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MILIEU ET PROCEDE DE CULTURE ET ISOLEMENT SELELI _________ iF DE LA BACTERIE
ENTEROCOCCUS HIRAE
La présente invention concerne un nouveau milieu et procédé de culture et
d'isolement sélectif de la bactérie commensale Enterococcus hirae au sein d'un
__ échantillon biologique, notamment de selles.
Les bactéries du genre Enterococcus sont des cocci à Gram positif, retrouvés
sous forme de diplocoques. Ce sont des germes commensaux du tube digestif, le
plus souvent responsables d'endocardites et d'infections urinaires [1]. Le
genre
Enterococcus est rangé dans le domaine des Bacteria, le phylum des Firmicutes,
la
ia classe des Bacilli, l'ordre des Lactobacillales, la famille des
Enterococcaceae et enfin
la branche des Clostridium. A l'heure actuelle, il existe 58 espèces
d'entérocoques
différentes [1].
Les entérocoques les plus souvent retrouvés dans les échantillons cliniques
sont Enterococcus faecalis qui représentent qui représentent 75 à 85 % des
souches
is cliniques d'entérocoques et Enterococcus faecium qui représentent 10 à 20
Vo des
souches cliniques d'entérocoques, les autres espèces des souches cliniques du
genre
Enterococcus représentant environ 5 % à savoir Enterococcus hirae, E.
casselfflavus,
E. gallinarum et E raffinosus [14].
Enterococcus hirae est un pathogène zoonotique, retrouvé chez les
20 mammifères et les oiseaux, qui a rarement été isolé à partir d'une
infection chez
l'homme [2].
Actuellement, différents milieux de culture solides sont utilisés pour
sélectionner les bactéries du genre Enterococcus, tel que le milieu BEA (Bile
Esculine
Azide) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) [3], qui permet
l'isolement
zs sélectif des bactéries du genre Streptococcus appartenant au groupe D et
les
bactéries du genre Enterococcus. Il existe également les milieux mEI Agar
(Difco,
BD, Franklin Lakes, New Jersey, Etats-Unis), Chromocult enterococci (Merck,
Darmstadt, Allemagne), et m-Enterococcus agar (Sigma-Aldrich), qui permettent
d'isoler les entérocoques [4].
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L'objectif de la présente invention est de sélectionner spécifiquement E
hirae,
parmi les autres bactéries du genre Enterococcus. En effet, cette bactérie E
hirae
joue un rôle important dans l'Immunité, notamment dans le traitement du cancer
du
sein [5]. Il a été démontré que la présence d'E. hirae chez les femmes
atteintes d'un
cancer du sein favorisait la réponse au traitement par chimiothérapie. E hirae
est un
oncomicrobiotique , elle favorise l'effet thérapeutique anti-cancéreux du
cyclophosphamide (CTX). En effet, elle active l'immunité anti-tumorale via
l'induction
de cellules Th17 et en augmentant le ratio des cellules cytotoxiques sur les
cellules T
régulatrices [5].
io Le
but de la présente invention est de sélectionner E. hirae à partir de
prélèvements biologiques, en particulier de selles de patients, afin de mettre
en
évidence la présence ou non de cette bactérie dans le microbiote de ces
patients et
ainsi prédire leur possible réponse au traitement thérapeutique par
cyclophosphamide [5].
is La
présente invention a consisté tout d'abord à sélectionner spécifiquement les
bactéries du genre Enterococcus et plus particulièrement E. faecalis, E
faecium et E
hirae sur un milieu de culture puis différencier E hirae des autres
entérocoques par
une technique de coloration.
On comprend que le milieu de culture pour Enterococcus selon l'invention est
zo
constitué d'un milieu de culture de base, connu pour la culture sélective des
entérocoques, comprenant notamment différents inhibiteurs des bactéries Gram
négatif et de la plupart des bactéries Gram positif, autres que les
entérocoques.
Un milieu couramment utilisé pour la mise en évidence des entérocoques est
le milieu bile-esculine qui comprend :
25 -
10 % de bile de boeuf (les entérocoques tolèrent jusqu'à 40 % de bile
contrairement à de nombreux autres germes) ;
- de l'azoture de sodium (un antiseptique élimine toutes les bactéries. Gram
négatifs) ;
- de l'esculine et du citrate de fer ammoniacal (un composé qui permet le
30 virage vers le noir du milieu de culture lorsque l'esculine est
hydrolysée).
