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WO 2016/046508 PCT/FR2015/052572
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Procédé de criblage de molécules interférentes
La présente invention concerne un procédé de criblage de molécules
interférentes.
Le phénomène connu d'interférence à ARN (RNAi) est basé sur le fait que de
petites
molécules d'acides ribonucléiques peuvent interagir avec les ARN messagers. Un
mécanisme complexe, contrôlé par de nombreuses enzymes, conduit à la
dégradation
des ARN messagers, inhibant ainsi l'expression des gènes codant lesdits ARN
messagers et inhibant, par voie de conséquence, l'expression des protéines qui
en
découlent.
Parmi les petits ARN interférents, plusieurs espèces d'ARN ont été
identifiées,
notamment les micro-ARN, les ARN en épingle à cheveux, et sont capable
d'inhiber
l'expression de gènes, et donc des protéines qui en découle, par des
mécanismes
similaires.
Il est actuellement très largement admis de tester pour chacun des gènes
d'intérêt pour
lesquels une inhibition par interférence à ARN est recherchée, de tester
individuellement chaque ARN interférent pour chacun des gènes envisagés. Un
tel
procédé est long et coûteux, puisqu'il est nécessaire de vérifier que chaque
ARN
interférent envisagé exerce bien son effet inhibiteur sur l'expression du gène
cible. De
plus, il est nécessaire de vérifier que chacun des ARN interférents considérés
comme
exerçant un effet inhibiteur approprié n'exerce pas par ailleurs un effet
inhibiteur
parasite en bloquant également l'expression d'un ou plusieurs autres gènes
que
celui qui est ciblé initialement.
Le brevet US8 252 535 décrit l'utilisation d'une séquence artificielle
comprenant une
séquence à cibler complémentaire de la séquence d'un ARN interférent connu. Ce
procédé permet par ailleurs d'inhiber simultanément des ARN codant des gènes
cibles
différents. Toutefois un tel procédé demeure imparfait, et ne permet pas
notamment de
cribler efficacement des ARN interférents spécifiques d'une cible naturelle.
On connait en outre de l'état de la technique des molécules d'acides
nucléiques ayant
un effet positif sur l'expression de gènes.
Par exemple Voutila et al, Molecular Therapy, 2012-08-01 décrit des siRNA
utilisés pour
activer les gènes impliqués dans la pluripotence cellulaire. La demande
W02006113246A2 décrit des sRNA activateurs de l'expression de gènes, notamment
en se fixant sur des régions promotrices, Toutefois, ces molécules ont pour
effet de
cibler des séquences régulatrices mais ne ciblent pas spécifiquement les
séquences
codantes de gènes.
Aussi, l'invention a pour but de palier à ces inconvénients.
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Un des objets de l'invention est de fournir un procédé de criblage de
molécules
interférentes présentant une meilleures sensibilité.
Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique hybride permettant
de mettre
en uvre un procédé de criblage de molécules interférentes, ce procédé étant
plus
sensible que ceux connus de l'état de la technique.
Encore un autre but de l'invention est de fournir les moyens permettant de
mettre en
uvre facilement et efficacement le procédé susmentionné.
Aussi, l'invention concerne un procédé de criblage, notamment in vitro,
d'acides
nucléiques interférents augmentant :
- l'expression de gènes et/ou
- l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques ou ARN transcrits desdits
gènes,
lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins en partie une
complémentarité de séquence avec lesdits gènes ou lesdits ARN, et
ledit procédé comprenant une étape d'introduction, dans une cellule eucaryote,
notamment apte à réaliser de l'interférence à ARN, d'une molécule d'acides
nucléiques
hybride comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire de la séquence
desdits
acides nucléiques interférents à cribler, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé,
ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la
première
séquence,
ladite première séquence étant modifiée, notamment par substitution ou
délétion
ou addition d'au moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction
dudit au
moins un peptide est diminué d'au moins 10% par rapport au niveau de
traduction dudit
au moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version
non
modifiée, notamment optimale.
L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs
qu'il est
possible de cribler des molécules interférentes permettant d'augmenter
l'expression
des gènes lorsque ces dernières sont sélectionnées au moyen d'une molécule
d'acides
nucléiques possédant une séquence d'initiation de la traduction modifiée (non-
optimale).
Aussi, les inventeurs ont identifié pour la première fois des ARN interférents
possédant
des propriétés opposées à celles largement décrites et admises dans l'état de
a
technique, à savoir les propriétés d'inhibition de l'expression connues des
mécanismes
d'interférence à ARN.
Dans l'invention, il est primordial de disposer d'une molécule d'acide
nucléique qui
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comprend une première séquence d'initiation de la traduction qui ne soit pas
naturelle,
et qui diffère de ladite séquence telle qu'elle peut être retrouvée chez les
eucaryotes
sauvages (c'est-à-dire ne présentant pas de mutation au niveau de ladite
séquence
d'initiation de la traduction).
Dans l'invention, on entend par séquence d'initiation de la traduction la
séquence
d'acides nucléiques présente dans les gènes et dans les ARN messagers qui en
découle, et qui entoure le codon d'initiation ATG. Cette séquence est plus
communément appelée séquence Kozak.
Dans l'invention on entend par optimale , le niveau de traduction maximum
opérant
pour un gène déterminé dans un type cellulaire donné et dans une condition de
culture
donnée. Le niveau optimal de traduction est le niveau maximum de production
d'une
protéine par un ARN sous la dépendance dudit site d'initiation de la
traduction où a lieu
le chargement du premier acide aminé importé par l'ARN de transfert initiateur
Methionine. La cellule s'entend comme n'étant pas capable, à l'état naturel
physiologique, de produire plus de protéine pour un ARN donné que son niveau
optimal.
Dans l'invention, on entend par augmentant l'expression de gènes toutes
modifications qui a pour conséquence d'obtenir une quantité de protéine, codée
par
ledit gène, plus élevée que la quantité de protéine obtenu sans modification.
Aussi, en
présence d'un acide nucléique interférent selon l'invention, le produit
protéique d'un
gène (ciblé par ledit acide nucléique interferent) sera plus abondant que le
produit
protéique du même gène en l'absence d'un acide nucléique interférent ciblant
ledit
gène, ou en présence d'un acide nucléique interférent ciblant un autre gène.
Cette
définition d' augmentant l'expression de gènes est une définition classique
utilisée
par l'homme du métier.
Aussi, même si le mécanisme moléculaire qui implique cette augmentation
protéique
est post transcriptionnelle (stabilisation de l'ARN, augmentation de la
transcription), on
parlera toujours d'augmentation d'expression génique.
Dans l'invention augmentation de l'activité de gènes et/ou d'acides
ribonucléiques ou
ARN transcrits desdits gènes correspond, comme indiqué ci-dessus, à l'un des
mécanismes conduisant à l'augmentation de l'expression des gènes, c'est-à-dire
à
l'augmentation du produit protéique codé par ledit gène.
Dans l'invention on entend par molécules interférentes des molécules d'acide
nucléique
capables de réguler l'expression de gènes par interférence à ARN. Un des
exemples de
molécules interférentes couvertes par l'invention sont donc les petits ARN
interférents
(siRNA pour Small interfering RNA), les micros ARN (miRNA pour micro RNA ),
ou
les petits ARN en épingle à cheveux (shRNA pour short hairpin RNA ).
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Les siRNA sont de petits ARN double brin de 21 à 24 nucléotides. Les petits
ARN
interférents à l'état de double brin sont reconnus dans le cytoplasme de la
cellule par un
complexe protéique nommé complexe RISC (pour RNA induce silencing complex).
Celui-ci s'active en libérant le brin complémentaire de l'ARN ou brin sens. Ce
complexe
activé va reconnaître son transcrit cible, un ARN messager, par
complémentarité des
bases nucléiques. Ce système de reconnaissance assure la haute spécificité de
ce
mécanisme. Une fois la cible liée, la protéine Argonaute, faisant partie du
complexe
RISC, peut couper le transcrit au niveau du site de reconnaissance. Ago peut
donc agir
comme une endonucléase. Les deux morceaux du transcrit clivé par Ago vont être
rapidement dégradés via leurs extrémités par des exonucléases.
Les miRNA sont des ARN simple brins capable de former par appariement de base
des
structures double brins. Au cours de la formation du RISC il y a passage d'un
miRNA
double brin à un miRNA simple brin. Seul le brin spécifique de l'ARN messager
cible du
miRNA est conservé au sein du complexe. L'ARNm cible est alors chargé au sein
du
complexe RISC. Deux voies d'inhibition sont alors possibles, soit la
dégradation de
l'ARNm cible si le complexe contient la protéine Ago2, soit la répression de
la traduction
de ce dernier si le complexe contient la protéine Ago1.
Les shRNA sont des ARN adoptant une structure en tige et boucle pouvant être
impliqués dans le phénomène d'interférence par ARN. Après la prise en charge
par le
complexe RISC, le brin sens est dégradé. Le brin anti-sens dirige le complexe
RISC
vers les ARNm possédant une séquence complémentaire. Le mécanisme de
dégradation est alors similaire à celui opéré par les siRNA.
Dans le cadre de l'invention, le mécanisme selon lequel certaines molécules
interférentes sont capables d'augmenter l'expression de gènes n'est pas encore
élucidé. Toutefois, les inventeurs ont montré, au moyen du procédé selon
l'invention,
que certaines molécules qui sont généralement réputée dans l'état de la
technique
comme inhibant la traduction d'ARN messagers, ou déstabilisant les ARN
messagers
sont en fait capables d'augmenter l'expression ou la stabilité desdits ARN
messagers.
Dans l'invention lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins
en partie
une complémentarité de séquence avec ledit gène ou ledit ARN signifie que
les
acides nucléiques interférents à cribler sont préalablement sélectionnés d'une
part pour
être au moins en partie complémentaire de la séquence d'un gène, ou de l'ARN
messager qu'il code, de sorte que le criblage soit spécifique. Par ailleurs,
l'homme du
métier comprendra que les acides nucléiques interférents ne peuvent être
complètement complémentaires de la séquence du gène qu'ils ciblent, dans la
mesure
où ils ont une taille, en nombre de nucléotides, inférieure à celle du gène
ciblé.
Dans l'invention, on entend par molécule d'acide nucléique hybride, une
molécule
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d'acides nucléiques hybride qui est composée d'au moins deux fragments
d'acides
nucléiques qui ne sont pas adjacents dans la nature. Cette molécule hydride
n'existe
donc pas à l'état naturel.
Ladite molécule d'acide nucléique hybride, comme mentionné ci-dessus, comprend
au
moins trois séquences :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction, ou plus
communément appelée séquence d'initiation de la traduction. Cette séquence est
modifiée, c'est-à-dire qu'elle présente au moins un nucléotide différent par
rapport à la
même séquence observée dans la population générale,
- une deuxième séquence au moins en partie complémentaire de la séquence
desdits acides nucléiques interférents à cribler, qui correspond à la séquence
cible de
l'acide ou des acides nucléiques interférents, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé,
ce
peptide pouvant correspondre à une étiquette immunogène, ou tag, ou encore à
une
protéine fonctionnelle présentant une activité enzymatique ou à une protéine
présentant
des propriétés luminescentes ou fluorescentes.
Dans l'invention, il est possible que la deuxième séquence soit contenue dans
la
troisième séquence. Cela signifie que la troisième séquence qui code ledit au
moins un
peptide déterminé comporte une partie de sa séquence qui est au moins en
partie
complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à
cribler. Cela
peut signifier d'une part que la deuxième séquence correspond à une partie de
la
troisième séquence toutes deux codant une partie du peptide déterminé, ou
d'autre part
que le peptide déterminé est hybride > , c'est-à-dire qu'il est codé par une
séquence
dans laquelle une séquence exogène (la deuxième séquence) a été introduite.
Dans ce
second cas, le peptide déterminé comportera une partie de sa séquence d'acide
nucléique qui n'est pas naturellement comprise dans la séquence dudit peptide
déterminé.
Dans l'invention, il est également possible que la deuxième et la troisième
séquence
soient identiques. C'est le cas notamment lorsque la séquence codant le
peptide
déterminé est également intégralement en partie complémentaire, ou
complètement
complémentaire, des acides nucléiques interférents à cribler. C'est le cas
notamment
de la séquence codant l'étiquette FLAG. S'il est recherché une molécule
interférente
augmentant l'expression de l'étiquette, la séquence d'acides nucléiques codant
l'étiquette FLAG est placée en aval de la première séquence et la molécule
d'acide
nucléique hybride est alors composée de trois séquences (qui en fait n'en
représentent
que deux), la deuxième et la troisième étant complètement confondues, ou
identiques.
Dans la molécule d'acides nucléiques hybride, il existe un contrôle
fonctionnel de la
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troisième séquence par la première séquence, ce contrôle étant exercé en cis
ce qui
signifie que le contrôle se fait lorsque les deux séquences sont portées par
la même
molécule.
