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WO 2018/104058 1 PCT/EP2017/080088
PROCEDE DE DETECTION DES MALADIES ARTICULAIRES
La présente invention concerne un procédé de diagnostic.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour
diagnostiquer, déterminer le type ou évaluer la sévérité d'une maladie
articulaire affectant
un mammifère, notamment l'arthrose.
Les maladies articulaires, ou arthropathies, touchent les articulations et
comprennent notamment l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la
spondylarthrite
ankylosante et les arthralgies.
Parmi ces maladies articulaires, l'arthrose aussi dénommée ostéo-arthrite est
la
plus répandue. La prévalence de l'arthrose est en constante augmentation dans
le monde,
car elle est liée au vieillissement et au surpoids de la population. Elle se
manifeste le plus
souvent par des douleurs mécaniques et/ou une gêne, lors des mouvements d'une
articulation.
De nombreuses articulations peuvent être touchées par l'arthrose. Les
principales sont les cervicales et les lombaires (entre 70 et 75 %), le genou
(40 %), le
pouce (30 %), la hanche et la cheville (10 %) et les épaules (2 %).
L'arthrose a longtemps été présentée comme une usure du cartilage alors
qu'il s'agit bien d'un syndrome destructeur et inflammatoire, associé à
différents facteurs
de risque. Les scientifiques ne parlent plus d'arthrose en général mais des
arthroses en
fonction du profil du patient : arthrose liée à l'âge, arthrose liée à une
obésité, arthrose liée
à une maladie de l'articulation, etc. L'objectif à l'heure actuelle est
d'individualiser la prise
en charge et les traitements en fonction de ces différents profils.
Les lésions du cartilage ne régressent pas au cours du temps et leur évolution
n'est pas linéaire. Elle peut être très rapide et rendre nécessaire la pose
d'une prothèse en
moins de 5 ans. L'arthrose peut également évoluer lentement, sur plusieurs
années, sans
induire de handicap majeur.
Le diagnostic de la maladie s'établit généralement par (i) l'observation par
le
patient lui-même d'une douleur ou d'une gêne dans une articulation, et (ii)
une
radiographie de l'articulation en question qui permet de constater de visu
l'état de
dégradation du cartilage. Toutefois, il n'y a pas de relation entre
l'importance des lésions
radiologiques et l'importance de la douleur arthrosique.
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Des critères de diagnostic clinique ont été développés par l'ACR
(American College of Rheumatology), basés sur la description des douleurs
et/ou gênes
(Litwic et al., 2013).
Les radiographies peuvent montrer des signes très caractéristiques de
l'arthrose
telles que :
= le pincement articulaire,
= l'ostéophyte, c'est-à-dire un surplus d'os autour de l'articulation,
= la condensation de l'os sous le cartilage.
= les géodes dans l'os qui correspondent à des trous .
La sévérité de la maladie est le plus généralement mesurée selon l'échelle de
Kellgren & Lawrence, qui ont établi une échelle de scores de sévérité
radiologique K/L
allant de 0 à 4, cette échelle ayant été maintenant adoptée par l'OMS.
Il n'existe à ce jour que des traitements symptomatiques pour soulager la
douleur. Aucune thérapeutique anti-arthrosique capable de protéger le
cartilage n'est
actuellement disponible.
La recherche sur les maladies articulaires se focalise actuellement sur deux
objectifs principaux, d'une part trouver des cibles thérapeutiques, et d'autre
part identifier
des biomarqueurs (i) permettant de diagnostiquer la maladie avant l'apparition
des
symptômes invalidants, (ii) permettant de déterminer le type de maladie afin
de
personnaliser le traitement, (iii) permettant de déterminer le stade de la
maladie, et (iv)
permettant de prédire l'évolution de la maladie.
La présente invention concerne la réalisation de ce deuxième objectif.
Actuellement, et comme indiqué précédemment, le diagnostic s'effectue sur la
base de l'examen clinique et des images radiologiques. Les chercheurs
s'emploient à
identifier des molécules dont la présence ou la concentration dans le sérum ou
l'urine
pourrait servir de biomarqueur, sans que toutefois à l'heure actuelle aucune
molécule
candidate ne permette de catégoriser les patients (Lotz et al., 2013). Il a
cependant été mis
en évidence un lien entre la présence de certains micro-ARN circulants dans le
sérum, et la
sévérité de l'arthrose du genou ou de la hanche (Beyer et al., 2015)
Lors d'une poussée avec un épanchement de liquide intra-articulaire aussi
appelé liquide synovial, l'analyse de ce liquide recueilli lors d'une ponction
de
l'articulation peut aider à confirmer et/ou affiner le diagnostic.
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Des procédé in vitro permettant d'évaluer la sévérité d'une maladie
articulaire
chez un mammifère, à partir d'échantillons de liquide synovial, sont
activement
recherchés.
L'article (Esmonde-White et al., 2009a) décrit notamment un procédé
permettant de discriminer différents stades de la maladie, comprenant la
mesure, sur une
goutte séchée de liquide synovial, des paramètres suivants : présence de
cristaux au centre
de la goutte, et présence de marques d'érosion radiales sur les bords de la
goutte.
De plus, en analysant la composition du liquide synovial pathologique par
spectroscopie Raman, l'équipe du Dr Esmonde-White a identifié un lien entre
ledit spectre
Raman du liquide synovial et la sévérité, selon le score K/L, de l'arthrose du
genou. En
particulier, des ratios d'intensité de bandes Raman ont été corrélés de
manière significative
avec la sévérité radiographique de la maladie (Esmonde-White et al., 2009b).
Dans la demande US 2007/0082409, l'analyse du spectre Raman du liquide
synovial a permis de déterminer la présence de certaines molécules, tel que
l'acide
hyaluronique (HA). Ce composé lubrifiant des articulations est un biomarqueur
des
maladies articulaires : en effet dans ces pathologies, il est soit dégradé,
soit présent en
concentration moindre suite à l'infiltration de fluides et protéines dans
l'articulation ; de
plus, l'acide hyaluronique présent est sous une forme moléculaire différente,
de plus faible
poids moléculaire, cette forme ne présentant pas les mêmes propriétés
viscoélastiques que
l'acide hyaluronique présent dans des articulations saines.
La détection de ce biomarqueur est indicative du stade de la maladie, mais
reste
toutefois difficile à mettre en oeuvre, un équipement permettant d'effectuer
une
spectroscopie Raman étant nécessaire.
En cas de maladies articulaires, d'autres modifications moléculaires du
liquide
synovial sont observées telles qu'une augmentation de la concentration en
protéines, et une
modification du taux de glycosaminoglycances (GAG) : augmentation de leur
concentration aux stades précoces, diminution aux stades avancés.
Les inventeurs ont mis en évidence un lien entre les caractéristiques
morphologiques d'une goutte de liquide synovial et la présence, le type ou le
stade d'une
maladie articulaire touchant le mammifère dont est issu le liquide synovial.
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Les inventeurs ont également mis en évidence une corrélation entre les
caractéristiques morphologiques d'une goutte de liquide synovial et la teneur
en acide
hyaluronique et en protéines dudit liquide synovial.
Le procédé tel que présenté ci-dessous permet de diagnostiquer une maladie
articulaire et/ou d'obtenir des informations sur son type ou son stade et/ou
de prédire son
évolution, de manière simple, rapide et à faible coût.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une
maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie
articulaire et/ou
déterminer le stade de ladite maladie et/ou prédire l'évolution de ladite
maladie,
comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère
sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de
.. référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du
bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et
(iii) le profil de
surface (Z) de la goutte.
Par ailleurs, selon un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé peut
comprendre de plus les étapes suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et
f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman
représentatif d'un liquide synovial de référence.
La présente invention concerne également un procédé in vitro de suivi d'un
mammifère présentant une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes
:
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a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère,
obtenu à un instant Il, sur un support plan constitué d'un matériau
inorganique, tel que du
verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur
obtenue en appliquant les étapes (a) à (c) du procédé à un échantillon de
liquide synovial
dudit mammifère obtenu à un instant Io antérieur à l'instant Ii,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte
et (iii) le profil
de surface (Z) de la goutte.
La présente invention concerne également un procédé in vitro pour déterminer
l'efficacité d'un traitement d'une maladie articulaire chez un mammifère
atteint de ladite
maladie et auquel est administré ledit traitement, comprenant les étapes
suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère,
obtenu après le début dudit traitement, sur un support plan constitué d'un
matériau
inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de
référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte
et (iii) le profil
de surface (Z) de la goutte.
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La présente invention concerne également un procédé de criblage in vivo chez
un mammifère non humain de composés candidats destinés à traiter au moins une
maladie
articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère
obtenu après le début de l'administration de l'un desdits composés candidats
audit
mammifère non humain, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique,
tel que
du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a);
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de
référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte
et (iii) le profil
de surface (Z) de la goutte.
La présente invention concerne également un procédé de caractérisation
moléculaire d'un liquide synovial de mammifère, comprenant les étapes
suivantes :
a. dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère
sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b. séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c. mesure de :
= la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (S)
pour cette surface est obtenue, et/ou
= la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte
séchée à l'étape b), par quoi une valeur (H) pour ladite hauteur est
obtenue, et
d. comparaison de ces valeurs (S) et/ou (H) avec les gammes de valeurs
suivantes :
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= la valeur (S) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la
concentration d'acide hyaluronique présente dans un liquide
synovial ; et
= la valeur (H) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la
concentration de protéines présente dans un liquide synovial.
FIGURES
Figure 1. Représentation schématique du protocole de dépôt de gouttes (DDRS).
