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WO 2019/106134
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Bactérie génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2
Domaine de l'invention
L'invention a trait à une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène et
génétiquement
modifiée pour produire du lactate à partir de 002. L'invention a également
trait à un procédéde
production de lactate, ou d'acide lactique, à partir de CO2 utilisant une
telle bactérie
génétiquement modifiée.
Etat de la technique
L'acide lactique trouve des applications dans de nombreuses industries. Par
exemple,
l'acide lactique est utilisé comme précurseur de l'acide polylactique (PLA)
qui est un polymère
entièrement biodégradable, utilisé par exemple dans les emballages
alimentaires. L'acide
lactique peut également être utilisé comme additif, en tant qu'antioxydant,
acidifiant ou
exhausteur de goût par l'industrie agroalimentaire. En cosmétique, l'acide
lactique est
généralement utilisé comme bactériostatique ou comme agent de peeling.
Actuellement, la production à l'échelle industrielle de l'acide lactique
repose
principalement sur la fermentation d'hydrate de carbone, et notamment de
glucose, lactose,
sucrose ou maltose. Si de nombreuses bactéries peuvent provoquer la
transformation de ces
sucres en acide lactique, seules les bactéries lactiques permettent de
produire exclusivement
de l'acide lactique, les autres bactéries produisant en général un mélange de
plusieurs acides
organiques.
En outre, la production d'acide lactique à partir de sucres fermentescibles,
tels que le
glucose ou le lactose, pose la question de la concurrence entre l'alimentation
et la production
de produits de commodité comme l'acide lactique.
En parallèle, les émissions de dioxyde de carbone (002) dans l'atmosphère ne
cessent
de croître. Des systèmes biologiques qui fixent le carbone par des processus
métaboliques
biochimiques naturels, telles que les algues, ont déjà été utilisés pour
produire des molécules
d'intérêt par réactions photosynthétiques. Cependant, les rendements de
production restent
insuffisants et limitent l'intérêt économique de ces systèmes.
De même, des méthodes mettant en oeuvre des cellules bactériennes
génétiquement
modifiées ont été développées, pour transformer des sucres en molécules
d'intérêt dans des
systèmes de fermentation hétérotrophe. Angermayr & al. (2012) décrit la
surexpression de la
lactate déshydrogénase de Bacillus subtilis dans la cyanobactérie
Synechocystis. WO
2014/205146 et WO 2015/155790 décrivent des bactéries méthanotrophes dont la
source
d'énergie vient de leur substrat carboné. De tels systèmes présentent
plusieurs inconvénients.
En effet, les systèmes de fermentation hétérotrophe sont sensibles à la
contamination, ce qui
impacte considérablement les rendements de production. En outre, ces systèmes
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hétérotrophes ne résolvent pas les problèmes de concurrence avec
l'alimentation, puisque des
sucres fermentescibles restent nécessaires, ni d'impacts environnementaux
négatifs.
Il existe donc toujours un besoin en des procédés microbiologiques pour
permettre la
production de molécules, telles que l'acide lactique, en grandes quantités à
partir de CO2
.. comme seule source de carbone, afin de ne pas entrer en compétition avec
l'alimentaire tout
en réduisant les émissions de gaz à effet de serre.
Résumé de l'invention
En travaillant sur cette problématique, les inventeurs ont découvert qu'il est
possible de
forcer des bactéries oxydant naturellement l'hydrogène, et capables de
produire de la matière
organique à partir de 002, dans une voie de synthèse de lactate, au détriment
éventuellement
d'autres voies de synthèse. Notamment, les inventeurs ont découvert qu'il est
possible de
favoriser une voie de synthèse de lactate endogène, qui n'est pas ou peu
exprimée
naturellement dans la bactérie, en jouant sur l'expression du ou des gènes
associés à cette
voie de synthèse. Ainsi, les inventeurs ont découvert que les bactéries
oxydant l'hydrogène
peuvent être génétiquement modifiée de manière à surexprimer une lactate
déshydrogénase
endogène ou une hétérologue, et/ou de manière à réprimer l'expression de gènes
intervenant
dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production
de lactate,
afin de produire du lactate à partir de 002. Plus particulièrement, les
inventeurs ont découvert
que la bactérie Cupriavidus necator (également appelée Hydrogenomonas
eutrophus,
Alcaligenes eutropha, Ralstonia eutropha, ou Wautersia eutropha) peut être
génétiquement
modifiée de manière à surexprimer une lactate déshydrogénase endogène, en
jouant sur le
promoteur et/ou le nombre de copie du gène codant pour cette lactate
déshydrogénase
notamment, de manière à produire du lactate à partir de 002. De manière
alternative ou
complémentaire, la production de lactate peut être améliorée en introduisant
un ou plusieurs
gènes exprimant une lactate déshydrogénase hétérologue et/ou en réprimant
l'expression de
gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence
de la
production de lactate.
L'invention a donc pour objet une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène
et
génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de 002, ladite
bactérie étant
génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une
lactate
déshydrogénase.
Selon l'invention, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour
surexprimer une
lactate déshydrogénase endogène et/ou exogène.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une bactérie selon
l'invention pour la
.. production de lactate à partir de 002, Préférentiellement pour la
production exclusivement de L-
lactate, ou pour la production exclusivement de D-lactate.
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L'invention porte également sur un procédé de production de lactate à partir
de 002,
comprenant les étapes consistant à
- cultiver la bactérie avec du CO2 comme seule source de carbone, puis
- récupérer le lactate.
Description des figures
La figure 1 montre une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène selon
l'invention
apte à produire du lactate à partir de CO2 et H2.
La figure 2 montre les différentes voies métaboliques présentes naturellement
chez
Cupriavidus necator, et notamment, la glycolyse et le cycle de Calvin.
La figure 3 montre les différentes modifications génétiques (surexpression
et/ou
inhibition de l'expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez
Cupriavidus necator pour
favoriser la production de L-lactate à partir de 002.
La figure 4 montre les différentes modifications génétiques (surexpression
et/ou
inhibition de l'expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez
Cupriavidus necator pour
favoriser la production de D-lactate à partir de 002.
La figure 5 est un tableau récapitulant les différentes abréviations utilisées
dans la
description et les figures 2, 3 et 4.
La figure 6 représente la production de lactate par la bactérie 0N0002 à
partir de
fructose.
La figure 7 représente la production de lactate par la bactérie oxydant
naturellement
l'hydrogène 0N0002 et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir
de 002.
Description détaillée de l'invention
L'invention a pour objet une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène,
génétiquement
modifiée pour produire du lactate à partir de 002, ladite bactérie étant
génétiquement modifiée
pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase
Dans le contexte de l'invention, une bactérie oxydant naturellement
l'hydrogène
désigne une bactérie capable, sans manipulation génétique préalable,
d'utiliser l'hydrogène
gazeux comme donneur d'électron et l'oxygène comme accepteur d'électron, et
capable de
fixer le dioxyde de carbone. Ces bactéries sont également appelées bactéries
knallgas . Les
bactéries oxydant naturellement l'hydrogène ont besoin de dioxyde de carbone
comme source
de carbone et d'hydrogène comme source d'énergie.
Selon l'invention, la bactérie oxydant naturellement l'hydrogène est
préférentiellement
sélectionnée parmi Ralstonia sp, Cupriavidus sp., Hydrogenobacter sp.,
Rhodococcus sp.,
Hydrogenovibrio sp.; Rhodopseudomonas sp., Rhodobacter sp., Aquifex sp.,
Cupriavidus sp.,
Co uynebacterium sp., Nocardia sp., Rhodopseudomonas sp., Rhodospirillum sp.,
Rhodococcus sp., Rhizobium sp., Thiocapsa sp., Pseudomonas sp., Hydrogenomonas
sp.,
Hydrogenobacter sp., Hydrogenophilus sp., Hydrogenautresmus sp., Helicobacter
sp.,
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Xanthobacter sp., Hydrogenophaga sp., Bradyrhizobium sp., Alcaligenes sp.,
Amycolata sp.;
Aquaspirfflum sp., Arthrobacter sp., Azospirfflum sp., Variovouax sp.,
Acidovouax sp., Bacillus
sp., Calderobacterium sp., Derxia sp., Flavobacterium sp., Microcyclus sp.,
Mycobacterium sp.,
Paracoccus sp., Persephonefia sp., Renobacter sp., Thermocrinis sp., Wautersia
sp., et les
.. cyan obactéries telles que Anabaena sp.
Notamment, la bactérie est sélectionnée parmi Rhodococcus opacus, Rhodococcus
jostii, Hydrogenovibrio marin us, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas
palustris,
Rhodobacter sphaeroides, Aquifex pyrophilus, Aquifex aeoficus, Cupriavidus
necator,
Cupriavidus metallidurans, Couynebacterium autotrophicum, Nocardia
autotrophica, Nocardia
opaca, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas capsulata,
Rhodopseudomonas
viridis, Rhodopseudomonas sulfoviridis, Rhodopseudomonas blastica,
Rhodopseudomonas
sphe roides, Rhodopseudomonas acidophila, Rhodospirfflum rubrum, Rhodococcus
opacus,
Rhizobium japonicum, Thiocapsa roseopersicina, Pseudomonas facilis,
Pseudomonas fia va,
Pseudomonas putida, Pseudomonas hydrogenovouaõ Pseudomonas palleronii,
Pseudomonas
pseudoflava, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas thermophila, Pseudomonas
hydrogenothermophila, Hydrogenomonas pantotropha, Hydrogenomonas
eutropha,
Hydrogenomonas facilis, Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobacter
halophilus,
Hydrogenobacter hydrogenophilus, Hydrogenophilus isleticus, Hydrogenophilus
thermoluteolus, Hydrogenautresmus marinus, Heficobacter pyloui, Xanthobacter
autotrophicus,
Xanthobacter fia vus, Hydrogenophaga fia va, Hydrogenophaga palleronii,
Hydrogenophaga
pseudoflava, Bradyrhizobium japonicum, Ralstonia eutropha, Alcaligenes
eutrophus,
Alcaligenes facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes la tus,
Alcaligenes paradoxus,
Alcaligenes ruhletii, Amycolata sp., Aquaspirfflum autotrophicum, Arthrobacter
strain 11/X,
Azospirfflum fipoferum, Variovouax paradoxus, Acidovouax facilis, Bacillus
schlegefii, Bacillus
tusciae, Calderobacterium hydrogenophilum, Derxia gummosa, Flavobacterium
autautresmophilum, Microcyclus aquaticus, Mycobacterium goudoniae, Para coccus
denitrificans, Persephonefia marina, Persephonefia guaymasensis, Renobacter
vacuolatum,
Thermocrinis ruber, Wautersia sp., Anabaena oscillarioides, Anabaena spiroides
et Anabaena
cyfindrica.
