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WO 2013/182921
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UTILISATION D'UNE CHAUFFERETTE POUR FAVORISER UNE REACTION
BIOLOGIQUE'
La présente invention concerne le domaine des trousSes de biologie.
moléculaire et cellulaire,. ainsi que celui des -trousses pour mettre en
oeuvre une réaction
Chimique nécessitant un apport modéré de chaleur. Elle a notamment-pour objet
des trousses
comprenant un moyen de chauffage. antonomeSimple et peucoûteux pour
traitettjes biopsies.
Depuis plusieurs années, là .greffe de cellules, en particulier de cellules
autôlogues, s'impose comme. un moyen efficace et .sécuritaire pour favoriser
la régénération
de tissus malades ou lésés. Certains protocoles thérapeutiques nécessitent. ià
prolifération
et/ou là modification des. cellules- ex vivo: avant réimplantation. D'autres
protocoles prévoient
essentiellement le prélèVement de cellules dans une partie :saine du tissu.
coi:lierne et leur
réimplantation quasi-imm.édiate au niveau dela lésion d traiter. Ceci est
notamment le cas des
protocoles pour le traitement de pathologies ou lésions cutanées: telles que
certaines brûlures
(d'étendue ne.= nécessitant pas d'expansion cellulaire),. les hypoebromies.
post-traumatiques et
postopératOires, .les dermatoses achromatiques, les cicatrices etc.. Dalle
.Ces prot0Coles, le
traitement des échantillons se résume essentiellement à une .dissociation plus
ou moins
poussée des cellules, suivie, le cas échéant, de la séparation de différents
types cellulaires
pour sélectionner les. cellules appropriées pour l'application .visée:
.(mélanocytes pour lés
dermatOses achromatiqties, par eXe.mple) et d'une -filtration pour éliminer
les agrégats. La
dissociation cellulaire est le plus souvent réalisée par incubation de
l'échantillon dans une
solution de trypsine. La température optimale pour ractivité de la trypsine
est de 37 C. A
cette température, et suivant la concentration d'enzyme et le degré de
dissociation sOnhaité,
les temps d'incubation décrits dans la littérature sont compris entre 50
mintites -3 heures
(Guetta et al, 2003; Mulekar, 2003.; van Geel et ai., 2004). A iule
température inférieure,
'enzyme est moins :active, et il est nécessaire d'allonger le -temps
d'incubation de plusieurs
heures, ce qui rend impossible la réalisation de toutes .les étapes du
protocole dans la Jerne
journée (Gambier and Surleve-Bazeille, 1992)õ Pour cette raison., ces
protocoles sont
actuellement réalisés au moins partiellement dans des structures disposant -de
plateformes
techniques. .comportant un incubateur., ce -qui n'est pas souvent le cas des
cabinets -de
dermatologie.
Afin de permettre A des praticiens non équipés d'incubateur de traiter des:
patients atteint S de vitiligo, la. société .Clinicat Cell Culture propose. un
kit (ReCelle)
comportant les consommables: nécessaires pour effectuer toutes -les étapes, du
prélèvement .à
la réimplantation des cellules, ainsi q-u'une unité de chauffage électronique
équipée de .piles,
Ce dispositif présente deux inconvénients majeurs, .qui sont son prix -très
élevé et son impact
écologique.
La présente invention propose une alternative avantageuse aux solutions de
l'art antérieur, en particulier au kit ReCelle, puisqu'elle repose sur
'l'utilisation de
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chaufferettes pour chauffer et maintenir à une température convenable une
solution
enzymatique, pendant la durée nécessaire à l'action de l'enzyme. 'Le terme
chaufferette
désigne. ici les petits objets capables d'émettre de la chaleur, aussi
.appelés . bouillottes
magiques ou packs de chaleur autonomes >>õ et dont le fOnctionnement repose
sur des
processus physiques. ou chimiques exothermiques.. .Elles sont couramment
utilisées pour
réchauffer les mains ou les pieds exposés. au .froid. Dans ce qui suit, les
termes
chaufferette . et . pack de chaleur >.>. sont utilisés indifféremment A titre
d'exemple de.
chaufferette reposant sur un processus physique, on. peut citer les
chaufferettes réutilisables
constituées d'une pochette contenant une solution aqueuse. saturée en acétate.