Figure 2. Images obtenues par la technique DDRS :
(a) Images prises au microscope à lumière blanche d'une goutte sèche de
liquide synovial
(LS) montrant des structures typiques dans deux régions distinctes : une zone
périphérique
translucide présentant des cracks radiaux et une zone centrale avec des dépôts
cristallins de
forme dendritiques. Les acquisitions Raman ont été réalisées dans les zones
cardinales
périphériques et sont représentées par des rectangles.
.. (b) L'image supérieure mesurée avec un interféromètre montre que les quatre
ROI (Region
of Interest) sont positionnées dans des zones où les solutés sont concentrés.
Figure 3. Exemples d'images 2D et 3D pour un LS sain (partie supérieure de la
figure) et
un LS arthrosique (LS OA ¨ partie inférieure de la figure) : la goutte de LS
sain est de
taille inférieure à celle de LS OA; sur la goutte de LS sain, un cercle noir
est visible entre
la périphérie extérieure et le centre, et la hauteur maximale du bourrelet est
de l'ordre de
12 ium (la hauteur est représentée par les variations de couleur noir/blanc) ;
sur la goutte de
LS OA, on voit clairement un bourrelet en périphérie, dont la hauteur maximale
est de
l'ordre de 25 ium et est plus large que sur la goutte de LS sain.
Figure 4. A) Boîtes à moustache (i.e. box plot ) (représentant médianes,
quartiles et
valeurs minimales et maximales) des surfaces des gouttes (partie gauche de la
Figure 4A)
et des hauteurs de bourrelet entre gouttes (partie droite de la Figure 4A) de
LS sains et
arthrosiques : les étoiles témoignent des différences significatives* (p<0.05)
et **
(p<0.01).
B) Profils Z le long de la périphérie des gouttes sur LS sains et arthrosiques
: les lignes en
gras et les zones ombrées représentent respectivement la moyenne et les écart-
types. La
courbe supérieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets OA.
La courbe
inférieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets sains.
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Figure 5. (A) Spectres Raman moyen normalisés de LS sains chez le chien (n=6)
;
macroscopiquement tous les échantillons présentaient un aspect normal
(viscosité,
turbidité, transparence, couleur). En ordonnées : valeur d'intensité du
signal, exprimée en
Unités Arbitraires (a.u.). En abscisse : nombres d'onde, exprimées en cm-1.
(B) Spectre Raman normalisé de LS arthrosique chez le chien (n=6) ; les
échantillons
étaient plus ou moins inflammatoires avec une couleur allant de jaune paille à
orange. Le
spectre en gras représente l'empreinte spectrale Raman de LS sain, la zone
grisée
correspond à l'écart-type. En ordonnées : valeur d'intensité du signal,
exprimée en Unités
Arbitraires (a.u.). En abscisse : nombres d'onde, exprimées en cm-1.
(C) Zones spectrales d'intérêt.
Partie supérieure de la Figure 5C : spectres obtenus à partir de gouttes de
sujets sains ; De
gauche à droite : (i) spectres dans la gamme spectrale 910 à 990 cm-1 ; (ii)
spectres dans la
gamme spectrale 1020 à 1145 cm-1 ; (iii) spectre dans la gamme spectrale 1220
à
1280 cm-1 ;
Partie inférieure de la Figure 5C : spectres obtenus à partir de gouttes de
sujets OA; De
gauche à droite : (i) spectres dans la gamme spectrale 910 à 990 cm-1 ; (ii)
spectres dans la
gamme spectrale 1020 à 1145 cm-1 ; (iii) spectres dans la gamme spectrale 1220
à
1280 cm-1;
Les lignes verticales de la Figure 5C correspondent aux longueurs d'ondes
spécifiées sur la
ligne des abscisses de la partie inférieure de la figure, respectivement de
gauche à droite :
945 cm-1, 960 cm-1, 970 cm-1, 1031 cm-1, 1046 cm-1, 1062 cm-1, 1081 cm-1, 1102
cm-1,
1127 cm-1, 1242 cm-1 et 1275 cm-1.
Figure 6. Résultats d'une Analyse des Composantes Principales (ACP ou PCA en
anglais)
basée sur 210 ratios de spectre Raman.
Chaque point (étoile pour les échantillons sains, cercle pour les échantillons
malades OA)
représente les 210 ratios du spectre Raman d'un échantillon. Les groupes de
points sains et
OA sont clairement situés dans des zones distinctes.
Figure 7. Cette figure montre une bonne corrélation entre trois ratios de pics
de spectre
Raman avec la quantité d'interleukine 6 (IL6) dans des échantillons de LS
humain.
(A) En ordonnées : le ratio de signal du pic à 1062 cm-1 par rapport au pic à
945 cm-1. En
abscisse : la quantité d'IL6, exprimée en Logio de la concentration.
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(B) En ordonnées : le ratio de signal du pic à 1081 cm-1 par rapport au pic à
1062 cm-1. En
abscisse : la quantité d'IL6, exprimée en Logio de la concentration.
(C) En ordonnées : le ratio de signal du pic à 1102 cm-1 par rapport au pic à
1062 cm-1. En
abscisse : la quantité d'IL6, exprimée en Logio de la concentration.
Figure 8. Les trois ratios des pics Raman 1448/1102 cm-1 (A) ; 1654/1102 cm-1
(B) ; et
1448/1317 cm-1 (C) ; sont corrélés avec la valeur (H) de hauteur des
bourrelets, aussi bien
dans les échantillons de LS issus d'humain que de chien. Le ratio 1031/1102 cm-
1
(D) également lié aux protéines est fortement corrélé (R2>85%) avec la valeur
(H) de
hauteur de bourrelet chez le chien.
Figure 9. Les quatre ratios des pics Raman en relation avec l'acide
hyaluronique :
1317/896 cm-1 (A) ; 1339/896 cm-1 (B) ; 1062/1046 cm-1 (C) et 1317/945 cm-1
(D), sont
corrélés avec la valeur (S) de surface de la goutte de liquide synovial, dans
des échantillons
de LS issus de chiens.
Figure 10. (A) Boîtes à moustache (ie. box plot ) (représentant médianes,
quartiles et
valeurs minimales et maximales) des surfaces des gouttes entre gouttes de LS
SI (stade
inflammatoire) et SNI (stade non inflammatoire) : les étoiles témoignent des
différences
significatives* (p<0.05) et ** (p<0.01).
(b) Boîtes à moustache (ie. box plot ) (représentant médianes, quartiles et
valeurs
minimales et maximales) des hauteurs de bourrelet entre gouttes de LS SI
(stade
inflammatoire) et SNI (stade non inflammatoire) : les étoiles témoignent des
différences
significatives* (p<0.05) et ** (p<0.01).
(C) Profils Z le long de la périphérie des gouttes sur LS SI et SNI : les
lignes en gras et les
zones ombrées représentent respectivement la moyenne et les écart-types. La
courbe
supérieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets au SI. La
courbe inférieure
illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets au SNI.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis en évidence de nouveaux biomarqueurs permettant de
diagnostiquer ou de déterminer le type ou la sévérité d'une maladie
articulaire, ces
biomarqueurs étant des paramètres indicatifs des caractéristiques
morphologiques d'une
goutte séchée de liquide synovial issu d'un mammifère.
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Par maladie articulaire, au sens de l'invention, on entend une maladie
touchant
les articulations et notamment le cartilage présent au niveau de ces
articulations. Cette
maladie articulaire peut être de type inflammatoire ou non, dégénérative ou
non, et est
notamment choisie parmi l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la
spondylarthrite ankylosante et les arthralgies.
Par mammifère, au sens de l'invention, on entend notamment les animaux
mammifères domestiques tels que les chats, les chiens, les hamsters, les
lapins, les cochons
d'inde et les furets ; sont également visés par la présente invention les
animaux d'élevage
tels que les ovins, bovins, caprins, équidés, camélidés et cervidés.
Plus particulièrement, la présente invention concerne les maladies
articulaires
affectant l'être humain. Dans la présente demande, le terme patient
désigne un être
humain, enfant ou adulte, affecté par une maladie articulaire.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro
pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère, comprenant les
étapes
.. suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère
sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de
référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte
et (iii) le profil
de surface (Z) de la goutte.
Par diagnostiquer on entend, au sens de l'invention, établir la présence
d'une maladie articulaire chez un patient, y compris à un stade très précoce
de la maladie
où les symptômes cliniques sont difficiles à déceler ou à interpréter.
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Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro
pour déterminer le type de maladie articulaire affectant un mammifère,
comprenant les
étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère
sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de
référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte
et (iii) le profil
de surface (Z) de la goutte.
Par déterminer le type de maladie articulaire on entend, au sens de
l'invention, déterminer la ou les origines de la maladie articulaire, et en
particulier
déterminer s'il s'agit d'une maladie inflammatoire ou pas, ou s'il s'agit
d'une maladie liée
au profil du patient (âge, surpoids) ou à la présence d'un pathogène
(bactéries, virus), ou
encore s'il s'agit d'une maladie dégénérative.
En particulier, il sera possible de déterminer quelle est la maladie touchant
le
patient, parmi les maladies articulaires suivantes : l'arthrose, l'arthrite,
la polyarthrite
rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et les arthralgies.
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro
pour évaluer le stade d'une maladie articulaire affectant un mammifère,
comprenant les
étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère
sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
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d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de
référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte
et (iii) le profil
de surface (Z) de la goutte.
Par évaluer le stade d'une maladie articulaire , également désigné dans la
présente demande par l'expression évaluer la sévérité d'une maladie
articulaire , on
entend au sens de la présente invention déterminer le stade de la maladie
selon les scores
cliniques et biologiques préalablement établis, comme par exemple le score de
sévérité
radio logique K/L.
Ce procédé permet notamment de distinguer le stade inflammatoire et le stade
non inflammatoire d'une maladie articulaire.