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Les entérocoques se développent en hydrolysant l'esculine de sorte que les
entérocoques poussent en faisant virer le milieu au noir : le noircissement du
milieu
traduisant l'hydrolyse par le citrate de fer ammoniacal de l'esculine en
esculétine qui
se lie avec le fer.
Un milieu de culture solide spécifique des entérocoques, dénommé milieu m-
Enterococcus agar [3] comprend de préférence dans les quantités et proportions
pondérales suivantes pour 1L:
- Extrait pancréatique de gélatine: 10 g (1%)
- Extrait de levure : 30 g (3%)
- Chlorure de sodium : 15 g (1,5%)
- Esculine : 1 g (0,1%)
- Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%)
- Cycloheximide : 0,05 g (0,005%)
- Acide nalidixique : 0,25 g (0,025%)
- Agar : 15 g (1,5%)
L'azoture de sodium présente une action inhibitrice sur les bactéries Gram
négatif et sur tous les streptocoques sauf ceux du groupe D.
Le cycloheximide présente une son action antifongique.
L'acide nalidixique est un antibiotique de la classe des quinolones, utilisé
pour
son action sur les bactéries Gram négatif.
Le chlorure de sodium permet d'inhiber les bactéries gram positifs autres
qu'Enterocaccus, en particulier le sous-genre Streptococcus D peut être inhibé
par la
salinité d'un milieu de culture. Ainsi Les Enterococcus peuvent être cultivées
sélectivement sur un milieu hypersalé.
L'extrait pancréatique de gélatine et l'extrait de levure apportent les
nutriments nécessaires.
La présente invention fournit un milieu de culture spécifique pour la culture
et
l'isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae constitué de nutriments
autres
que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques
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dépourvu d'esculine, comprenant des inhibiteurs de bactéries Gram négatif et
de
bactéries Gram positif autres que les entérocoques et de préférence au moins
un
composé antifongique caractérisé en ce qu'il comprend :
- comme inhibiteur de bactéries Gram positif autres que les
entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas
plus de 60 g/L, et
- comme seul sucre du mannitol, et
- comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un
pH inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à
l'acidification
Io dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du
mannitol.
On évite en particulier la mise en oeuvre d'esculine dans le milieu de base
car
celle-ci colore en noir tous les entérocoques comme indiqué ci-dessus.
Selon la présente invention on tire parti du fait que E. hirae ne consomme pas
de mannitol alors que le mannitol est consommé en provoquant une baisse du pH
ou
acidification dudit milieu de culture spécifique, par toutes les principales
autres
bactéries Enterococcus susceptibles d'être présentes dans des échantillons
cliniques
de patients humains, notamment de selles, à savoir E. faecalis, E. faecium, E
casseliflavus, E gallinarum et E raffinosus [14].
Plus particulièrement, le dit milieu selon l'invention est sous forme solide
zo comprenant un agent gélifiant de préférence à une concentration au moins
1%, de
préférence encore de l'agar à la concentration de 1,5%. Le milieu selon
l'invention
présente ainsi la capacité d'isoler par culture Enterococcus hirae en partant
d'une
flore microbienne d'échantillon de selles composée d'environ 1010 bactéries /g
de
selle comprenant en pratique environ 400 espèces différentes. Ce milieu exerce
avant tout une action de sélection sur le reste de la flore et cela grâce
entre autres à
la présence d'agents inhibiteurs ce qui permet de sélectionner parmi les 400
espèces,
3 espèces seulement Enterococcus hirae, Enterococcus faecalls et Enterococcus
faecium lesquelles sont différentiées par la combinaison de leur propriétés de
fermentation du mannitol générant un Ph correspondant à celui d'un indicateur
coloré le bromocrésol pourpre.
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Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium représentent à eux deux 95%
des bactéries entérocoques pouvant être trouvées dans des échantillons
cliniques de
selles humains. Pour sélectionner ces 3 espèces seulement Enterococcus
Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium, on met en oeuvre notamment Gram
5 positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une
concentration d'au
moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, qui n'affecte pas la croissance
d'Enterococcus
hirae à ces concentrations.
Le pourpre de bromocrésol, a été choisi comme indicateur coloré non pas par
rapport au mannitol en tant que tel mais de par sa fourchette de virage de
couleur
vis-à-vis du pH correspondant en l'espèce à celle résultant la consommation du
mannitol par les espèces en cause dans le milieu de l'invention.