Les termes bactérie recombinante et bactérie génétiquement modifiée sont
utilisés
ici de manière interchangeable et désignent des bactéries qui ont été
génétiquement modifiées
pour exprimer ou pour surexprimer des séquences nucléotidiques endogènes, pour
exprimer
des séquences nucléotidiques hétérologues (exogènes), ou qui ont une
altération de
l'expression d'un gène endogène. Par altération , on entend que l'expression
du gène, ou
niveau d'une molécule d'ARN ou molécules d'ARN équivalentes codant pour un ou
plusieurs
polypeptides ou sous-unités polypeptidiques, ou l'activité d'un ou plusieurs
polypeptides ou
sous-unités polypeptidiques est régulée, de sorte que l'expression, le niveau
ou l'activité soit
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supérieur ou inférieur à celui observé en l'absence de cette modification. Il
est entendu que les
termes bactérie recombinante et bactérie génétiquement modifiée se
réfèrent non
seulement à la bactérie recombinante particulière, mais également à la
descendance ou à la
descendance potentielle d'une telle bactérie. Certaines modifications pouvant
se produire dans
5 les générations suivantes, du fait d'une mutation ou d'influences
environnementales, cette
progéniture peut ne pas être identique à la cellule mère, mais elle est encore
comprise dans le
cadre du terme tel qu'utilisé ici.
Selon l'invention, on entend par surexpression d'un gène le fait que ledit
gène est
plus exprimé dans la bactérie considérée que dans une bactérie non
génétiquement modifiée
pour surexprimer ledit gène, conduisant à une production ou une production
plus importante de
la protéine correspondante (et plus particulièrement de la lactate
déshydrogénase) et
notamment à une augmentation supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%,
40%, 50%,
60%, 70%, 80%, 90%. Selon l'invention, une telle surexpression s'entend de
l'expression d'une
lactate déshydrogénase endogène, qui n'est pas ou peu exprimée dans la
bactérie non
génétiquement modifiée, ou de l'expression d'une lactate déshydrogénase
exogène.
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est sélectionnée parmi
les bactéries
oxydant naturellement l'hydrogène possédant une lactate déshydrogénase
endogène.
Avantageusement, la bactérie est sélectionnée parmi Cupriavidus sp., telle que
Cupriavidus necator, Hydrogenobacter sp., telle que Hydrogenobacter
thermophilus,
Rhodococcus sp., telle que Rhodococcus opacus, et Pseudomonas sp., telle que
Pseudomonas hydrogenothermophila
Les termes "endogène" ou "natif' désignent un gène qui est normalement ou
naturellement présent dans le génome de la bactérie considérée. A l'inverse,
les termes
exogène ou hétérologue tels qu'utilisés ici en référence à un gène
(séquence
nucléotidique) désignent un gène qui n'est pas normalement ou naturellement
présent dans le
génome de la bactérie considérée.
Dans le cas d'une bactérie possédant une lactate déshydrogénase endogène, il
est
possible de modifier génétiquement ladite bactérie, de manière à permettre une
surexpression
dudit gène. Notamment, il est possible de modifier la bactérie pour que au
moins un gène
codant pour une lactate déshydrogénase endogène soit sous le contrôle d'un
promoteur
permettant une telle surexpression. Un promoteur désigne la séquence à
l'extrémité 5 'du gène
structural considéré et qui dirige l'initiation de la transcription. D'une
manière générale, selon
l'invention, les promoteurs utilisables incluent des promoteurs constitutifs,
à savoir des
promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des
conditions
environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou
réprimés par des
stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau
d'expression
variable en fonction de la présence ou de l'absence de ces stimuli. De manière
alternative ou
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complémentaire, il est possible de modifier génétiquement le promoteur
endogène, par
exemple pour lever de potentielles inhibitions de son induction. Il est
également possible de
surexprimer une lactate déshydrogénase endogène en multipliant le nombre de
copies du gène
dans le génome de la bactérie, par le biais de plasmides et/ou en introduisant
des séquences
nucléotidiques à d'autres loci sur le ou les chromosomes de la bactérie, etc.
Dans un mode de réalisation, la bactérie selon l'invention est génétiquement
modifiée
pour surexprimer une lactate déshydrogénase endogène. Avantageusement, la
bactérie est
génétiquement modifiée pour surexprimer seulement la L-lactate déshydrogénase
endogène
ou seulement la D-lactate déshydrogénase endogène.
Les tableaux 1 et 2 ci-dessous répertorient, à titre d'exemples, des séquences
codant
pour des L-lactate déshydrogénase et des D-lactate déshydrogénase,
respectivement, de
différentes bactéries, ainsi que les séquences protéiques correspondantes.
Selon l'invention,
ces séquences peuvent être la cible de modifications génétiques, y compris de
multiplication,
pour conduire à une bactérie génétiquement modifiée apte à produire du lactate
à partir de
002.
Tableau 1: Exemples de L-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.27)
Microorganisme Gène GenBank Séquence
protéique
Cupriavidus necator H16 ldh 0AJ91814.1 SEQ
ID N 1
Pediococcus acidilactici IdhA
1082254718 SEQ ID N 2
Streptococcus equinus (streptococcus bovis) ldh
KFN85486.1 SEQ ID N 3
Bacillus coagulans ldh
AGU00860.1 SEQ ID N 4
Lactobacillus casei ldh
0AQ65818.1 SEQ ID N 5
Lactobacillus helveticus ldh ABX26516.1 SEQ
ID N 6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ldh
KRN37463.1 SEQ ID N 7
Lactobacillus plantarum ldh EFK28653.1 SEQ
ID N 8
Lactobacillus pentosus ldh EIW14906.1 SEQ
ID N 9
Lactococcus lactis subsp. lactis ldh BAL51029.1 SEQ ID N 10
Tableau 2 : Exemples de D-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.28)
Microorganisme Gène GenBank Séquence
protéique
Cupriavidus necator H16 IdhA1 0AJ92810.1 SEQ
ID N 11
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IdhA 0AI96942.1 SEQ
ID N 12
Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 IdhA 16129341 SEQ
ID N 13
Bacillus coagulans IdhA
ADV02473.1 SEQ ID N 14
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Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est une bactérie
Cupriavidus
necator, génétiquement modifiée au niveau du promoteur associé au(x) gène(s)
codant pour la
L-lactate déshydrogénase endogène et/ou la D-lactate déshydrogénase endogène,
afin de
favoriser l'expression de l'un et/ou de l'autre gène. En effet, les inventeurs
ont découvert que
Cupriavidus necator possède des gènes codant une L-lactate déshydrogénase
(ldh) et une D-
lactate déshydrogénase (IdhA1) endogènes, dont l'expression dépend des
conditions de
culture et qui est généralement quasiment nulle en limitation de nutriments.
Selon l'invention,
cette bactérie peut avantageusement être génétiquement modifiée au niveau de
la séquence
nucléotidique codant pour ledit promoteur, afin de lever cette régulation
négative et permettre
l'expression des gènes correspondants, même en limitation de nutriments. Il
est notamment
possible de modifier Cupriavidus necator de manière à associer la ou les
séquences codant
pour la L-lactate déshydrogénase et/ou la D-lactate déshydrogénase endogènes à
un
promoteur constitutif ou à un promoteur inductible.
Dans un mode de réalisation, les gènes codant pour la L-lactate déshydrogénase
et/ou
à la D-lactate déshydrogénase endogènes sont modifiés de manière à être sous
contrôle d'un
promoteur recombinant constitutif (non soumis à une régulation négative) ou
inductible en
présence d'une molécule particulière. A titre d'exemple, il est possible
d'utiliser des promoteurs
constitutifs tels que pLAC, pTAC, pJ5 (Gruber et al., 2014), un promoteur
inductible tel que le
promoteur pBAD, inductible à l'arabinose (Grousseau et al., 2014), le
promoteur pPHAP
inductible en limitation phosphate (Barnard et al. 2015), le promoteur pCBBL
inductible en
conditions autotrophes (Lütte et al., 2012) ou le promoteur pKRrha inductible
au rhamnose
(Sydow et al., 2017) .
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie selon l'invention est
génétiquement
modifiée pour surexprimer un gène codant pour l'expression d'une protéine
présentant au
moins 50% d'homologie avec SEQ ID N 1 (séquence de la L-lactate déshydrogénase
de
Cupriavidus necator H16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,
99%. Dans
un autre mode de réalisation, la bactérie selon l'invention est génétiquement
modifiée pour
surexprimer un gène codant pour l'expression d'une protéine présentant au
moins 50%
d'homologie avec SEQ ID N 11 (séquence d'une D-lactate déshydrogénase de
Cupriavidus
necator H16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%.
De manière alternative ou cumulative, la bactérie peut être génétiquement
modifiée
pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase
exogène, ou
hétérologue.
Selon l'invention, le génome de la bactérie est alors modifié de manière à
intégrer une
séquence nucléique codant pour une telle lactate déshydrogénase exogène.
Ladite séquence
nucléique peut avoir été introduite dans le génome de la bactérie ou d'un de
ses ascendants,
par le biais de toute méthode de clonage moléculaire adaptée. Dans le contexte
de l'invention,
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le génome de la bactérie s'entend de l'ensemble du matériel génétique contenu
dans ladite
bactérie, y compris le matériel génétique extrachromosomique contenu par
exemple dans des
plasmides, épisomes, chromosomes synthétiques, etc. La séquence nucléique
introduite peut
être une séquence hétérologue, c'est-à-dire qui n'existe pas à l'état naturel
dans ladite
bactérie, ou une séquence homologue. Avantageusement, on introduit dans le
génome de la
bactérie une unité transcriptionnelle comportant la séquence nucléique
d'intérêt, placée sous le
contrôle d'un ou plusieurs promoteur(s) et d'un ou plusieurs sites de liaison
au ribosome. Une
telle unité transcriptionnelle comprend également, avantageusement, les
séquences usuelles
telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d'autres
éléments de régulation
de la transcription.