Selon une mise en oeuvre de l'invention, le procédé pour déterminer le stade
d'une maladie articulaire affectant un mammifère permet également de donner un
pronostic sur l'évolution de la maladie.
Selon un quatrième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro
pour prédire l'évolution d'une maladie articulaire, comprenant les étapes
suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère
sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de
référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte
et (iii) le profil
de surface (Z) de la goutte.
Selon un cinquième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro
pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et sévérité de la
maladie
articulaire, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus.
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Selon un sixième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro
pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et déterminer le
type de
ladite maladie articulaire, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus.
Selon un septième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro
pour évaluer la sévérité et déterminer le type d'une maladie articulaire
affectant un
mammifère, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus.
Selon un huitième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro
pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère, pour évaluer la
sévérité et
déterminer le type de ladite maladie, comprenant les étapes a) à d) listées ci-
dessus.
Les procédés selon l'invention comprennent tous quatre étapes successives a) à
d) dont la mise en oeuvre est détaillée ci-dessous.
Etape a)
La première étape consiste en un dépôt d'une goutte d'un échantillon de
liquide
.. synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau
inorganique, tel que
du verre.
Echantillon de liquide synovial
Le liquide synovial (LS), ou synovie, est un liquide biologique produit par la
membrane synoviale. Ce liquide est visqueux, transparent ou jaune pâle. Il est
composé
d'un dialysât du sérum comprenant des électrolytes, du glucose, des protéines,
des
glucoprotéines et de l'acide hyaluronique, et de liquide interstitiel filtré
du plasma sanguin.
La présence de ce liquide dans les articulations a pour fonction de réduire la
friction par son pouvoir lubrifiant, d'absorber les chocs, de fournir de
l'oxygène et des
nutriments aux chondrocytes du cartilage articulaire, et d'éliminer le dioxyde
de carbone et
les déchets métaboliques de ces cellules.
Les échantillons de liquide synovial testés selon le procédé de l'invention
sont
issus d'articulations de mammifères atteints ou susceptibles d'être atteints
par une maladie
articulaire. Les prélèvements sont effectués stérilement par intervention
chirurgicale. Les
échantillons sont ensuite congelés pour leur conservation.
Avant le dépôt de la goutte, ces échantillons sont centrifugés pour éliminer
les
cellules présentes dans le liquide synovial.
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Ces échantillons de LS peuvent être dilués avec des tampons classiques, ou non
dilués. Ils peuvent également être traités avec des protéases et des RNAses
afin de
conserver au mieux les constituants biologiques.
Selon un aspect préféré de l'invention, la goutte déposée provient d'un
échantillon de LS non dilué. Selon un autre aspect, l'échantillon de LS est
non traité par
des protéases et/ou RNAses.
Technique de Drop Deposition
La technique de DD (Drop Deposition) est bien adaptée pour l'examen des
biofluides de faible abondance, comme les larmes, le liquide synovial ou le
liquide
céphalo-rachidien, car il n'y a souvent pas assez de liquide pour effectuer
des analyses en
chromatographie ou en électrophorèse classique. Les biofluides peuvent être
préparés en
utilisant une seule goutte de liquide, et la même goutte séchée peut être
examinée à l'aide
de multiples techniques telles que la microscopie optique, l'interférométrie à
lumière
blanche, la microscopie à force atomique (AFM), le laser assisté par matrice
désorption /
ionisation (MALDI), la spectrométrie de masse, l'impédance acoustique-
mécanique ou la
spectroscopie optique, notamment la spectroscopie Raman.
Les multiples données obtenues à partir de quelques microlitres de biofluide
sont représentatives des propriétés physiques et chimiques du fluide
biologique analysé.
Nature du matériau constituant la surface plane
Dans le procédé selon l'invention, le dépôt d'une goutte d'un échantillon de
liquide synovial est effectué sur un support plan constitué d'un matériau
inorganique, en
particulier de nature hydrofuge.
Le terme matériau de nature hydrofuge désigne un matériau imperméable,
qui repousse l'eau, celle-ci ne pouvant s'immiscer dans les pores du matériau
grâce à la
nature même ou au revêtement du matériau.
Selon une mise en mise en oeuvre particulière de l'invention, le support plan
est
préalablement traité pour éliminer toute trace de graisse à sa surface.
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le support plan présente
un angle de contact avec l'eau compris entre 500 et 90 .
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Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le support plan est
transparent. Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, le support plan
est constitué
de verre.
Au sens de l'invention, le terme verre désigne des solides amorphes
obtenus par chauffage d'un mélange, en proportions appropriées, de silice et
d'oxydes
métalliques. Ce sont donc des silicates mixtes, solides, non cristallins,
transparents et
fragiles, formés par la juxtaposition désordonnée de tétraèdres de silice 5iO4
et par la
présence d'oxydes alcalins, alcalinoterreux, de plomb, d'aluminium, etc. Le
verre est dur,
cassant et transparent à la lumière visible. Le verre considéré dans la
présente invention est
un verre minéral, et non un verre organique.
Il peut s'agir notamment de verre sodo-calcique, ou de verre borosilicaté, de
qualité adaptée à la microscopie.
Le support plan est en particulier une lame porte-objet pour microscope, en
verre de qualité optique, de faible épaisseur (environ 1 mm) et sans
revêtement. Ce support
.. est particulièrement avantageux du fait de son coût très faible et de sa
grande disponibilité.
L'article de Esmonde-White et al., 2014, présente une étude sur la technique
DD, basée sur deux biofluides : le plasma et le liquide synovial, où plusieurs
matériaux
légèrement hydrophiles ont été testés comme support pour le dépôt des gouttes.
Il s'agit en
particulier de verre recouvert d'or ou de fluorure de calcium (CaF2). Ces
matériaux sont
utilisés car ils permettent d'optimiser la lecture du spectre Raman, le bruit
de fond étant
bien plus faible que celui généré par le verre sans revêtement. Toutefois, sur
un support
plan constitué de ces matériaux, les auteurs de l'article n'ont pas observé de
différences au
niveau des caractéristiques morphologiques des gouttes de LS issus de patient
atteints
d'arthrose, à différents stades de la maladie.
Etape b) : séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
Le séchage sera effectué de la manière la plus adéquate, comme cela est
facilement déterminable par l'homme du métier.
Selon une mise en oeuvre de l'invention, le séchage de la goutte de liquide
synovial est effectué à température ambiante, pendant au moins 8 heures, voire
au moins
12 heures, voire au moins 24 heures.
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Selon une autre mise en oeuvre de l'invention, le séchage de la goutte sera
effectué pendant 30 minutes ou une heure, à 37 C.
Selon d'autres mises en oeuvre de l'invention, le temps de séchage pourra être
raccourci jusqu'à moins de 30 minutes. En effet, le procédé de diagnostic
selon l'invention
sera de préférence mis en oeuvre de manière rapide, pour obtenir un diagnostic
dans les
plus courts délais.
Une fois la goutte séchée, des images en 2 et 3 dimensions pourront être
obtenues afin de réaliser les mesures détaillées ci-dessous. De telles images
de gouttes
séchées sont présentées en figure 3.
Etape c).
La troisième étape du procédé est une étape de mesure d'au moins un
paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à
l'étape b),
par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue.
Par paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte on
entend tous les paramètres relatifs à la taille et à la forme de la goutte, et
relatifs à la taille
et à la forme du bourrelet qui se crée en périphérie de la goutte (voir figure
3, OA). Les
paramètres représentatifs des caractéristiques morphologiques de la goutte
sont notamment
la surface de la goutte, le profil de surface (Z) de la goutte, la hauteur (H)
du bourrelet et la
largeur du bourrelet.
Selon l'invention, le paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques
de la goutte séchée est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet
formé à la
surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de
surface (Z) de la goutte.
Il est entendu que, dans le procédé selon l'invention, l'Homme du métier
pourra choisir de mesurer un seul paramètre choisi parmi (i) la hauteur
maximale (H) du
bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et
(iii) le profil de
surface (Z) de la goutte, ou de mesurer les valeurs de deux paramètres ou
encore de
mesurer les valeurs des trois paramètres cités ci-dessus. Tous ces paramètres
sont
mesurables à partir d'images 2D et/ou images 3D de la goutte séchée sur un
support plan,
notamment une lame de verre.
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, l'étape c) de mesure est
réalisée par une méthode d'interférométrie à lumière blanche, permettant
d'obtenir les
images 3D des gouttes séchées.
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L'interférométrie est une méthode de mesure qui exploite les interférences
intervenant entre plusieurs ondes cohérentes entre elles.
Les interféromètres à lumière blanche utilisent des configurations optiques
spéciales et des sources lumineuses de courte longueur de cohérence, qui
optimisent
l'interaction entre la lumière réfléchie par l'objet mesuré et le faisceau de
référence.
La mesure elle-même est basée sur le principe de l'interféromètre de
Michelson. La lumière est collimatée à partir de la source lumineuse et
ensuite divisée en
deux faisceaux : un faisceau objet et un faisceau de référence. Le faisceau
objet est réfléchi
par l'objet mesuré, et le faisceau de référence se reflète sur un miroir de
référence. La
lumière réfléchie à partir de chaque faisceau est captée et recombinée au
niveau du diviseur
de faisceau. Les faisceaux superposés sont ensuite mis en image par une
caméra.
Etape d) : comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une
valeur de reference représentative d'un liquide synovial de reference.
Chaque valeur de paramètre mesurée à l'étape c) doit être mise en perspective
avec une valeur de référence correspondante, afin de pouvoir tirer une
conclusion
diagnostique sur la présence d'une maladie articulaire chez un mammifère et/ou
sur le type
de maladie articulaire présent et/ou pour évaluer la sévérité de ladite
maladie articulaire.