De préférence, le milieu selon l'invention comprend un inhibiteur de bactéries
Gram positif entérocoques autres qu'Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis
et
Enterococcus faecium, notamment inhibiteur de Enterococcus durans, la
Clindamycine, de préférence à la concentration d'au moins 8mg/L. Cet
antibiotique
permet d'éliminer cette bactérie Enterococcus durans laquelle comme
Enterococcus
hirae ne fermente pas le mannitol et apparait présentant de rares occurrences
dans
les échantillons de selles.
Plus particulièrement, le pH dudit milieu de culture spécifique selon
l'invention
est de 7,3 +/- 0,2 et l'indicateur coloré est le pourpre de bromocrésol.
Cet indicateur coloré vire à un pH de 5,2-6,8, un pH dans cette fourchette de
5,2-6,8 correspondant à l'acidification d'un milieu de culture de PH 7,3 +/-
0,2;
ensemencé par au moins une colonie isolée de bactérie Enterococcus autre que
Enterococcus hirae.
Plus particulièrement encore, le milieu de culture spécifique selon
l'invention
comprend au moins 10 g/L de mannitol.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon
l'invention
comprend des nutriments autres que le mannitol dans une concentration de pas
plus
de 20g/L, de préférence d'au moins au moins 10g/L. Cette concentration
relativement élevée en mannitol par rapport aux autres nutriments permet de
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favoriser la consommation prioritaire dudit sucre par les Enterococrus autres
que E.
hirae d'une part offre suffisamment de nutriment pour la croissance de E.
hirae.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon
l'invention
comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration
d'au moins 25 mg/L.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon
l'invention
comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration
d'au moins 50mg/L.
De façon connue, lesdits nutriments sont des sources d'énergie et source de
carbone, azote ou phopsphore.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon
l'invention
comprend comme nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base
pour la culture des entérocoques : des vitamines, des sels minéraux
métalliques,
notamment de métaux tels que Cu, Zn, Co, Ni, Bi, Ti, et des composés azotés.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon
l'invention
comprend comme source de vitamines, sels essentiels et composés azotés :
- un extrait de viande de boeuf, et
- la protéose-peptone.
La peptone permet d'apporter des acides aminés et des peptides comme
source d'énergie et de carbone autre que sucres.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon
l'invention
comprend :
- un extrait de viande de boeuf à la concentration de 1 g/L, et
- la protéose-peptone à la concentration de 10 g/L.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon
l'invention
comprend un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar,
de
préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de
1 à
2%.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon
l'invention
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comprend:
- comme inhibiteurs de bactéries Gram négatif:
- l'azoture de sodium, et
- l'acide nalidixique à une concentration de pas plus de 100 mg/L, et
- la Colistine, et
- comme antifongique : la Cycloheximide.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon
l'invention
comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et
proportions
pondérales suivantes pour 1L:
Protéose-peptone 10 g (1%)
- Extrait de viande de boeuf : 1 g (0,1%)
- Chlorure de sodium : 60 g (6%)
- Mannitol 10 g (1%)
- Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%)
Cycloheximide : 0,05 g (0,005%)
- Acide nalidixique 0,10 g (0,010%)
- Colistine 0,025 g (0,0025%)
Clindamycine 0,008 g (0,0008 h)
- Pourpre de bromocrésol 0,05 g (0,005%)
- Agar : 15 g (1,5%)
La présente invention fournit également un procédé de culture et isolement
sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae caractérisé en ce qu'on cultive un
échantillon de prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir une
bactérie Enterococcus hirae et/ou des bactéries Enterococcus autres que
Enterococcus hirae, à une température de 37 C durant un temps suffisant pour
faire
apparaître une coloration de bactéries Enterococcus autres qu'Entercroccus
hirae par
ledit colorant dans un dit milieu de culture spécifique solide selon
l'invention.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon
l'invention
permet de sélectionner une bactérie Enterococcus hirae dans un échantillon
testé
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comprenant d'autres bactéries choisies parmi E. faecalis, E. faedum, E.
casseliflavus,
E. gallinarum et E. raffinosus.
Plus particulièrement encore, le procédé selon l'invention comprend les étapes
suivantes dans lesquelles:
a) on effectue une dilution de préférence au moins 3 dilutions successives au
1/10 (soit au dilution à 10-3 ), à partir d'un échantillon de selle à raison
de 0,10 à
0,50 g/mL dans une solution tampon, de préférence de tampon PBS, et
b) un échantillon de selle diluée, de préférence de 100 microlitres de selle
diluée, est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide, et
c) au bout de 72 heures d'incubation, de préférence au moins 5 jours
d'incubation, à 37 C, on détecte une dite bactérie Enterococcus hirae si on
identifie
une colonie de bactérie non décolorée par rapport audit colorant de pourpre de
bromocrésol, et
d) de préférence, on confirme que la dite colonie de bactérie non décolorée
est de l'espèce Enterococcus hIrae par une technique d'identification par
spectrométrie de masse de type MALDI-TOF.