de sodium en
surfusion. En tordant une plaquette métallique à l'intérieur du liqtaid.e, on
génère des cristaux
(acétate solidifié, qui déclenchent la cristallisation, et la solution
devient. solide e Cette
transition de phase se faisant à la. température de fusion (5e pour une
solution 20%:õ par
exemple), il y a échauffement de la pochette puis refroidissement jusqu'à la
température
.ambiante une fois la solidification terminée. Lorsque la pochette est
refroidie, il est possible
de remettre l'acétate de sodium (devenu solide) à l'état liquide, en plaçant
la pochette dans de
l'eau très. ehaude. Il existe aussi des chaufferettes chimiques dont le
principe est activé par
oxydation ..au contact de l'air. Elles sont efficaces plus longtemps fele 8 à
.0 heures contre
.environ I heure pour les chaufferettes à base: d'acétate de sodium en
surfiision) niais ne
servent qu'une fois.
les inventeurs, ont montré (exemples 1 et 3 ci-dessous) qu'une solution
placée dans un récipient, typiquement une. boîte de Petri, posée .sur une
chaufferette, atteint en
quelques minutes une température optimale pour l'activité de nombreuses
enzymes telles que
la trypsine, et s'y maintient pendant au moins 1.5 à. 20 minutes.
L'invention porte donc, en premier lieu, sur un procédé pour mettre en
OniVre une réaction biologique, biochimique Qt1 chimique néeessitant une
ineubation a une
température comprise entre 30 et 40eeenracterisé en te qu'il comprend une
étape d'activation
d'une chaufferette dont le fonctionnement repose. sur un processus physique ou
chimique
exothermique, et une étape. de mise en contact de ladite chaufferette avec un
récipient
contenant les réactifs impliqués dans ladite réaction. Ce procédé est
particulièrement.
avantageux dans le cadre. d'une application biologique, médicale ou de
diagnestic.
Dans une mise en oeuvre particulière .de ce proeédé., l'étape .de mise en
contact de la chaufferette avec le réeipient est effectuée en plaçant la
chaufferette et au moins'
la partie inférieure du récipient dans une cavité d'un support prévu à cet
effet. Un tel support.
permet d'une part, .de bien, caler le recipiernsur la chaufferette,. limitant
ainsi les risques de
renversement, En. outre l'utilisation d'un support isolant, présentant une
faible conductivité'
thermique, permet de limiter lespertes de chaleur de la chaufferette, et de
favoriser le transfert
de la chaleur de la chaufferette vers la solution à chauffer. Dans: une mise
en imuVre préféréee
Id profondeur de la ca llç permet .d'y placer la chaufferette :et uniquement
la ilartie inférieure
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du récipient. De cette façon, le récipient est bien calé sur la chaufferette,
:rte risque pas de
gliSSer, et reste facile à saiSir par l'Opératettr.
Dans les procédés ci-dessus. l'utilisation d'une chaufferette et, le cas:
échéant, d'un support isolant, permet de maintenir la température d'une
solution biologique,
biochimique ou chimique entre 30 et 40QC pendant la durée nécessaire (de
quelques: minutes à
quelques dizaines de minutes, par exemple 5,10, 15, 18:, 20 minutes ou
davantage). Cette
utilisation de la chaufferette, Objet simple, peu coûteux et en général
destiné aux loisirs de
grand air (ski., alpinisme
pour mettre en oeuvre un procédé: biologique (biologie
moléculaire ou cellulaire) ou chimique en remplacement d'un matériel de
:laboratoire
sophistiqué, est aussi avantageuse que surprenante, puisqu'elle permet des
=éeOneenies
considérables sans altérer la. qualité des résultats obtenus.
Dans ce qui précède, on appelle "réaction biologique" toute réaction
impliquant des ékments issus d'un être vivent, comme per exemple des cellules
vivantes,
(celiale5 animales provenant d'une biopsie, eelluies végétales, levures ou
bactéries), deS virus,
des organelles, des enzymes, des produits du métabolisme, etc. Une "réaction
biochimique
met en, oeuvre des substances impliquées dans des réactions chimiques de la
matière vivante
(enzymes, sucres lipides, etc.).
Selon une mise en oeuvre particulière du procédé de l'invention, le récipient
contient une solution :enzymatique et le contact entre la chaufferette et le
récipient est
maintenu pendant au moins 10 minutes: Selon un mode de réalisation
particulier, la
chaufferette est utilisée dans le cadre d'un procédé dg biologie cellulaire,
et la solution
enzymatique contient des cellules provenant d'une biopSie, par exemple un
eehanti lion de
tissu à dissocier. Dans ce cas, la solution enzymatique contient, par
exemple,: de la trypsine.