Valeur de reference
Au sens de l'invention, on entend par valeur de référence , une valeur d'un
paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques d'une ou plusieurs
gouttes de LS,
représentatives d'un ou plusieurs liquides synoviaux de référence.
Par liquide synovial de référence on entend, au sens de l'invention, un
échantillon de LS issu d'un mammifère dont le statut vis-à-vis d'une maladie
articulaire
donnée est connu.
Il pourra s'agir notamment d'échantillons de LS issus de mammifères ne
présentant pas de maladies articulaires, ou au contraire présentant une
maladie articulaire
spécifique et dont le stade est connu.
Selon une mise en oeuvre de l'invention, la valeur de référence est choisie
parmi une valeur représentative d'un liquide synovial d'un mammifère non
atteint par une
maladie articulaire, et une valeur représentative d'un liquide synovial d'un
mammifère
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WO 2018/104058 18 PCT/EP2017/080088
atteint par une maladie articulaire à un stade donné, notamment à un stade non
inflammatoire.
Il est en effet difficile de se procurer des échantillons de liquide synovial
issus
d'individus sains. Ainsi, les échantillons de référence sont généralement des
échantillons
issus de mammifères dont le stade de la maladie est connu et caractérisé, par
exemple dont
le stade de la maladie est caractérisé comme étant non inflammatoire .
Il est entendu qu'un liquide synovial de référence sera issu d'un mammifère de
la même espèce que le mammifère dont le statut vis-à-vis d'une maladie
articulaire donnée
est testé. En particulier, pour diagnostiquer chez un être humain une maladie
articulaire, le
LS de référence sera issu d'un être humain.
Il est également entendu qu'un liquide synovial de référence sera issu d'un
mammifère dont le statut ou le type ou le stade de sévérité vis-à-vis d'une
maladie
articulaire spécifique est connu, pour diagnostiquer ou déterminer le type ou
évaluer la
sévérité de ladite maladie articulaire. En particulier, pour diagnostiquer ou
évaluer la
sévérité de l'arthrose, le LS de référence sera issu d'un mammifère dont le
statut vis-à-vis
de l'arthrose est connu.
Il pourra être fait usage, dans certains cas, de plusieurs valeurs de
référence.
Par exemple, pour évaluer la sévérité d'une arthrose chez un mammifère, la
valeur d'un
paramètre indicatif pourra être comparée à une première valeur de référence
représentative
d'un LS issu d'un mammifère atteint d'arthrose sévère, et à une seconde valeur
de
référence représentative d'un LS issu d'un mammifère atteint d'arthrose
modérée.
Il est également entendu que pour chaque paramètre indicatif des
caractéristiques morphologiques de la goutte séchée, il sera affecté une
valeur de référence
dudit paramètre mesuré à partir d'un ou de plusieurs liquides synoviaux de
référence.
Selon une mise en oeuvre préférée du procédé, ladite valeur de référence est
une valeur moyenne mesurée à partir de plusieurs échantillons de LS issus
d'une pluralité
de mammifères dont le statut vis-à-vis d'une maladie articulaire donnée est
connu, en
particulier issus de mammifères ne présentant pas de maladie articulaire, et
en particulier
de chiens ou d'êtres humains sains, c'est-à-dire non affectés par une maladie
articulaire.
Dans encore un autre mode de réalisation, la valeur de référence est une
valeur
dite seuil ou de cut-off , qui est déterminée à partir de valeurs
déterminées à partir
(i) d'échantillons de LS issus de mammifères atteints d'une maladie
articulaire, et (ii) de
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WO 2018/104058 19 PCT/EP2017/080088
valeurs déterminées à partir d'échantillons de LS issus de mammifères sains,
c'est-à-dire
qui ne sont pas atteints par cette même maladie articulaire (LS témoins).
Une valeur moyenne de référence peut être définie, cette valeur seuil
séparant sans ambiguïté les valeurs obtenues à partir d'échantillons de LS
témoins ne
présentant pas de maladie articulaire, et ceux de mammifères présentant une
maladie
articulaire.
Dans ce mode de réalisation, un mammifère testé selon le procédé de
l'invention sera considéré comme étant atteint d'une maladie articulaire
lorsque la valeur
du paramètre mesurée à partir de la goutte séchée de LS dudit mammifère est
significativement différente de la valeur seuil de référence.
Différences significatives avec les valeurs de reference
Les exemples 1 et 2 présentés dans la présente demande ont été réalisés à
partir
d'échantillons de liquide synovial issus de chiens sains et de chiens
présentant des signes
de lésion du cartilage et divers degrés d'inflammation. L'exemple 3 est
relatif à des
échantillons de liquide synovial issus d'individus atteints d'arthrose.
L'exemple 4 est
relatif à des échantillons de liquide synovial issus de lapins développant une
arthrose
induite chirurgicalement par transection chirurgicale du ligament croisé
antérieur.
Comme cela est connu par l'Homme du métier, les résultats mis en évidence
sur ces échantillons s'appliquent également à des échantillons de LS issus
d'autres espèces
de mammifères, et sont donc applicables à d'autres espèces de mammifères.
Les caractéristiques morphologiques des gouttes de LS séchées ont été
observées sur des images en deux dimensions (2D), ainsi que sur des images en
3D prises
par interférométrie à lumière blanche. Les résultats suivants ont été observés
:
- la surface des gouttes est significativement plus grande dans le groupe des
chiens malades (OA) que dans le groupe des chiens sains (figure 4A) ;
- la hauteur du bourrelet formé en périphérie de la goutte est
significativement
plus grande dans le groupe des chiens malades (H moyenne = 30.09 ium) que dans
le
groupe des chiens sains (H moyenne = 11.81 ium) (figure 4A) ;
- la valeur du profil Z (Z/X) de surface de la goutte est bien supérieure,
dans le
groupe des chiens malades, à la valeur de référence de ce profil de surface
mesuré dans le
groupe des chiens sains (figure 4B).
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WO 2018/104058 20 PCT/EP2017/080088
- dans le modèle lapin , la surface des gouttes est significativement
plus
grande dans le groupe des lapins présentant une OA à un stade inflammatoire
(SI) que dans
le groupe des lapins présentant une OA à un stade non inflammatoire (SNI)
(figure 10A) ;
- de même, la hauteur des bourrelets est significativement plus grande
lorsque
le liquide synovial provient d'articulations à un stade inflammatoire (figure
10B) ;
- la valeur du profil Z (Z/X) de surface de la goutte est bien supérieure
pour le
liquide synovial provenant d'articulations à un stade inflammatoire (figure
10C).
Ainsi, les déductions suivantes peuvent donc être formulées :
= une valeur de surface de goutte supérieure à une valeur de référence de
surface de goutte, représentative d'un ou plusieurs liquides synoviaux de
référence issus de mammifères non atteints d'une maladie articulaire, est
indicative de la présence d'une maladie articulaire ;
= une valeur de hauteur de bourrelet (H) supérieure à une valeur de
référence
de hauteur de bourrelet (HR), représentative d'un ou plusieurs liquides
synoviaux de référence issus de mammifères non atteints d'une maladie
articulaire, est indicative de la présence d'une maladie articulaire ;
= une valeur de profil (Z) de surface de goutte supérieure à une valeur de
référence de profil (ZR) de surface de goutte, représentative d'un ou
plusieurs liquides synoviaux de référence issus de mammifères non atteints
d'une maladie articulaire, est indicative de la présence d'une maladie
articulaire ;
= la valeur de surface de goutte, de hauteur de bourrelet et de profil de
surface sont indicatives d'un stade inflammatoire de la maladie articulaire.
Etapes supplémentaires
La spectroscopie Raman, ou spectrométrie Raman, est une méthode non
destructive d'observation et de caractérisation de la composition moléculaire
et de la
structure externe d'un matériau, qui exploite le phénomène physique selon
lequel un milieu
modifie légèrement la fréquence de la lumière y circulant. Ce décalage en
fréquence dit
effet Raman correspond à un échange d'énergie entre le rayon lumineux et le
milieu, et
donne des informations sur la composition du milieu lui-même.
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WO 2018/104058 21 PCT/EP2017/080088
La spectroscopie Raman est mise en oeuvre en envoyant une lumière
monochromatique sur un échantillon et en analysant la lumière diffusée. Les
informations
obtenues par la mesure et l'analyse de ce décalage permettent de définir
certaines
propriétés du milieu.
Ainsi, la spectroscopie Raman de la goutte séchée de LS fournit des
informations sur la composition chimique et notamment sur la présence des
protéines
contenues dans ladite goutte.
Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, le procédé in vitro pour
diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le
type de
maladie articulaire et/ou évaluer la sévérité de ladite maladie et/ou prédire
l'évolution de
ladite maladie, comprend de plus les étapes suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et
f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de
référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
Comme indiqué dans les exemples, tous les spectres Raman des LS issus de
chiens sains ne présentent que d'infimes différences, comme l'atteste le
faible écart type.
Ainsi, un spectre Raman de référence peut notamment être une moyenne de
plusieurs
spectres Raman représentatifs de plusieurs échantillons de liquide synovial,
issus de chiens
sains.
Comme cela est présenté dans l'exemple 2, il a été constaté que la forme des
bandes structurelles des protéines, ainsi que leurs intensités, varient
significativement entre
les spectres Raman d'échantillons LS de chiens sains, et ceux de chiens
présentant une
maladie articulaire.
En particulier, dans les spectres Raman d'échantillons de LS issus de chiens
atteints d'une maladie articulaire :
- de nouvelles bandes apparaissent aux emplacements 970, 1248, 1575 cm-1 et
à 1542 cm-1, attribuées respectivement à la fibrine et l'hémoglobine,
résultant de
l'inflammation de l'articulation (Virkler and Lednev, 2010) (Figure 5B).