L'identification d'Enterococcus hirae par une technique d'identification par
spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a été décrite [15].
Selon la présente invention, on a découvert qu'au bout d'au moins 72h, de
préférence 5 jours d'incubation sur les géloses, on peut voir apparaitre avec
un
milieu selon l'invention une coloration pour toutes les souches d'entérocoques
sauf
pour Enterococcus hirae , y compris un jaunissement des colonies dE.faecium.
Plus particulièrement à l'étape a) on effectue une série de plusieurs
dilutions
au 1/10 du prélèvement de départ, de préférence au moins 5 (soit une dilution
de
le ) à partir d'un échantillon de selle, notamment prélevé à l'aide d'une
oêse, à
raison de 0,15 g/mL de tampon PBS, et à l'étape b) un échantillon de chacune
des
dilutions est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide selon
l'invention,
de préférence un échantillon de 100 microlitres de selle diluée est ensemencé
sur le
dit milieu de culture spécifique solide.
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De préférence, on réalise au préalable (avant l'étape a)) une pré incubation à
37 C, de préférence d'au moins 24 h, du dit échantillons de selles dans un
milieu de
culture spécifique liquide de même composition que le dit milieu de culture
spécifique
solide mais sans agar et de préférence sans colorant.
Plus particulièrement, on réalise une dite pré incubation avec un dit
échantillon de 0.10 à 0,50 g/mL de selle dans une solution solution tampon, de
préférence 0.15 g/L dans du PBS, dans 10 à 100 mL dudit milieu de culture
culture
spécifique liquide, de préférence respectivement 40 mL
Cette pré-incubation permet d'augmenter le pouvoir sélectif du milieu
Io de culture selon l'invention contre Edurans, Efaecalis et E. faeclum comme
rapporté dans l'exemple B ci-après et ainsi de pouvoir observer un plus grand
nombre de colonies d'E. hirae le cas échéant dès la lème dilution au 1/10
(soit une
dilution de 10-3) de l'échantillon pré-incubé.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à
15 la lumière de la description détaillée de l'invention et des exemples
illustratifs ci-
après.
Exemple A:
Du fait que les entérocoques sont résistants aux fortes concentrations salines
[1], afin d'éliminer une partie des bactéries Gram positif autres
qu'entérocoques et
20 les bactéries Gram négatif, résistantes aux inhibiteurs cités
précédemment, il a été
testé différentes concentrations de sel (chlorure de sodium) pour trouver la
plus
adéquate à ajouter à la formulation de la présente invention. Quatre
concentrations
ont été expérimentées (60 g/L, 65 g/L, 70 g/L et 75 g/L). Les résultats ont
montrés
que les 3 souches d'entérocoques E hirae, E faecium et E faecalis¨ testées sur
25 ces milieux ont eu une croissance pour chacune des concentrations testées.
Cependant, après lecture des géloses à 24 heures, il a été observé que plus
les
concentrations en sel étaient augmentées, plus les colonies des bactéries E.
hirae
obtenues étaient de petite taille.
Pour permettre une visibilité suffisante des colonies, la concentration en
30 chlorure de sodium retenue pour un milieu sélectif selon la présente
invention est
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d'au moins 20g/L mais pas plus de 60 g/L.
Les entérocoques les plus représentés dans les prélèvements biologiques, en
particulier les selles, sont E faecalis et E faecium [2, 6, 7]. Les autres
espèces
d'entérocoques étant sous-dominantes, aucun inhibiteur des autres entérocoques
n'a
5 été ajouté à la formulation de la présente invention. Cependant, certains
entérocoques - Enterococcus casseliflavus, enterococcus gallinarum et
Enterococcus
raffinosus - sont présents en quantité comparable à Enterococcus hirae [8]
dans les
selles. La présente invention permet toutefois de les différencier
d'Enterococcus
hirae, comme démontré ci-après.