Un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène peut par exemple être
dérivé d'une bactérie, d'un champignon, d'une levure ou d'un mammifère.
Préférentiellement,
un tel gène est dérivé d'une bactérie et notamment de E. cou, Bacillus
coagulans, Pediococcus
acidilactici, Streptococcus bovis (Streptococcus equinus), d'une bactérie
lactique, et
notamment de Lactobacillus case!, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus
bulgaricus,
Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum ou Lactobacillus pentosus,
Lactococcus
lactis subsp. lactis. Les gènes listés dans les tableaux 1 et 2 peuvent
également être utilisés
pour modifier génétiquement une bactérie selon l'invention.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate
déshydrogénase
hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention
présente au
moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de
Pediococcus
acidilactici (SEQ ID N 2), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%,
90%, 95%,
99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate
déshydrogénase
hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention
présente au
moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de
Streptococcus
equinus (Streptococcus bovis) (SEQ ID N 3), préférentiellement au moins 60%,
70%, 75%, 80,
85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate
déshydrogénase
hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention
présente au
moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de
Bacillus
coagulans (SEQ ID N 4), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,
70%, 75%,
80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate
déshydrogénase
.. hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon
l'invention présente au
moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de
Lactobacillus
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casei (SEQ ID N 5), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,
75%, 80,
85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate
déshydrogénase
hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention
présente au
moins 50% d'homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase de
Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus (SEQ ID N 12), préférentiellement au moins 20%,
30%, 40%,
50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate
déshydrogénase
hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention
présente au
moins 50% d'homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase de
Escherichia cou/
(SEQ ID N 13), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%,
80, 85%,
90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate
déshydrogénase
hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention
présente au
moins 50% d'homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase Bacillus
coagulans
(SEQ ID N 14), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%,
80, 85%,
90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation, la bactérie est génétiquement modifiée pour
surexprimer
au moins un gène codant pour une L-lactate déshydrogénase (endogène ou
hétérologue), de
manière à pouvoir produire du L-lactate. Dans le cas d'une bactérie possédant
un gène codant
pour une D-lactate déshydrogénase endogène, l'expression dudit gène est
avantageusement
au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de L-
lactate seulement.
De manière alternative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour
surexprimer
au moins un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase (endogène ou
hétérologue) de
manière à pouvoir produire du D-lactate. Dans le cas d'une bactérie possédant
un gène codant
pour une L-lactate déshydrogénase endogène, l'expression dudit gène est
avantageusement
au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de D-
lactate seulement.
Selon l'invention, on entend par inhibition de l'expression d'un gène le
fait que ledit
gène n'est plus exprimé dans la bactérie considérée ou que son expression est
réduite,
comparativement à la bactérie sauvage (non génétiquement modifiée pour inhiber
l'expression
du gène), conduisant à l'absence de production de la protéine correspondante
ou à une baisse
significative de sa production, et notamment à une baisse supérieure à 20%,
plus
préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Dans un mode de
réalisation,
l'inhibition peut être totale, c'est-à-dire que la protéine codée par ledit
gène n'est plus du tout
produite. L'inhibition de l'expression d'un gène peut notamment être obtenue
par délétion,
mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le
gène considéré.
Préférentiellement, l'inhibition de l'expression du gène est obtenue par
délétion totale de la
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séquence nucléotidique. Selon l'invention, toute méthode d'inhibition d'un
gène, connue en soi
par l'homme de l'art et applicable à une bactérie peut être utilisée. Par
exemple, l'inhibition de
l'expression d'un gène peut être obtenue par recombinaison homologue (Datsenko
et al., 2000;
Lodish et al., 2000) ; mutagénèse aléatoire ou dirigée pour modifier
l'expression d'un gène
5
et/ou l'activité de la protéine encodée (Thomas et al., 1987) ; modification
d'une séquence
promotrice du gène pour altérer son expression (Kaufmann et al., 2011) ;
ciblage induit des
lésions locales dans les génomes (TILLING) ; conjugaison, etc. Une autre
approche particulière
est l'inactivation génique par insertion d'une séquence étrangère, par exemple
par mutagenèse
de transposon en utilisant des éléments génétiques mobiles (transposons),
d'origine naturelle
10
ou artificielle ou par exemple par insertion d'une cassette antibiotique.
Selon un autre mode de
réalisation préféré, l'inhibition de l'expression du gène est obtenue par des
techniques knock-
out. L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par
extinction du gène en
utilisant des ARN interférents, ribozymes ou antisens (Daneholt, 2006. Nobel
Prize in
Physiology or Medicine). Dans le contexte de la présente invention, le terme
"ARN interférent"
ou "ARNi" désigne toute molécule d'ARNi (par exemple ARN monocaténaire ou ARN
bicaténaire) qui peut bloquer l'expression d'un gène cible et/ou faciliter la
dégradation de
l'ARNm correspondants. L'inhibition du gène peut également être obtenue par
des méthodes
d'édition génomique qui permettent de directement apporter des modifications
génétiques à un
génome donné, via l'utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kim et al.,
1996), de nucléases
effectrices de type activateur de transcription, dites TALEN (Ousterout et
al. 2016), d'un
système combinant des nucléases de type Cas9 avec des courtes répétitions
palindromiques
groupées et régulièrement espacées dites 'CRISPR' (Mali et al., 2013), ou
encore de
méganucléases (Daboussi et al., 2012). L'inhibition de l'expression du gène
peut également
être obtenue par inactivation de la protéine codée par ledit gène.
L'inhibition de l'expression du
gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou
substitution d'un ou
plusieurs nucléotides dans le promoteur en amont du gène considéré.
L'inhibition de
l'expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation,
insertion et/ou
substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le site de liaison au ribosome
en amont du gène
considéré.
En travaillant sur les modifications génétiques à apporter à une bactérie
oxydant
naturellement l'hydrogène pour lui permettre de produire du lactate à partir
de 002, les
inventeurs ont mis en évidence que, dans certaines bactéries, il est possible
d'inhiber au moins
partiellement une voie de dégradation du pyruvate compétitrice de la voie de
synthèse du
lactate, de manière à favoriser la production de lactate à partir dudit
pyruvate.
En effet, certaines bactéries oxydant naturellement l'hydrogène et susceptible
d'être
modifiées génétiquement selon l'invention, présentent une voie de synthèse du
Polyhydroxybutyrate (PHB) à partir du pyruvate. C'est le cas notamment de
Cupriavidus
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necator (figure 2). Une telle voie de biosynthèse peut entrer en compétition
avec la voie de
synthèse du lactate, en forçant la consommation du pyruvate dans cette voie.
Aussi, dans un
mode de réalisation, une telle bactérie est génétiquement modifiée pour
inhiber au moins
partiellement la voie de synthèse du PHB (figure 3). Plus particulièrement, il
est possible
d'inhiber au moins partiellement l'expression d'au moins un gène choisi parmi
les gènes codant
pour l'Acétyl-CoA acetyltransférase (EC : 2.3.1.9), l'Acetoacétyl-CoA
réductase (EC: 1.1.1.36)
et la poly(3-hydroxybutyrate) synthase (EC :2.3.1.-), préférentiellement
l'expression d'au moins
deux desdits gènes, plus préférentiellement l'expression desdits trois gènes.
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée
est
Cupriavidus necator, dans laquelle l'expression d'au moins un et
préférentiellement des trois
gènes parmi les gènes codant pour une phaA (GenBank: 0AJ91322.1), une phaB
(GenBank:
0AJ92574.1) et une phaC (GenBank: 0AJ92572.1) est inhibée (figure 2). Les
inventeurs ont
découvert qu'une telle bactérie également génétiquement modifiée pour
surexprimer une
lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de
lactate en
présence de CO2 comme seule source de carbone, le pyruvate produit n'étant pas
ou peu
consommé par la voie de production du PHB.
De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier
génétiquement la
bactérie de manière à inhiber au moins partiellement l'expression d'un gène
codant pour une
phosphoenolpyruvate synthase (EC: 2.7.9.2), qui convertit le pyruvate en
phosphoenol
pyruvate (PEP), et/ou une pyruvate carboxylase (EC: 6.4.1.1) et/ou un complexe
pyruvate
dehydrogenase (EC: 1.2.4.1) et/ou une fumarate reductase (EC: 1.3.5.4).
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée
est
Cupriavidus necator, dans laquelle l'expression d'au moins un gène parmi les
gènes codant
pour une ppsa (GenBank: 0AJ93138.1), une pyc (GenBank: 0AJ92391.1), une pdhA
(GenBank: 0AJ92510.1) et une sdhABCD (GenBank: 0AJ93711.1, 0AJ93712.1,
0AJ93713.1,
0AJ93714.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu'une telle
bactérie
également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase
est capable
de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO2 comme
seule source de
carbone, le pyruvate produit n'étant pas ou peu consommé par ces voies
compétitrices.
De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier
génétiquement la
bactérie de manière à inhiber au moins partiellement la voie de conversion de
l'Acetyl-CoA en
acétate et/ou en Acétaldéhyde. Pour cela, il est possible d'inhiber au moins
partiellement
l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour une acetyl-
CoA hydrolase
(EC: 3.1.2.1), une phosphate acétyltransférase (EC: 2.3.1.8), une Acétate
kinase (EC:
2.7.2.1), une propionate CoA-transferase (EC: 2.8.3.1), une succinyl-CoA
:acetate CoA-
transferase (EC :2.8.3.18) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (EC: 1.2.1.10).
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Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée
est
Cupriavidus necator, dans laquelle l'expression d'au moins un gène parmi les
gènes codant
pour une Acetyl-CoA hydrolase (GenBank: 0AJ96157.1), une Phosphate
acétyltransférase
(pta1, pta2) (GenBank: 0AJ96416.1, GenBank: 0AJ96653.1), une Acétate kinase
(ackA,
ackA2) (GenBank: 0AJ91818.1, GenBank: 0AJ96415.1), une Propionate CoA-
transferase
(GenBank: 0AJ93797.1), une Succinyl-CoA :acetate CoA-transferase (GenBank:
0AJ92496.1)
et une Acétaldéhyde déhydrogénase (mhpf) (GenBank: 0AJ92911.1) est inhibée
(figure 2). Les
inventeurs ont découvert qu'une telle bactérie également génétiquement
modifiée pour
surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités
importantes de
lactate en présence de CO2 comme seule source de carbone, le pyruvate produit
n'étant pas
ou peu consommé par ces voies compétitrices.