La première séquence de la molécule hybride est modifiée de sorte que la
traduction
dudit au moins un peptide est diminuée d'au moins 10% par rapport au niveau de
traduction dudit au moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence
dans
sa version non modifiée, notamment optimale. En d'autres termes, en l'absence
d'acides nucléiques interférents, une cellule eucaryote comprenant une
molécule
d'acides nucléiques hybride ne présentant pas de première séquence modifiée
exprimera au moins 10% plus de peptide déterminé (codé par la troisième
séquence)
que la même cellule eucaryote comprenant une molécule d'acides nucléiques
hybride
présentant ladite première séquence modifiée.
Afin de permettre une interaction entre la molécule d'acides nucléiques
hybrides et les
acides nucléiques interférents à cribler, il est nécessaire que les séquences
des acides
nucléiques interférents et la seconde séquence de la molécule d'acide
nucléique
hydride soient au moins en partie complémentaire, selon la complémentarité des
bases
A-T/A-U et G-C, bien connue de l'homme du métier.
Dans l'invention on entend par au moins en partie complémentaire le fait
que la
grande majorité de nucléotides qui composent les acides nucléiques
interférents à
cribler soient complémentaires des nucléotides qui définissent la deuxième
séquence
de la molécule d'acides nucléiques hybride. En particulier, il est avantageux
que les
nucléotides des acides nucléiques interférents à cribler et ceux qui composent
la
deuxième séquence de la molécule d'acides nucléique hybride soient
complémentaires
à plus de 90%, avantageusement plus de 95%, notamment plus de 99% en
particulier
100%, ou en d'autres termes que les deux molécules présentent moins de 10%,
avantageusement moins de 5%, notamment moins de 1%, en particulier 0% de
mésappariements. Lorsque la deuxième séquence de la molécule d'acides
nucléique
interférents est composée d'environ 20 nucléotides, il est particulièrement
avantageux
que la complémentarité soit totale.
L'invention repose en effet sur cette constatation surprenante faite par les
inventeurs
selon laquelle une modification de la séquence d'initiation de la traduction
permet une
expression plus faible du peptide déterminé, qui sert de marqueur, et donc
permet de
visualiser de manière plus précise la variation d'expression, notamment
l'augmentation
d'expression, lorsque l'efficacité d'un acide nucléique interférent est
testée.
Le procédé selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes :
- Une première étape qui consiste en la transformation de cellules eucaryotes
aptes à réaliser de l'interférence à ARN, par des techniques bien connues de
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l'état de la technique de transfection, d'une molécule d'acides nucléiques
hybride. Il peut s'agir notamment d'électroporation, de transformation au
phosphate de calcium, de lipofection, d'infection virale, ou encore de
nucléofection. Ces exemples de transformation de cellules eucaryotes sont
donnés à titre indicatif, et ne sauraient limiter la portée de l'invention.
Une fois transformées, transitoirement ou de manière stable, les cellules
susmentionnées sont prêtes à être utilisées pour le criblage des acides
nucléiques interférents. Il peut être avantageux de disposer de cellules
transformées de manière stable (c'est-à-dire de cellules ayant intégré dans
leur
génome ladite molécule d'acides nucléiques hybride) afin de pouvoir, par
simple
culture cellulaire, utiliser toujours la même cellule transformée.
- Dans une seconde étape, la cellule ou les cellules transformées à l'étape
précédente sont une nouvelle fois transformées par des moyens conventionnels
bien connus de l'homme du métier, afin d'introduire dans lesdites cellules
lesdits
acides nucléiques interférents à cribler.
- Les cellules ainsi transformées avec d'une part la molécule d'acides
nucléiques
hybride et une population d'un acide nucléique interférent à cribler sont
mises
en culture, dans une troisième étape, afin de permettre la mise en uvre du
processus d'interférence à ARN, pendant un temps déterminé que l'homme du
métier, avec ses connaissances générales de l'interférence à ARN peut
facilement déterminer selon le type de cellule utilisé.
- A l'issue dudit temps déterminé, les cellules sont alors, dans une quatrième
étape, analysées afin de mesurer le taux d'expression, c'est-à-dire la
présence,
l'absence ou la quantité dudit peptide déterminé codé par ladite molécule
d'acides nucléiques hybrides. Cette présence, absence ou quantité de peptide
déterminé est évaluée en comparaison avec la quantité dudit même peptide
déterminé exprimé par lesdites cellules transformées avec ladite molécule
d'acide nucléiques hybride, mais qui n'a pas été transformée avec des acides
nucléiques interférents à cribler, ou qui a été transfectée avec des acides
nucléiques interférents qui n'ont pas de cible (c'est-à-dire de séquences
complémentaires) dans la molécule d'acides nucléiques hybrides.
Si la quantité de peptide déterminé dans les cellules transformées avec un
acide
nucléique interférent est inférieure ou égale ou supérieure à moins de 10% à
la quantité
du peptide dans les cellules qui n'ont été transformées avec aucun acide
nucléique
interférent, ou qui ont été transfectées avec des acides nucléiques
interférents qui n'ont
pas de cible (c'est-à-dire de séquences complémentaires) dans la molécule
d'acides
nucléiques hybrides, ledit acide nucléique interférent ne sera pas retenu. Si
par contre
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la quantité de peptide déterminé dans les cellules transformées avec un acide
nucléique interférent est supérieure d'au moins 10 % à la quantité du peptide
dans les
cellules qui n'ont été transformées avec aucun acide nucléique interférent, ou
qui a été
transfectée avec des acides nucléiques interférents qui n'ont pas de cible
(c'est-à-dire
de séquences complémentaires) dans la molécule d'acides nucléiques hybrides,
alors
ledit acide nucléique interférent sera retenu, car il exerce un effet
activateur de
l'expression ou de l'activité du gène qu'il cible.
Afin de mesurer la différence du niveau d'expression d'au moins 10%, il est
possible
d'utiliser des techniques conventionnelles d'immunodétection capables de
détecter de
manière quantitative les rayonnements lumineux émis par une détection par
chimioluminescence ou par fluorescence.
Par exemple, il est possible de réaliser soit un immunomarquage du peptide
d'intérêt
par la technique de western blot, et de mesurer sa quantité par
chimioluminescence.
De la même manière si l'anticorps dirigé contre le peptide est couplé à un
marqueur
fluorescent, il est possible de mesurer sa quantité en mesurant le rayonnement
fluorescent émis après excitation à la longueur d'onde appropriée.
Lorsque le peptide est lui-même doté de propriétés autofluorescentes, il est
possible de
mesurer sa quantité directement à partir des cellules vivantes, notamment par
cytométrie de flux.
II peut également être avantageux que la molécule d'acide nucléique hybride,
par
l'intermédiaire de la troisième séquence code au moins deux peptides qui sont
susceptibles de réaliser un transfert d'énergie entre molécules fluorescentes
ou FRET.
Dans ce cas particulier où la troisième séquence code au moins deux peptides
susceptibles de réaliser du FRET, il est possible de mesurer la quantité de
peptide
exprimé, et donc l'effet de l'acide nucléique interférent, directement sur les
cellules
vivantes transformées avec la molécule d'acides nucléiques hybride transformée
ou
non par un acide nucléique interférent en mesurant l'émission de fluorescence
résultat
du transfert d'énergie.
En résumé, le procédé selon l'invention est un procédé de criblage d'acides
nucléiques
interférents augmentant :
- l'expression de gènes et/ou
- l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes,
lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins en partie une
complémentarité de séquence avec ledit gène ou ledit ARN,
ledit procédé comprenant
1- une étape d'introduction, dans une cellule eucaryote, notamment apte à
réaliser
de l'interférence à ARN, d'une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant
:
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- une première séquence non codante destinée à initier la traduction,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire de la séquence
desdits
acides nucléiques interférents à cribler, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé,
ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la
première
séquence,
ladite première séquence étant modifiée, par substitution, délétion ou
addition
d'au moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction dudit au moins
un
peptide est diminué d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit
au moins
un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non
modifiée,
notamment optimale,
2- une étape d'introduction dans la cellule eucaryote obtenue à l'étape
précédente d'un
acide nucléique interférent, et
3- une étape de mesure de l'expression dudit au moins un peptide.
Ce procédé permet de conclure que si le niveau d'expression dudit au moins un
peptide
est supérieur de 10% au niveau d'expression dudit peptide exprimé par une
cellule
eucaryote obtenue à l'étape 1, mais qui n'est transformé avec aucun acide
nucléique
interférent, ou un acide nucléique interférent ne présentant aucune
complémentarité de
séquence avec la deuxième séquence de ladite molécule d'acides nucléiques
hybride,
l'acide nucléique interférent qui a permis cette augmentation d'expression de
plus de
10% est un acide nucléique interférent d'intérêt selon l'invention.
Dans le cas contraire, l'acide nucléique interfèrant testé n'est pas conservé
car il ne
présente pas les propriétés d'augmentation de l'expression ou de l'activité du
gène
ciblé.
Il est à noter que dans l'invention, la molécule d'acides nucléiques hybride
peut être soit
un acide ribonucléique (ARN), soit un acide désoxyribonucléique simple ou
double brin
(ADN simple brin ou ADN double brin). Avantageusement, la molécule d'acides
nucléiques hybride est une molécule d'acide désoxyribonucléique.
Avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, dans lequel
ladite
première séquence est une séquence Kozak d'initiation de la traduction en aval
soit
d'un site d'entrée interne des ribosomes ou IRES, ou soit d'une coiffe ARN
(5'CAP).
L'initiation de la traduction a lieu grâce à la présence d'une séquence Kozak.
Toutefois,
afin de permettre l'initiation de la traduction, il est nécessaire que les
ribosomes et toute
la machinerie de traduction soient chargés sur l'ARN messager. Un tel
chargement est opéré à l'aide soit d'une coiffe ARN (5'CAP) soit à l'aide
d'une
séquence interne d'entrée des ribosomes ou IRES. Ces séquences (5'CAP/IRES)
ont
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également la capacité de stabiliser les ARN messagers sur lesquels ils sont
chargés,
voire même d'exporter les ARN messagers vers leurs sites de traduction.
La coiffe ARN (5'CAP) est un nucléotide modifié que l'on trouve à l'extrémité
5' des
ARN messagers dans les cellules eucaryotes. C'est une modification post-
transcriptionnelle qui est introduite par l'action successive de plusieurs
enzymes
localisées dans le noyau. La coiffe se compose d'une guanosine méthylée en
position
N7, reliée au premier nucléotide de l'ARN messager transcrit par une liaison
5'-5'
triphosphate.
Les IRES permettent le recrutement direct des ribosomes au niveau du codon
initiateur,
indépendamment de la présence de la coiffe et du mécanisme de balayage. Les
IRES
sont des régions structurées de l'ARNm qui interagissent directement avec le
ribosome
ou avec les facteurs d'initiation de la traduction.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le procédé défini
ci-
dessus, dans lequel la molécule d'acide nucléique comprend ladite première
séquence
positionnée en amont, ou en position 5', de ladite troisième séquence.
Afin de coordonner la régulation en cis de la troisième séquence, il est
avantageux que
la première séquence de la molécule d'acides nucléiques hybride soit
positionnée en
amont de la troisième séquence codant le peptide déterminé. Les premières et
troisièmes séquences peuvent être ainsi liées directement, ou adjacentes, mais
peuvent également être séparées par une autre séquence qu'il s'agisse de la
deuxième
séquence ou de tout autre séquence.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le procédé
susmentionné, dans lequel ladite deuxième séquence est positionnée,
- soit en 5' de ladite première séquence,
- soit en 3' de ladite première séquence et en 5' de ladite troisième
séquence,
- soit en 3' de ladite troisième séquence,
- soit comprise dans la troisième séquence.
Les différentes possibilités d'ordonnancement des séquences de la molécule
d'acides
nucléiques hybrides sont illustrées par la Figure 1.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le procédé
tel que
défini ci-dessus, dans laquelle la dite molécule d'acide nucléique est une
molécule
d'acides désoxyribonucléiques, notamment double brin, éventuellement contenu
dans
un vecteur, ou une molécule d'acides ribonucléiques, notamment simple brin.
Comme cela a été mentionné précédemment, la molécule d'acides nucléiques
hybride
est introduite dans une cellule eucaryote. Cette molécule d'acides nucléiques
hybride
peut être introduite sous différentes formes dans la dite cellule eucaryote, à
savoir :
- sous la forme d'un acide ribonucléique ou ARN simple brin, qui sera pris en
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charge par la machinerie de traduction de la cellule eucaryote pour traduire
ledit
au moins un peptide déterminé codé par ladite troisième séquence,
- sous la forme d'un acide désoxyribonucléique ou ADN, en particulier double
brin,
qui devra alors être transcrit en ARN par la machinerie cellulaire de la
cellule
eucaryote, puis traduit, dans ce cas il sera important que la molécule
d'acides
nucléique hybride comprenne, outre les trois séquences susmentionnées, une
séquence permettant la transcription d'un ARN,
- sous la forme d'un vecteur ADN comprenant ladite séquence d'acides
nucléiques
hybride, ce vecteur comprenant des moyens permettant la transcription de la
molécule d'acides nucléiques hybride, notamment un promoteur et
accessoirement une séquence augmentant la transcription (enhancer). Le
vecteur peut alors être un vecteur circulaire, et pouvant comprendre une
origine
de réplication eucaryote ou virale afin qu'il puisse se répliquer de manière
autonome, ou un vecteur linéarisé afin de stimuler son intégration dans la
cellule
eucaryote. Il est par ailleurs avantageux que ledit vecteur comprenne une ou
plusieurs séquences codant des protéines permettant de sélectionner les
cellules qui ont intégré dans leur génome ledit vecteur, par exemple, et sans
être
limitatif,
= des séquences codant des peptides permettant la résistance à
certains antibiotique, comme la puromycine, la néomycine/G148,
la blasticidine, ou encore la zéocine,
= des séquences codants des protéines auto fluorescentes comme
la protéine fluorescente verte et ses dérivés, ou
= des séquences codant des protéines exerçant une sélection
négative sur les cellules qui l'expriment, comme par exemple la
thymidine kinase.