Pour les réactions nécessitant une incubation de moins d'une heure:, la
ehaufferette est de préférence constituée eine pochette plastique hermétique
contenant une
solution aqueuse saturée en acétate de sddium, Toutefois, l'invention peut
également être
mise en oeuvre avec une chaufferette chimique, permettant une incubation plus
longue.
Selon une mise en uvre particulière. du procédé de l'invention, la
chaufferette utilisée, de type pochette contenant de l'acétate dç sodium, est
un disque dont
l'épaisseur est comprise 'entre 3 et 7 mm, de préférence 4 à 6 mm et le
diamètre est compris
entre 7 et 11 cm, de préférence 8 à 10 cm, et la. solution contenant les
réactifs impliques dans
la réaction a un volume compris entre 3 et 10 ml et est contenue dans une
boîte: de Petri de
diamètre compris entre 7 et 11 cm, de préférence entre 8 et 10 cm, ou un
compartiment de
ladite boite. Pur e. boite de Petri e, on entend ici une boite cylindrique
transparente peu
profonde, en verre ou en plastique, munie d'un convercle. Dans eertaines
réalisations
particulières de l'invention, la boite de Petri est compartimentée, par
ekeeppie par une petite
paroi le long d'un diamètre, Lorsqu'un support est utilisé dans le cadre de
cette mise en: oeuvre
partieulière, la cavité destinée à recevoir la chaufferette est égaleinent
circulaire, de diamètre
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légèrement supérieur à Celui de la :chaufferette (compris entre: 7 et 11,5 cm)
et. a une
profondeur comprise entre 5 et 20 min.
La présente invention porte également sur un procédé de dissociation de
eelluicsissues d'un échantillon de tissu fraîchement prélevé, comportant les
étapes suivantes :
(i) initier la cristallisation dans une chauftbrette constituëe d'une pochette
plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de
sodium ;
optionnellement, placer ladite chaufferette dans une cavité prévue à. cet
effet dans un support,
de préférence isolant ;
(ii) placer sur ladite chaufferette un récipient contenant une solution de
trypsine de concentration, comprise entre 0,2% et 1%;
(hi) placer l'échantillon de tissu dans ladite solution et laisser incuber au
moins 10 minutes, de préférence 15 à 20 minutes.;
(iv) rincer l'échantillon de tissu.
Bien entendu, lors de la mise en ouvre de :cc procédé, on veillera e ce que
les géométries de la chaufferette, du récipient: et, le cas échéant, de la
cavité du support
isolant, soient telles qu'il existe une surface d'échange importante entre la
chaufferette et le
récipient. Selon un mode de réalisation particulier, la chaufferette a une
forme de disque et le
récipient est une boîte de Petri, comme mentionné plus haut. Dans ce cas, les
diamètres de: ces
deux élérnents sont de préférence identiques ou quasi-identiques ; Si un
support est utilisé, la
cavité du support destinée à recevoir au moins la chaufferette est également
circulaire, de
diamètre légèrement supérieur au diamètre de la .chauffretteet du téeirient.
Dans le procédé ci-dessus l'étape (iv) peut, le cas échéant, étre précédée ou
suivie d'une étape d'inhibition de la trypsine, par ajout d'un inhibiteur.
Toutefois, selon tin
mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, aucun inhibiteur
de la trypsine
2.5 n'est ajouté, le rinçage de: l'échantillon de tissu étant suffisant
pour stopper l'actio.n de la
trypsine. Ceci permet en particulier de limiter le nombre de substances el
setont appliqUées
au patiCnt avec les cellules.
La présente invention porte également sur un procédé de préparation d'une
suspension cellulaire appropriée pour une application cutanée sur un patient,
comprenant les
étapes suivantes :
(i) mettre en uvre le procédé dé disSociation décrit plus haut sur un
échantillon de tieu cutané comprenant des cellules appropriées pour une greffe
à un patient ;
(ii) récolter les cellules appropriées provenant de l'échantillon cutané et
les
mettre en suspension: dans une solution ; le cas échéant, cette- étape
nécessite une étape
intermédiaire de séparation et/ou de tri de certaines cellules de récnentillon
.;et
(iii) filtrer la solution obtenue à. rétapo (ii) sur tamis cellulaire.