Dans certains cas, les bactéries oxydant naturellement l'hydrogène possèdent
un ou
des gènes codant pour une Lactate ferricytochrome C reductase. C'est le cas
notamment de
Cupriavidus necator qui possèdent trois gènes IldD (EC : 1.1.2.3, GenBank:
0AJ95257.1), IldA
(EC : 1.1.2.3, GenBank: 0AJ96599.1), dld (EC :1.1.2.4, GenBank: 0AJ94166.1)
codant pour
une telle Lactate ferricytochrome C reductase. Or, les inventeurs ont
découvert qu'une telle
enzyme est susceptible de diminuer le taux de lactate produit, en
convertissant ledit lactate en
pyruvate. Aussi, selon l'invention, dans le cas où la bactérie possède une
telle Lactate
ferricytochrome C reductase endogène, le gène codant pour ladite enzyme est
avantageusement au moins partiellement inhibé.
L'invention propose avantageusement d'utiliser une bactérie génétiquement
modifiée
selon l'invention pour produire du lactate à partir de 002. Avantageusement,
une bactérie
génétiquement modifiée pour surexprimer une L-lactate déshydrogénase, et le
cas échéant
inhiber une D-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement
du L-lactate. De
manière similaire, une bactérie génétiquement modifiée pour surexprimer une D-
lactate
déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une L-lactate déshydrogénase est
utilisée pour
produire exclusivement du D-lactate.
L'invention propose plus particulièrement un procédé de production de lactate
à partir
de 002, selon lequel on cultive, par exemple en batch, fed-batch ou en culture
continue, une
bactérie génétiquement modifiée selon l'invention en présence de CO2 et on
récupère le lactate
produit.
Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, une solution de base est ajoutée
pendant
la fermentation pour contrôler le pH. L'acide lactique se trouve alors dans le
milieu de
fermentation sous forme de sel (lactate de sodium, lactate de potassium,
lactate de calcium ou
lactate d'ammonium, seuls ou en mélange, en fonction de la base choisie pour
réguler le pH du
milieu de fermentation).
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Le bouillon de fermentation contenant les bactéries, les impuretés du milieu
de
fermentation (protéines non consommées et sels inorganiques de natures
diverses) et le sel de
lactate, est alors traité afin de les séparer. Une telle étape de séparation
peut notamment être
mise en oeuvre en utilisant un séparateur de cellules tel qu'une
centrifugeuse, un dispositif de
microfiltration ou d'ultrafiltration. Après séparation, on obtient d'une part
une biomasse
cellulaire concentrée et d'autre part une solution de sel de lactate.
Il est ensuite possible de procéder à une étape de conversion des sels de
lactate en
acide lactique sous forme libre. Cette étape de récupération de l'acide
lactique à partir du
milieu de fermentation peut notamment être réalisée via l'extraction de
l'acide lactique en tant
que tel du milieu de fermentation, ou par acidification du milieu à l'acide
sulfurique.
Une étape de purification par extraction, estérification, distillation ou
hydrolyse peut
ensuite être réalisée, afin d'obtenir un acide lactique à haut degré de
pureté.
Selon l'invention, la source de CO2 peut être du CO2 pur ou du CO2 issu
d'émissions
des usines ayant des procédés industriels tels que les raffineries de pétrole,
les cimenteries,
les productions d'ammoniaque, les productions de méthanol, etc. Le CO2 peut
également être
un produit de fermentation, un gaz enrichi en CO2, un gaz CO2 au moins
partiellement purifié,
une solution de carbonate ou de bicarbonate, et / ou l'acide formique. La
teneur du gaz total en
CO2 peut être de 10% à 100%. Un tel gaz contenant du CO2 peut être injecté
directement ou
via une étape intermédiaire de capture ou purification du CO2. La purification
du CO2 peut être
réalisée par traitement chimique, par exemple en présence d'amines, ou par
traitement
enzymatique mettant par exemple en oeuvre une anhydrase carbonique.
Selon l'invention, la source l'hydrogène peut être un produit du vaporeformage
du
méthane, de l'électrolyse de l'eau ou être un co-produit (hydrogène fatal )
des procédés
industriels tels que le procédé chlore-alcali lors de la préparation du
dichlore ou l'incinération
des déchets.
Selon l'invention, il est possible de prévoir éventuellement une étape de
croissance de
la bactérie en amont, en présence notamment de sucres fermentescibles, tels
que du glucose
du fructose ou du glycérol. Il est également possible de cultiver la bactérie
en présence de CO2
et d'une autre source de carbone lors de l'étape de production de lactate.
EXEMPLES
Exemple 1 - souche productrice de lactate CN0001
Souche et constructions génétiques. Pour la production de lactate, une souche
Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n 541) est utilisée. Cette souche ne forme
pas de poly-
6-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate
CN0001 est
réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déhydrogénase de Cupriavidus necator (ldh,
EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l'arabinose est cloné en une étape in
vitro via le
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protocole d'assemblage In-Fusion (Clontech). Les oligonucléotides sont
synthétisés et
purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène ldh est amplifié par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus
necator H16 PHB-4 à l'aide des oligonucléotides 1 (5' GGATCCAAAC TCGAGTAAGG
ATCTCC 3') et 2 (5' ATGTATATCT CCTTCTTAAA AGATCTTTTG AATTCC 3') et de l'enzyme
Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GO Buffer (New England Biolabs, Evry,
France). Le
produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up
(Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJM3 (Müller et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS2
(Kovach et al, 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia cou, est
amplifié à l'aide
des oligonucléotides 3 (5' GAAGGAGATA TACATATGAA GATCTCCCTC ACCAGCG 3') et 4
(5' CTCGAGTTTG GATCCTCAGG CCGTGGGGAC GGC 3') et de l'enzyme Phusion High-
Fidelity PCRMaster Mix (New England Biolabs, Evry, France).Le produit de PCR
est digéré par
l'enzyme Dpnl (New England Biolabs, Evry, France) : 1p1 de Dpnl est ajouté à
50pL de produit
PCR, puis incubé 15-60min à 37 C, l'enzyme est ensuite inactivée 10min à 80 C.
Le produit
PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-
Nagel).
Un assemblage in vitro par In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin
d'obtenir le
plasmide pJM3-ldh. 5p1 du produit d'assemblage sont transformés dans des
cellules
Escherichia cou/ Stellar (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont
sélectionnés
sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5g/L, NaCl 5g/L,
Sigma-Aldrich, agar
20g/L) contenant 25pg/mL de kanamycine. La sélection des clones positifs est
réalisée par
PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo
ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin
Plasmid (Macherey-
Nagel), l'insertion correcte du gène ldh est confirmée par séquençage
(Eurofins genomic) avec
les oligonucléotides 5 (5' GACGCTTTTT ATCGCAACTC TCTACTG 3') et 6 (5'
CGAACGCCCT
AGGTATAAAC GCAG 3').
Le plasmide pBBAD-ldh est inséré dans la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4
par
électroporation (protocole adapté de Taghavi et al., 1994). Des cellules
Cupriavidus necator
sont mises en culture en milieu TSB contenant 27.5 g/L de bouillon de soja
tryptique (TSB,
Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA, 3m1 dans des tubes 10m1) et incubées
une nuit à
30 C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, 1m1 de la culture est transféré
dans un
erlenmeyer de 250mL contenant 25mL de milieu TSB et incubé à 30 C, 200 rpm
jusqu'à
atteindre une D0600nm de 0,5-0,6. Les cellules sont alors récoltées et lavées
deux fois avec
25mL de tampon de lavage froid (10%glycerol, 90% eau [vol/vol]). Les cellules
rendues par ce
procédé électro-compétentes sont ensuite concentrées dans la solution de
lavage afin d'obtenir
une D0600nm de 50 et aliquotées par 150pL.
Un aliquot de cellules compétentes est transformée avec 2-5p1 d'ADN
plasmidique (100-
15Ong/p1). Le mélange ADN/cellules contenu dans un tube 1.5m1 est agité par de
légers
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tapotements (4-5 fois). Le mélange est placé 5 min sur la glace et transféré
dans une cuvette
d'électroporation froide (0.2 cm, 10573463, Fisher scientific, Illkirch).
L'électroporation est
réalisée avec les réglages suivants : voltage 2.5kV, capacité 25pF, résistance
externe 200 Cl
Immédiatement après l'électroporation les cellules sont mélangées avec 1mL de
milieu SOC
5
(tryptone 2 (Y0, extrait de levure 0,5 (Y0, NaCI 10 mM, KCI 2,5 mM, MgCl2 10
mM, MgSO4
10 mM et glucose 20 mM), incubées 2h à 30 C puis étalées sur des boites de
pétri maintenue
à 30 C contenant du milieu TSB/Agar (20g/L) additionné de 10 mg/L de
gentamycine et 200
mg/L de kanamycine).
La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pJM3-Idh est récupérée et nommée
10 CN0001. Les modifications génétiques sont validées par séquencçage.
Milieux Pour les précultures, le milieu minimum A utilisé contient : NaH2PO4,
4,0 g/L ;
Na2HPO4, 4,6 g/L; K2504, 0,45 g/L; MgSO4 0,39 g/L, CaCl2, 0,062 g/L; NH4CI
0.05 %
(w/v), trace d'éléments, 1mI/L (FeSO4=7H20, 15 g/L; MnSO4=H20, 2.4 g/L ;
ZnSO4=7H20, 2.4
g/L; CuSO4=5H20, 0,48 g/L dans HCM 0,1M).
15
Pour les cultures en bioréacteurs le milieu minimum B utilisé contient par
litre :
MgSO4,7H20, 0,75 g; phosphate (Na2HPO4,12H20, 1,5g; KH2PO4, 0,25 g); acide
nitrilotriacetique, 0,285g; citrate d'ammonium de fer(III), 0,9 g; CaCl2,
0,015 g; trace d'éléments
(H3B03, 0,45 mg; CoC12,6H20, 0,3 mg; ZnSO4,7H20, 0,15 mg; MnC12,4H20, 0,045
mg;
Na2Mo04,2H20, 0,045 mg; NiC12,6H20, 0,03 mg; CuSO4, 0,015 mg); kanamycin, 0,1
g.
Précultures Une colonie isolée de la souche CN0001 est utilisée pour
ensemencer la
première culture qui est cultivée pendant 24 h avec 10 mL de TSB contenant 10
mg/L de
gentamycine et 200 mg/L de kanamycine, dans un erlenmeyer baflé de 100 mL.