- La région 910-990 cm-1 s'est révélée être drastiquement différente entre
spectres sains et malades : alors que seule la bande de l'acide hyaluronique à
945 cm-1 est
prédominante sur les spectres sains, des bandes à 960 cm-1 et 970 cm-1
apparaissent sur les
spectres des sujets arthrosiques.
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WO 2018/104058 22 PCT/EP2017/080088
- La région 1020-1145 cm-1 est riche en information car contient les bandes
correspondant à la phénylalanine (1031 cm-1), à l'acide hyaluronique (1046,
1102 et
1127 cm-1), à la chondroïtine 6-sulfate (C6S) (1062 cm-1) et au squelette des
protéines
(1081 cm-1).
- Finalement, la région 1220-1280 cm-1 des Amide III est la troisième à être
notablement différente. (Figure 5C).
En conclusion, il s'avère que toutes les bandes liées au HA, au C6S et au
squelette des protéines diminuent dans les échantillons de LS de chiens
malades, tandis que
l'on constate une augmentation des bandes de CH2/CH3 et des acides aminés,
ainsi que du
phosphate minéral osseux.
D'une manière générale, le spectre Raman des échantillons de LS de chiens
malades est significativement différent de celui des échantillons de référence
(figure 6).
Par ailleurs, et comme présenté dans l'exemple 3, la valeur de hauteur (H) des
bourrelets des gouttes peut être corrélée à la présence de certaines bandes
Raman des
gouttes de LS, telles que les bandes 1448/1102; 1654/1102; et 1448/1317 cm-1'
à la fois
sur les échantillons de LS de chiens et d'êtres humains (voir tableau 4 et
figure 8).
Applications du procédé selon l'invention
Le procédé selon l'invention pour diagnostiquer et/ou déterminer le type et/ou
évaluer la sévérité d'une maladie articulaire est notamment adapté pour les
maladies
articulaires suivantes : l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde,
la spondylarthrite
ankylosante et les arthralgies.
Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, ce procédé est adapté pour
diagnostiquer et/ou déterminer le type et/ou évaluer la sévérité de
l'arthrose.
La sévérité de la maladie articulaire pourra notamment être déterminée en
fonction de 'scores' cliniques ou biologiques préalablement définis, notamment
liés à des
symptômes cliniques importants et/ou à un capital cartilagineux faible et/ou à
une synovite
et/ou à un remodelage osseux.
Selon une mise en oeuvre de l'invention, la sévérité / le stade de la maladie
articulaire correspond à des symptômes cliniques importants et/ou à un capital
cartilagineux faible et/ou à une synovite et/ou à un remodelage osseux.
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WO 2018/104058 23 PCT/EP2017/080088
La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro de suivi
d'un
mammifère présentant une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes
:
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère,
obtenu à un instant Il, sur un support plan constitué d'un matériau
inorganique, tel que du
verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur
obtenue en appliquant les étapes (a) à (c) du procédé à un échantillon de
liquide synovial
dudit mammifère obtenu à un instant Io antérieur à l'instant
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte
et (iii) le profil
de surface (Z) de la goutte..
Selon une mise en oeuvre de ce procédé, aucune valeur de référence n'est
utilisée puisque les deux valeurs comparées sont celles obtenues à partir
d'échantillons de
LS issus d'un même mammifère, mais à deux instants différents.
Selon une mise en oeuvre particulière du procédé selon l'invention, une valeur
de référence représentative d'un liquide synovial de référence est utilisée en
comparaison
des valeurs obtenues à partir des échantillons de LS obtenus aux instants Io
et Il.
Naturellement, dans ce procédé, il est également possible de comparer un
grand nombre de valeurs d'un seul paramètre, obtenues à partir d'échantillons
de LS
obtenus à des instants Io, Il, 12, 13 etc., et ainsi de suivre l'évolution de
la maladie
articulaire.
Selon une mise en oeuvre de ce procédé, l'instant Io correspond à un instant
où
le mammifère présentant une maladie articulaire n'est pas encore traité pour
ladite maladie,
et correspond en particulier à un état avant traitement .
Selon une autre mise en oeuvre de ce procédé, l'instant Io correspond à un
instant où le mammifère présentant une maladie articulaire débute un
traitement contre
ladite maladie.
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Selon une mise en oeuvre de ce procédé, l'instant Ii correspond à un instant
où
le mammifère présentant une maladie articulaire suit un traitement contre
ladite maladie,
depuis au moins un jour, deux jours, trois jours, une semaine, deux semaines,
trois
semaines, un mois, deux mois, ou au moins trois mois.
Selon une autre mise en oeuvre de ce procédé, l'instant Ii correspond à un
instant où le mammifère présentant une maladie articulaire a fini son
traitement contre
ladite maladie, et correspond en particulier à un état après traitement .
Ce procédé permet de suivre l'évolution d'une maladie, et ainsi de classifier
la
pathologie en plusieurs catégories telles que : maladie à évolution lente ou
rapide, maladie
dégénérative, etc.
Ce procédé permet également d'évaluer l'efficacité d'un traitement donné.
Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la
valeur de (i) la
hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface
de la goutte
et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à
l'étape a) est
inférieure à la valeur de référence Vo correspondante déterminée avant le
début du
traitement à Io.
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, ce procédé pourra être
complété par la mise en oeuvre des étapes supplémentaires suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et
f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de
référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro pour
déterminer l'efficacité d'un traitement d'une maladie articulaire chez un
mammifère atteint
de ladite maladie, et auquel est administré ledit traitement, comprenant les
étapes
suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère,
obtenu après le début dudit traitement, sur un support plan constitué d'un
matériau
inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
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c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de
.. référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte
et (iii) le profil
de surface (Z) de la goutte.
Un tel procédé permettant de suivre l'évolution et/ou l'efficacité d'un
traitement, correspond à ce que l'on peut appeler un 'test compagnon' qui
permet d'adapter
ou de changer un traitement, en fonction de la réponse spécifique d'un
individu donné à ce
traitement.
Dans ce procédé, la valeur de référence pourra en particulier être
représentative
du liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Io avant le début du
traitement.
Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la
valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou
(ii) de la surface
de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que
déterminée(s) à
l'étape a) est inférieure à la valeur de référence Vo correspondante
déterminée avant le
début du traitement à Io.
La valeur de référence pourra également être représentative d'un liquide
synovial de référence, obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de
maladie
articulaire.
Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la
valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou
(ii) de la surface
de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que
déterminée(s) à
l'étape a) est sensiblement égale à la valeur de référence.
Il pourra également être utilisé deux valeurs de référence :
- une valeur de référence représentative du liquide synovial dudit mammifère,
obtenu à un instant Io avant le début du traitement ; et
- une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de maladie articulaire.
CA 03084561 2020-05-29
WO 2018/104058 26 PCT/EP2017/080088
Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la
valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou
(ii) de la surface
de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que
déterminée(s) à
l'étape a), se rapproche de la valeur de référence représentative d'un liquide
synovial de
référence tout en s'éloignant de la valeur Vo déterminée avant le début du
traitement à lo.
Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, ce procédé pourra être
complété par la mise en oeuvre des étapes supplémentaires suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et
f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman
de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
La présente invention se rapporte également à un procédé de criblage chez un
mammifère non humain de composés candidats destinés à traiter au moins une
maladie
articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère
obtenu après le début de l'administration de l'un desdits composés candidats
audit
mammifère non humain, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique,
tel que
du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a);
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques
morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour
ledit paramètre
est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de
référence représentative d'un liquide synovial de référence
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte
et (iii) le profil
de surface (Z) de la goutte.
Dans ce procédé de criblage, la valeur de référence pourra en particulier être
représentative du liquide synovial dudit mammifère non humain, obtenu à un
instant Io
avant le début de l'administration d'un composé candidat.
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WO 2018/104058 27 PCT/EP2017/080088
Dans ce cas de figure, ledit composé candidat sera jugé comme étant efficace
si
la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte,
et/ou (ii) de la
surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels
que déterminée(s) à
l'étape a) est inférieure à la valeur de référence Vo correspondante
déterminée avant le
début de l'administration à Io.
La valeur de référence pourra également être représentative d'un liquide
synovial de référence, obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de
maladie
articulaire.
Dans ce cas de figure, ledit composé candidat sera jugé comme étant efficace
si
la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte,
et/ou (ii) de la
surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels
que déterminée(s) à
l'étape a) est sensiblement égale à la valeur de référence.
Il pourra également être utilisé deux valeurs de référence :
- une valeur de référence représentative du liquide synovial dudit
mammifère,
obtenu à un instant Io avant le début de l'administration du composé candidat
; et
- une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de
référence,
obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de maladie articulaire.
Dans ce cas de figure, ledit composé candidat sera jugé comme étant efficace
si
la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte,
et/ou (ii) de la
surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels
que déterminée(s) à
l'étape a), se rapproche de la valeur de référence représentative d'un liquide
synovial de
référence tout en s'éloignant de la valeur Vo déterminée avant le début de
l'administration
à Io.
Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, ce procédé pourra être
complété par la mise en oeuvre des étapes supplémentaires suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et
f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman
de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
En particulier, grâce à ce procédé de criblage in vivo, on pourra tester les
composés à activité anti-arthrosique suivants : la chondroïtine sulfate, la
glucosamine, la
diacéréine, les insaponifiables d'avocat et de soja, et l'acide hyaluronique.
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WO 2018/104058 28 PCT/EP2017/080088
Naturellement, ce procédé est essentiellement destiné à tester de nouveaux
composés dont l'activité anti-arthrosique n'a pas encore été démontrée.