Selon une mise en oeuvre particulière, le procédé ci-dessuS comporte une
étape supplémentaire d'ajout d'acide hyaluronique à la suspension cellulaire
obtenue à l'étape
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(iii), Cette étape permet d'obtenir un mélange visqueux qui est facilement
appliqué dans le lit
de la plaie. En outre, l'acide hyaluronique favorise la viabilité des.
cellules.
Une application particulière des procédés ci-dessus est le traitement du
vitiligo ; dans cette application, lés cellules récupérées à l'étape (ii)
mprennent au Moins
5 des mélanocytes.
La présente invention porte également sur une trousse pour application
biologique (trousse de biologie cellulaire ettou trousse de biologie
moléculaire), caractérisée
en Ce qu'elle comprend une chaufferette dont le fonctionnement repose sur un
processus
physique ou chimique exothermique.
Selon un mode de réalisation préféré des trousses selon la présente
invention, in chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique
contenant une
solution aquetist Saturée en aatate de sodium en état de surfusion.
Selon un mode de réalisation préféré de la trousSe de la présente invention,
la trousse contient également un support qui comprend une cavité destinée à
recevoir la
chaufferette. Ce support comprend par exemple une plaque de matériau isolant
thermique
dlepaisSeur comprise .entre 5 et 35 mm, dans lequel la cavité destinée à
recevoir la
chaufferette a une profondeur comprise entre 5 et 25 mm. Le support petit
également être
constitué d'une plaque plus fine (par exemple 1 mm d'épaisseur), pliée ou
assemblée pour
fOrmer nri support creux. De préférence.; :te matériau utilisé pour le suppurt
a une conductivité
thermique 2, inférieure ou égale à 0,4 \\/..m-',K1 à 20C, De manière encore
préférée, sa
conductivité thermique est inférieure à 0,15 W,m-I.K'1, voire inférieure à
0,08 W.111-1 . ou
même inférieure ou égale à 0,04 Wall-J.1(4. A titre d'exempleS non limitatifs
de matériaux
utilisables, on peut citer lie bois 0,, du contreplaqué = 0,11 W.nfj,W1), le
carton 0, ¨ 0,07
W.rn-1.1<-5, le liège()¨ 0,04 W.m-I.K1), le PVC (TA
W.nfl.K.71), le polypropylène 0,-0,1
à 0,22 Wu:11'1.W' ), la mousse de polyuréthane rigide ¨ 0,025) et le
polystyrène expansé Ok, --
0,030. Suivant les applications envisagées pour la trousse, le caractère
isolant du support ce
plus ou moins important. Par exemple, pour une trousse destinée à préparer,
dans un cabinet
de dermatologie, une suspension cellulaire par un procédé tel que décrit ci-
dessus, le caractère
isolant du support est secondaire, car les locaux dans lesquels ta trousse
Sera utilisée, sont
généralement à au moins 18"C, et le. temps d'incubation de l'échantillon
cellulaire avec la
trypsine n'est pas très long, En revanche, certaines applications peuvent
imposer des
conditions thermiques extrêmes et/ou nécessiter un temps d'incubation plus
long à une
température comprise entre 30 et 40 C, Dans ce cas, il est important
d'utiliser un ,riupport.
isolant, qui peut, le cas échéant et-ré effimplété par un couvercle permettant
de onserver pins
longtemps la chaleur dans le récipient. A titre d'exemples non limitatifs de
telles applications,
neeessitant une incubation de plus d'une heure entre 30 et 40"C on peut citer
la digestion
enzymatique de cartilage, afin d'isoler des Chondroeytes ; la digestion de
biopsie testiculaire,
pour isoler les cellules germinales l'obtention d'îlots de Langerbans à partir
d'une biopsie de
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pancréas la digestion de derme pour isoler des fibrobastes ; et la digestion
d'une biopsie
gingivale pour isoler des fibroblastes gingivaux.