Deux autres
étapes de propagation sont menées pendant 12 h chacune (25 mL et 300 mL de
milieu
minimum A, respectivement dans des flacons Erlenmeyer de 250 mL et 3 L).
Chaque culture
est cultivée à 30 C et agitée à 100 tours par minute dans un incubateur.
Cette préculture est
utilisée pour inoculer l'étape de culture en bioréacteurs.
Culture en bioréacteurs La culture de la souche CN0001 en fed-batch est
réalisée en
trois phases. La première phase consiste en une phase de croissance contrôlée
sur fructose
pour atteindre 0,9 g/L de biomasse à un taux de croissance spécifique de 0,16
h-1. Après la
consommation du fructose, la deuxième phase est réalisée pour permettre
l'adaptation du
métabolisme cellulaire aux substrats gazeux. Il est démarré en par un flux de
0,22 L/min d'un
mélange commercial H2/02/CO2/N2 (`)/0 molaire: 60:2:10:28, Air Liquide, Paris,
France). La
troisième phase consiste en une croissance limitée en azote sur des substrats
gazeux couplée
à la production de lactate. Cette phase est initiée par l'ajout de 1 g/L de L-
arabinose pour
induire l'expression de la lactate déshydrogénase. L'azote est alimenté à
partir d'une solution
de 56 g/L de NH3, pour contrôler un taux de croissance spécifique résiduel de
0,02 h-1. Cette
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culture est menée dans des bioréacteurs de 1,4 L BDCU B.Braun. La température
est régulée
à 30 C et le pH à 7,0 par l'addition d'une solution de KOH 2,5 M.
Analyse du lactate et des métabolites Afin de déterminer les concentrations en
acides organiques, en particulier celle en lactate, le surnageant de
fermentation est analysé par
chromatographie HPLC-UV-RI. Le moût de fermentation régulièrement prélevé (1
mL) est
d'abord centrifugé pendant 10 min à 10 000 g. Puis, il est filtré sur 0,45 pm
(Minicart RC4,
Sartorius). Le système HPLC utilisé est un Thermo Scientific UltiMate 3000
HPLC, couplé à un
réfractomètre et détecteur UV (210 nm). 10 pL de chaque échantillon est
injecté sur une
colonne Aminex HPX-87H H+, 300 mm x 7,8 mm (Biorad). L'éluant est une solution
aqueuse
d'acide sulfurique 4 mM. Le débit est fixé à 0,5 ml/min. La température du
four est de 45 C.
Une élution isocratique est réalisée. La quantification est réalisée grâce à
une gamme étalon
appropriée. Si besoin, les échantillons sont dilués.
Résultat La souche CN0001 produit dans ces conditions de culture de 5 à 100
mg/L de
lactate.
Exemple 2: Construction d'une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène,
Cupriavidus necator et génétiquement modifiée pour surexprimer de manière
plasmidique une lactate déshydrogénase endogène et pour produire du lactate à
partir
de CO2 (CN0002).
Souche et constructions génétiques Pour la production de lactate, une souche
Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n 541) est utilisée. Cette souche ne forme
pas de poly-
6-hydroxy-butyrate (PHB).
La construction de la souche productrice de lactate CN0002 est réalisée selon
le
protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator (ldh,
EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l'arabinose est cloné en une étape in
vitro via le
protocole d'assemblage In-Fusion (Clontech). Les oligonucléotides sont
synthétisés et
purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène ldh (GenBank: CAJ91814.1) est amplifié par PCR sur l'ADN génomique de
la
souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 à l'aide des oligonucléotides 7 (5'
AAGGAGATAT
ACATATGAAG ATCTCCCTCA CCAGCG 3') et 8 (5' ACTCGAGTTT GGATCCTCAG
GCCGTGGGGA CGGC 3') et de l'enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC
Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel
avec le kit
Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pBADTrfp (Bi et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS
(Kovach et al., 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia cou, est
digéré par les
enzymes de restrictions BamHI-HF et Ndel (New England Biolabs, Evry, France)
afin d'éliminer
la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d'ADN de 5247 paires de
bases
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contenant l'origine de réplication pBBR1, le gène de selection (kan) et le
promoteur pBAD est
purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin
d'obtenir le
plasmide pBAD-Idh(cn). 5 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des
cellules
Escherichia cou/ StellarTM (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants
sont sélectionnés
sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L,
Sigma-Aldrich,
agar 20 g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine (GibcoTm). La sélection des
clones positifs est
réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master
Mix (Thermo
ScientificTM) et des oligonucléotides 9 (5' CGAAGGTGAG CCAGTGTGAC TC 3') et 10
(5'
CCTGTCGATC CTGCCCAACT AC 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit
NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), l'insertion correcte du gène 1.1dh est
confirmée par
séquençage (Eurofins Genomic) avec les oligonucléotides 9 et 11 (5' CATTGATTAT
TTGCACGGCG TCAC 3').
Le plasmide pBAD-1.1dh(cn) est inséré dans une souche électrocompétente
Escherichia
.. cou/ S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser,
BioRad (Datsenko
and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme
DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 9
et 10. Le
clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de
levures 5 g/L, NaCI 5
g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubé une
nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou/ S17-1 et celles de la
souche
Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n 541) est réalisée comme suit:
Les cellules Cupriavidus necator sont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB
contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson,
Sparks, Maryland,
USA) et incubées 20 h à 30 C sous agitation vigoureuse. Les cellules
Escherichia cou/ sont
mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5
g/L, NaCI 5 g/L,
Sigma-Aldrich) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37 C
sous agitation
vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (DOsoonm) est mesurée pour chaque
culture et
l'équivalent de 1 DO de cellules sont transférées en tube 1,5 ml et
centrifugées (5 minutes,
3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1m1 de
PBS (Sigma-
Aldrich). Le lavage est répété une seconde fois. 50 pL de la suspension
cellulaire Cupriavidus
necator et 50 pL de la suspension cellulaire Escherichia cou/ sont prélevés et
mélangés dans
un tube 1,5 mL. Ce mélange est déposé sous forme d'une goutte sur un milieu
non sélectif
LB/Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30 C. Les cellules sont
ensuite grattées et
resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 :1000ème et
100 pL de
cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de
fructose, 300 pg/mL de
kanamycine et 10 pg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises
à incuber
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24h à 30 C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu
sélectif et mis à incuber
24h à 30 C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD-Idh(cn) est
réalisée par PCR
sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo
ScientificTM) et des
oligonucléotides 9 et 10.
La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-Idh(cn) est récupérée et nommée
CN0002. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Exemple 3: Production de lactate à partir de Fructose par culture en
Erlenmeyer
d'une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène, Cupriavidus necator,
génétiquement
modifiée (CN0002)
Souche Pour la production de lactate, la souche CN0002 (Cupriavidus necator
H16
PHB-4 pBAD -Idh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate
déshydrogénase) de C.
necator est surexprimée sur plasmide via un promoteur inductible à
l'arabinose. Cette souche
est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance
plasmidique à la
kanamycine.
Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase
de soja
(TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures
en Erlenmeyers
(milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH2PO4 2H20; 4,6 g/L de Na2HPO4 12H20;
0,45 de g/L
K2SO4; 0,39 g/L de MgSO4 7H20; 0,062 g/L de CaCl2 2H20 et 1 ml/L de solution
de trace
d'éléments. La solution de trace d'éléments contenait : 15 g/L de FeSO4 7H20;
2,4 g/L MnSO4
H20; 2,4 g/L de ZnSO4 7H20 et 0,48 g/L de CuSO4 5H20 dans 0,1 M de HCI. Le
fructose (20
g/L) a été utilisé comme source de carbone. NH4CI (0,5 g/L) a été utilisé
comme source d'azote
pour atteindre une concentration de biomasse d'environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH
ont été
ajoutés.
Chaîne d'inoculation Un clone de la souche CN0002 repiqué d'une plaque de
culture
a été tout d'abord cultivé durant 8 h dans 5 mL de milieu riche avec de la
gentamycine (10
mg/L) et de la kanamycine (200 mg/L) (dépendant de la souche), dans des tubes
de culture, à
C sous agitation (200 rpm). Cette première préculture a été utilisée pour
inoculer la
deuxième préculture à une DOsoo initiale de 0,05 dans 25 mL de milieu MMR dans
des
Erlenmeyer bafflés de 250 mL qui ont été incubés durant 20 h à 30 C, 200 rpm.
Cette seconde
30
préculture a été utilisée pour inoculer la culture en Erlenmeyer dans 50 mL de
milieu MMR en
présence de gentamycine (10 mg/L) et de kanamycine (200 mg/L) (dépendant de la
souche).
La DOsoo initiale visée a été de 0,05.
Culture en Erlenmeyer La culture hétérotrophe a été réalisée dans un volume de
MMR
de 50 mL dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL, à une température de 30 C et
une
agitation de 200 rpm. Une phase de croissance d'une durée de 20h a été
réalisée jusqu'à
l'obtention d'une biomasse de 1 g/L. Après cette première phase de croissance,
une
modification de l'aération est opérée (2% air soit 0,4% d'02), une induction
du promoteur de la
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LDH est réalisée par l'ajout de 1 g/L d'arabinose (dépendant de la souche) ce
qui conduit à une
phase de production de lactate d'une durée de 120 h.
Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons de 1mL ont été
prélevés
régulièrement au cours de la culture. La croissance a été suivie par une
mesure de la densité
optique (DO) à 600 nm; convertie en poids sec de cellules bactériennes
(gCDW/L) selon une
courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC comme
décrit dans
l'exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 5 min à 13 000
tr/min et les
surnageants ont été filtrés avant d'être analysés par HPLC. L'étalonnage a
varié de 0,1 à 5 g/L
dans de l'eau.
Résultats La croissance de la souche est représentée à la figure 6. Pendant la
phase
de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en
condition
hétérotrophe atteint p.= 0,14 h'. Un maximum de lactate, c'est-à-dire 1,3 g/L,
a été atteint
après 139 h de culture comme représenté à la figure 6. Il est à noter que dans
les mêmes
conditions de culture, la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 sans
surexpression de lactate
déshydrogénase ne produit pas de lactate.