Procédés de caractérisation moléculaire d'un liquide synovial de mammifère
La présente invention concerne également un procédé de caractérisation
moléculaire d'un liquide synovial de mammifère, comprenant les étapes
suivantes :
a. dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère
sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b. séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c. mesure de :
= la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (S)
pour cette surface est obtenue, et/ou
= la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la
goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (H) pour ladite
hauteur est obtenue, et
d. comparaison de ces valeurs (S) et/ou (H) avec les gammes de valeurs
suivantes:
= la valeur (S) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la
concentration d'acide hyaluronique présente dans un liquide
synovial ; et
= la valeur (H) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la
concentration de protéines présente dans un liquide synovial.
Comme cela est présenté dans l'exemple 2, sur les bases des résultats
présentés
dans le tableau 3 et la figure 9, une corrélation très nette (R2>70%) est
observée entre la
valeur (S) de surface des gouttes, et la concentration d'acide hyaluronique
dans le liquide
synovial ; plus la surface des gouttes augmente, plus la concentration d'acide
hyaluronique
dans le liquide synovial est faible.
Ainsi, une gamme de valeurs de surfaces de gouttes, comprenant des valeurs Si
avec i = 1 à n, n étant au moins égal à 5, préférentiellement égal ou
supérieur à 10, peut
.. être indexée sur une gamme de concentration en acide hyaluronique, de la
façon suivante :
Si correspond à une concentration en acide hyaluronique Ci ;
S i+i correspond à une concentration en acide hyaluronique Ci+i ;
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WO 2018/104058 29 PCT/EP2017/080088
Si correspond à une concentration en acide hyaluronique Ci+2
S. correspond à une concentration en acide hyaluronique C.
Une telle gamme de valeurs sera aisément obtenue par un Homme du métier,
en appliquant des techniques classiques de mesure de la concentration d'acide
hyaluronique.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un
liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en acide
hyaluronique, à partir
de la valeur de la surface de la goutte séchée dudit liquide synovial, sans
procéder à de plus
amples manipulations.
Ainsi, par une simple mesure de la surface (S) d'une goutte séchée, il est
possible de déterminer quel est le taux d'acide hyaluronique dans un
échantillon de liquide
synovial, sans recourir à des techniques d'analyses plus sophistiquées et
coûteuses.
De même, comme cela est illustré dans le tableau 4 et la figure 8, une
corrélation très nette (R2>85%) est observée entre la valeur (H) de hauteur
des bourrelets,
et la concentration en protéines dans le liquide synovial ; plus la hauteur du
bourrelet
augmente, plus la concentration en protéines dans ce liquide synovial est
élevée.
Ainsi, une gamme de valeurs de hauteur des bourrelets, comprenant des valeurs
Hi avec i = 1 à n, n étant au moins égal à 5, préférentiellement égal ou
supérieur à 10, peut
être indexée sur une gamme de concentration en protéines, de la façon suivante
:
Hi correspond à une concentration en protéines Cpi ;
H 1+1 correspond à une concentration en protéines Cpi ;
Eli+2 correspond à une concentration en protéines Cpi
Hi, correspond à une concentration en protéines Cp..
Une telle gamme de valeurs sera aisément obtenue par un Homme du métier,
en appliquant des techniques classiques de détermination de la teneur en
protéines.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un
liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en protéines, à
partir de la
valeur de la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée dudit
liquide
synovial, sans procéder à de plus amples manipulations.
Ainsi, par une simple mesure de la hauteur (H) du bourrelet présent à la
surface
d'une goutte séchée, il est possible de déterminer quel est le taux de
protéines dans un
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WO 2018/104058 30 PCT/EP2017/080088
échantillon de liquide synovial, sans recourir à des techniques d'analyses
plus
sophistiquées et coûteuses.
Les deux paramètres surface de goutte (S) et hauteur de bourrelet (H) pourront
avantageusement être mesurés conjointement sur le même échantillon de liquide
synovial,
ce qui permettra de déterminer la concentration en acide hyaluronique et en
protéines de ce
liquide synovial.
L'Homme du métier pourra ainsi obtenir des informations sur le type de
maladie articulaire, ou le stade de la maladie articulaire, en fonction des
concentrations en
acide hyaluronique et en protéines telles que déterminées selon le procédé de
l'invention.
En particulier, si ces mesures sont réalisées sur des échantillons de liquide
synovial prélevés à des différents moments dans le temps, il sera possible
pour l'Homme
du métier de déterminer l'évolution de la maladie chez un patient, en fonction
de
l'évolution dans le temps de la concentration en acide hyaluronique et en
protéines dans le
liquide synovial.
EXEMPLES
Les exemples présentés ci-dessous sont à but illustratifs et ne limitent en
rien
l'invention décrite dans la présente demande.
1VIATERIEL ET METHODES
Echantillons de Liquide Synovial (LS)
Les échantillons de LS sont prélevés in vivo sur des chiens sains et
arthrosiques. Le protocole de prélèvement, en accord avec la législation de la
Communauté
Européenne, a été validé par le Comité d'éthique (VetAgro Sup, saisine n 1187
pour les
LS sains, n 1408 pour les LS pathologiques).
Les échantillons de LS ont été placés dans des eppendorfs hermétiques, sans
additifs, puis stockés à -80 C jusqu'à leur utilisation.
Les échantillons de LS sains ont été obtenus par arthrocentèse (aiguille 20G,
seringue 5m1) sur six chiens adultes de race Beagle, âgés de 2 à 3 ans,
cliniquement et
radio logiquement sains après sédation intramusculaire et préparation
chirurgicale des
articulations. Tous les échantillons étaient exempts de contamination sanguine
et
d'apparence (transparence, turbidité, viscosité, couleur) normale.
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WO 2018/104058 31 PCT/EP2017/080088
Les échantillons de LS pathologiques ont été prélevés stérilement en bloc
opératoire sur des chiens de clients de la clinique du CHEV du campus
vétérinaire de
VetAgro Sup et nécessitant une intervention chirurgicale sous anesthésie
générale. Les
différentes articulations opérées présentaient des signes de lésions du
cartilage et divers
degrés d'inflammation évalués par les chirurgiens et notés sur chaque compte-
rendu
opératoire.
Le tableau 1 ci- dessous résume les caractéristiques des différents
échantillons :
Tableau 1
LS Age Poids Deg Diagnostic clinique
(mois) le,.
H1 34 10.6 (Sain)
112 35 8.8 (Sain)
112 34 9.8 (Sain)
114 35 11.5 (Sain)
115 34 11.0 (Sain)
116 11 12.8 (Sain)
OA1 91 56.2 J Rupture des ligaments croisés
0A2 56 52.7 J Rupture des ligaments croisés
0A3 29 40.5 J Rupture des ligaments croisés
0A4 60 28 J Rupture des ligaments croisés
0A5 45 30 J Rupture des ligaments croisés
0A6 29 58.5 + Post TPLO sévère
Dépôt de gouttes
Après décongélation à température ambiante, 150 iil d'échantillon sont
centrifugés à 3000 tr/min (soit 1000g) pendant 10 min, à 4 C. Le culot est
séparé du
surnageant. Des lames de verre sont préalablement dégraissées à l'alcool 70 .
Des gouttes
de 8 iLt1 de surnageant sont ensuite déposées sur les lames puis laissées
sécher à température
ambiante semi-couvertes pendant une journée (Figure 1).
Observation des photos en 2D et 3D des gouttes séchées
Un microscope standard équipé d'une caméra 2048 x 2048 pixels a été utilisé
pour photographier les gouttes séchées, avec un objectif 2,5X. Selon la taille
des gouttes,
plusieurs photos ont pu être nécessaires. Le logiciel 'Image J' a été utilisé
pour reconstruire
des photos 2D grâce au module d'extension (plugin) `Mosaia' et pour mesurer la
surface
de chaque goutte.
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WO 2018/104058 32 PCT/EP2017/080088
Des topographies 3D ont été réalisées par interférométrie à lumière blanche
(smartWLI-microscope, GBS mbH, Germany) en périphérie de chaque goutte (côté
droit)
en mode vertical scanning interferometry (VSI) avec un objectif de
Michelson.
Le logiciel d'analyse MountainsMap (DigitalSurf, France) a permis la
reconstruction des cartes topographiques de taille 1.4 x 1.07 mm et
l'enregistrement des
données associées (X, Y, Z).
Des routines Matlab (The Mathworks, MA, USA, version R2013a) ont été
développées spécifiquement pour calculer les profils Z le long de chaque carte
topographique.
DDRS (Drop Deposition RS)
Les acquisitions spectrales ont été réalisées sur un microscope confocal Raman
(LabRAM HR8000, Horiba Jobin Yvon, Villeneuve d'Ascq, France). Quatre ROI
(Region
of Interest) ont été sélectionnées avec un objectif 10X aux quatre points
cardinaux de
chaque goutte, de taille 20 x 60 um2, dans la zone périphérique où la pré-
concentration des
solutés est maximum, comme cela a pu être vérifié par interférométrie (Figure
2).
Avant toute acquisition, le système a été calibré en utilisant la raie à 520.7
cm-1
d'un échantillon de silicium de référence. Les acquisitions spectrales ont été
réalisées avec
un objectif 50X, d'ouverture numérique 0.75 et une longueur d'onde du laser à
632.8 nm
(HeNe, puissance à l'échantillon de 12 mW) donnant une taille de spot de 1 m.
La
diffusion Raman était mesurée par un détecteur CCD (1024x 256 pixels refroidi
par effet
Peltier à -70 C). La résolution spectrale est inférieure à 1 cm-1 grâce à
l'utilisation d'un
réseau 1800 traits/mm. La taille du trou confocal est ajustée à 200 um pour
une résolution
axiale de 2 um.