Les ;rousses de l'invention peuvent également comprendre un récipient dont
la base a la même géométrie que celle de la chaufferette et, le ças échéant de
la cavité du
support, afin de permettre des échanges thermiques efficacesõ Par exeMple, la
chaufferette
peut être un disque dont l'épaisseur est comprise entre 3 et 7 nrn de
préférence 4 à 6 mm et
le diamètre est compris entre 7 et I I cm, de préférence 8 à I 0 cm ; dans ce
cas, le récipient est
de préférence une boîte de Petri de diamètre sensiblement égal à celui de la
chaufferette et, si
un support est présent, la cavité deStin& à recevoir la chaufferette est
4.alernent circulaire,
d'un diamètre légèrement supérieur à celui de la chaufferette.
Une trousse selon la présente invention peut également contenir une
enzyme, par exemple de la trypsine. Une telle trousse est par exemple conçue
pour le
traitement d'une biopsie, et comprend notamment les moyens nécessaires pour la
dissociation
des cellules de ladite biopsie. Selon un mode de réalisation particulier,
cette trousse comprend
une boite de Petri compartimentée dent le diamètre est identique ou très
proche de celui de la
chaufferette., un tamis eellulaire, et de la trypsine (sous forme lyophilisée:
ou en solution).
Les: exemples et figures Stlivarits illustrent l'invention sans toutefois
limiter
son étendue.
Légendes des figures
Figure I Evolution de la température d'une soluticn tampon dans une boite
de Petri de 9 cm de diamètre, placée sur une chaufferette a l'acétate
de:sodium, présentant une
forme de disque d'un diamètre sensiblement égal à celui de la boite de Petri,
sur une durée de
40 minutes, dans une pièce à 20')C
Figure : photos du dispositif comprenant un support et un pack de chaleur
(chaufferette). 1 : pack de chaleur ; 2 : support ;. 3 boîte compartimentée
posée sur le pack de:
chaleur.
Figure 3 : Evolution de la température en fonction du temps, Sans Support
Eiguree4 EvOlution de la température en fonction du temps, avec le support
V2.
Figure Evolution de la
température en fonction du temps, avec le support
"3.
Figure 6 : Evolution de la température en fonction du temps (comparaison
des moyennes sans support et avec supports V2 ou W),
Exeat p les
Exemple 1 : Température du milieu dans une boîte de Petri placée 5.air une
chaufferette
température d'une solution (tampon) dans une boîte de Petri de 9 cm de
digetre, placée sur une chaufferette à l'acétate de, sodium, présentant une
forme de disque
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d'un diamètre sensiblement égal à celui de la boîte de Petri et une épaisseur
comprise entre =4
et 6 mm a été mesurée.
Les résultats (Figure 1) montrée une montée: en température assez rapide,
puisque la température atteint 30 C en quelques minutes. La température t.Ç*
ensuite
comprise entre 30 et 40 C pendant un peu plus de 20 minutes.
Ces résultats ont montré une bonne reproductibilité.
Exemple 2 Application à la séparation dermo-épidermique, dans le cadre
du traitement du vitili 20 par eeffe autologue de mélanoevtes
A partir d'une biopsie de peau fine (0,2 mrn-0,3 mm), le lit d'une plaie est
ensemencée avec des cellules autologues.
La suspension cellulaire obtenue après désagrégation du greffon. est
constituée d'une population mixte, principalement des cellules basales de
kératinocytes, mais
également des cellules de Langerhans, des mélanocyteS et des fibroblaStes.
Matériels utilisés
Une chaufferette telle que décrite à l'exemple 1, et un kit à usage unique
eornpesé d'éléments et d'instruments annexes solutions enzymatiques et
d'application;
instruments stériles, dont une boîte de Petri à du X compartiments.
Protocole
Préparer un champ chirurgical stérile.
A réception, le kit est conetvé à +49C jusqu'à utilisation. Le kit est disposé
à température ambiante 10 min avant utilisation.
Préparation et chauffage de la Solution errzymatique
= A l'aide d'une seringue de 5 ml et d'une aiguille, prélever 5 ml
solution de PBS et les injecter dans le flacon de trypsine lyophilisée,
Bien homogénéiser avant de reprendre la solution régéne..teé e dans
un compartiment de la boite de Petri double compartiment.
O Activer le pack de chaleur instantanée en froissant la plaque
métallique ; lé cristal se solidifie instantanément.
e Placer la boite de Petri double compartiment sur le pack de chaleur
activé et attendre 5 min.
Prélèvement cutané
La zone à prélever est délimitée au feutre chirurgical, désinfectée avec de la
Chlorhexidine à 0,5% en solution alcoolique, et anesthésiée avec de la
xylocabe a 2%. Un
lambeau: de peau mince de 4 cm2 minimum de surfaee et 0,2-0,3 mm d'épaisseur
est prélevé
avec un dermatotne.