Exemple 4: Production de lactate à partir de CO2 par fermentation d'une
bactérie
oxydant naturellement l'hydrogène, Cupriavidus necator, génétiquement modifiée
(CNO002).
Souche Pour la production de lactate, la souche CN0002 (Cupriavidus necator
H16
PHB-4 pBAD -Idh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate
déshydrogénase) de C.
necator est surexprimée sur plasmide via un promoteur inductible à
l'arabinose. Cette souche
est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance
plasmidique à la
kanamycine.
Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase
de soja
(TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures
en Erlenmeyers
(milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH2PO4 2H20; 4,6 g/L de Na2HPO4 12H20;
0,45 de g/L
K2SO4; 0,39 g/L de MgSO4 7H20; 0,062 g/L de CaCl2 2H20 et 1 ml/L de solution
de trace
d'éléments. La solution de trace d'éléments contenait : 15 g/L de FeSO4 7H20;
2,4 g/L MnSO4
H20; 2,4 g/L de ZnSO4 7H20 et 0,48 g/L de CuSO4 5H20 dans 0,1 M de HCI. Le
fructose (20
g/L) a été utilisé comme source de carbone. NI-14C1 (0,5 g/L) a été utilisé
comme source d'azote
pour atteindre une concentration de biomasse d'environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH
ont été
ajoutés.
Le milieu minimum utilisé dans le bioréacteur pour les fermentations gaz
(milieu FAME)
était constitué de : 0,29 g/L d'acide NitriloTriAcetique; 0,09 g/L de citrate
d'ammonium ferrique ;
0,75 g/L de MgSO4 7H20; 0,015 g/L de CaCl2 2H20 et 1,5 ml/L de solution de
trace élément.
La composition de la solution de trace élément était : 0,3 g/L de H3B03; 0,2
g/L de CoCl2 6H20;
0,1 g/L de ZnSO4 7H20; 0,03 g/L de MnCl2 4H20; 0,03 g/L de Na2Mo04 2H20; 0,02
g/L de
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NiCl2 6H20; 0,01 g/L de CuSO4 5H20. (NH4)2SO4 (1,6 g/L) a été utilisé comme
source d'azote
pour atteindre une concentration en biomasse d'environ 2,5 g/L. Le pH a été
ajusté à 7 avec
2,5 M de KOH. Après autoclavage du milieu, une solution de phosphate stérile
de Na2HPO4
12H20 (concentration finale de 1,6 g/L) et de KH2PO4 (concentration finale de
2,9 g/L) a été
5
ajoutée stérilement dans le bioréacteur (permettant de produire environ 10 g/L
de biomasse)
ainsi qu'une solution stérile de FeSO4 7H20 (10,7 g/L; concentration finale
0,032 g/L).
Chaîne d'inoculation Un clone de la souche CN0002 repiqué d'une plaque de
culture
a été tout d'abord cultivé durant 24 h dans 5 mL de milieu TSB avec de la
gentamycine (10
mg/L) et de la kanamycine (50 mg/L) (dépendant de la souche), dans des
Erlenmeyers bafflés
10
de 50 mL, à 30 c sous agitation (110 rpm). Le milieu de culture a été ensuite
centrifugé durant
10 min à 1900 g. Les cellules ont été resuspendues dans 5 mL de milieu MMR, et
ont été
utilisées pour inoculer les 45 mL de milieu MMR avec 5,5 mg/L de gentamycine
et 100 mg/L de
kanamycine (dépendant de la souche) dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL qui
ont été
incubés durant 20-24 h à 30 C, 110 rpm. Le milieu de culture a été centrifugé
durant 5 min à
15
4000 g et les cellules ont été resuspendues dans 30 mL de milieu FAME, et ont
été utilisées
pour inoculer les 300 mL de milieu FAME (avec si besoin 100 mg/L de
kanamycine) dans le
bioréacteur gaz. La DOsoo initiale visée a été de 0,2.
Bioréacteur gaz La culture autotrophe a été réalisée dans un bioréacteur à gaz
avec
un volume de travail de 330 mL. La température a été réglée à 30 C, le pH à
7. La pression et
20
la vitesse d'agitation ont été définies en fonction des besoins de la culture.
Les débits de gaz
étaient contrôlés individuellement (CO2, H2, air). Un analyseur de gaz a été
utilisé pour
l'analyse des gaz de sortie (`)/0 02 et CO2) et un volumètre pour mesurer les
débits de gaz de
sortie totaux. Après 53 heures de croissance, environ 3 g/L de biomasse ont
été atteint, la
concentration en oxygène dissous est tombée à 0 et 160 mg/L de lactate ont été
produits.
Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons (environ 1 ml) ont
été
prélevés régulièrement (toutes les 2-3 heures) en prélevant au travers d'un
septum avec une
seringue et une aiguille. La croissance a été suivie par une mesure de la
densité optique (DO)
à 600 nm; convertis en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une
courbe
d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC/HPAIC comme
décrit dans
l'exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 3 min à 13 000
tr/min et les
surnageants ont été analysés. Pour l'analyse HPLC, les surnageants des
échantillons ont été
filtrés avant analyse. L'étalonnage a varié de 0,1 à 5 g/L dans de l'eau.
Fermentation La production de lactate par la souche CN0002 a été caractérisée
en
bioréacteur en conditions autotrophes. La croissance de la souche est
représentée à la figure
7. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance
spécifique de CN0002
en condition autotrophe atteint p. = 0,14 h'. Un maximum de lactate, c'est-à-
dire 160 mg/L, a
été atteint après 53 h de culture comme représenté à la figure 7.
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Exemple 5: Construction et évaluation d'une souche de Cupriavidus necator
génétiquement modifiée dans laquelle une lactate déshydrogénase hétérologue de
Streptococcus bovis est surexprimée (CN0003).
Souche et constructions génétiques. Pour la production de lactate, une souche
Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n 541) est utilisée. Cette souche ne forme
pas de poly-
6-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate
CN0003 est
réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase (ldh, EC:1.1.1.27) de
Streptococcus
bovis (ATCC 33317) sous promoteur inductible à l'arabinose est cloné en une
étape in vitro via
.. le protocole d'assemblage In-Fusion (Clontech). Les oligonucléotides sont
synthétisés et
purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène ldh (GenBank: KFN85486.1) est recodé selon le biais d'usage de codon
décrit
pour Cupriavidus necator H16 et synthetisé in vitro (GenScripti0). Il est
amplifié par PCR à
l'aide des oligonucléotides 12 (5' AAGGAGATAT ACATATGACC GCGACCAAGC AGCAC 3')
et 13 (5' ACTCGAGTTT GGATCCTCAG TTCTTGCAGG CCGACGCGA 3') et de l'enzyme
Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry,
France). Le
produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up
(Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pBADTrfp (Bi et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS
(Kovach et al., 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia cou, est
digéré par les
enzymes de restrictions BamHI-HF et Ndel (New England Biolabs, Evry, France)
afin d'éliminer
la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d'ADN de 5247 paires de
bases
contenant l'origine de réplication pBBR1, le gène de sélection (kan) et le
promoteur pBAD est
purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin
d'obtenir le
plasmide pBAD-Idh(sb). 5 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des
cellules
Escherichia cou/ StellarTM (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants
sont sélectionnés
sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5g/L,
Sigma-Aldrich, agar
20g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine (GibcoTm). La sélection des clones
positifs est
réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master
Mix (Thermo
ScientificTM) et des oligonucléotides 9 et 14 (5' GGAGCTGGGC ATCATCGAGA TC
3'). Après
extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel),
l'insertion
correcte du gène ldh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les
oligonucléotides 9 et 11.
Le plasmide pBAD-Idh(sb) est inséré dans une souche électrocompétente
Escherichia
cou/ S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser,
BioRad (Datsenko
and Wanner, 2000).
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La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de
l'enzyme
DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 9
et 14. Le
clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de
levures 5 g/L, NaCI 5
g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubé
une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche
Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n 541) est réalisé comme suit :
Les cellules Cupriavidus necator sont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB
contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson,
Sparks, Maryland,
USA) et incubées 20h à 30 C sous agitation vigoureuse. Les cellules
Escherichia cou sont
mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5
g/L, NaCI 5 g/L,
Sigma-Aldrich) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37 C
sous agitation
vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (DOsoonm) est mesurée pour chaque
culture et
l'équivalent de 1 DO de cellules est transféré en tube 1,5m1 et centrifugé (5
minutes, 3000
rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1 ml de PBS
(Sigma-Aldrich).
Le lavage est répété une seconde fois. 50 pL de la suspension cellulaire
Cupriavidus necator
et 50 pL de la suspension cellulaire Escherichia cou sont prélevées et
mélangées dans un tube
1,5 ml. Ce mélange est déposé sous forme d'une goutte sur un milieu non
sélectif LB/Agar
contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30 C. Les cellules sont ensuite
grattées et
resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 :1000eme et
100 pl de
cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de
fructose, 300 pg/mL de
kanamycine et 10 pg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises
à incuber
24h à 30 C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu
sélectif et mis à incuber
24h à 30 C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD- Idh(sb) est
réalisée par PCR
sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo
ScientificTM) et des
oligonucléotides 9 et 14.
La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-Idh(sb) est récupérée et nommée
CNO003.
Evaluation de la souche CN0003 en fructose La production de lactate sur
fructose de
la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-Idh(sb) (CN0003) a été évaluée
selon la
méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche
CN0003 produit 1
g/L de lactate après 140h de culture.
Extrapolation production de lactate par la CN0003 à partir de CO2 La
production de
lactate de la souche CN0003 n'a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant,
l'évaluation en
fructose a montré que la souche CN0003 produisait 23% de lactate en moins que
la souche
.. CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel
que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0003 produirait 23% de lactate en
moins à partir de
CO2 que la souche CN0002.
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Exemple 6: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement
modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB)
est
délétée et dans laquelle une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée
(CNO004).
Souche Pour la production de lactate, la souche Cupriavidus necator H16 (ATCC
17699) est utilisée. La délétion de l'opéron de voie de biosynthèse du
polyhydroxybutyrate
(PHB) est inhibée par insertion d'une lactate déshydrogénase endogène.
Constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate
CN0004 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator (ldh,
EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l'arabinose ainsi que les séquences
des zones
d'homologie amont et aval de l'opéron phaCAB est cloné en une étape in vitro
via le protocole
d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry,
France).
Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins
Genomics.