Dans chacune des ROI, six points ont été cartographiés, espacés chacun de
20 ium, dans la gamme spectrale de 800 à 1780 cm-1, avec un temps
d'acquisition de 30 s et
3 accumulations. Les spectres ont été enregistrés avec le logiciel LabSpec6
(Horiba Jobin
Yvon, Villeneuve d'Ascq, France).
Prétraitement des résultats Raman
Tous les spectres présentaient un haut rapport signal sur bruit. Tous ont été
prétraités dans Matlab (The Mathworks, MA, USA, version R2013a) par le
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WO 2018/104058 33 PCT/EP2017/080088
développement de routines utilisateurs pour éliminer la fluorescence et
supprimer la ligne
de base.
Pour la comparaison des signatures spectrales et l'identification des bandes
Raman, le spectre moyen de chaque goutte de LS a été défini comme la moyenne
des
spectres moyens de chaque ROI.
La bande à 1002 cm-1 de la phénylalanine (dite respiration du cycle, ou ring
breathing band) a été utilisée pour normaliser les intensités (Esmonde-White
et al., 2009),
cette bande n'étant pas sensible au changement de conformation des protéines.
Les fonctions Gauss et Lorentz ont servi à fitter les pics dans des bandes
spécifiques. Classiquement en spectroscopie Raman, les ratios d'intensités de
pics sont
utilisés plutôt que les intensités elle-même pour détecter les différences
entre échantillons
(Nyman et al., 2011), les ratios associés aux pics fittés ont donc été
calculés.
Analyses statistiques
Tous les tests statistiques ont été réalisés dans Matlab avec les outils
Statistics and Machine Learning Toolbox . Des tests de Mann Whitney ont été
effectués
sur tous les ratios calculés pour vérifier les différences statistiques entre
les LS sains et
arthrosiques. Le niveau de significativité a été un risque -a de 5% (p<0.05).
Des tests de
corrélation de Pearson ont été réalisés sur ces mêmes ratios pour trouver s'il
existe des
corrélations entre les ratios et les caractérisations morphologiques des
gouttes.
Des Analyses en Composantes Principales (ACP) ont également été réalisées
sur ces ratios. L'ACP est une méthode statistique multivariée classiquement
utilisée sur les
données hyper spectrales pour réduire le grand nombre de variables contenu
dans les
spectres. Les Composantes Principales (PCs) sont calculées comme étant un
nouvel
ensemble de variables décorrélées, combinaisons linéaires des variables
initiales corrélées,
et expliquant le maximum de variance possible entre les données. Les
diagrammes dits
scatter plots , permettent une visualisation aisée des résultats de l'ACP,
chaque spectre
étant représenté par un point dans le système d'axe des PCs.
Exemple 1. Résultats obtenus par interférométrie à lumière blanche
Les gouttes de LS ont été déposées sur des lames en verre standard et des
images 2D des gouttes séchées ont été capturées (Figure 3).
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WO 2018/104058 34 PCT/EP2017/080088
La surface des gouttes était significativement plus grande (p=0.026) dans le
groupe OA malade (n=6) avec une surface moyenne (écart-type) de 38.37 mm2
(4.80 mm2)
que dans le groupe sain (n=6) avec une moyenne (écart-type) de 31.30 mm2 (2.85
mm2)
(Figure 4).
Ces images prises au microscope ont révélé la présence d'un anneau noir entre
la périphérique extérieur et le centre cristallin seulement visible sur les
gouttes du groupe
sain tandis qu'un bourrelet se voit distinctement sur les gouttes du groupe
OA.
Les images 3D prises par interférométrie (Figure 3) ont confirmé que la
hauteur du bourrelet en périphérie est significativement plus importante
(p=0.002) dans le
groupe OA (n=6) avec une hauteur moyenne (écart-type) de 30.09 ium (5.80 ,um),
soit
presque trois fois supérieure à celle du groupe sain (n=6) avec une hauteur
moyenne
(écart-type) de 11.81 ium (1.71,um) (Figure 4).
Exemple 2. Résultats obtenus par analyse du spectre Raman
Aucune différence significative n'a été observée entre les différents spectres
des LS sains comme en atteste le faible écart-type. La moyenne des 6 spectres
des LS sains
a ainsi été utilisée par la suite pour modéliser la signature spectrale des LS
sains (Figure
5A).
Les bandes Raman ont été identifiées et assignées à partir d'une étude
bibliographique sur le liquide synovial, les protéines, les acides aminés, le
sang et le sérum
(Tableau 2).
Pour comparer les spectres sains et OA, les principales bandes ont été
identifiées, déconvoluées et les ratios afférents calculés. Ainsi, vingt et un
pics ont été
sélectionnés, identifiés dans le Tableau 2, résultant dans le calcul de deux
cent dix ratios
(seulement la moitié de la matrice des ratios a été utilisée, considérant
qu'il n'était pas
nécessaire de calculer un ratio et son inverse).
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WO 2018/104058 35 PCT/EP2017/080088
Tableau 2. Bandes Raman des gouttes séchées de LS
Bande Molécule assignée Pics
Raman Raman
(cm-i) utilisés
(n=21)
828 Tyrosine doublet
852 Tyrosine doublet
880 O(C-C) Tryptophan
896 Hyaluronic acid
945 Hyaluronic acicl
960 \'( P( Or phosphate bone
970 Fibrin or blood
1002 C-C aromatic ring or plicnylalaninc (breathing mode)
1031 O.((-H ) or phenylalanine
1046 Hyaluronic acid
1062 v( ( )S( )2-) or cliondroilin 6-su1 rate
1081 \'(C-C) or \'(C-O) or \'(C-N) protein and lipids
1102 Hyaluronie acid
1127 Hyaluronic acid
1172 Tyrosine
1207 Tyrosine, plicnylalaninc
1242 v( C-1\1), (')(N-E1) ()l'Amide Ill (il-shcet
conrormation)
1248 Fibrin or Blood
1275 v(Ci-N), O(N-11) or Amide III (u-helix conliormation)
1317 CH2 CHt twist or proteins
1339 Tryptophan, CH2 CH 2 wag of prolcins
1363 Hente or blood
1448 (i(.2Ht in collagen
1542 Hente or blood
1554 Tryptophan
1575 Fibrin or blood
1586 Phenylitlaninc
1605 Plicnylalaninc
1615 Tyrosine
1654 v(C=0) stretching of Amide I (a-helix conformation)
1670 v(C=0) stretching of Amide I (f3-sheet conformation)
Les assignements ont été réalisés à partir de la bibliographie sur le LS, les
protéines, les acides aminés, l'acide hyaluronique, le sang et le sérum
(Alkrad et al., 2003;
Bansil et al., 1978; Dingari et al., 2012; Ellis et al., 2009; Esmonde-White
et al., 2008;
Mandair et al., 2006; Rygula et al., 2013; Tuma, 2005; Virkler and Lednev,
2010; Wei et
al., 2008)
Les bandes structurelles des protéines, comme les Amide III entre 1242 et 1275
cm-1 et les Amide I entre 1654 et 1670 cm-1 sont particulièrement
reconnaissables, ainsi
que les bandes des acides aminés comme la phénylalanine (mode breathing du
cycle
aromatique à 1002 cm-1) et la tyrosine (doublet à 828 et 850 cm-1). La teneur
en protéine
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peut également être identifiée par les différents modes de CH2CH3 à 1448 cm-1
(mode
bending ), 1317 cm-1 (mode twisting ) et 1339 cm-1 (mode wagging ). La
présence
de l'acide hyaluronique (HA) est identifiable par la bande à 945 cm-1 et sa
contribution
dans la région 1020-1140 cm-1 (Esmonde-White et al., 2008).
La forme des bandes et leurs intensités varient significativement entre les
spectres sains et OA, dans lesquels apparaissent de nouvelles bandes comme
970, 1248 et
1575 cm-1 et à 1542 cm-1 attribuées respectivement à la fibrine et
l'hémoglobine, résultant
de l'inflammation de l'articulation (Virkler and Lednev, 2010) (Figure 5B).
Plusieurs zones spectrales d'intérêt ont focalisé l'attention (Figure 5C). La
région 910-990 cm-1 s'est révélée être drastiquement différente entre spectres
sains et OA:
alors que seule la bande HA à 945 cm-1 est prédominante sur les spectres
sains, des bandes
à 960 cm-1 et 970 cm-1 apparaissent sur les spectres OA. La région 1020-1145
cm-1 est
riche en information car contient des bandes de la phénylalanine (1031 cm-1),
HA (1046,
1102 et 1127 cm-1), chondroïtine 6-sulfate (C6S) (1062 cm-1) et le squelette
des protéines
(1081 cm-1). Finalement, la région 1220-1280 cm-1 des Amide III est la
troisième à être
notablement différente.
Analyses statistiques univariées
Des tests univariés de Mann Whitney ont été réalisés sur les deux cent dix
ratios calculés pour comparer le groupe sain (n=6) et le groupe OA (n=6). Cent
soixante-
quatre d'entre eux se sont révélés être significativement différents.
L'analyse de ces ratios
significativement différents permet de conclure que toutes les bandes liées au
HA, au C6S
et au squelette des protéines diminuent tandis que l'on peut constater une
augmentation des
bandes de CH2/CH3 et des acides aminés, ainsi que du phosphate minéral osseux.
Régressions linéaires
Des tests de corrélation de Pearson ont été menés sur les deux cent dix ratios
pour trouver les corrélations pouvant exister entre les ratios et les
caractérisations
morphologiques des gouttes (hauteur des bourrelets et surfaces des gouttes).