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Réalisation de la séparation dermo-épidermique(SDE)
0. A raide de la pince stérile (non fournie) transférer
la biopsie dans le
compartiment de la boite de Petri contenant la trypsine en solution à:
0.4%.
etu Incuber 15 minutes.
= Rinçage de la biopsie
- Avec la. même: seringue de. 5m1 et une aiguille,
prélever 5m1 de
solution de PBS et disposer dans le :second :compartiment de la
boite de Petri.
- A la. fin de l'incubation, à l'aide de la pince...stérile, transférer la
biopsie dans le second compartiment, pour rinçage rapide au
PBS.
e5 A l'aide de la pince stérile, disposer la biopsie à l'intérieur du
couvercle de la boite de Petri, en prenant. soin de conserver le sens
jonction dermo-épidermique vers le haut,
e. A l'aide de la pince,. procéder à la. séparation des
deux fragmente.
Réalisation de la. suspension cellulaire
O A l'aide de la seconde seringu.e de 5 ml.. et d'une aiguille, prélever
1,5 ml de PBS et les déposer sur les fragments de biopsie, racler les
cellules des surfaces de jonetion .avec un scalpel (nen fourni) et
découper la partie épidermique grossièrement pour réaliser un
mélange de cellules.
Ecarter et immobiliser la partie dermique.
o Pencher la boite de Petri de fàoe à aspirer la totalité du volume à
l'aide dc la seringue de 5 ml, faire. monter les cellules dans là
seringue et aspirer plusieurs fois pour créer une suspension
cellulaire.
Filtration des cellules
es. Transférer la suspension cellulaire dans le tamis qui
aura été placé:
sur le pot à bouchon rouge.
Réalisation de la suspension cellulaire dans l'acidelyaluronique.
= Retirer le tamis.
*u, Déposer l'acide hyaluronique contenu dans la
.seringue (soit 1,5 rtil)
dans le pot à bouchon rouge contenant la. suspension cellulaire
filtrée,
A l'aide de la .seringue, mélanger l'acide hyaluronique et le
suspension cellulaire de fa.con. â obtenir une 'suspension visqueuse
mais homogène,
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ee La suspension ainsi préparée est prête à être déposée à la seringue
sur le lit de la plaie.
Résultais
Le protocole ci-dessus a été effectué plusieurs fois, à partir de trois:
échantillons cutanés différents, en utilisant deux concentrations de trypsine
(0,4 et 028%),
tes résultats obtenus sont résumés dans le tableau 1 .ci-dessous.
[ Identification Concentration Nombre de Viabilité I Test Présence
de
..
de trypsine cellules cellulaire (%) d'efficacité
mélanocytes
isolées x 106 de clonae en c
ytométrie
r cm- de flux
Biopsie 1 0,4% 1,2 95,0% 3,4% > 0,1%
0,8% 1,2 97,0% 3,4% >0,1%
Biopsie 2 0.4% 3,4 98,0% 3,3% >0,1%
................ 0,8% 2,3 97,0% 3 f;%.
L>0,1%
Biopsie 3 0,4% 4.2 97,4%
0,1%
0.8% 3.49 99,4% 4,5% > 0,1%
Tableau I
Concentration de la irypsine
Le procédé d'obtention de la substance active à été adapté de la technique
décrite par van Geel et al. (van Geel et al., 2004).
La concentration de la solution de trypsine a été optimisée (trypsine 0,4% ou
0,8% au lieu de trypsine 0,25% IEDTA 0,08%), A la différence de la technique
décri.te par
:van Geel et al., l'inhibition de la trypsine n'a pas été. réalisée par ajout
d'inhibiteur de type
sérum de veau tbetal, niais par rinçage avec du PBS, ceci afin dé diminuer le
nombre de
produits d'origine biologique utilisé pour la fabrication du produit. La
viabilité cellulaire
après ce mode d'inhibition de la trypsine a été: validée.
Viabilitée,?ell4laire
La détermination de là viabilité cellulaire a été réalisée selon une technique
clasSique de culture cellulaire le test d'exclusion au bleu dé trypan. Une
dilution. volume .à
volume de bleu trypan et de la suspension: cellulaire a été réalisée dans un
tube à hémolyse;
Après un temps de contact de 1 à 2 minutes, :le mélange a été déposé avec une
micropipette
entre lame et lamelle stil' une cellule de numération. 1.,,es cellules mortes;
colorées en bleu, et
les cellules vivantes, non colorées, ont été comptées à l'aide d'un microscope
optique :à.
contrastede phase.