Encore plus avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné,
dans
lequel ladite première séquence est une séquence Kozak représentée, dans sa
version
non modifiée, par la séquence suivante :
5'- ssmRccA(T/U)GG -3' (SEQ ID NO : 1)
où R représente un purine, s représente G ou C et m représente A/U ou C.
Il s'agit de cette séquence SEQ ID NO: 1 qui correspond à la première séquence
de la
molécule d'acides nucléiques hybride qui doit être modifiée par suppression,
ou
délétion ou insertion d'au moins un nucléotide.
Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel
que
défini ci-dessus, dans lequel
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride est une molécule d'acides
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désoxyribonucléiques, notamment double brin, ladite première séquence dans sa
version non modifiée, est représentée par la séquence suivante : 5'-
ssmRccATGG -3'
(SEQ ID NO : 2), ou
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride est une molécule d'acides
ribonucléiques, notamment simple brin, ladite première séquence dans sa
version non
modifiée, est représentée par la séquence suivante : 5'- ssmRccAUGG -3' (SEQ
ID
NO : 3).
Aussi, la séquence SEQ ID NO : 2 couvre les différentes séquences suivantes :
5'-GGCGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 4),
5'-GGCACCATGG-3' (SEQ ID NO: 5),
5'-GGAGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 6),
5'-GGAACCATGG-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-GCCGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-GCCACCATGG-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-GCAGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-GCAACCATGG-3' (SEQ ID NO: 11),
5'-CGCGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 12),
5'-CGCACCATGG-3' (SEQ ID NO: 13),
5'-CGAGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 14),
5'-CGAACCATGG-3' (SEQ ID NO: 15),
5'-000GCCATGG-3' (SEQ ID NO: 16),
5'-000ACCATGG-3' (SEQ ID NO: 17),
5'-CCAGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 18), et
5'-CCAACCATGG-3' (SEQ ID NO: 19).
De la même manière, la séquence SEQ ID NO : 3 couvre les différentes séquences
suivantes :
5'-GGCGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 20),
5'-GGCACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 21),
5'-GGAGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 22),
5'-GGAACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 23),
5'-GCCGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 24),
5'-GCCACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 25),
5'-GCAGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 26),
5'-GCAACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 27),
5'-CGCGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 28),
5'-CGCACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 29),
5'-CGAGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 30),
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5'-CGAACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 31),
5'-000GCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 32),
5'-000ACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 33),
5'-CCAGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 34), et
5'-CCAACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 35).
Avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, dans lequel
ladite
première séquence est une séquence Kozak comprenant ou consistant en, dans sa
version modifiée, l'une des séquences suivantes :
5'- SSMRCCA(T/U)Gt -3' (SEQ ID NO : 36), ou
5'- SSMRCCa(t/u)A(T/U)GG -3' (SEQ ID NO : 37).
Les inventeurs ont constaté de manière surprenante que l'insertion du doublet
A(T/U)
avant le codon initiateur de la traduction de la séquence Kozak, ou la
substitution G->T,
après le codon initiateur de la traduction de la séquence Kozak avait un effet
sur
l'efficacité de traduction de toute séquence sous contrôle de de ces séquences
Kozak
mutées.
Encore plus avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné,
dans
lequel ladite première séquence est une séquence Kozak comprenant ou
consistant en,
dans sa version modifiée :
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride est une molécule
d'acides
désoxyribonucléiques, notamment double brin, l'une quelconque des séquences
suivantes :
5'-GGCGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 38),
5'-GGCACCATGt-3' (SEQ ID NO: 39),
5'-GGAGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 40),
5'-GGAACCATGt-3' (SEQ ID NO: 41),
5'-GCCGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 42),
5'-GCCACCATGt-3' (SEQ ID NO: 43),
5'-GCAGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 44),
5'-GCAACCATGt-3' (SEQ ID NO: 45),
5'-CGCGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 46),
5'-CGCACCATGt-3' (SEQ ID NO: 47),
5'-CGAGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 48),
5'-CGAACCATGt-3' (SEQ ID NO: 49),
5'-000GCCATGt-3' (SEQ ID NO: 50),
5'-000ACCATGt-3' (SEQ ID NO: 51),
5'-CCAGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 52),
5'-CCAACCATGt-3' (SEQ ID NO: 53),
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5'-GGCGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 54),
5'-GGCACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 55),
5'-GGAGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 56),
5'-GGAACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 57),
5'-GCCGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 58),
5'-GCCACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 59),
5'-GCAGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 60),
5'-GCAACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 61),
5'-CGCGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 62),
5'-CGCACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 63),
5'-CGAGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 64),
5'-CGAACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 65),
5'-000GCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 66),
5'-000ACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 67),
5'-CCAGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 68), et
5'-CCAACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 69),
et
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride est une molécule
d'acides
ribonucléiques, notamment simple brin, l'une quelconque des séquences
5'-GGCGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 70),
5'-GGCACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 71),
5'-GGAGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 72),
5'-GGAACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 73),
5'-GCCGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 74),
5'-GCCACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 75),
5'-GCAGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 76),
5'-GCAACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 77),
5'-CGCGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 78),
5'-CGCACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 79),
5'-CGAGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 80),
5'-CGAACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 81),
5'-000GCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 82),
5'-000ACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 83),
5'-CCAGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 84),
5'-CCAACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 85),
5'-GGCGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 86),
5'-GGCACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 87),
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5'-GGAGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 88),
5'-GGAACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 89),
5'-GCCGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 90),
5'-GCCACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 91),
5'-GCAGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 92),
5'-GCAACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 93),
5'-CGCGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 94),
5'-CGCACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 95),
5'-CGAGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 96),
5'-CGAACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 97),
5'-000GCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 98),
5'-000ACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 99),
5'-CCAGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 100), et
5'-CCAACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 101).
Encore plus avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné,
dans
lequel ladite première séquence est une séquence Kozak comprenant ou
consistant en,
dans sa version modifiée en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 38 à
101.
Toujours plus avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné,
dans
lequel ladite première séquence est une séquence Kozak comprenant ou
consistant en,
dans sa version modifiée en l'une quelconque des séquences : SEQ ID NO: 43,
SEQ
ID NO : 46, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO : 68,
SEQ
ID NO: 75, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 94 et
SEQ ID NO :100.
L'invention concerne ainsi avantageusement un procédé de criblage d'acides
nucléiques interférents augmentant :
- l'expression de gènes et/ou
- l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes,
lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins en partie une
complémentarité de séquence avec ledit gène ou ledit ARN, et
ledit procédé comprenant une étape d'introduction, dans une cellule eucaryote,
notamment apte à réaliser de l'interférence à ARN, d'une molécule d'acides
nucléiques
hybride comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction, ladite
première
séquence comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 1, ladite
première
séquence étant modifiée,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire de la séquence
desdits
acides nucléiques interférents à cribler, et
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- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé,
ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la
première
séquence,
ladite première séquence modifiée comprenant ou consistant en l'une quelconque
des séquences SEQ ID NO: 38 à 101, et notamment SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:
46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO:
75, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 94 et SEQ ID
NO :100.
Les définitions précédentes s'appliquent mutatis mutandis.
Ainsi, avantageusement l'invention concerne un procédé de criblage d'acides
nucléiques interférents augmentant :
- l'expression de gènes et/ou
- l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes,
lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins en partie une
complémentarité de séquence avec ledit gène ou ledit ARN, et
ledit procédé comprenant une étape d'introduction, dans une cellule eucaryote,
notamment apte à réaliser de l'interférence à ARN, d'une molécule d'acides
nucléiques
hybride comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire de la séquence
desdits
acides nucléiques interférents à cribler, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé,
ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la
première
séquence,
ladite première séquence modifiée comprenant ou consistant en l'une quelconque
des séquences SEQ ID NO: 38 à 101, et notamment SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:
46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO:
75, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 94 et SEQ ID
NO :100.
L'invention concerne encore plus avantageusement le procédé susmentionné, dans
lequel ladite deuxième séquence comprend de 18 à 10000 nucléotides au moins en
partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à
cribler,
notamment de 18 à 1000, en particulier de 18 à 500, plus particulièrement de
18 à 100
nucléotides consécutifs au moins en partie complémentaire de la séquence
desdits
acides nucléiques interférents à cribler.
Il est souhaitable pour multiplier les chances de cribler des acides
nucléiques
interférents selon l'invention de disposer d'une molécule d'acides nucléiques
hybride
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qui présente une troisième séquence d'une grande taille, qui ne sera jamais
inférieure à
18 nucléotides, taille minimale d'un petit ARN interférent.
Une taille avantageuse de la troisième séquence est de 18 à 500 nucléotides,
ce qui
signifie que la séquence peut comprendre 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29,
30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,
49, 50, 51, 52,
53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,
72, 73, 74, 75,
76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,
95, 96, 97, 98,
99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,
115, 116,
117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,
132, 133,
134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,
149, 150,
151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165,
166, 167,
168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182,
183, 184,
185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199,
200, 201,
202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216,
217, 218,
219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233,
234, 235,
236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250,
251, 252,
253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267,
268, 269,
270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284,
285, 286,
287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301,
302, 303,
304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318,
319, 320,
321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335,
336, 337,
338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352,
353, 354,
355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369,
370, 371,
372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386,
387, 388,
389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403,
404, 405,
406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420,
421, 422,
423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437,
438, 439,
440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454,
455, 456,
457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471,
472, 473,
474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488,
489, 490,
491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ou 500 nucléotides.
Avantageusement, l'invention concerne un procédé tel que défini précédemment,
dans
lequel ledit au moins un peptide est une protéine naturelle ou recombinante,
étiquetée
ou non, notamment une protéine autofluorescente.
La troisième séquence code donc un ou plusieurs peptides, et notamment une ou
plusieurs protéines qui peuvent être étiquetés à l'aide de peptides
immunogènes tels
que les étiquettes (ou tags) FLAG, HA, V5, MYC, HIS, ou étiqueté avec des
protéines
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fluorescentes telles que la GFP, la CFP, la RFP, la mCherry... Cette liste
n'est pas
limitative et ne saurait restreindre la portée de l'invention.
De manière plus avantageuse les peptides utilisés sont l'eGFP codée par la
séquence
SEQ ID NO :102, la cycline D1 (CD1) murine codée par la séquence SEQ ID NO :
103,
la protéine Hras murine codée par la séquence SEQ ID NO: 104 ou l'exportine 1
(XPO)
codée par la séquence SEQ ID NO : 105. Les étiquettes avantageuses sont les
suivantes : l'étiquette Flag codée par la séquence SEQ ID NO : 106,
l'étiquette HA
codée par la séquence SEQ ID NO :107, l'étiquette Ntag codée par la séquence
SEQ
ID NO :108, l'étiquette V5 codée par la séquence SEQ ID NO :109, l'étiquette
Myc
codée par la séquence SEQ Dl NO: 110 ou encore l'étiquette Ctag codée par la
séquence SEQ ID NO : 111.
Aussi, les peptides étiquetés pouvant être utilisés dans le cadre de
l'invention sont
notamment : Myc-XPO codé par la séquence SEQ ID NO :112, XPO-V5 codée par la
séquence SEQ ID NO : 113, Myc-XPO-V5 codée par la séquence SEQ Dl NO :114,
Ha-CD1 codée par la séquence SEQ ID NO : 115
L'invention concerne en outre une molécule d'acides nucléiques hybride
comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire d'au moins un acide
nucléique interférent, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé,
ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la
première
séquence,
ladite première séquence étant modifiée, par substitution, délétion ou
addition
d'au moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction dudit au moins
un
peptide est diminuée d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit
au
moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non
modifiée, notamment optimale.
De telles molécules d'acides nucléiques hybrides sont nouvelles et n'existent
pas à
l'état naturel puisqu'il s'agit de molécules artificielles constituées de
fragments de
molécules issus d'origines et de localisations génomiques différentes.
Avantageusement, l'invention concerne une molécule d'acides nucléiques hybride
telle
que définie ci-dessus, dans laquelle ladite première séquence est une séquence
d'initiation de la transcription de type Kozak, en aval d'un site d'entrée
interne des
ribosomes ou IRES, ou d'une coiffe (5'cap).