Le principal objectif de la présente invention est d'isoler E hirae parmi E
faecium et E faecalis. Ces deux dernières espèces bactériennes étant
résistantes à
un grand nombre d'inhibiteurs auxquels E hirae résiste, il n'a pas été
possible de les
éliminer des prélèvements. Les inventeurs ont alors cherché à les différencier
en
fonction de leur profil métabolique. Pour cela, les inventeurs ont recherché
des
is sucres consommés soit exclusivement par E hirae, soit exclusivement par
E. faecium
et E faecalis. Après étude des données de la littérature, trois sucres ont été
retenus : le mélibiose, le raffinose et le mannitol. En effet, le mélibiose
est
consommépar E. hirae et de façon variable par E faecium. On entend par
variable le
fait que la consommation de ce sucre par E faecium est souche-dépendante.
Quant
au raffinose et au mannitol, ils sont exclusivement consommés par E faecalis
et E
faecium et non pas par E hirae (cf tableau 1) [9, 10, 11].
Pour mettre en évidence la consommation du sucre par les bactéries, les
inventeurs ont ajouté au milieu de la présente invention un indicateur coloré
dont la
couleur va varier en fonction du pH du milieu. En effet, lors de la
consommation du
sucre par la bactérie, il y a une acidification du milieu, ce qui entraîne un
virage de
l'indicateur coloré. Pour déterminer l'indicateur coloré le plus approprié,
les
inventeurs en ont testé plusieurs dont les trois suivants : le rouge phénol,
le vert de
bromocrésol et le pourpre de bromocrésol. En se basant sur les concentrations
dans
des milieux contenant déjà un de ces indicateurs colorés, les inventeurs ont
choisi,
dans un premier temps, de tester une concentration de 25 mg/L [12] pour chacun
des indicateurs choisis.
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1) Tests des différents indicateurs colorés
Le rouge phénol est de couleur rouge ; il vire vers le jaune lorsque le pH est
dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 6.6 et 8. Le
milieu
ayant un pH compris entre 7.3 0.2, l'indicateur a commencé a viré vers le
jaune dès
l'autoclavage, ne permettant pas son utilisation dans un milieu selon la
présente
invention.
Le vert de bromocrésol a une couleur bleue ; il vire vers le jaune lorsque le
pH
est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 3.8 et 5.4.
Cet
indicateur coloré nécessite une acidification du milieu trop importante pour
pouvoir
io visualiser un véritable changement de couleur. Les inventeurs ont ainsi
observé un
virage davantage vers le vert que vers le jaune. Le contraste entre les
colonies de E.
faecalis et E. faeciurn et le milieu de culture n'a donc pas été assez
important pour
les différencier.
Le pourpre de bromocrésol est de couleur violet ; il vire vers le jaune
lorsque
le pH est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 5.2
et 6.8.
L'avantage de cet indicateur coloré est qu'il ne nécessite pas un fort
abaissement du
pH pour laisser apparaitre des colonies jaunes avec un halo jaune dessous. De
plus,
cette zone de virage est idéale puisque le pH de la présente invention est de
7.3 0.2. Les inventeurs ont donc choisi ce dernier indicateur coloré pour la
formulation de la présente invention. Voulant améliorer davantage le
contraste, les
inventeurs ont augmenté la concentration du pourpre de bromocrésol jusqu'à 50
mg/L.
2) Détermination du sucre
Une fois l'indicateur coloré choisi, les inventeurs ont pu déterminer quel
sucre
était le plus adapté à la présente invention.
Le mélibiose a donné des résultats variables, du fait de la consommation
variable de ce sucre par E. faecium. Ce sucre ne peut donc pas être utilisé
pour isoler
les E. hirae.
Concernant le raffinose, le test n'a pas été concluant car aucun changement
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de couleur des colonies de E faecalis et E. faecium n'a pu être observé.
Enfin, le dernier sucre testé a été le mannitol. Pour ce sucre, les inventeurs
ont constaté qu'il y avait bien un changement de couleur du milieu et des
colonies
pour E faecalis et E. faecium, mais pas pour celles d'if hirae qui sont
restées
incolores. Les inventeurs ont donc choisi le mannitol comme sucre pour la
formulation de la dite invention, à une concentration de 10 g/L, concentration
fréquemment retrouvée dans les milieux de culture [12].
1Mélibiose Raffinose Mannitol
Enterococcus hirae + + -
Enterococcus faecalis - - +
Enterococcus faecium V - +
Tableau 1 : Consommation des sucres par les 3 entérocoques étudiés
Io De plus, il a été montré dans la littérature que certaines souches
d'entérocoques - Enterococcus casselifla vus, enterococcus gallinarum et
Enterococcus raffinosus - sont présentes en quantité comparable à E hirae.