Là viabilité cellulaire était très satisfaisante après isolement des cellules
épidermiques (supérieure a 90%).
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Le comportement des cellules après remise en culture et l'efficaeité de
clonage étaient homogènes d'une biopsie à l'autre et montraient que la
suspension cellulaire
contenait des cellules capables de proliférer après trypsinatiom
Nombre de cellules isolées lem2 de biopsie
5 Calcul effectifé â partir des résultats du test décrit ci-
dessus.
Le nombre de cellules isolées était variable d'on individu à un autre en
fonction de la taille des biopsies traitées, mais le rendement eellule/cm2 a
été relativement
constant. La densité eellulairc de la suspension finale dépend donc grandet-
lient de la taille de
le biopsie traitée.
10 Test eqfficacité de clonage (CFT)
Le pourcentage d'efficacité de clonage permet dévaluer le taux de cellules
capables d'adhérer et de fort= des 'colonies, Une quantité connue de cellules
épidermiques a
été ensemencée dans 3 flasques 125 cm2. Vers le J,4e'e jour de: culture,
lorsque les :clones
étaient suffisamment gros mais non jointifs, les fiasques ont été colorées:
par unesolution de
Cristal Violet (10% forrnaldébyde 05% Cristal Violet, qsp eau distillée).
L'efficacité de
clonage a été calculée en. effectuant le rapport de la moyenne du nombre total
de colonies par
fiasque T25em2x 100 sur le nombre de cellules e,risemencées par T25 cm2.
Le comportement des cellules après remise en culture et l'efficacité de
clonage ont été homogènes d'une biopsie :à. l'autre et ont montré que la
suspension cellulaire
conteõnait des cellules capables de proliférer après trypsination:
Tare de mélanocyte dans là eteceion cellulaire pat cytometrie en .140c
.t,a membrane cellulaire a été perineabilisée dans une solution de PBS-BSA
(Bovine Serum Albumine) 1%: triton 0,5%. L'anticorps primaire spécifique des
mélanocytes
normaux. :(anticorps NKI/beteb) a été ince& puis rincé avec du PBS-BSA 1%.
L'anticorps
secondaire (anticorps d'âne antisouris Alexa Fluor 488) a eé incubé puis tincé
avec du PRS,.
BSA 1%. Les cellules marquées ont été reprises dans du PBS et. passées au FACS-
SCAN.
Les ratios de mélanocytes/kératinocytes dans les suspensions épidermiques
obtenues ont été comparables à ceux. cale-1.11es par atterra et al: (entre 1
:30 et 1 :200) (Ciuerra
et al., 2003).
Dans le procédé décrit ici, tee cellules épidermiques isolées teont pas été
mises en culture et l'ensemble du procédé a été effectué dans la journée
(biopsie, fabrication
du produit fini et greffe de cellules épidermiques autologues non cultivées),
Exemple 3 ; utilisation d'un support isolant pour optimiser la montée et le
maintien de la température du mi lieu_par la chaufferette
3 L Matériels et méthodes
Matériels et Réacte
Packs de chaleur (chaufferettes) en PVC, marquage CE
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- Plateaux de support constitués d'une plaque de polypropylène (PP)= de I
à 2 min d'épaisseur, pliée pour obtenir un support d'une épaisseur totale de
15 mm, présentant
une cavité circulaire de 90 mm de diamètre: (Figure 2).
= Boite de Petri compartimentée (réf. Dutscher 020012)
Sonde de température (Thermobouton) programmée pour fonétionner
avec le logiciel ThermoTrack V4= et/ou A BI 529:
Méthodes
Si: millilitres de PBS conservés a 4-4 C, équilibrés 2t) minutes a
température ambiante, sont déposés dans un des compartiments d'une boite de
Petri de
diamètre 90 mm, dans lequel est placé tin thermobouton (dispositif permettant
d'enregistrer
les variations de température) pour réaliser des relevés de température toutes
les minutes. La
boîte de Petri est ensuite recouverte de: 804 couvercle.