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une
molécule
d'acides nucléiques hybride susmentionnée, dans laquelle ladite première
séquence
est une séquence Kozak représentée, dans sa version non modifiée, par la
séquence
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suivante :
5'- ssmRccA(T/U)GG -3' (SEQ ID NO : 1)
où R représente un purine, s représente G ou C et m représente A/U ou C.
Avantageusement, l'invention concerne une molécule d'acides nucléiques hybride
susmentionnée, dans laquelle ladite première séquence est une séquence Kozak
comprenant ou consistant en, dans sa version non modifiée, l'une des séquences
suivantes : SEQ ID NO : 4 à SEQ ID NO : 35.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une
molécule
d'acides nucléiques hybride telle que définie précédemment, dans laquelle
ladite
première séquence modifiée est choisie parmi :
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride une molécule d'acides
désoxyribonucléiques, notamment double brin, l'une quelconque des séquences
SEQ
ID NO : 38 à 69, et
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride une molécule d'acides
ribonucléiques, notamment simple brin, l'une quelconque des séquences SEQ ID
NO:
70 à 101.
Encore plus avantageusement, l'invention concerne une molécule d'acides
nucléiques
hybride définie ci-dessus, ladite molécule d'acide nucléique étant choisie
parmi les
molécules de séquence suivante : SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO : 117, SEQ ID NO :
118, SEQ ID NO : 119, SEQ ID NO : 120, SEQ ID NO : 121, SEQ ID NO : 122, SEQ
ID
NO : 123, SEQ ID NO : 124, SEQ ID NO : 125, SEQ ID NO : 126, SEQ ID NO : 127
et
SEQ ID NO :128.
SEQ ID NO GCCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCACAGAA
116: TACAAGCTTGTGGTGGTGGGCGCTGGAGGCGTGGGAAAGAGT
KOZopt-HA- GCCCTGACCATCCAGCTGATCCAGAACCACTTTGTGGACGAGT
ras- Flag ATGATCCCACTATAGAGGACTCCTACCGGAAACAGGTGGTCAT
TGATGGGGAGACATGTCTACTGGACATCTTAGACACAGCAGGT
CAAGAAGAGTATAGTGCCATGCGGGACCAGTACATGCGCACAG
GGGAGGGCTTCCTCTGTGTATTTGCCATCAACAACACCAAGTC
CTTCGAGGACATCCATCAGTACAGGGAGCAGATCAAGCGGGT
GAAAGATTCAGATGATGTGCCAATGGTGCTGGTGGGCAACAAG
TGTGACCTGGCTGCTCGCACTGTTGAGTCTCGGCAGGCCCAG
GACCTTGCTCGCAGCTATGGCATCCCCTACATTGAAACATCAG
CCAAGACCCGGCAGGGCGTGGAGGATGCCTTCTATACACTAG
TCCGTGAGATTCGGCAGCATAAATTGCGGAAACTGAACCCACC
CGATGAGAGTGGTCCTGGCTGCATGAGCTGCAAATGTGTGCT
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GTCCGACTACAAGGACGACGATGACAAG
SEQ ID NO GCCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCACAGAA
117 TACAAGCTTGTGGTGGTGGGCGCTGtAGGCGTGGGAAAGAGT
KOZopt- HA- GCCCTGACCATCCAGCTGATCCAGAACCACTTTGTGGACGAGT
rasG12v-Flag ATGATCCCACTATAGAGGACTCCTACCGGAAACAGGTGGTCAT
TGATGGGGAGACATGTCTACTGGACATCTTAGACACAGCAGGT
CAAGAAGAGTATAGTGCCATGCGGGACCAGTACATGCGCACAG
GGGAGGGCTTCCTCTGTGTATTTGCCATCAACAACACCAAGTC
CTTCGAGGACATCCATCAGTACAGGGAGCAGATCAAGCGGGT
GAAAGATTCAGATGATGTGCCAATGGTGCTGGTGGGCAACAAG
TGTGACCTGGCTGCTCGCACTGTTGAGTCTCGGCAGGCCCAG
GACCTTGCTCGCAGCTATGGCATCCCCTACATTGAAACATCAG
CCAAGACCCGGCAGGGCGTGGAGGATGCCTTCTATACACTAG
TCCGTGAGATTCGGCAGCATAAATTGCGGAAACTGAACCCACC
CGATGAGAGTGGTCCTGGCTGCATGAGCTGCAAATGTGTGCT
GTCCGACTACAAGGACGACGATGACAAG
SEQ ID NO CGCGCCATatgGIAACACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTGGAGAC
118 CATCCGCCGCGCGTACCCTGACACCAATCTCCTCAACGACCG
m Koz-AT- GGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGAGACCTGTGCGC
mC D 1-Ctag CCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGTGCAGAAGGAGATTGTGCC
ATCCATGCGGAAAATCGTGGCCACCTGGATGCTGGAGGTCTGT
GAGGAGCAGAAGTGCGAAGAGGAGGTCTTCCCGCTGGCCAT
GAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCCCTGGAGCCCTTGAAGAA
GAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACCTGCATGTTCGTGG
CCTCTAAGATGAAGGAGACCATTCCCTTGACTGCCGAGAAGTT
GTGCATCTACACTGACAACTCTATCCGGCCCGAGGAGCTGCTG
CAAATGGAACTGCTTCTGGTGAACAAGCTCAAGTGGAACCTGG
CCGCCATGACTCCCCACGATTTCATCGAACACTTCCTCTCCAA
AATGCCAGAGGCGGATGAGAACAAGCAGACCATCCGCAAGCA
TGCACAGACCTTTGTGGCCCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTTC
ATTTCCAACCCACCCTCCATGGTAGCTGCTGGGAGCGTGGTG
GCTGCGATGCAAGGCCTGAACCTGGGCAGCCCCAACAACTTC
CTCTCCTGCTACCGCACAACGCACTTTCTTTCCAGAGTCATCA
AGTGTGACCCGGACTGCCTCCGTGCCTGCCAGGAACAGATTG
AAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTGCGCCAGGCCCAGCAGAACG
TCGACCCCAAGGCCACTGAGGAGGAGGGGGAAGTGGAGGAA
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GAGGCTGGTCTGGCCTGCACGCCCACCGACGTGCGAGATGT
GGACATCg cg gccgctg g ag g ag actacaagg acg acg atgacaagtcggccgct
g g agg atacccctacg acg tg cccg actacg cc
SEQ ID NO CGCGCCATatgGIAACACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTGGAGAC
119 CATCCGCCGCGCGTACCCTGACACCAATCTCCTCAACGACCG
m Koz-AT- GGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGAGACCTGTGCGC
mCD 1 CCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGTGCAGAAGGAGATTGTGCC
ATCCATGCGGAAAATCGTGGCCACCTGGATGCTGGAGGTCTGT
GAGGAGCAGAAGTGCGAAGAGGAGGTCTTCCCGCTGGCCAT
GAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCCCTGGAGCCCTTGAAGAA
GAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACCTGCATGTTCGTGG
CCTCTAAGATGAAGGAGACCATTCCCTTGACTGCCGAGAAGTT
GTGCATCTACACTGACAACTCTATCCGGCCCGAGGAGCTGCTG
CAAATGGAACTGCTTCTGGTGAACAAGCTCAAGTGGAACCTGG
CCGCCATGACTCCCCACGATTTCATCGAACACTTCCTCTCCAA
AATGCCAGAGGCGGATGAGAACAAGCAGACCATCCGCAAGCA
TGCACAGACCTTTGTGGCCCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTTC
ATTTCCAACCCACCCTCCATGGTAGCTGCTGGGAGCGTGGTG
GCTGCGATGCAAGGCCTGAACCTGGGCAGCCCCAACAACTTC
CTCTCCTGCTACCGCACAACGCACTTTCTTTCCAGAGTCATCA
AGTGTGACCCGGACTGCCTCCGTGCCTGCCAGGAACAGATTG
AAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTGCGCCAGGCCCAGCAGAACG
TCGACCCCAAGGCCACTGAGGAGGAGGGGGAAGTGGAGGAA
GAGGCTGGTCTGGCCTGCACGCCCACCGACGTGCGAGATGT
GGACATC
SEQ ID NO CGCGCCATatggactacaaggacgacgatgacaagctcgatggaggataccccta
120 cg acgtgcccgactacgccggagg actcgagGAACACCAGCTCCTGTGCTG
m Koz-AT- CGAAGTGGAGACCATCCGCCGCGCGTACCCTGACACCAATCT
Ntag- mC D 1 CCTCAACGACCGGGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGA
GACCTGTGCGCCCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGTGCAGAAG
GAGATTGTGCCATCCATGCGGAAAATCGTGGCCACCTGGATGC
TGGAGGTCTGTGAGGAGCAGAAGTGCGAAGAGGAGGTCTTCC
CGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCCCTGGAGC
CCTTGAAGAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACCTGCA
TGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGGAGACCATTCCCTTGACTGC
CGAGAAGTTGTGCATCTACACTGACAACTCTATCCGGCCCGAG
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GAGCTGCTGCAAATGGAACTGCTTCTGGTGAACAAGCTCAAGT
GGAACCTGGCCGCCATGACTCCCCACGATTTCATCGAACACTT
CCTCTCCAAAATGCCAGAGGCGGATGAGAACAAGCAGACCAT
CCGCAAGCATGCACAGACCTTTGTGGCCCTCTGTGCCACAGA
TGTGAAGTTCATTTCCAACCCACCCTCCATGGTAGCTGCTGGG
AGCGTGGTGGCTGCGATGCAAGGCCTGAACCTGGGCAGCCC
CAACAACTTCCTCTCCTGCTACCGCACAACGCACTTTCTTTCC
AGAGTCATCAAGTGTGACCCGGACTGCCTCCGTGCCTGCCAG
GAACAGATTGAAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTGCGCCAGGCC
CAGCAGAACGTCGACCCCAAGGCCACTGAGGAGGAGGGGGA
AGTGGAGGAAGAGGCTGGTCTGGCCTGCACGCCCACCGACG
TGCGAGATGTGGACATC
SEQ ID NO CCAGCCATGtacccctacgacgtgcccgactacgccctcgatggaggagactacaa
121 ggacgacg
atgacaagggaggactcg ag GAACACCAGCTCCTGTGCTGC
hKOZ-HA-
GAAGTGGAAACCATCCGCCGCGCGTACCCCGATGCCAACCTC
FLAG-hCD1 CTCAACGACCGGGTGCTGCGGGCCATGCTGAAGGCGGAGGA
GACCTGCGCGCCCTCGGTGTCCTACTTCAAATGTGTGCAGAA
GGAGGTCCTGCCGTCCATGCGGAAGATCGTCGCCACCTGGAT
GCTGGAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTGCGAGGAGGAGGTCT
TCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCGCTGG
AGCCCGTGAAAAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACT
TGCATGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGGAGACCATCCCCCTGA
CGGCCGAGAAGCTGTGCATCTACACCGACAACTCCATCCGGC
CCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGCTGCTCCTGGTGAACAAGC
TCAAGTGGAACCTGGCCGCAATGACCCCGCACGATTTCATTGA
ACACTTCCTCTCCAAAATGCCAGAGGCGGAGGAGAACAAACA
GATCATCCGCAAACACGCGCAGACCTTCGTTGCCCTCTGTGC
CACAGATGTGAAGTTCATTTCCAATCCGCCCTCCATGGTGGCA
GCGGGGAGCGTGGTGGCCGCAGTGCAAGGCCTGAACCTGAG
GAGCCCCAACAACTTCCTGTCCTACTACCGCCTCACACGCTTC
CTCTCCAGAGTGATCAAGTGTGACCCGGACTGCCTCCGGGCC
TGCCAGGAGCAGATCGAAGCCCTGCTGGAGTCAAGCCTGCGC
CAGGCCCAGCAGAACATGGACCCCAAGGCCGCCGAGGAGGA
GGAAGAGGAGGAGGAGGAGGTGGACCTGGCTTGCACACCCA
CCGACGTGCGGGACGTGGACATC
SEQ ID NO
CCAGCCATatgg actacaagg acg acgatg acaag GAACACCAGCTCCT
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122 GTGCTGCGAAGTGGAAACCATCCGCCGCGCGTACCCCGATGC
hKoz-AT- CAACCTCCTCAACGACCGGGTGCTGCGGGCCATGCTGAAGGC
FLAG-hCD1- GGAGGAGACCTGCGCGCCCTCGGTGTCCTACTTCAAATGTGT
HA GCAGAAGGAGGTCCTGCCGTCCATGCGGAAGATCGTCGCCAC
CTGGATGCTGGAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTGCGAGGAGG
AGGTCTTCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTC
GCTGGAGCCCGTGAAAAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGG
CCACTTGCATGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGGAGACCATCCC
CCTGACGGCCGAGAAGCTGTGCATCTACACCGACAACTCCAT
CCGGCCCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGCTGCTCCTGGTGAA
CAAGCTCAAGTGGAACCTGGCCGCAATGACCCCGCACGATTT
CATTGAACACTTCCTCTCCAAAATGCCAGAGGCGGAGGAGAAC
AAACAGATCATCCGCAAACACGCGCAGACCTTCGTTGCCCTCT
GTGCCACAGATGTGAAGTTCATTTCCAATCCGCCCTCCATGGT
GGCAGCGGGGAGCGTGGTGGCCGCAGTGCAAGGCCTGAACC
TGAGGAGCCCCAACAACTTCCTGTCCTACTACCGCCTCACACG
CTTCCTCTCCAGAGTGATCAAGTGTGACCCGGACTGCCTCCG
GGCCTGCCAGGAGCAGATCGAAGCCCTGCTGGAGTCAAGCCT
GCGCCAGGCCCAGCAGAACATGGACCCCAAGGCCGCCGAGG
AGGAGGAAGAGGAGGAGGAGGAGGTGGACCTGGCTTGCACA
CCCACCGACGTGCGGGACGTGGACATCtacccctacgacgtgcccgact
acgcc
SEQ ID NO CCAGCCATatggactacaaggacgacgatgacaagctcgatggaggatacccctac
123 gacgtgcccgactacgccggaggactcgagGAACACCAGCTCCTGTGCTG
hKoz-AT-Ntag- CGAAGTGGAAACCATCCGCCGCGCGTACCCCGATGCCAACCT
hCD1 CCTCAACGACCGGGTGCTGCGGGCCATGCTGAAGGCGGAGG
AGACCTGCGCGCCCTCGGTGTCCTACTTCAAATGTGTGCAGAA
GGAGGTCCTGCCGTCCATGCGGAAGATCGTCGCCACCTGGAT
GCTGGAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTGCGAGGAGGAGGTCT
TCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCGCTGG
AGCCCGTGAAAAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACT
TGCATGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGGAGACCATCCCCCTGA
CGGCCGAGAAGCTGTGCATCTACACCGACAACTCCATCCGGC
CCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGCTGCTCCTGGTGAACAAGC
TCAAGTGGAACCTGGCCGCAATGACCCCGCACGATTTCATTGA
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ACACTTCCTCTCCAAAATGCCAGAGGCGGAGGAGAACAAACA
GATCATCCGCAAACACGCGCAGACCTTCGTTGCCCTCTGTGC
CACAGATGTGAAGTTCATTTCCAATCCGCCCTCCATGGTGGCA
GCGGGGAGCGTGGTGGCCGCAGTGCAAGGCCTGAACCTGAG
GAGCCCCAACAACTTCCTGTCCTACTACCGCCTCACACGCTTC
CTCTCCAGAGTGATCAAGTGTGACCCGGACTGCCTCCGGGCC
TGCCAGGAGCAGATCGAAGCCCTGCTGGAGTCAAGCCTGCGC
CAGGCCCAGCAGAACATGGACCCCAAGGCCGCCGAGGAGGA
GGAAGAGGAGGAGGAGGAGGTGGACCTGGCTTGCACACCCA
CCGACGTGCGGGACGTGGACATC
SEQ ID NO : g actacaaggacgacgatg acaag GCCACCatATGGIAACACCAGCTCCT
124 GTGCTGCGAAGTGGAGACCATCCGCCGCGCGTACCCTGACAC
FLAG-KOZopt- CAATCTCCTCAACGACCGGGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGAC
AT- mC D1- HA GGAGGAGACCTGTGCGCCCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGT
GCAGAAGGAGATTGTGCCATCCATGCGGAAAATCGTGGCCAC
CTGGATGCTGGAGGTCTGTGAGGAGCAGAAGTGCGAAGAGGA
GGTCTTCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTC
CCTGGAGCCCTTGAAGAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGG
CCACCTGCATGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGGAGACCATTCC
CTTGACTGCCGAGAAGTTGTGCATCTACACTGACAACTCTATC
CGGCCCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAACTGCTTCTGGTGAAC
AAGCTCAAGTGGAACCTGGCCGCCATGACTCCCCACGATTTCA
TCGAACACTTCCTCTCCAAAATGCCAGAGGCGGATGAGAACAA
GCAGACCATCCGCAAGCATGCACAGACCTTTGTGGCCCTCTG
TGCCACAGATGTGAAGTTCATTTCCAACCCACCCTCCATGGTA
GCTGCTGGGAGCGTGGTGGCTGCGATGCAAGGCCTGAACCT
GGGCAGCCCCAACAACTTCCTCTCCTGCTACCGCACAACGCA
CTTTCTTTCCAGAGTCATCAAGTGTGACCCGGACTGCCTCCGT
GCCTGCCAGGAACAGATTGAAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTG
CGCCAGGCCCAGCAGAACGTCGACCCCAAGGCCACTGAGGA
GGAGGGGGAAGTGGAGGAAGAGGCTGGTCTGGCCTGCACGC
CCACCGACGTGCGAGATGTGGACATCTACCCCTACGACGTGC
CCGACTACGCC
SEQ ID NO : GCCACCatATGG AACACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTGGAGA
125 CCATCCGCCGCGCGTACCCTGACACCAATCTCCTCAACGACC
KOZopt-AT- GGGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGAGACCTGTGCG
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mCD1-HA- CCCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGTGCAGAAGGAGATTGTGC
STOP-FLAG CATCCATGCGGAAAATCGTGGCCACCTGGATGCTGGAGGTCT
GTGAGGAGCAGAAGTGCGAAGAGGAGGTCTTCCCGCTGGCC
ATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCCCTGGAGCCCTTGAAGA
AGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACCTGCATGTTCGTG
GCCTCTAAGATGAAGGAGACCATTCCCTTGACTGCCGAGAAGT
TGTGCATCTACACTGACAACTCTATCCGGCCCGAGGAGCTGCT
GCAAATGGAACTGCTTCTGGTGAACAAGCTCAAGTGGAACCTG
GCCGCCATGACTCCCCACGATTTCATCGAACACTTCCTCTCCA
AAATGCCAGAGGCGGATGAGAACAAGCAGACCATCCGCAAGC
ATGCACAGACCTTTGTGGCCCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTT
CATTTCCAACCCACCCTCCATGGTAGCTGCTGGGAGCGTGGT
GGCTGCGATGCAAGGCCTGAACCTGGGCAGCCCCAACAACTT
CCTCTCCTGCTACCGCACAACGCACTTTCTTTCCAGAGTCATC
AAGTGTGACCCGGACTGCCTCCGTGCCTGCCAGGAACAGATT
GAAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTGCGCCAGGCCCAGCAGAAC
GTCGACCCCAAGGCCACTGAGGAGGAGGGGGAAGTGGAGGA
AGAGGCTGGTCTGGCCTGCACGCCCACCGACGTGCGAGATGT
GGACATCTACCCACGACGTGCCCGACTACGCCTGAgactacaagg
acgacgatgacaag
SEQ ID NO: gactacaaggacgacgatgacaagGGAAGAGCGCCAGCCatATGGAAC
126
ACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTGGAAACCATCCGCCGCGCGT
FLAG-hKoz- ACCCCGATGCCAACCTCCTCAACGACCGGGTGCTGCGGGCCA
AT-hCD1-
TGCTGAAGGCGGAGGAGACCTGCGCGCCCTCGGTGTCCTACT
STOP-HA
TCAAATGTGTGCAGAAGGAGGTCCTGCCGTCCATGCGGAAGA
TCGTCGCCACCTGGATGCTGGAGGTCTGCGAGGAACAGAAGT
GCGAGGAGGAGGTCTTCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACC
GCTTCCTGTCGCTGGAGCCCGTGAAAAAGAGCCGCCTGCAGC
TGCTGGGGGCCACTTGCATGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGG
AGACCATCCCCCTGACGGCCGAGAAGCTGTGCATCTACACCG
ACAACTCCATCCGGCCCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGCTGC
TCCTGGTGAACAAGCTCAAGTGGAACCTGGCCGCAATGACCC
CGCACGATTTCATTGAACACTTCCTCTCCAAAATGCCAGAGGC
GGAGGAGAACAAACAGATCATCCGCAAACACGCGCAGACCTT
CGTTGCCCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTTCATTTCCAATCCG
CCCTCCATGGTGGCAGCGGGGAGCGTGGTGGCCGCAGTGCA
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WO 2016/046508
PCT/FR2015/052572
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AGGCCTGAACCTGAGGAGCCCCAACAACTTCCTGTCCTACTAC
CGCCTCACACGCTTCCTCTCCAGAGTGATCAAGTGTGACCCG
GACTGCCTCCGGGCCTGCCAGGAGCAGATCGAAGCCCTGCT
GGAGTCAAGCCTGCGCCAGGCCCAGCAGAACATGGACCCCAA
GGCCGCCGAGGAGGAGGAAGAGGAGGAGGAGGAGGTGGAC
CTGGCTTGCACACCCACCGACGTGCGGGACGTGGACATCTGA
tacccctacgacgtgcccgactacgcc
SEQ ID NO : gccaccATATGG AACAGAAACTGATTAGCGAAGAGGATCTGGCT
127
GCCACTCGATATGAACCCGTGGCTGAAATTGGTGTCGGTGCCT
KOZopt-AT- ATGGGACGGTGTACAAAGCCCGAGATCCCCACAGTGGCCACT
Myc-C D K4-V5 TTGTGGCCCTCAAGAGTGTGAGAGTTCCTAATGGAGGAGCAG
CTGGAGGGGGCCTTCCCGTCAGCACAGTTCGTGAGGTGGCC
TTGTTAAGGAGGCTGGAGGCCTTTGAACATCCCAATGTTGTAC
GGCTGATGGATGTCTGTGCTACTTCCCGAACTGATCGGGACAT
CAAGGTCACCCTAGTGTTTGAGCATATAGACCAGGACCTGAGG
ACATACCTGGACAAAGCACCTCCACCGGGCCTGCCGGTTGAG
ACCATTAAGGATCTAATGCGTCAGTTTCTAAGCGGCCTGGATTT
TCTTCATGCAAACTGCATTGTTCACCGGGACCTGAAGCCAGAG
AACATTCTAGTGACAAGTAATGGGACCGTCAAGCTGGCTGACT
TTGGCCTAGCTAGAATCTACAGCTACCAGATGGCCCTCACGCC
TGTGGTGGTTACGCTCTGGTACCGAGCTCCTGAAGTTCTTCTG
CAGTCTACATACGCAACACCCGTGGACATGTGGAGCGTTGGCT
GTATCTTTGCAGAGATGTTCCGTCGGAAGCCTCTCTTCTGTGG
AAACTCTGAAGCCGACCAGTTGGGGAAAATCTTTGATCTCATT
GGATTGCCTCCAGAAGACGACTGGCCTCGAGAGGTATCTCTAC
CTCGAGGAGCCTTTGCCCCCAGAGGGCCTCGGCCAGTGCAG
TCAGTGGTGCCAGAGATGGAGGAGTCTGGAGCGCAGCTGCTA
CTGGAAATGCTGACCTTTAACCCACATAAGCGAATCTCTGCCTT
CCGAGCCCTGCAGCACTCCTACCTGCACAAGGAGGAAAGCGA
CGCAGAGGGCAAACCGATTCCGAACCCGCTGCTGGGCCTGGA
TAGCACC
SEQ ID NO : g actacaaggacgacgatg acaag GCCACCatATGGgaACAGAATACAAG
128
CTTGTGGTGGTGGGCGCTGGAGGCGTGGGAAAGAGTGCCCT
FLAG-KOZopt- GACCATCCAGCTGATCCAGAACCACTTTGTGGACGAGTATGAT
AT-G ly- Ras-
CCCACTATAGAGGACTCCTACCGGAAACAGGTGGTCATTGATG
HA
GGGAGACATGTCTACTGGACATCTTAGACACAGCAGGTCAAGA
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AGAGTATAGTGCCATGCGGGACCAGTACATGCGCACAGGGGA
GGGCTTCCTCTGTGTATTTGCCATCAACAACACCAAGTCCTTC
GAGGACATCCATCAGTACAGGGAGCAGATCAAGCGGGTGAAA
GATTCAGATGATGTGCCAATGGTGCTGGTGGGCAACAAGTGTG
ACCTGGCTGCTCGCACTGTTGAGTCTCGGCAGGCCCAGGACC
TTGCTCGCAGCTATGGCATCCCCTACATTGAAACATCAGCCAA
GACCCGGCAGGGCGTGGAGGATGCCTTCTATACACTAGTCCG
TGAGATTCGGCAGCATAAATTGCGGAAACTGAACCCACCCGAT
GAGAGTGGTCCTGGCTGCATGAGCTGCAAATGTGTGCTGTCC
TACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCC
Dans le tableau ci-dessus, la première séquence, dans sa version mutée, est
indiquée
par un cadre.
Ces exemples de molécule d'acides nucléiques hybrides illustrent, de manière
non
limitative les différentes possibilités couvertes par l'invention, et par
exemple :
- dans la séquence SEQ ID NO; 128, la première séquence est encadrée, la
deuxième séquence est en 3' de la première séquence, et la troisième séquence
est en 5' de la première séquence. Cette molécule d'acide nucléique hybride
permet idéalement de sélectionner des acides nucléiques augmentant
l'expression du peptide FLAG.