Les tests ont montré que quatre ratios avaient une corrélation supérieure à
70%
(p<10-3) avec la surface des gouttes et dix-huit ratios avaient une
corrélation supérieure
80% (p<10-4), dont 8 avec une corrélation supérieure à 85%, avec la hauteur
des bourrelets.
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Tous ces ratios faisaient partie des cent soixante-quatre ratios
significativement différents
entre groupes sain et OA (Tableaux 3 et 4).
Tableau 3. Liste des quatre ratios liés à l'acide hyaluronique, montrant un
haut
degré de corrélation avec la surface des gouttes : moyenne et écart-types des
ratios, valeur
p des tests de Mann-Whitney, tendance d'évolution, coefficients de corrélation
avec la
surface des gouttes.
Ratios Sain OA
Mann- Tendance Corrélation
Whitney Surface
Moyenne EC Moyenne EC p R2 (%)
1317/896 cm-1 3,00 H, 10 3,6S 0,00-1 71 77,3
1339/896 cin-1 2,74 0,06 3,65 0.2v 0 002 71
72,6
1317/945 cm-1 1,30 0.0/ 1,S6 0,26 0,002 71
70,8
1062/1046 cm' 0,88 0,06 1,05 0,05 0,002 71
71,8
La figure 9 présente de manière graphique cette corrélation très nette
(R2>70%)
entre la valeur de surface des gouttes et la concentration d'acide
hyaluronique dans le
liquide synovial ; plus la surface des gouttes augmente, plus la concentration
d'acide
hyaluronique dans le liquide synovial est faible.
Ainsi, une gamme de valeurs de surfaces de gouttes peut être indexée sur une
gamme de concentration en acide hyaluronique.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un
liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en acide
hyaluronique, à partir
de la valeur de la surface de la goutte séchée dudit liquide synovial, sans
procéder à de plus
amples manipulations.
Une autre corrélation d'importance a été mise en évidence entre la hauteur (H)
du bourrelet présent à la surface des gouttes, et le taux de protéines présent
dans le LS
testé, comme cela est présenté dans le tableau 4 ci-dessous et la figure 8.
Tableau 4. Liste des huit ratios montrant un haut degré de corrélation avec la
hauteur des bourrelets : moyenne et écart-types des ratios, valeur p des tests
de Mann-
Whitney, tendance d'évolution, coefficients de corrélation avec la hauteur des
bourrelets.
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WO 2018/104058 38 PCT/EP2017/080088
Ratios Sain OA
Mann- Tendance Corrélation
Whitney Hauteur
Moyenne EC Moyenne EC p R2 (%)
1102/852 cnfl 0,92 0,06 0,42 0,07 0,002
88,3
1102/1002 cm-1 0,20 0,02 0,10 0,0/ 0,002
86,0
1102/1031 cm1 04 o 1)4 0,53 0- 0,002 90,5
1127/1102 cm-1 1,?S 00- 1,97 0 0,002 71 88,2
1172/1102 cm-1 0,3S 005 0,93 0 12 0 ,0 02 71
87,1
1448/1102 cm-1 25 1 0.21 6,04 0.2 0,002 71 86,6
1654/1102 cm-1 3,30 032 6,46 0 90 0,002 71
86,3
1448/1317 cm-1 137 0.03 1,70 () (r 0,007 71
88,6
La figure 8 présente de manière graphique cette corrélation très nette (R2>85%
chez le chien) entre la valeur de hauteur des bourrelets, et la concentration
en protéines
dans le liquide synovial ; plus la hauteur du bourrelet augmente, plus la
concentration en
protéines dans ce liquide synovial est élevée.
Ainsi, une gamme de valeurs de hauteur de bourrelet peut être indexée sur une
gamme de concentration en protéines.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un
liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en protéines, à
partir de la
valeur de la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée dudit
liquide
synovial, sans procéder à de plus amples manipulations.
Analyse statistique multivariée
Afin d'évaluer les différences statistiques entre les spectres de LS sains et
OA,
une ACP a été effectuée en utilisant les deux cent dix ratios comme variables
d'entrée. Les
scatter plot des quatre premiers scores de PCA représentant 92,2% de la
variance
expliquée totale, ont montré que les groupes OA et sains sont distinctement
séparés
(Figure 6).
Exemple 3. Analyse de gouttes de liquide synovial humain
Dans cette étude, les échantillons de LS humains ont été fournis prêts à
l'emploi par l'Hôpital Universitaire de Genève (HUG). Il s'agissait de LS
prélevés in
vivo sur des patients de grades radiographiques 2 et 4. Ces échantillons ont
été fournis avec
un certain nombre de données patients (âge, IMC) et de biomarqueurs comme les
dosages
de la leptine, de l'interleukine-6 (IL6) ainsi que les scores WOMAC douleur et
fonction.
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WO 2018/104058 39 PCT/EP2017/080088
Ces échantillons de LS ont été exploités comme présenté ci-dessus pour les
échantillons de LS de chiens, à savoir dépôt de gouttes, images 2D et 3D des
gouttes
séchées et spectres Raman.
Analyses statistiques
Tous les tests statistiques ont été réalisés dans Matlab avec les outils
Statistics and Machine Learning Toolbox . Des tests de corrélation de Pearson
ont été
réalisés sur tous les ratios pour rechercher l'existence de corrélations entre
les deux cent
dix ratios et (i) les biomarqueurs et (ii) les caractéristiques morphologiques
des gouttes
(hauteur des bourrelets et surfaces des gouttes).
Corrélation LS HUG / dosage IL6
Les tests de corrélation ont mis en évidence une corrélation linéaire
supérieure
à 50% entre trois ratios, tous liés à la chondroïtine 6-sulfate et le dosage
en Interleukine-6
(Figure 7), pris sous forme de logio. Ces corrélations semblent très
pertinentes puisqu'il
est connu qu'il existe une relation entre chondroïtine 6-sulfate (un des
glycosaminoglycanes de la matrice du cartilage) et l'Interleukine-6.
Corrélation LS HUG + CN / Hauteur
Comme pour le chien, des tests de corrélation de Pearson ont été réalisés sur
les deux cent dix ratios pour trouver les corrélations significatives entre
les ratios et les
caractéristiques morphologiques des gouttes (hauteur des bourrelets et
surfaces des
gouttes). Les tests ont notamment montré que les ratios fortement corrélés à
la hauteur des
bourrelets chez l'humain, sont aussi très fortement corrélés chez le chien
(Tableau 5) et
qu'en outre les ratios sont très proches (Figure 8), rendant ces ratios très
pertinents.
Tableau 5. Trois ratios montrent une corrélation supérieure à 70% (p<10-4)
avec la hauteur des bourrelets des gouttes de LS humains. Ils sont aussi
significativement
corrélés avec les hauteurs des bourrelets des gouttes de LS de chiens.
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Ratios Corrélation Hauteur
R2 HUG(%) R2 Chiens(%)
1448/1102 cm-1 72,1 86,6
1654/1102 cm-1 73,9 86,3
1448/1317 cm-1 85,6 88,6
Exemple 4. Analyse de gouttes de liquide synovial de lapin
Un modèle animal de l'arthrose induite chirurgicalement a été développé chez
le lapin : ce modèle est désigné modèle de transection chirurgicale du
ligament croisé
antérieur (ACLT) . Ce modèle est particulièrement approprié pour étudier les
stades
précoces de l'arthrose (Madry et al., 2016).
Deux groupes de lapins ont été étudiés :
- Un groupe 2 semaines après induction ACLT qui correspond au stade
inflammatoire de la maladie, ci-après désigné Stade inflammatoire (SI) ;
- Un groupe 6 semaines après induction ACLT qui correspond à un stade
non inflammatoire de l'arthrose, ci-après désigné Stade non inflammatoire
(SNI) .
Dans chaque groupe, la moitié des individus a été traitée par injection
d'acide
hyaluronique dans l'articulation ; toutefois, aucune différence notable n'a
été observée
entre les lapins traités et non traités au regard des paramètres étudiés, ces
différences ne
sont donc pas présentées ici.
Le volume de liquide synovial prélevé est plus important dans le groupe SI que
dans le groupe SNI, ceci étant dû à l'inflammation post-chirurgicale.
Les échantillons de tissus articulaires du groupe SI ne présentent pas encore
de
modifications macroscopiques visibles, typiques de l'arthrose. Au contraire
les
échantillons tissulaires du groupe SNI présentent des dégradations tissulaires
caractéristiques de l'arthrose. Toutefois, dans le groupe SI, les propriétés
viscoélastiques
de l'articulation sont déjà affectées.
Le liquide synovial prélevé sur ces lapins a été étudié comme cela est
présenté
dans le chapitre Matériel et Méthodes ci-dessus.
Le tableau 6 ci-dessous, ainsi que la figure 10, présentent les valeurs de
surface
des gouttes et de hauteur des bourrelets des liquides synoviaux identifiés.
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WO 2018/104058 41 PCT/EP2017/080088
Tableau 6. Valeurs moyennes et écart type de la surface et de la hauteur du
bourrelet des gouttes de LS.
Surface
Hauteur (mm)
(mm2)
Groupes
C ô c
SI (n=8) 38,07 2,70 27,55 1,52
SNI (n=9) 29,29 3,21 21,74 4,58
p-value 3.104 0,0037
Le liquide synovial issu de lapins SI présente des valeurs de surface de
goutte
et de hauteur de bourrelets nettement supérieures que le liquide synovial issu
de lapins
SNI, provenant d'articulations présentant des dégradations tissulaires
typiques de l'arthrose
mais où l'inflammation est atténuée.
Ainsi, les paramètres surface des gouttes et hauteur des bourrelets
permettent de déterminer si la maladie est à un stade inflammatoire ou non
inflammatoire.
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WO 2018/104058 42 PCT/EP2017/080088
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