Le gène ldh est amplifié par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus
necator H16
à l'aide des oligonucléotides 15 (5' AGACAATCAA ATCTTTACAC
TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT
TCACACAGGA AACAGCTATG AAGATCTCCC TCACCAGCGC CC 3') présentant en 5' une
zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone
d'homologie amont
de l'opéron phaCAB et la séquence du promoteur pLac (en italique) provenant du
pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) et 16 (5' CCAGGCCGGC AGGTCAGGCC
GTGGGGACGG CCA 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 13 paires de
bases
avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval de l'opéron phaCAB et de
l'enzyme KOD Hot
Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur
gel avec
le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie amont de l'opéron phaCAB est amplifiée par
PCR
sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides 17 (5'
GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGGGTCG CTTCTACTCC TATCG 3') présentant en 5'
une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide
pJQ200mpTet et 18 (5' CATAAAGTGT AAAGATTTGA TTGTCTCTCT GCC 3') présentant en
5' une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 5' de la
séquence du
promoteur pLac et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5%
de
DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR
clean-up
(Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval de l'opéron phaCAB est amplifiée par
PCR
sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides 19 (5'
CCCCACGGCC TGACCTGCCG GCCTGGTTCA ACC 3') présentant en 5' une zone de
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recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 3' de la séquence du gène
ldh de la
souche Cupriavidus necator H16 et 20 (5' TACGAATTCG AGCTCGGTAC CCGGGTTCTG
GATGTCGATG AAGGCCTG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires
de
bases avec l'extrémité 5' du plasmide pJQ200mpTet et de l'enzyme KOD Hot Start
DNA
Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec
le kit
Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt
and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par
le gène de
résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par
l'enzyme de
restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de
digestion est purifié
sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England
Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les quatre fragments afin d'obtenir
le plasmide
pJQ200mp-AphaCABC2pLac L-ldh. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés
dans des
cellules Escherichia cou NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry,
France), chimio-
compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar
(Tryptone 10 g/L,
extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15
pg/mL de
tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur
colonie à l'aide de
l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction
des
plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), l'insertion
correcte du gène
ldh, de la séquence de la zone d'homologie amont et de la séquence de la zone
d'homologie
aval est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides
21 (5'
TGCAAGGCGA TTAAGTTG 3'), 22 (5' CATGCAAAGT GCCGGCCAGG 3'), 23 (5'
CTGCACGAAC ATGGTGCTGG CT 3') et 24 (5' CTGGCACGAC AGGTTTCCCG A 3').
Le plasmide pJQ200mp-AphaCABC2pLac L-ldh est inséré dans une souche
électrocompétente Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un
électroporateur
Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de
l'enzyme
DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est
isolé sur milieu
LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich,
agar 20 g/L)
contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche
Cupriavidus necator H16 (ATCC 17699) a été adaptée du protocole de Lenz et
al., 1994. La
méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a
permis de
déléter précisément l'opéron phaCAB et d'y insérer pLac L-ldh. Après la
première
recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à
l'aide de
l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après la
deuxième
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recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones
sensibles à la
tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod Xtreme
TM Hot Start DNA
Polymerase (Novagen) (Kraufle et al., 2009).
La souche Cupriavidus necator H16 AphaCABOpLAC_L-Idh C.necator est récupérée
et
5 nommée CN0004. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Evaluation de la souche CN0004 en fructose La production de lactate sur
fructose de
la souche Cupriavidus necator H16 AphaCABOpLAC_L-Idh C.necator (CN0004) a été
évaluée
selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la
souche CN0004
produit 1,5 g/L de lactate après 140 h de culture.
10 Extrapolation production de lactate de la CN0004 à partir de CO2 La
production de
lactate de la souche CN0004 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant,
l'évaluation en
fructose a montré que la souche CN0004 produisait 25% de lactate en plus que
la souche
CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel
que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0004 produirait 25% de lactate en
plus à partir de
15 CO2 que la souche CN0002.
Exemple 7: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement
modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB)
est
délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle
une
pyruvate carboxylase est délétée (CN0005)
20 Souche et constructions génétiques La construction de la souche
productrice de
lactate CN0005 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène
codant pour la pyruvate carboxylase (pyc) de Cupriavidus necator est cloné en
une étape in
vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New
England
25 Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et
purifiés (dessalés) par Eurofins
Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour pyc est amplifiée
par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
25 (5' AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCGCAT GGCCAAGGTG GAAGAG 3')
présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec
l'extrémité 3' du
plasmide pL03 et 26 (5' TGCCGGCCAA CGTCACATGG GATGCAGGGA AGCGAAC 3')
présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec
l'extrémité 5' de la
zone d'homologie aval du gène codant pour pyc et de l'enzyme KOD Hot Start DNA
Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec
le kit
Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour pyc est amplifiée
par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
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27 (5' TCCCTGCATC CCATGTGACG TTGGCCGGCA GGG 3') présentant en 5' une zone de
recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie
amont du gène
codant pour pyc et 28 (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCCGG GCTGATAGTT
CTTCAACACC AGCAGTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 31 paires
de
bases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA
Polymerase
(Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit
Nucleospin gel and
PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme
de
restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de
digestion est purifié sur
gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England
Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le
plasmide pL03-
Apyc. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules
Escherichia cou NEB 5-
alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les
transformants
sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5
g/L, NaCI 5 g/L,
Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection
des clones
positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green
PCR Master
Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit
NucleoSpin Plasmid
(Macherey-Nagel), la délétion du gène pyc est confirmée par séquençage
(Eurofins genomic)
avec les oligonucléotides 29 (5' GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3'), 30 (5' CGCCATATCG
GATGCCGTTC 3') et 31(5' TAGCAGCACG CCATAGTGAC TG 3').
Le plasmide pL03-Apyc est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia
cou
S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad
(Datsenko and
Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme
DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est
isolé sur milieu
LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich,
agar 20 g/L)
contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche
CN0004
a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au
saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène
codant pour pyc.
Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR
sur colonie
à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm).
Après la
deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les
clones
sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme Kod XtremeTM
Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
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La souche Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est
récupérée et nommée CN0005. Les modifications génétiques sont validées par
séquençage.
Evaluation de la souche CN0005 en fructose La production de lactate sur
fructose de
la souche Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator (CN0005)
a été
évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de
culture, la souche
CN0005 produit 21% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de
culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0005 à partir de CO2 La production
de
lactate de la souche CN0005 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant,
l'évaluation en
fructose a montré que la souche CN0005 produisait 21% de lactate en plus que
la souche
CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel
que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0005 produirait 25% de lactate en
plus à partir de
CO2 que la souche CN0004.
Exemple 8: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement
modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB)
est
délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle
une
pyruvate déshydrogénase est délétée (CN0006)
Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de
lactate CN0006 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène
codant pour le composant El de la pyruvate deshydrogénase (pdhA2) de
Cupriavidus necator
est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi
DNA Assembly
Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont
synthétisés et purifiés
(dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour pdhA2 est
amplifiée
.. par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide
des
oligonucléotides 32 (5' TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGTGC GTAATCCACT
TCCAG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec
l'extrémité
3' du plasmide pL03 et 33 (5' CCCATCGTTC ACACGGCAAG TCTCCGTTAA GGAATTC 3')
présentant en 5' une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec
l'extrémité 5' de la
zone d'homologie aval du gène codant pour pdhA2 et de l'enzyme KOD Hot Start
DNA
Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec
le kit
Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour pdhA2 est
amplifiée par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
34 (5' GACTTGCCGT GTGAACGATG GGCCATCGGG CA 3') présentant en 5' une zone de
recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie
amont du gène
codant pour pdhA2 et 35 (5' TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGTTGAGCA GGATCACGTC
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GATCC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec
l'extrémité
5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec
5% de
DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR
clean-up
(Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme
de
restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de
digestion est purifié sur
gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England
Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le
plasmide pL03-
ApdhA2. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules
Escherichia cou NEB
5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les
transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L,
extrait de levures 5
g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de
tétracycline. La sélection
des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme
DreamTaq Green
PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide
du kit
NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pdhA2 est confirmée
par
séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 36 (5' TAATCCACTT
CCAGCGCGAT AAG 3'), 37 (5' CCTGAAGTCT CCGCGATAAC 3'), 38 (5' GTTCGAAGCC
ACCGAGTATG AC 3') et 29 (5' GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3').
Le plasmide pL03-.8.pdhA2 est inséré dans une souche électrocompétente
Escherichia
cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser,
BioRad (Datsenko
and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme
DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est
isolé sur milieu
LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich,
agar 20 g/L)
contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche
CN0004
a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au
saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène
codant pour pdhA2.
Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR
sur colonie
à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm).
Après la
deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les
clones
sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme Kod XtremeTM
Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 ApdhA2 AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est
récupérée et nommée CN0006. Les modifications génétiques sont validées par
séquençage.
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Evaluation de la souche CN0006 en fructose La production de lactate sur
fructose de
la souche Cupriavidus necator H16 ApdhA2 AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator
(CN0006) a été
évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de
culture, la souche
CN0006 produit 13% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de
culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0006 à partir de CO2 La production
de
lactate de la souche CN0006 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant,
l'évaluation en
fructose a montré que la souche CN0006 produisait 13% de lactate en plus que
la souche
CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel
que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0006 produirait 13% de lactate en
plus à partir de
CO2 que la souche CN0004.
Exemple 9: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement
modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB)
est
délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle
une
phosphate acétyltransférasee et une acétate kinase phosphoenolpyruvate
synthase sont
délétées (CN0007)
Souche et constructions génétiques
La construction de la souche productrice de lactate CN0007 est réalisée selon
le
protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval de
l'opéron
codant pour les gènes acétate kinase (ackA) et phosphotransacétylase (pta1) de
Cupriavidus
necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage
NEBuilder HiFi DNA
Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides
sont synthétisés
et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour pta1 est
amplifiée par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
39 (5' TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACGTGTCCAA TGAGATGACA GCACG 3') présentant
en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité 3' du
plasmide pL03 et
40 (5' TGTAGCGGTG GTGCGTCAGG GTCGTCGGTG 3') présentant en 5' une zone de
recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie
aval du gène
codant pour ackA et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5%
de
DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR
clean-up
(Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour ackA est amplifiée
par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
41(5' ACCCTGACGC ACCACCGCTA CAGCCGACCA AG 3') présentant en 5' une zone de
recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie
amont du gène
codant pour pta1 et 42 (5' TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGCTGATAC GTTCACGCAT
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AGTGGTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases
avec
l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase
(Novagen)
avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel
and PCR
clean-up (Macherey-Nagel).