- dans la séquence SEQ ID NO: 126 ou 125, la première séquence est encadrée,
la deuxième séquence est en 3' de la première séquence, et la troisième
séquence est en 3' de la deuxième séquence. Cette molécule d'acide nucléique
hybride permet idéalement de sélectionner des acides nucléiques augmentant
l'expression du peptide HA ou FLAG, respectivement.
Bien évidemment, comme mentionné ci-dessus, la deuxième et la troisième
séquence
peuvent être superposées, c'est-à-dire qu'une partie de la deuxième séquence
correspond à la troisième séquence. Aussi, les molécules d'acides nucléiques
hybrides
telles qu'illustrées par les séquences SEQ ID NO : 116 à 128 permettent donc
aussi de
sélectionner des acides nucléiques interférents contre la protéine cycline D1,
murine ou
humaine, ou encore la protéine Ras.
Chacune des séquences susmentionnées, lorsqu'il n'est pas mentionné STOP
(codon
souligné dans les séquences SEQ ID NO : 125 et 126) dans sa dénomination (sous
le
numéro de séquence) est terminée par un codon terminateur TAG, TAA ou TGA.
Du fait de la complémentarité des bases, l'homme du métier est capable de
déterminer
les correspondances des séquences susmentionnées en ARN.
De manière avantageuse, la molécule d'acides nucléiques hybride susmentionnée
est
contenue dans un vecteur, notamment un vecteur eucaryote.
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Plus avantageusement les vecteurs sont constitués essentiellement des
séquences
suivantes : pBABE, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO :
129
ou 130 ou MSCV, notamment représenté par la séquence SEQ ID NO : 131.
En outre, l'invention concerne une cellule eucaryote comprenant au moins une
molécule d'acides nucléiques hybride telle que définie ci-dessus. L'invention
concerne
également un animal, notamment un mammifère, en particulier un rongeur
comprenant
au moins une molécule d'acides nucléiques hybride telle que définie ci-dessus.
L'invention embrasse tout type de cellule eucaryote capable d'interférence à
ARN.
L'homme du métier, avec ses connaissances générales des cellules eucaryotes
cultivées in vitro est capable d'identifier aisément les cellules appropriées
et de
déterminer les méthodes de transformation ou transfection pour y introduire la
molécule
d'acides nucléiques définie ci-dessus.
L'invention concerne de plus une molécule d'acides nucléiques hybride
intermédiaire
comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction, telle
que
définie précédemment,
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé,
ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la
première
séquence, telle que définie précédemment,
et au moins un site de coupure par une enzyme de restriction, permettant
l'insertion
d'une molécule d'acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'un acide
nucléique interférent,
ladite première séquence étant modifiée, par substitution, délétion ou
addition d'au
moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction dudit au moins un
peptide est
diminuée d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit au moins un
peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non
modifiée,
notamment optimale.
Avantageusement, l'invention concerne la molécule susmentionnée dans lequel
ladite première séquence est une séquence Kozak représentée, dans sa version
non
modifiée, par la séquence suivante :
5'- ssmRccA(T/U)GG -3' (SEQ ID NO : 1)
où R représente un purine, s représente G ou C et m représente A/U ou C, et
notamment dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak
comprenant
ou consistant en, dans sa version modifiée, l'une des séquences suivantes :
SEQ ID
NO :4 ou SEQ ID NO : 5.
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Cette molécule d'acides nucléiques hybride intermédiaire est en fait la
structure de
base de la molécule d'acides nucléiques hybride susmentionnée, ledit au moins
un site
de coupure par une enzyme de restriction permettant le clonage de ladite
deuxième
séquence selon le gène pour lequel il est souhaitable de cribler des acides
nucléiques
interférents augmentant l'expression dudit gène et/ou l'activité dudit gène
et/ou d'acides
ribonucléiques transcrits dudit gène.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une molécule d'acide
nucléique
telle que définie précédemment, pour le criblage, notamment in vitro, d'acides
nucléiques interférents augmentant l'expression de gènes et/ou l'activité de
gènes et/ou
d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes.
L'invention concerne par ailleurs un kit, ou une trousse, comprenant :
- au moins une molécule d'acides nucléiques hybride telle que décrite
précédemment, et
- au moins une cellule eucaryote.
Une trousse ou un kit selon l'invention peut également comprendre :
- au moins une molécule d'acides nucléiques hybride telle que décrite
précédemment, et
- des moyens de transformation d'une cellule eucaryote par ladite molécule
d'acides nucléiques hybride.
Une trousse ou un kit selon l'invention peut également comprendre :
- au moins une molécule d'acides nucléiques hybride telle que décrite
précédemment, et
o des moyens de transformation d'une cellule eucaryote par ladite
molécule
d'acides nucléiques hybride, et/ou
o au moins une cellule eucaryote, capable d'interférence à ARN.
Les moyens de transformation utilisés peuvent être des moyens de
transformation des
cellules eucaryotes tels que des moyens de transformation des cellules au
phosphate
de calcium, des moyens de transformation avec des liposomes, des moyens de
transformation avec des agents poly cationiques ou encore de moyens de
transformation par électrolocation ou nucléofection.
L'invention concerne également un kit ou une trousse comprenant :
- au moins une molécule d'acides nucléiques hydride telle que définie ci-
dessus,
ladite molécule étant contenue dans une cellule eucaryote, et
- des moyens de transformation de ladite cellule par des acides nucléiques
interférents.
On notera que dans tout ce qui précède, il est utilisé le terme
transformation de
cellule au sens d'introduction de molécule(s) d'acides nucléiques exogène(s)
dans la
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cellule eucaryote considérée. L'homme du métier comprendra ainsi que cette
notion de
transformation correspond à la notion de transfection communément utilisée
dans
l'état de la technique.
L'invention sera mieux comprise à la lumière des figures et des exemples
décrits ci-
après.
Brève description des figures
La figure 1 décrit de manière schématique les différents types de molécules
d'acides
nucléiques hybrides décrites dans l'invention. 1 représente schématiquement la
première séquence, 2 représente schématiquement la deuxième séquence et 3
représente schématiquement la troisième séquence. 3* représente la troisième
séquence dans laquelle a été insérée la seconde séquence. n représente une
séquence qui n'est ni la première ni la deuxième ni la troisième séquence.
La figure 2 représente les diagrammes issus du séquençage de la première
séquence
de la molécule d'acide nucléique hybride présentant une première séquence non
mutée
(diagramme du haut) et de la première séquence de la molécule d'acide
nucléique
hybride présentant une première séquence mutée pat une insertion d'un
dinucléotide
AT, indiqué par l'éclipse (diagramme du haut).
La figure 3 représente l'alignement de la molécule d'acide nucléique hybride
SEQ ID
NO: 120 avec les séquences de molécules d'acides nucléiques interférents
testés. Les
numéros de séquence (SEQ ID) sont indiqués.
La figure 4 représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant
la
molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO: 120 et transfectées avec les
siRNA
SEQ ID NO : 138 (1), SEQ ID NO : 140(3), SEQ ID NO : 142 (5), SEQ ID NO : 144
(7),
témoin SEQ ID NO : 161/162 (T.), SEQ ID NO : 150 (F3), SEQ ID NO : 152 (F5),
SEQ
ID NO :153 (F6) ou SEQ ID NO :154 (F-M). Les protéines sont révélées avec un
anticorps anti HA (B.). En contrôle, la charge de protéine est révélée avec un
anticorps
anti actine (A.).
La figure 5 représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant
la
molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO: 120 non transfectées (-) ou
transfectées avec les siRNA témoin SEQ ID NO : 161/162 (T.), SEQ ID NO : 146
(F-N),
SEQ ID NO : 149 (F2), SEQ ID NO : 148 (F), SEQ ID NO : 142 (5) ou SEQ ID NO :
145
(CT). Les protéines sont révélées avec un anticorps anti HA (B.). En contrôle,
la charge
de protéine est révélée avec un anticorps anti actine (A.).
Les figures 6A et 6B représentent la comparaison de l'effet de la mutation de
la
première séquence de la molécule d'acides nucléiques hybride.
La figure 6A représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant
la
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molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 136 transfectées avec les
siRNA
témoin SEQ ID NO :161/162 (T.), SEQ ID NO :150 (F3) ou SEQ ID NO :154 (F-M).
Les protéines sont révélées avec un anticorps anti HA (B.). En contrôle, la
charge de
protéine est révélée avec un anticorps anti actine (A.).
La figure 6A représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant
la
molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO :120 transfectées avec les
siRNA
témoin SEQ ID NO :161/162 (T.), SEQ ID NO :150 (F3) ou SEQ ID NO :154 (F-M).
Les protéines sont révélées avec un anticorps anti HA (B.). En contrôle, la
charge de
protéine est révélée avec un anticorps anti actine (A.).
La figure 7 représente un histogramme de résultats de FRET représentant la
quantité
d'expression de CD1 dans des cellules possédant la séquence SEQ ID NO: 1
transfectées avec l'un des siRNA suivant : SEQ ID NO : 146 (B), SEQ ID NO :
147 (C),
SEQ ID NO : 148 (D), SEQ ID NO : 149 (E), SEQ ID NO : 150 (F), SEQ ID NO : 151
(G), SEQ ID NO : 152 (H), SEQ ID NO : 153 (I), SEQ ID NO : 155 (J), SEQ ID NO
: 156
(K), SEQ ID NO : 154 (L), SEQ ID NO : 137 (M), SEQ IDNO : 138 (N), SEQ ID NO:
139 (0), SEQ ID NO : 140 (P), SEQ ID NO : 141 (Q), SEQ ID NO : 142 (R), SEQ ID
NO :143 (S), SEQ ID NO : 144 (T) ou SEQ ID NO :145 (U), par rapport à des
cellules
possédant la séquence SEQ ID NO : 120 et transfectées avec les siRNA témoin
(SEQ
ID NO : 161/162). Les résultats sont exprimés en pourcentage. En contrôle sont
présentés les résultats obtenus pour des cellules non transfectées (U).
Les siRNA augmentant l'expression sont indiquées par une flèche.
La figure 8 représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant
la
molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 121 et transfectées avec les
siRNA
SEQ ID NO : 139 (2), SEQ ID NO : 140 (3), SEQ ID NO : 142 (5), SEQ ID NO : 144
(7),
témoin SEQ ID NO : 161/162 (T.), SEQ ID NO : 150 (F3), SEQ ID NO : 152 (F5),
SEQ
ID NO :153 (F6) ou SEQ ID NO :154 (F-M). Les protéines sont révélées avec un
anticorps anti HA (B.). En contrôle, la charge de protéine est révélée avec un
anticorps
anti actine (A.).
La figure 9 représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant
la
molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO: 121 et transfectées avec les
siRNA
SEQ ID NO : 139 (2), SEQ ID NO : 140 (3), SEQ ID NO : 142 (5), SEQ ID NO : 144
(7),
témoin SEQ ID NO :161/162 (T.), SEQ ID NO :150 (F3), SEQ ID NO :152 (F5), SEQ
ID NO :153 (F6) ou SEQ ID NO :154 (F-M). Les protéines sont révélées avec un
anticorps anti HA (B.). En contrôle, la charge de protéine est révélée avec un
anticorps
anti actine (A.).
La figure 10 représente un histogramme de résultats de FRET représentant la
quantité
d'expression de CD1 (en unité arbitraire) dans des cellules possédant une
construction
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avec la séquence Kozak murine (A), la séquence Kozak murine mutée par
insertion AT
(B), ou la séquence Kozak optimisée (C). Les barres d'erreurs indiquent
l'écart type
obtenu pour trois expériences indépendantes.
La figure 11 représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant
une
construction avec la séquence Kozak murine (A), la séquence Kozak murine mutée
par
insertion AT (B), ou la séquence Kozak optimisée (C). Le niveau de cycline D1
est
révélé avec un anticorps anti-cycline D1 (1. RB-010-PABX (AB3), Fisher
scientific). En
contrôle, la charge de protéine est révélée avec un anticorps anti actine (2.
ab6276,
Abcam).
La figure 12 représente un histogramme montrant l'abondance des ARN messagers
cyclines D1 dans des cellules possédant une construction avec la séquence
Kozak
murine (A), la séquence Kozak murine mutée par insertion AT (B), ou la
séquence
Kozak optimisée (C).
La figure 13 représente un histogramme de résultats de FRET représentant la
quantité
d'expression de CD1 (en unité arbitraire) dans des cellules possédant l'une
des
constructions suivantes :
- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la
cycline D1 ayant une insertion AT (Ntag-mKozAT) ; barres noires,
- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la
cycline D1 (Ntag-mKoz); barres blanches,
- Cycline D1 étiquetée en C-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la
cycline D1 AT (Ctag-mKozAT) ; barres grises,
- Cycline D1 étiquetée en C-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la
cycline D1 ayant une insertion AT (Ctag-mKozAT) ; barres avec des hachures
penchées, et
- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la
cycline D1 optimisée pour augmenter l'expression (Ntag-KozOPT) ; barres avec
des hachures horizontales,
traitées avec différents siRNA: contrôle non relevant (A) ; siRNA SEQ ID NO :
149/150 (B), siRNA SEQ ID NO : 155 (C), siRNA SEQ ID NO : 154 (D) et siRNA
SEQ ID NO : 142 (C).