Le thermobouton est eai contact avec le milieu, permettant de mesurer
directement au. sein de la solution les variations: de température, après
activation du pack: de
chaleur. L'expérience est réalisée en plaçant ou non le pack de chaleur et la
boîte de: Petri
dans la cavité circulaire du support (Figure 2)'. Trois supports différents:
ont été testés, Ils
diffèrent par la position plus ou moins centrale dé la culte circulaire
destinée à accueillir le
chaufferette et la boite de Petri.
chaque condition a: été testée 5 à 6 fois, avec des sondes de température
différentes. Les mesures de température ont été réalisées pendant 20 min, La
moyenne des
températures a été .réalisée sur l'ensemble des valeurs relevées durant ce
laps de temps.
Une analyse statistique des températures mesurées dans le Milieu avec ou
sans support a été réalisée par un test t destudent.
3.2. Résultats
Evolution de la tempéedture du milieu avec im pack de chaleur sans support
Les données de température recueillies par la sonde de température plOngée
dans le milieu sont schématisées d la Figure 3. La température moyenne sur les
6 tests était de
35,5 C, avec une moyenne des écarts-types de 3,9 C.
Ces résultats mettent en évidence la reproductibilité des températures
obtenues: avec les différentes chaufferetteS, sans support.
Evolettiim de la température du milieu avec un pack de chaleur dans un
support
Deux supports (prototypes V2 et V3) ont été testés. Ils diffèrent pat la
position de la cavité circulaire destinée à accueillir la chaufferette. En
effet, dans lé support
V3, cette cavité a été centralisée pour permettre une homogénéisation de la
chaleur à
l'intérieur du support, afin d'optimiser la montée et le maintien .de la
température dans la boite
de Petri compartimentée disposée sur la chaufferette.
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Les données de température recueillies pendant 20 minutes par la sonde de
température plongée dans le milieu sont schématisées dans les graphes
présentés la figure 4
(Support V2), à la figure 5 (support V$) e 4 la figure 6 (comparaison des deux
supports et des
températures obtenues sans support), é,..t résumées dans le tableau ci-
desSous.
Durée de Température Temps
pour Température
maintien de la Maximale atteindre
la moyenne des e
température atteinte 1 température tests
>35'C * maximale
Test sens 18 min 39.5 C 9 min 35,5C 3.9 C
support
Test avec 18 min 40.5C 6 min 36.79C 3.6 C
support V2
Test avec 18 min , 409C 1 9 min
l'C
support V3
Tableau 2 ;
durée obtenue sur une durée totale de l'expérience de. 21
minutes
Ces résultats mettent en évidence
- la reproductibilité entre les chaufferettes ;
les températures eteinteS sont plus élevées lorsque les ehaufferetteS
sont disposées dans un support (1,19C de différence avec V2 et 0,8-c. avec
V3).;
4,
avec ou sans support, le milieu contenu dans la boite de Petri
compartimenté est maintenu it une température supérieure à 3 5C pendant au
moins 18
minutes ;
- Sans support, la température maximale de 39.5C est atteinte en 9 min,
alors qu'avec le support V2 elle atteint 40.52C en 6 min.
Afin de déterminer si les différences observées sont statistiquement
Significatives, une analyse statistique par un test t student a ete réalisée
en utilisant les valeurs
obtenues avec k Stipport 1J3. Ce test indique une probabilité de 0.03 < 0.05,
detnontrant
l'écart des températures obtenues sans support et avec le support. V3 est
significatif (tableau
3): Le support V3 permet donc d'obtenir une température en moyenne plus élevée
que sans
support, plus rapidement et de façon plus reproductibit; (e-t 19C)õ
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Moyennç sans support Moyenne avec support
35,4: 35,9
35,9 35,7
35,7 ------------- 36,9 ..
35,3 ............. 36,3 ..
35,1 36,8
35,6 ______________ NA
Moyenne 35,5 36,37
_________________ _ tt 0,03
Tableau 3
Les supports permettent donc d'optimiser la montée en température etlou
son main lien.
L'utilisation du support du kit VitiCelb".., lors d'une digestion enzymatique
de biopsie de peau fine afin d'en réaliser une séparation dermo-épidermique,
selon le process
de production de suspensions épidermiques décrit à l'exemple 2, permet
d'obtenir en
moyenne une température plus élevée et plus rapidement. te support presente
donc un double
intérêt plateau de travail et optimisation de la montée en température des
packs de chaleur.
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