5
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme
de
restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de
digestion est purifié sur
gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England
Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le
plasmide pL03-
10
Apta1-ackA. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules
Escherichia cou
NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes.
Les
transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L,
extrait de levures 5
g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de
tétracycline. La sélection
des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme
DreamTaq Green
15
PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide
du kit
NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l'opéron ackA-pta1 est
confirmée par
séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 43 (5' GACTTCCGGC
AGGTCATGC 3'), 44 (5' CAGTTGTTGC GCTGCAGTCA T 3'), 45 (5' GCCAAGCCGG
AACGCGTC 3') et 46 (5' GATGGTGGCA CGATGTTCAC 3').
20
Le plasmide pL03-Apta1-ackA est inséré dans une souche électrocompétente
Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene
Pulser, BioRad
(Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de
l'enzyme
DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est
isolé sur milieu
25
LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich,
agar 20 g/L)
contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la
souche CN0004
a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au
saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l'opéron pta1-
ackA. Après la
30
première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur
colonie à l'aide
de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après la
deuxième
recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones
sensibles à la
tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod Xtreme
TM Hot Start DNA
Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 Apta1-ackA AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est
récupérée et nommée CN0007. Les modifications génétiques sont validées par
séquençage.
CA 03083840 2020-05-27
WO 2019/106134
PCT/EP2018/083097
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Evaluation de la souche CN0007 en fructose La production de lactate sur
fructose de
la souche Cupriavidus necator H16 Apta1-ackA AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator
(CN0007) a
été évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de
culture, la
souche CN0007 produit 11% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h
de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0007 à partir de CO2 La production
de
lactate de la souche CN0007 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant,
l'évaluation en
fructose a montré que la souche CN0007 produisait 11% de lactate en plus que
la souche
CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel
que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0007 produirait 11% de lactate en
plus à partir de
CO2 que la souche CN0004.
Exemple 10: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement
modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB)
est
délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle
une
lactate ferricytochrome C reductase est délétée (CN0008)
Souche et constructions génétiques. La construction de la souche productrice
de
lactate CN0008 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du site
actif
de la L-Lactate cytochrome c reductase (1IdD, 1.1.2.3) de Cupriavidus necator
est cloné en une
étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly
Cloning (New
England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et
purifiés (dessalés) par
Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour IldD est
amplifiée par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
47 (5' CCTGCAGGTC GACTCTAGAG AGCAATTGCT CCGCCATCAG C 3') présentant en 5'
une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide
pJQ200mpTet et 48 (5' AGTCGATGGC CACTTGGCGG CGCAAGGTAC 3') présentant en 5'
une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone
d'homologie
aval du gène codant pour IldD et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase
(Novagen) avec
5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and
PCR clean-up
(Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour IldD est amplifiée
par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
49 (5' CCGCCAAGTG GCCATCGACT TGTTGCAGGC 3') présentant en 5' une zone de
recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie
amont du gène
codant pour IldD et 50 (5' ATTCGAGCTC GGTACCCGGG CAAAGGCTGC GTCCAGCCAG
3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec
l'extrémité 5' du
plasmide pJQ200mpTet et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen)
avec 5%
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de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR
clean-up
(Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt
and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par
le gène de
résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par
l'enzyme de
restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de
digestion est purifié
sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England
Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le
plasmide
pJQ200mpTet -AlIdD. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des
cellules
Escherichia cou NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France),
chimio-
compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar
(Tryptone 10 g/L,
extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15
pg/mL de
tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur
colonie à l'aide de
l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction
des
plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du
gène IldD est
confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 24 (5'
CTGGCACGAC
AGGTTTCCCG A 3'), 51 (5' TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACG 3') et 52 (5'
GAACAGCTGC ACGCCGAG 3').
Le plasmide pJQ200mpTet -AlIdD est inséré dans une souche électrocompétente
Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene
Pulser, BioRad
(Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme
DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est
isolé sur milieu
LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich,
agar 20 g/L)
contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche
CN0004
a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au
saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène
codant pour IldD.
Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR
sur colonie
à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm).
Après la
deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les
clones
sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme Kod XtremeTM
Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est
récupérée et nommée CN0008. Les modifications génétiques sont validées par
séquençage.
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Evaluation de la souche CN0008 en fructose La production de lactate sur
fructose de
la souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator (CN0008)
a été
évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de
culture, la souche
CN0008 produit 1,4 g/L de lactate après 140 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0008 à partir de CO2 La production
de
lactate de la souche CN0008 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant,
l'évaluation en
fructose a montré que la souche CN0008 produisait 7% de lactate en moins que
la souche
CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel
que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0008 produirait 7% de lactate en
moins à partir de
CO2 que la souche CN0004.
Exemple 11 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement
modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB)
est
délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle
deux
lactates ferricytochrome C reductases sont délétées (CN0009)
Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de
lactate CN0009 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène
codant pour L-Lactate cytochrome reductase (IldA) de Cupriavidus necator est
cloné en une
étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly
Cloning (New
England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et
purifiés (dessalés) par
Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour IldA est
amplifiée par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
53 (5' CCTGCAGGTC GACTCTAGAG GATCCGCAAG ACGGTTTATC TCTCGGTC 3')
.. présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec
l'extrémité 3' du
plasmide pJQ200mpTet et 54 (5' GACGCTATCA CATGGGAACT CCCTTGAAAA
AAACAAAAAG CTGC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 10 paires de
bases
avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour IldA et de
l'enzyme KOD
Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié
sur gel
avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour IldA est amplifiée
par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
55 (5' AGTTCCCATG TGATAGCGTC TATGAGGCGT C 3') présentant en 5' une zone de
recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie
amont du gène
codant pour IldA et 56 (5' ATTCGAGCTC GGTACCCGGG GATCGAGGAA ATCGGCTGCG
TAGG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 24 paires de bases avec
l'extrémité 5'
du plasmide pJQ200mpTet et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen)
avec
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5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and
PCR clean-up
(Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt
and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par
le gène de
résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par
l'enzyme de
restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de
digestion est purifié
sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England
Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le
plasmide
pJQ200mpTet -3,11dA. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des
cellules
Escherichia cou NEB 5-alpha compétentes (New England Biolabs, Evry, France),
chimio-
compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar
(Tryptone 10 g/L,
extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15
pg/mL de
tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur
colonie à l'aide de
l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction
des
plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du
gène IldA est
confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 21(5'
TGCAAGGCGA
TTAAGTTG 3'), 57 (5' CCTCATAGAC GCTATCACAT GG 3'), 58 (5'
CCATGTGATAGCGTCTATGAGG 3') et 24 (5' CTGGCACGACAGGTTTCCCGA 3').
Le plasmide pJQ200mpTet -3,11dA est inséré dans une souche électrocompétente
Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene
Pulser, BioRad
(Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme
DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est
isolé sur milieu
LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich,
agar 20 g/L)
contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche
CN0008
a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au
saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène
codant pour IldA.
Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR
sur colonie
à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm).
Après la
deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les
clones
sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme Kod XtremeTM
Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 AlldA AlldD AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator
est
récupérée et nommée CN0009. Les modifications génétiques sont validées par
séquençage.
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Evaluation de la souche CN0009 en fructose La production de lactate sur
fructose de
la souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator (CN0009)
a été
évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de
culture, la souche
CN0009 produit 1,4 g/L de lactate après 140 h de culture.
5 Extrapolation production de lactate de la CN0009 à partir de CO2 La
production de
lactate de la souche CN0009 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant,
l'évaluation en
fructose a montré que la souche CN0009 produisait 7% de lactate en moins que
la souche
CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel
que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0009 produirait 7% de lactate en
moins à partir de
10 CO2 que la souche CN0004.
Exemple 12: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement
modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB)
est
délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle
une
phosphoenolpyruvate synthase est délétée (CNO010)
15 Souche et constructions génétiques. La construction de la souche
productrice de
lactate CNO010 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène
codant pour la phosphoenolpyruvate synthase (ppsA) de Cupriavidus necator est
cloné en une
étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly
Cloning (New
20 England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et
purifiés (dessalés) par
Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour ppsA est
amplifiée par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
59 (5' AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCCGAA GATCTTCGGC TTGAACG 3')
25 .. présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec
l'extrémité 3' du
plasmide pL03 et 60 (5' ACGTCAAATG CTTCACATGT CCGGTATGTT CTTGGAGTTC 3')
présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec
l'extrémité 5' de la
zone d'homologie aval du gène codant pour ppsA et de l'enzyme KOD Hot Start
DNA
Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec
le kit
30 Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour ppsA est amplifiée
par
PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des
oligonucléotides
61 (5' AACATACCGG ACATGTGAAG CATTTGACGT CACAATAACG 3') présentant en 5'
une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone
d'homologie
35 amont du gène codant pour ppsA et 62 (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCTTGA
GCACGTGCT TGTAGG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de
bases
avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA
Polymerase
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(Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit
Nucleospin gel and
PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme
de
restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de
digestion est purifié sur
gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England
Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le
plasmide pL03-
AppsA. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules
Escherichia cou NEB
5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les
transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L,
extrait de levures 5
g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de
tétracycline. La sélection
des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme
DreamTaq Green
PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide
du kit
NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène ppsA est confirmée
par
séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 63 (5' ATGAACACCG
GCACCTTCTA CC 3'), 91 (5' CAGGATGGAG TGGCTGAACG 3') et 29 (5' GCAAACAAAC
CACCGCTGGT 3').
Le plasmide pL03-AppsA est inséré dans une souche électrocompétente
Escherichia
cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser,
BioRad (Datsenko
and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme
DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est
isolé sur milieu
LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich,
agar 20 g/L)
contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche
CN0004
a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au
saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène
codant pour ppsA.
Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR
sur colonie
à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm).
Après la
deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les
clones
sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de
l'enzyme Kod XtremeTM
Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 AppsA AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est
récupérée et nommée CNO010. Les modifications génétiques sont validées par
séquençage.
CA 03083840 2020-05-27
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