EXEMPLES
Exemple 1 : Exemple d'une construction d'une molécule d'acides nucléiques
hybride comprenant la première séquence SEQ ID NO : 37 (insertion AT).
Pour obtenir une construction comprenant une première séquence mutée
représentée
par la séquence SEQ ID NO : 36, les inventeurs ont utilisé une stratégie de
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mutagenèse dirigée en introduisant dans la séquence Kozak SEQ ID NO: 9 un di-
nucléotide AT, par PCR, en utilisant le kit GeneArt (Life technology), selon
les
instructions du fournisseur.
Brièvement, l'insertion se fait au moyen du vecteur matrice comprenant la
séquence
SEQ ID NO : 9 et des oligonucléotides sens et antisens contenant la
mutation/insertion
AT :
sens : 5'-TGGTACGGCgccaccATatggactacaaggac-3' (SEQ ID NO :132),
antisens : 5'-gtccttgtagtccatATggtggcGCCGTACCA-3' (SEQ ID NO : 133).
La réaction de polymérisation en chaine (PCR) se fait dans les conditions
suivantes :
Étape 1-méthylation du plasmide matrice: 20 minutes à 37 C
Etape 2: PCR/mutagénèse
a-1 cycle de 2 minutes à 95 C
b-1 cycle de 30 secondes à 95 C
1 cycle de 30 secondes à 60 C
1 cycle de 4 minutes à 68 C
c- Retour à b 35 fois
d-1 cycle de 5 minutes à 68 C
e-1 un cycle à durée indéterminée à 4 C pour conserver le produit de réaction
Les produits de PCR ainsi obtenu sont alors séquences et les vecteurs
comprenant la
séquence SEQ ID NO : 59 sont sélectionnés.
La figure 2 montre les résultats du séquençage.
Exemple 2: Exemple de construction d'une molécule d'acides nucléiques hybride
comprenant la première séquence SEQ ID NO : 36 (substitution G->"1").
Pour obtenir une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant une première
séquence mutée par substitution du G situé juste après l'ATG par un T, il
suffit :
1-soit de remplacer le tag en ammenant un tag qui debute par T à la place d'un
G (HA
à la place de Flag par exemple),
2-soit on réalise une insertion d'un triplet (1 codon) afin d'ajouter un acide
aminé codé
par un codon commençant par un T. Il faut ajouter 3 bases (ou un multiple de
3) pour
garder le cadre de lecture de la traduction du peptide rapporteur qui suit.
Dans le cas ou la modification de la séquence codante n'a pas d'importance, il
est
aussi possible de réaliser une mutagenèse dirigée comme indiquée à l'exemple
1, en
utilisant les oligonucléotides suivants :
sens : 5'-TGGTACGGCgccaccatgTTRactacaaggac-3' (SEQ ID NO: 157), R étant
une purine
antisens: 5'-gtccttgtagtYAAcatggtggcGCCGTACCA-3' (SEQ ID NO : 158), Y étant
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une pyrimidine.
Exemple 3 : Exemple de transformation de cellules eucaryote par la molécule
d'acides nucléiques hybride
Selon les expériences à mener plusieurs techniques de transfection peuvent
être
utilisées :
a-Transfection à Lipofectamine 83000 (Invitrogen) :
Cette méthode permet de transfecter de manière rapide les cellules de manière
transitoire avec les constructions d'acides nucléiques hybrides. La
transfection est
réalisée selon les instructions du fournisseur.
ID-Infection virale après production de virus contenant les constructions
d'intérêt :
Afin d'obtenir des cellules qui expriment de manière stable une molécule
d'acides
nucléiques hybride selon l'invention, les inventeurs ont tiré avantage de
l'infection
virale.
Le protocole utilisé est le suivant :
Jour 1 : 3x106 cellules 293T en croissance exponentielle sont ensemencées dans
des
boites de 100 mm avec 10 mL de milieu complet (DMEM, 10% sérum de veau foetal,
pénicilline, streptomycine et L-glutamine) et incubée à 37 C toute la nuit.
Jour 2 : 2 à 3 heures avant la transfection, le milieu de culture est changé
afin de limiter
les variations de pH.
Dans un tube, les plasmides suivants sont ajoutés dans l'ordre :
- 12 g de vecteur MSCV ou de vecteur rétroviral comprenant la molécule
d'acides
nucléiques hybrides,
- 6 g de plasmide Gag-pol, et
- 2 g de plasmide Eco, (protéine de reconnaissance virale spécifique de
cellules
murines, utilisée pour des raisons de sécurité liées aux manipulations d'OGM).
Ensuite, 500 L d'eau stérile sont ajoutés aux vecteurs. Puis 500 L de tampon
2x HBS
sont ajoutés, et l'ensemble est agité sans toutefois être soumis à une
agitation au
vortex. Enfin 50 L d'une solution de CaCl2 ph 5,5 est ajoutée, et le mélangé
est agité
sans toutefois être soumis à une agitation au vortex. Le milieu HSB 2x est
préparé de la
manière suivante : dissoudre 0,8 g de NaCI, 0,027 g de Na2HPO4-2H20, et 1.2 g
d'HEPES dans un volume de 90 ml d'eau distillée. Ajuster le pH à 7.05 avec du
NaOH
0,5 N, et ajuster le volume à 100 mL avec de l'eau distillée. Stériliser la
solution en la
filtrant au travers d'un filtre possédant des pores de 0,22 m, et aliquoter
la solution par
5 mL avant congélation à -20 C pour une durée maximum d'un an.
Le mélange est laissé à température ambiante 20 à 30 min avec agitation douce
occasionnelle.
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Le mélange est alors ajouté au milieu de culture et les cellules sont incubées
à 37 C
toute la nuit.
Jour 3 : le matin du troisième jour, environ la moitié du milieu est changé.
Le milieu est
alors conservé à 4 C. L'opération est renouvelée toutes les 6-heures et le
surnageant
conservé à 4 C. Le soir, les surnageant sont mélangés et éventuellement
centrifugés à
1000Orpm toute la nuit.
Jour 4 : Les virus sont récupérés, et le milieu est changé trois fois dans la
journée pour
maintenir les virus infectieux.
Jour 5 : les virus sont filtrés sur un filtre 0,45 lm et utilisés pour
infecter des cellules
NIH3T3 pendant 1 à 2 heures dans un volume de 1,5 à 2 mL comprenant 8 pg/mL de
polybrene. Puis 10 mL de milieu sont ajoutés et les cellules ont incubées
toute la nuit.
Jour 6 : le milieu est changé avec 10 mL de milieu frais.
Jours 8 et 9 : les cellules sont alors analysées par cytométrie de flux pour
tester
l'expression de protéines fluorescentes.
Les cellules sont alors infectées avec la molécule.
Exemple 4 : Exemple de criblage de molécules d'acides nucléiques interférent
augmentant l'expression de gènes et/ou l'activité de gènes et/ou d'acides
ribonucléiques transcrits desdits gènes.
1-Protocole
- culture de cellules,
o les cellules stables exprimant la construction d'acides nucléiques
hybride
sont maintenues en culture sous-confluentes à 37 C, 5%CO2 dans un
incubateur.
- mises en plaque,
Le matin de la transfection des siRNA à cribler, les cellules stock exprimant
la
construction hybride sont traitées à la trypsine pour être décollées du
support de
culture et ensemencées en plaques 24 puits afin d'atteindre une confluence de
cellules adhérentes de 40 à 80% le soir.
- préparation des siRNA et transfection
Les siRNA à tester sont préparés selon le protocole Lipofectamine RNAiMAX
Reagent (Life technologies). Brièvement, 1,5 pl_ de Lipofectamine est diluée
dans 25 pl_ de milieu OPTI-MEM . En parallèle, 5 pmol de siRNA dans 0,51.1.1_
d'eau stérile sont dilués dans 25 pl_ de milieu OPTI-MEM . Les deux solutions
d'OPTI-MEM sont alors mélangées et incubées pendant 5 minutes à
température ambiante.
Le mélange précédent de 50 pl_ est alors ajouté dans chaque puits. Les
cellules
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sont incubées à 37 C jusqu'au lendemain.
- Analyse des résultats
Le lendemain, les cellules sont lavées au PBS puis lysées au moyen d'un
tampon de lyse (TRIS 10mM pH=8, EDTA 1 mM, NP-40 0,05%, +/- inhibiteurs de
protéase-ROCHE-cOmplete) et d'une étape de sonication à raison de 5 cycles
de sonication au bioruptor (Diagenode), composés de 15' de sonication active
(puissance maximum de l'appareil) suivies de 15' de pause, afin de récupérer
les
protéines intra-cellulaires, notamment la protéine de fusion produite par la
séquence hybride. Les lysats protéiques des différentes conditions testées
sont
ensuite normalisés au moyen d'une quantification d'ADN ou de protéines, afin
de
comparer une quantité totale équivalente de matériel issu des différentes
conditions de traitement. Les lysats normalisés sont ensuite analysés en
western
blot à l'aide d'un anticorps spécifique du produit de traduction de la
construction
hybride, ou en mesure de FRET, ou de fluorescence si le produit de traduction
de la construction hybride le permet.
2-Résultats
a-Mutation par insertion AT
Dans une première série d'expériences, les inventeurs ont réalisé un criblage
de
molécules interférentes selon l'invention en utilisant la molécule d'acides
nucléiques
hybride SEQ ID NO: 220. Dans cette molécule la première séquence est
CGCGCCATatgg (SEQ ID NO : 62),
la seconde séquence est:
ACTACAAGGACGACGATGACAAGCTCGATGGAGGATACCCCTACGACGTGCCCGA
CTACGCCGGAGGACTCGAGG (SEQ ID NO : 134), et correspond à un enchainement
FLAG-intercalaire-HA-intercalaire
et la troisième séquence est :
AACACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTGGAGACCATCCGCCGCGCGTACCCTGACAC
CAATCTCCTCAACGACCGGGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGAGACCTGT
GCGCCCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGTGCAGAAGGAGATTGTGCCATCCATGCG
GAAAATCGTGGCCACCTGGATGCTGGAGGTCTGTGAGGAGCAGAAGTGCGAAGA
GGAGGTCTTCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCCCTGGAGCCC
TTGAAGAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACCTGCATGTTCGTGGCCTCTA
AGATGAAGGAGACCATTCCCTTGACTGCCGAGAAGTTGTGCATCTACACTGACAAC
TCTATCCGGCCCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAACTGCTTCTGGTGAACAAGCTCA
AGTGGAACCTGGCCGCCATGACTCCCCACGATTTCATCGAACACTTCCTCTCCAAA
ATGCCAGAGGCGGATGAGAACAAGCAGACCATCCGCAAGCATGCACAGACCTTTG
TGGCCCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTTCATTTCCAACCCACCCTCCATGGTAGCT
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GCTGGGAGCGTGGTGGCTGCGATGCAAGGCCTGAACCTGGGCAGCCCCAACAAC
TTCCTCTCCTGCTACCGCACAACGCACTTTCTTTCCAGAGTCATCAAGTGTGACCC
GGACTGCCTCCGTGCCTGCCAGGAACAGATTGAAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTG
CGCCAGGCCCAGCAGAACGTCGACCCCAAGGCCACTGAGGAGGAGGGGGAAGT
GGAGGAAGAGGCTGGTCTGGCCTGCACGCCCACCGACGTGCGAGATGTGGACAT
C (SEQ ID NO : 135)
Dans les conditions expérimentales telles que décrites ci-dessus, les
inventeurs ont
testés les différents acides nucléiques interférents (siRNA) suivant :
HA linker Nter : GAGCUACCUCCUAUGGGGAUG (SEQ ID NO : 137),
HA: AUGCUGCACGGGCUGAUGCGG (SEQ ID NO :138),
HA 2 : GGGAUGCUGCACGGGCUGAUG (SEQ ID NO : 139),
HA 3 : AUGGGGAUGCUGCACGGGCUG (SEQ ID NO : 140),
HA 4 : UGGGGAUGCUGCACGGGCUGA (SEQ ID NO : 141),
HA 5 : GGGGAUGCUGCACGGGCUGAU (SEQ ID NO : 142),
HA 6 : GGAUGCUGCACGGGCUGAUGC (SEQ ID NO : 143),
HA 7 : GAUGCUGCACGGGCUGAUGCG (SEQ ID NO : 144),
HA Linker Cter : AGCCGGCGACCUCCUAUGGGG (SEQ ID NO : 145),
FLAG N: CUGCUGCUACUGUUCGAGCUA (SEQ ID NO :146),
FLAG N2 : UUCCUGCUGCUACUGUUCGAG (SEQ ID NO : 147),
FLAG : AUGUUCCUGCUGCUACUGUUC (SEQ ID NO : 148),
FLAG V2 : CUGAUGUUCCUGCUGCUACUG (SEQ ID NO : 149),
Flag 3: CUGAUGUUCCUGCUGCUACUG (SEQ ID NO : 150),
FLAG 4 : UGAUGUUCCUGCUGCUACUGU (SEQ ID NO :151),
FLAG 5 : GAUGUUCCUGCUGCUACUGUU (SEQ ID NO : 152),
FLAG 6 : ACCUGAUGUUCCUGCUGCUAC (SEQ ID NO : 153),
FLAG M : AUGUUCCUGCUGCUGCUAUUC (SEQ ID NO :154),
FLAG+Iinker Cter : CUGCUGCUACUGUUCAGCCGG (SEQ ID NO : 155), et
FLAG Cter2 ha ct : UUCCUGCUGCUACUGUUCAGC (SEQ ID NO :156).
