 02869358 2014-10-02
28
L'unité de fractionnement mise en uvre est équipée d'une
colonne de fractionnement à contre-courant d'un diamètre
intérieur 125 mm et d'une hauteur de 8 m permettant d'établir un
gradient de température selon 4 sections de 2 m.
Cette colonne est remplie d'un garnissage haute
performance (type Sulzer BX). Cette unité est entièrement
automatisée et permet un fonctionnement en continu.
Etape 1 : Traitement de l'huile brute en vue d'extraire
le squalène
L'huile est introduite dans la colonne entre les sections
3 et 4, comptées en partant du bas de la colonne. Les paramètres
du procédé sont présentés dans le Tableau VII suivant.
Tableau VII
Purification du SQUALENE Etape 1
Pression (bar) 200
Température ( C) des 4
40/50/50/72
sections
Débit CO, (kg/h) 185
Débit charge (kg/h) 5
Taux de solvant (kgCO2/kg
37
huile)
Extrait
Fraction collectée
Raffinat
20%
(Extrait)
Fraction /Charge 80%
(Raffinat)
72%
Teneur en Squalène
(Extrait)
Le squalène est ainsi récupéré dans l'extrait avec une
concentration relativement élevée.
Le traitement de l'huile brute a permis l'extraction de
la plus grande partie du squalène.
Etape 2 : Purification du squalène :
Le fractionnement supercritique du squalène est conduit
une nouvelle fois dans des conditions similaires à celles
opérées sur l'huile brute, mais à des conditions de pression et
température légèrement différente comme indiqué sur le tableau
VIII suivant.
CA 02869358 2014-10-02
= ' =
29
Tableau VIII
Purification du SQUALENE
Etape 2
Pression (bar) 175
Température ( C) des 4
40/50/5C/72
sections
Débit CO2 (kg/h) 200
Débit charge (kg/h) 5
Taux de solvant (kgCO2/kg
huile)
Fraction collectée Extrait
Fraction /Charge 58%
Teneur en Squalène 97%
Ce procédé mettant en uvre deux étapes successives
d'extraction par CO, supercritique permet de garantir
5 l'obtention d'une composition d'une richesse en squalène de
97 %.