Etant
donné que les bactéries appartenant au genre Enterococcus sont dans l'ensemble
sensibles et résistantes aux mêmes inhibiteurs, les inventeurs ont recherché
la
consommation des sucres pour ces différents entérocoques. Il s'est avéré
qu'ils
consommaient tous le mannitol (cf tableau 2). Il est donc possible de
distinguer E.
hirae parmi ces entérocoques.
Mannitol
Enterococcus hirae -
Enterococcus casselifla vus +
Enterococcus gallinarum +
Enterococcus raffinosus +
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Tableau 2 : Consommation du mannitol par les espèces d'entérocoques présents
en
quantité comparable à E t'Irae dans les selles.
Ledit milieu de culture comprend également une source de vitamines, de sels
essentiels et de composés azotés par la présence d'extrait de viande de boeuf
[13] à
la concentration de 1 giL et la protéose-peptone ajoutée à 10 g/L à ladite
invention
qui permet d'apporter des acides aminés et des peptides (source d'énergie et
de
carbone). Aucun autre élément nutritif n'a été apporté à la présente invention
car
l'objectif est que E faecalis et E. faecium se servent en priorité du sucre,
le mannitol,
comme source de nutrition pour permettre leur croissance. Ces sources ne
peuvent
Io cependant pas être supprimées puisque E hirae, n'utilisant pas le sucre
sélectionné
comme source d'énergie, a besoin de nutriments pour croitre.
Ledit milieu de culture est un milieu de culture solide contenant un produit
gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans
une
proportion pondérale de 0.5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%.
Un milieu de culture permettant la sélection des Entercroccus hirae selon
l'invention comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités
et
proportions pondérales suivantes pour 1L d'eau.
Milieu A :
- Protéose-peptone : 10 g (1%)
zo - Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%)
- Chlorure de sodium : 60 g (6%)
- Mannitol 10 g (1%)
- Azide de sodium : 0,15 g (0,015%)
- Cycloheximide : 0,05 g (0,005%)
- Acide nalidixique : 0,25 g (0,025%)
- Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%)
- Agar : 15 g (1,5%)
Tous les composés de ce milieu sont référencés chez Sigma-Aldrich.
Plus particulièrement, on cultive un échantillon contenant une bactérie
Enterococcus hirae à une température de 37 C durant 72 heures dans ledit
milieu
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de culture de sélection d'Enterococcus hirae.
Plus particulièrement encore, on réalise les étapes suivantes :
- on effectue la culture d'un échantillon de prélèvement biologique pouvant
contenir Enterococcus hirae. Dans un premier temps, on effectue une
série de six dilutions au dixième à partir d'une solution mère du
prélèvement de départ. Cent microlitres de chacune des dilutions sont
ensemencés sur une gélose, correspondant à la présente invention, et
- au bout de 72 heures d'incubation à 37 C, on identifie que la bactérie
détectée non colorée est une bactérie de l'espèce Enterococcus hirae par
io une technique de spectrométrie de masse, de type MALDI-TOF [15]. Un
milieu de culture d'Enterococcus hirae selon l'invention permet de
sélectionner E. hirae au bout de 72 heures.
Aux exemples 1 à 3 ci-après, on fournit des résultats de l'ensemencement
d'une série de six dilutions de divers échantillons contenant trois
entérocoques - E.
hirae, E. faecalis et E. faeclum ¨ sur un milieu de culture solide selon la
présente
invention, au bout de 72 heures d'incubation à 37 C.
Mode opératoire :
Dans les 3 exemples, on réalise une série de six dilutions de 10-1 à 10-6 d'un
échantillon de départ comme suit :
- à l'exemple 1, une colonie d'une souche d'Enterococcus hirae, d'une
souche d'Enterococcus faecalis et d'une souche d'Enterococcus faecium,
ont été mélangées dans un millilitre de PBS (Phosphate Buffered Saline),
- à l'exemple 2, une selle est artificiellement enrichie en E. hirae, une
colonie d'une souche d'Enterococcus hirae a été mélangée dans un
millilitre de PBS avec l'équivalent d'une oése bleue (10 microlitres) de
selle, à savoir environ 0,15 g, et
- à l'exemple 3, l'équivalent d'une ose bleue (10 microlitres) de selle
clinique, à savoir environ 0,15 g que l'on sait riche en E. hirae a été
mélangé dans un millilitre de PBS.
Pour réaliser ces dilution, les inventeurs ont préparé six tubes eppendorf
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(Sigma-Aldrich), qui ont été remplis avec 900 microlitres de PBS et, à partir
du tube
mère, contenant les colonies et le cas échéant les échantillons de selles, 100
microlitres ont été prélevés et mélangés au 2ème tube contenant les 900
microlitres
de PBS, et des dilutions en cascade ont été réalisées jusqu'à obtenir six
dilutions de
5 104 à 10-6.
Puis, on réalise l'ensemencement de 100 pL sur un milieu de culture solide
selon l'exemple A ci-dessus, de la série des six dilutions et on observe le
résultat
après que les géloses aient été incubées dans une étuve à 37 c'C pendant 72
heures.
Pour les 3 exemples, on observe l'apparition de colonies jaunes pour E.
10 faecium et E faecalis et de colonies transparentes pour E. hirae.
Les colonies isolées
sont les plus visibles sur les dilutions 10-5 et 10-6. Les autres dilutions
sont trop
concentrées en bactéries pour que l'on puisse observer des colonies isolées et
ainsi
bien distinguer Enterococcus hirae des autres entérocoques pour l'analyse de
la
richesse en Enterococcus hirae de la selle testée.
15
Exemple B: En testant un plus grand nombre d'échantillons, à savoir plus de
100 selles cliniques, provenant du laboratoire diagnostic de bactériologie, il
est
apparu que le milieu de l'exemple A ci-dessus, sélectionnait dans de rares
occurrences (4 échantillons sur 100 testés) la bactérie Enterococcus durans
conjointement avec Enterococcus hirae, toutes deux ne fermentant pas le
mannitol
et apparaissant transparente en dépit de l'indicateur coloré BCP contrairement
aux
deux seules autres espèce présentes E faecium et E. faecalis.
Pour pallier cela, et être davantage encore sélectif vis-à-vis dEnterococcus
hirae, on a trouvé un antibiotique qui inhibe la croissance d'E.durans à
savoir la
clindamycine, un antibiotique de la famille des lincosamides. Cet antibiotique
possède
une action principalement bactériostatique à l'encontre des bactéries aérobies
Gram
positif y compris Enterococcus durans mais excepté les 3 espèces E. faeclum,
E.
faecalis et E. hirae et à l'encontre d'un large spectre de bactéries
anaérobies. Cet
antibiotique a été rajouté dans le milieu à la concentration de 8 mg/L.
Par ailleurs, on a diminué la concentration de l'acide nalidixique de 250 mg/L
à pas plus de 100 mg/L du fait de sa mauvaise dilution dans l'eau au-dessus de
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100mg/L et a été ajouté la colistine à une concentration 25 mg/L pour
compenser,
qui est un antibiotique polypeptidique de la famille des polymyxines qui a une
action
sur les bactéries Gram négatif.
Grâce à ce milieu B, on a pu sélectionner spécifiquement les souches
suivantes : Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium.
Pour cela, on a mis en oeuvre un milieu sélectif B comprenant des inhibiteurs
bactériens, tel que le NaCI à 60 g/L, le cycloheximide à 0,05 g/L, le sodium
azide à
0,15 g/L, l'acide nalidixique à 0,1 g/L, la colistine à 0,025 g/L et la
clindamycine à
0,008 g/L.
io La formule du milieu B est donc :
Protéose-peptone : 10 g (1%)
Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%)
Chlorure de sodium : 60 g (6%)
Mannitol 10 g (1%)
Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%)
Cycloheximide : 0,05 g (0,005%)
Acide nalidixique : 0,10 g (0,010%)
Colistine 0,025 g (0,0025%)
Clindamycine 0,008 g (0,0008 %)
Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%)
Agar : 15 g (1,5%)
Pour tester l'efficacité de ce milieu, les inventeurs ont ensemencé 100 selles
prises au hasard, provenant du laboratoire de diagnostic (bactériologie) de
l'IHU
Méditerranée infection. Pour cela, l'équivalent d'une oêse bleue (10
microlitres) de
selle clinique, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans lmL de PBS. Les
inventeurs ont décidé d'ensemencer la dilution 10-3 sur leur milieu, de façon
à
observer un grand nombre de colonies sur le milieu, en cas de croissance
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bactérienne. Pour réaliser des dilutions, les inventeurs ont préparé trois
tubes
eppendorf (Sigma-Aldrich), qui ont été remplis avec 900 microlitres de PBS, et
à
partir du tube mère, contenant les échantillons de selles dans 1 mL, 100
microlitres
ont été prélevés et mélangés au 2ème tube contenant les 900 microlitres de
PBS, et
des dilutions en cascade ont été réalisées jusqu'à obtenir trois dilutions de
10-1à 10-3.
Puis, on a réalisé l'ensemencement de 50 pL sur un milieu de culture solide
selon l'exemple ¨B ci-dessus, de la dilution 10-3 et on observe les résultats
après que
les géloses aient été incubées dans une étuve à 37 C pendant 72 heures, et de
préférence jusqu'à cinq jours.
Io
Sur les 100 selles ensemencées, seulement 40 ont montré une croissance
bactérienne. Après identification des colonies au spectromètre de type MALDI
TOF
SP, les inventeurs ont observé que les seuls bactéries obtenues étaient
Enterococcus
hirae (2), E faecium (16), E faecalis (22) et E durans (4).
Pour éliminer E. durans, les inventeurs ont testé un antibiotique, la
clindamycine. Ce choix a été basé sur une série d'antibiogrammes que les
inventeurs
avaient réalisés précédemment. Afin de déterminer la meilleure concentration
de
clindamycine à ajouter au milieu de culture, les inventeurs ont testé trois
concentrations de cet antibiotique, à savoir 2 mg/L, 4 mg/L et 8 mg/L. Les
inventeurs ont ensemencé des souches d'Enterococcus hirae, E faecium, E
faecalis
et E durans. Une croissance pour chacune de ces espèces a été observée pour
les
deux premières concentrations de clindamycine, 2 mg/L et 4 mg/L. En revanche,
une
absence de croissance pour E. durans a été mise en évidence à la concentration
de 8
mg/L de clindamycine. Enterococcus hirae, E. faecium, E faecalis ont une
croissance
à cette concentration de clindamycine.
Afin de confirmer ces résultats, les inventeurs ont retesté les 4 selles où E
durans avait été mise en évidence. Pour chacune de ces selles, aucune colonie
de E
durans n'a été identifiée par spectrométrie de masse MALDI TOF SP. Pour
augmenter
le pouvoir sélectif du milieu de culture contre E.durans dans les prélèvements
testés,
les inventeurs ont réalisé une pré-incubation des prélèvements durant 24h,
dans des
bouteilles d'hémoculture anaérobie vidées et dans lesquelles ils ont ajouté le
milieu
de culture hirae, sous sa forme liquide, cité ci-dessous, à raison de 40 mL
par
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bouteille. Pour cela, l'équivalent d'une oése bleue (10 microlitres) de selle
clinique,
contenant Edurans, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans lrriL de PBS, et
le
tout a été injecté dans la bouteille d'hémoculture. Les inventeurs ont incubé
la
bouteille à 37 C durant 24h.
s Ils ont ensuite réalisé des dilutions, comme décrit ci-dessus et
ensemencé la
3ème dilution (10-3) sur le milieu hirae solide. Après 72h d'incubation, de
préférence 5
jours, aucune croissance de E.durans n'a pu être observée.
Milieu de culture hirae liquide :
- Protéose-peptone : 10 g (1%)
- Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%)
- Chlorure de sodium : 60 g (6%)
- Mannitol 10 g (1%)
- Azoture de sodium : 0,15 g
(0,015%)
- Cycloheximide : 0,05 g (0,005%)
- Acide nalidixique : 0,10 g (0,010%)
- Colistine 0,025 g (0,0025%)
- Clindamycine 0,008 g (0,0008 h)
L'agar a été enlevé, de façon à obtenir un milieu liquide, et l'indicateur
coloré, le
pourpre de bromocrésol, a également été éliminé de cette formule du milieu
liquide
car il n'avait pas d'utilité lors de la pré-incubation.
Par ailleurs, pour favoriser la croissance d'E.Nrae sur le milieu de culture
hirae, notamment lorsque E.faecium et Efaecalis sont également présents dans
l'échantillon de selle testé, une pré-incubation de ces prélèvements est
également
réalisée pendant 24h. Pour cela, l'équivalent d'une oêse bleue (10
microlitres) de
selle clinique, contenant E.hirae, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans
lmL de
PBS, et le tout a été injecté dans la bouteille d'hémoculture contenant 40 mL
du
milieu hirae liquide. Les inventeurs ont incubé la bouteille à 37 C durant
24h. Ils ont
ensuite réalisé des dilutions, comme décrit ci-dessus et ensemencé la 3ème
dilution
(10-3) sur le milieu hirae solide. Après 72h d'incubation, de préférence 5
jours, une
croissance plus importante de Ehirae a pu être observée. Sans pré-incubation,
les
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inventeurs pouvaient observer moins de 10 colonies de Ehirae et après pré-
incubation, cette croissance était de l'ordre de 200-300 colonies à une même
dilution.
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