Afin de faciliter la lecture, la figure 3 représente l'alignement les
différents acides
nucléiques interférents (siRNA) testés sont sur la séquence de la molécule SEQ
ID
NO :120.
En contrôle de tranfection de siRNA, les siRNA témoins négatifs ( scramble
; T.) sont
également transfectés. Ces siRNA ont la séquence sens suivante : 5'-
UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3' (SEQ ID NO: 161) et le brin complémentaire
possède la séquence suivante : 5'-ACGUGACACA UUCGGAGAAtt -3' (SEQ ID NO:
162).
Les résultats obtenus par Western Blot sont représentés à la Figure 4.
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De cette figure on constate que parmi les différents siRNA testés, le siRNA
Flag M
(SEQ ID NO: 154) permet de détecter un niveau d'expression du peptide marqueur
CD1 plus élevé que le niveau observé avec un témoin non relevant.
Afin de confirmer que la position de la troisième séquence n'avait pas d'effet
sur le
criblage d'acides nucléiques interférents augmentant l'expression, les
inventeurs ont
utilisé la molécule d'acides nucléiques hybrides SEQ ID NO 118.
Les résultats obtenus par Western Blot sont représentés à la Figure 5.
De cette figure on constate que parmi les différents siRNA testés, le siRNA
Flag N
(SEQ ID NO :146) et le siRNA HA-CT (SEQ ID NO : 145) permet de détecter un
niveau
d'expression du peptide marqueur CD1 plus élevé que le niveau observé avec un
témoin non relevant.
Enfin, les inventeurs ont confirmé que seule une molécule d'acides nucléiques
hybride
présentant une première séquence mutée permettait de cribler des molécules
d'acides
nucléiques interférents en comparant l'effet d'un acide nucléique interfèrant
en présente
d'une molécule d'acide nucléiques hybride présentant une première séquence non
mutée (SEQ ID NO :136).
Les résultats obtenus par Western Blot sont représentés aux Figure 6A et 6B.
On constate de cette expérience que le siRNA FLAG M (SEQ ID NO :154) permet de
détecter une augmentation du niveau d'expression de CD1 uniquement lorsque la
molécule d'acides nucléiques hybride comporte une mutation dans sa première
séquence (Figure 6A), mais pas lorsque la première séquence n'est pas mutée
(Figure
6B).
b- Mutation par substitution G->"1"
Dans une seconde série d'expériences, les inventeurs ont réalisé un criblage
de
molécules interférentes selon l'invention en utilisant la molécule d'acides
nucléiques
hybride SEQ ID NO :121. Dans cette la première séquence est CCAGCCATGt (SEQ
ID NO : 52).
En contrôle de transfection de siRNA, les siRNA témoins négatifs ( scramble
; T.)
sont également transfectés. Ces siRNA ont la séquence sens suivante : 5'-
UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3' (SEQ ID NO: 161) et le brin complémentaire
possède la séquence suivante : 5'-ACGUGACACA UUCGGAGAAtt -3' (SEQ ID NO:
162).
Les résultats obtenus par Western Blot sont représentés à la Figure 8.
De cette figure on constate que parmi les différents siRNA testés, le siRNA
Flag M
(SEQ ID NO: 154) permet de détecter un niveau d'expression du peptide marqueur
CD1 plus élevé que le niveau observé avec un témoin non relevant. On observe
donc
les mêmes résultats que ceux obtenus pour la molécule d'acides nucléiques
hybride
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SEQ ID NO :120.
Les inventeurs ont confirmé que seule une molécule d'acides nucléiques hybride
présentant une première séquence mutée permettait de cribler des molécules
d'acides
nucléiques interférents en comparant l'effet d'un acide nucléique interfèrant
en
présence d'une molécule d'acide nucléiques hybride présentant une première
séquence non mutée (SEQ ID NO :136).
Les résultats obtenus par Western Blot sont représentés à la Figure 9.
On constate de cette expérience que le siRNA FLAG M (SEQ ID NO :154) permet de
détecter une augmentation du niveau d'expression de CD1 uniquement lorsque la
molécule d'acides nucléiques hybride comporte une mutation dans sa première
séquence.
En conclusion, seules des molécules d'acides nucléiques hybrides comprenant
une
première séquence mutée, notamment par une substitution G->T ou une insertion
d'un
dinucléotide AT, permet de cribler des molécules d'acides nucléiques
interférents qui
augmentent l'expression.
Exemple 5 : Exemple de criblage utilisant le FRET comme moyen de détection
Les cellules exprimant de manière stable la construction SEQ ID NO: 120, ont
été
ensemencées en plaques 24 puits le matin afin d'atteindre une confluence de
60% le
soir de la transfection avec les siRNA. Le soir, les cellules ont été
transfectées à la
lipofectamine (RNAimax-procédure du fournisseur) à raison de 10 nM de siRNA
par
puits. Différents siRNA (voir exemple 4) ont été testés afin d'évaluer leur
impact
respectifs sur l'expression du transgène d'intérêt. Le lendemain matin, les
cellules ont
été lavées au PBS lx, lysées dans 100 microlitres du tampon (TRIS 10 mM pH=8,
EDTA 1 mM, 0,05% NP-40, + inhibiteurs de protéases), collectées dans des tubes
eppendorf, puis soumises à sonication à raison de 5 cycles composés de 15
secondes
de sonication active (puissance maximum) suivies de 15 secondes de pause, dans
un
sonicateur à bain de la marque Diagénode. Les lysats cellulaires sont ensuite
centrifugés pour 5 minutes à 15000 rcf à 4 C.
Le surnagent est récupéré et après ajustement à concentration similaire en ADN
(et/ou
protéine) de chacun des échantillons (après mesure de la concentration en ADN
par
quantification au nanodrop, ou concentration protéique par la méthode de
Bradford) à
raison de 100 microgrammes d'ADN par litre, 5 microlitres par puits sont
déposés en
triplicats en boite 384 puits (Greiner-#784076). Un mélange de 5 microlitres
d'anticorps
donneur (CISB10-#610HATAB) et accepteur (CISB10-#61FG2XLB) selon les
instructions du fournisseur (CISB10), est ajouté à chacun des puits et suivi
d'une
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incubation à l'abri de la lumière et à température ambiante pour 1 heure. La
lecture de
fluorescence provenant du FRET entre le donneur et l'accepteur dirigés contre
les
TAGs produits par le transgène d'intérêt (Flag et HA) est réalisée au moyen
d'un
appareil d'HTRF (PHERAstar FS-BMG LABTECH) selon les instructions du
fournisseur.
Après normalisation des données par rapport au contrôle ne présentant pas de
FRET
(lysat ne contenant pas de TAGs capable de produire un signal de FRET), une
augmentation de 10% du signal par rapport au siRNA contrôle (T.) est
considérée
significative pour l'augmentation de l'expression du transgène d'intérêt.
Les résultats sont indiqués à la figure 7.
Les résultats quantitatifs de FRET montrent que les molécules d'acides
nucléiques
interférents F-N (SEQ ID NO : 146 ; B), Flag (SEQ ID NO : 148 et 149; D et E),
FLAG
Cter (SEQ ID NO : 156 ; J), F-M (SEQ ID NO : 154 ; L) et HA3 (SEQ ID NO : 140
; P)
augmentent l'expression.
L'ensemble de ces données montre que le procédé selon l'invention permet de
cribler
des molécules d'acides nucléiques interférents qui augmentent l'expression de
gènes.
Exemple 6 : détermination du mécanisme sous-iacent
Comme mentionné ci-dessus, on constate que le criblage de molécules d'acides
nucléiques interférents augmentant l'expression génique nécessite
l'utilisation d'une
séquence Kozak présentant une mutation déterminée. Une telle séquence Kozak a
pour effet de réduire l'expression du gène qu'elle contrôle, c'est à dire
réduire la
traduction de la protéine.
Dans un premier temps les inventeurs ont donc comparé les niveaux d'expression
protéique de la protéine cycline D1 dont l'expression protéique est contrôlée
par
- la séquence Kozak murine de la cycline D1 (mKoz), notamment représentée par
la séquence SEQ ID NO :12
- la séquence Kozak murine de la cycline D1 présentant une insertion AT selon
l'invention (mKozAT), représentée par la séquence SEQ ID NO : 9, et
- la séquence Kozak de la cycline D1 optimisée (KozOPT), de séquence SEQ ID
NO : 62.
Les lignées cellulaires de fibroblastes murins dépourvues du gène endogène de
la
Cycline D1 (Ccndl-/-) et exprimant de façon stable la construction mKoz-Ntag-
CycD1
ou mKozAT-Ntag-CycD1 (SEQ ID NO: 120) ou K0zOPT-Ntag-CycD1, ont été
ensemencées le matin du premier jour et cultivées dans un incubateur à 37 C
avec un
taux stable de CO2 à 5%, afin d'être d'atteindre une confluence cellulaire de
l'ordre de
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80% le lendemain. A ce stade, les lignées ont été collectées afin d'en
extraire soit les
protéines (tampon de lyse = Tris 10 mM, EDTA 1mM et NP-40 0,05%), soit les ARN
totaux avec du Trizol.
Les lysats protéiques ont ensuite été normalisées à une concentration
équivalente
de protéines totales par la méthode de Bradford, puis analysées en western
blot contre
l'actine ou la Cycline Dl. Ces échantillons ont aussi été analysés par la
méthode de
Tandem-HTRF décrite à l'exemple 5.
Les résultats obtenus sont présentés à la figure 10 et à la figure 11.
Les résultats illustrent une diminution de l'expression issue de mKozAT
comparée à
la séquence mKoz sauvage ou comparé à une séquence artificielle KozOPT. Cela
signifie donc que la séquence Kozak mutée a pour effet de diminuer
l'expression
protéique.
Les ARN messager ont été utilisées pour générer de l'ADN complémentaire
(ADNc) par Transcription Reverse, puis ces ADNc ont été analysées en PCR
quantitative (qPCR). Le taux d'ARN messager issu des constructions mKoz-Ntag-
CycD1 ou mKozAT-Ntag-CycD1 ou K0zOPT-Ntag-CycD1 à été évalué d'après la qPCR
après normalisation en utilisant les gènes de ménage (Hprt, B2M, Trfrl , Tubb
et
Gapdh).
Les résultats sont présentés à la figure 12.
Il apparaît un taux d'ARN messager pour Ntag-CycD1 comparable (écart non
significatif entre les groupes par un test de Student) entre les lignées mKoz-
Ntag-
CycD1 ou mKozAT-Ntag-CycD1 ou K0zOPT-Ntag-CycD1.
Aussi, le niveau d'expression est donc modulé à un niveau traductionnel.
Exemple 7: Comparaison des séquences Kozak dans le cadre du criblage des
siRNA de l'invention
Afin de confirmer l'importance des séquences Kozak mutées, les inventeurs ont
enfin
testé l'effet de différents siRNA (augmentation ou diminution de l'expression)
à partir de
différentes constructions :
- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la
cycline D1 ayant une insertion AT (Ntag-mKozAT),
- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la
cycline D1 (Ntag-mKoz),
- Cycline D1 étiquetée en C-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la
cycline D1 AT (Ctag-mKozAT),
- Cycline D1 étiquetée en C-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la
cycline D1 ayant une insertion AT (Ctag-mKozAT), et
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- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la
cycline D1 optimisée pour augmenter l'expression (Ntag-KozOPT).
Plusieurs siRNA testés à la figure 7 ont été utilisés : SQE ID NO : 149/150 ;
SEQ ID
NO :155, SEQID NO : 154 et SEQ ID NO : 142.
Les tests comparatifs sont présentés à la figure 13.
Ces données montrent que quel que soit la séquence Kozak, un siRNA diminuant
l'expression sera toujours identifié comme tel. Par contre, les siRNA
augmentant
l'expression sont systématiquement identifié lors que le rapporteur est mis
sous
contrôle d'une séquence Kozak mutée (présentant ici une insertion AT).
L'ensemble de ces résultats confirment l'importance de la région régulant la
traduction
du rapporteur dans le criblage des siRNA qui augmentent l'expression de gènes
selon
l'invention.
L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres
modes de
réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier
