Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 1 PCT/EP2019/067771
TITRE DE L'INVENTION
Polypeptides et compositions à activité polysaccharide oxydase lytique.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne, de manière générale, les enzymes à activité
polysaccharide oxydases. En particulier, l'invention concerne le domaine de la
production
d'éthanol de deuxième génération par oxydation et hydrolyse enzymatique de
matériaux
contenant des polysaccharides, et notamment la biomasse lignocellulosique.
Aussi, l'invention concerne le domaine des celluloses, ainsi que des procédés
pour la fabrication de fibres de celluloses et de défibrillation de substrats
cellulosiques.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
La biomasse lignocellulosique est un substrat polysaccharidique et une source
renouvelable pour la production de biocarburants et de molécules plateformes
pour
l'industrie. Sa conversion en produits d'intérêts, tels que les saccharides et
les fibres de
cellulose, requiert l'action combinée d'enzymes, pour la plupart d'origine
fongique.
Compte tenu de la complexité et de la récalcitrance de la biomasse
lignocellulosique, sa dégradation est un des verrous dans le développement
d'un procédé
de bioéthanol 2G économiquement viable.
Pour dégrader ce type de substrat polysaccharidique, composé essentiellement
de cellulose, hémicelluloses et de lignine, les microorganismes
cellulolytiques produisent
généralement des mélanges enzymatiques contenant des cellulases,
hémicellulases,
pectinases et des enzymes lignolytiques. Une action concertée des différentes
enzymes est
nécessaire pour une dégradation optimale de la lignocellulose. La dégradation
de la
cellulose nécessite notamment l'action coordonnée et synergique de différents
types
d'enzymes. Plus particulièrement, convertir efficacement de la cellulose en
petites
molécules nécessite l'action synergique des cellulases, c'est-à-dire des
endoglucanases
(EG), des cellobiohydrolases (CBH) et des B-glucosidases. Les EG clivent les
liaisons 13-
1,4 au hasard dans les chaînes cellulosiques, libérant ainsi de nouvelles
terminaisons pour
l'action des cellobiohydrolases (CBH) qui à leur tour libèrent des unités de
cellobiose. Les
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 2 PCT/EP2019/067771
13-glucosidases produisent des molécules de glucose à partir du cellobiose,
atténuant ainsi
l'effet inhibiteur du cellobiose sur la CBH.
Toutes les enzymes avec activités sur carbohydrates sont répertoriées dans la
base de données CAZy (Carbohydrate Active enzymes, Lombard et al., 2014), en
classes
(en fonction de leur mode d'action) et en familles en fonction de leur
séquence et de
paramètres structuraux, qui déterminent aussi les propriétés enzymatiques.
Par exemple, les enzymes hydrolytiques se trouvent dans la classe des
glycoside hydrolases (GH), et les cellulases notamment dans les familles GH5,
GH6, GH7,
GH12, GH45 et GH48.
Aussi, des effets synergiques ont été montrés pour des enzymes à activité
oxydative agissant sur la cellulose. Les premiers représentants de cette
famille, les Lytic
Polysaccharide Monooxygénases (LPMO) ont été isolés des champignons
filamenteux
Thielavia terrestris et Thermoascus aurantiacus (Harris et al. ; Stimulation
of
Lignocellulosic Biomass Hydrolysis by Proteins of Glycoside Hydrolase Family
61:
Structure and Function of a large, Enigmatic Family ; Biochemistry (Moscl.)
49, 3305-
3316; 2010). Elles oxydent les liaisons glycosidiques des chaines de
polysaccharides en
libérant des acides aldoniques, et augmentent ainsi l'accessibilité du
substrat pour les
enzymes hydro lytiques.
Ces monooxygénases (LPMO) sont classées parmi les enzymes à activité
auxiliaire (AA) (Levasseur et al., 2014) au sein des familles AA9, AA10, AA11,
AA13,
AA14 et AA15. Les LPMO avec activité sur cellulose appartiennent à la famille
AA9.
Mais d'autres familles de monooxygénases ont été découvertes : la famille AA10
regroupe
des enzymes bactériennes analogues aux AA9, les membres de la famille AAll ont
une
activité sur la chitine, ceux de la famille AA13 agissent sur l'amidon, ceux
de la famille
AA14 agissent sur le xylane et ceux de la famille AA15 sur celllulose et
chitine.
Un producteur d'enzymes fréquemment employé en industrie est le
champignon Trichoderma reesei qui est capable de produire des grandes
quantités
d'enzymes. Notamment, le cocktail d'enzymes dit K975 représente une faible
diversité
d'enzymes et n'est pas suffisamment efficace. En comparant le génome de T.
reesei à
d'autres génomes issus d'espèces proches, on constate effectivement que T.
reesei possède
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 3 PCT/EP2019/067771
à la fois moins de gènes impliqués dans la dégradation des carbohydrates de la
paroi
végétale et que les enzymes sont moins diversifiées.
Des nombreux travaux de recherche ont donc visé à supplémenter ce mélange
par des enzymes ayant une plus importante activité spécifique ou une activité
complémentaire au répertoire présent dans T. reesei, ce qui permettrait de
diminuer la dose
d'enzymes à mettre en oeuvre.
Il a ainsi été montré qu'un cocktail enzymatique de T. reesei contenant 7 % de
la protéine AA9 (LPMO) de T. aurantiacus était capable d'hydrolyser 90 % de la
cellulose
à 4 mg de protéine par gramme de cellulose, permettant de réduire la quantité
d'enzymes
nécessaire d'un facteur 2. D'autres membres de la famille AA9 ont été
identifiés chez
plusieurs espèces fongiques, notamment chez Podospora anserina, Myceliophthora
thermophila ou Phanerochaete chrysosporium.
WO 2018/050300 enseigne l'identification de LPM0s, et leur mise en oeuvre
dans un procédé de production de sucres à partir de biomasse
lignocellulosique.
WO 2016/193617 enseigne des procédés de fabrication de nanocelluloses,
comprenant une étape de traitement enzymatique du dit substrat par une enzyme
de clivage
appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides
(LPM0s), aptes
à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de celluloses.
Malgré les nouvelles stratégies de prétraitement, les coûts de production des
nanocelluloses restent élevés, les rendements incertains, et la qualité et les
propriétés sont
variables.
Il subsiste ainsi un besoin d'identifier de nouvelles familles enzymatiques
pour
le traitement de ces substrats polysaccharidiques, et notamment la biomasse
lignocellulosique. En particulier, il subsiste un besoin d'identifier des
familles d'enzymes
capables, seules ou en combinaison avec le dit cocktail de T. reesei,
d'améliorer le
rendement d'hydrolyse enzymatique.
Par exemple, il subsiste un besoin de familles enzymatiques capables
d'hydrolyser des biomasses récalcitrantes telles que le miscanthus et/ou le
peuplier.
Il subsiste également un besoin de familles enzymatiques permettant
d'améliorer les procédés existants d'obtention sucres et/ou de fibres de
cellulose à partir de
substrats polysaccharidiques tels que les biomasses lignocellulosiques.
L'invention a pour objet de répondre à ces besoins.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 4 PCT/EP2019/067771
RESUME DE L'INVENTION
Selon un premier objet, l'invention concerne un polypeptide isolé à activité
polysaccharide oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence
présentant une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
.. SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P,
la dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
En particulier, l'invention concerne un polypeptide isolé à activité
polysaccharide oxydase tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il
comprend une
séquence présentant une identité d'acide aminé d'au moins 80% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, la dite méthode de
comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Tout particulièrement, le dit polypeptide isolé à activité polysaccharide
oxydase peut être caractérisé en ce qu'il comprend une séquence polypeptidique
de
référence choisie parmi SEQ ID N 5 à SEQ ID N 382 et SEQ ID N 383.
Selon un second objet, l'invention concerne une composition à activité
polysaccharide-oxydase, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide à
activité
polysaccharide oxydase tel que défini ci-dessus.
En particulier, la dite composition peut être caractérisée en ce qu'elle
comprend en outre au moins un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase
choisi
parmi : une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate
oxydase.
La dite composition à activité polysaccharide oxydase peut être caractérisée
en
ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à partir d'un ou plusieurs
organismes de type
champignon ou levure, notamment choisis parmi les genres : Achlya, Acremonium,
Aspergillus, Cep halosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium,
Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora,
Penicillium,
Pyricularia, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Podospora, Pycnoporus,
Fusarium,
Thermonospora; tout particulièrement Aspergillus ou Trichoderma ou Podospora;
préférentiellement Aspergillus ou Podospora.
La dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut être caractérisée
en
ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase est obtenu de
façon
recombinante.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 5 PCT/EP2019/067771
Selon un troisième mode de réalisation, l'invention concerne un kit comprenant
au moins :
- une première partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-
oxydase tel
que défini ci-dessus, ou une composition comprenant le dit polypeptide à
activité
polysaccharide-oxydase;
- une seconde partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-
dégradase
choisi parmi une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une
carbohydrate oxydase,
ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-
dégradase.
Selon un quatrième mode de réalisation, l'invention concerne un hôte apte à
exprimer de manière recombinante un polypeptide à activité polysaccharide-
oxydase tel
que défini ci-dessus. Le dit hôte peut être notamment une levure, une bactérie
ou un
champignon.
Selon un cinquième mode de réalisation, l'invention concerne un acide
nucléique isolé codant pour un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase
tel que défini
ci-dessus.
Selon un sixième mode de réalisation, l'invention concerne un procédé
d'obtention d'un sucre à partir d'un substrat polysaccharidique, comprenant au
moins une
étape de mise en contact du dit substrat avec un polypeptide à activité
polysaccharide-
oxydase tel que défini ci-dessus, ou d'une composition à activité
polysaccharide-oxydase
comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase. De
préférence, le dit
substrat est un substrat lignocellulosique.
En particulier, l'invention concerne un procédé de production d'alcool à
partir
d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend l'obtention
d'un sucre par
un procédé d'obtention d'un sucre tel que défini ci-dessus, et la fermentation
alcoolique
dudit sucre par un microorganisme alcooligène.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 6 PCT/EP2019/067771
Selon un septième mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de
préparation d'un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de
cellulose, lequel
procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
b) mettre en contact, en présence d'un donneur d'électron, le dit substrat
avec
au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions
aptes à
assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide oxydase
présente une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon un huitième mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de
défibrillation d'un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins
les étapes
.. suivantes consistant à:
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose,
lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d'électrons et un
polypeptide à
activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un
clivage oxydatif
desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défibriller le
dit
substrat,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide oxydase
présente une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon un neuvième mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de
fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les
étapes suivantes
consistant à:
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 7 PCT/EP2019/067771
b) mettre en contact, en présence d'un donneur d'électron, ledit substrat
cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase
dans des
conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer
lesdites
fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase
présente une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon un dixième mode de réalisation, l'invention concerne des fibres de
celluloses issues d'un procédé de défibrillation et/ou d'un procédé de
fabrication de fibres
de cellulose tel(s) que défini(s) ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1: Suivi au cours du temps du rendement d'hydrolyse avec le
cocktail de T. reesei; sur trois biomasses prétraitée. Les barres d'erreur
représentent
l'écart-type calculé sur 3 réplicats. En ordonnée : rendement d'hydrolyse sur
trois
biomasses prétraitée A. Sur paille ; B. Sur miscanthus ; C. Sur peuplier
(exprimées en
pourcentage par rapport à la cellulose disponible dans le substrat initial).
En abscisse : le
temps en heure à partir du temps 0 d'hydrolyse. Courbe A. Sur paille :
Augmentation du
rendement d'hydrolyse jusqu'à une valeur de 90% à Temps (h) 140.Courbe B. Sur
Peuplier : Augmentation du rendement d'hydrolyse jusqu'à une valeur de 60% à
Temps (h)
140. Courbe C. Sur miscanthus : Augmentation du rendement d'hydrolyse jusqu'à
une
valeur de 50% à Temps (h) 140.
Figure 2A-2C: Modification du rendement d'hydrolyse en présence de
sécrétomes issus de la souche CIRM-BRFM 1490 d'Aspergillus japonieus, par
rapport
au rendement d'hydrolyse en présence du cocktail de référence seul. A. Sur
paille B.
Sur miscanthus C. Sur peuplier. Les moyennes ont été calculées sur 7 à 15
réplicats par
point (les * signalent les moyennes pour lesquelles le test de Student par
rapport à la
référence donne une p-value < 0.05). En ordonnée : Amélioration du rendement
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 8 PCT/EP2019/067771
d'hydrolyse dont les valeurs sont caractérisées de -15% à 15%. En abscisse :
les différents
sécrétomes de la souche CIRM-BRMF 1490, selon les substrats sur lesquels ils
ont été
produit (ASM : autoclavat de son de maïs, SBP : pulpe de betterave, Avicel),
testés en
supplémentation du cocktail de référence sur une des trois biomasses à 24, 48
ou 96h
d'hydrolyse. A. Sur paille : Les boites les plus claires illustrent les
performances des
sécrétomes sur la paille à 24h (à gauche de chaque entrée) et les boites les
plus foncées les
performances des sécrétomes sur la paille à 48h (à droite de chaque entrée).
B. Sur
miscanthus : Les boites les plus claires (à gauche) illustrent les
performances des
sécrétomes sur miscanthus à 24h et les boites les plus foncées (à droite) les
performances
des sécrétomes sur miscanthus à 96h. C. Sur peuplier : Les boites les plus
claires (à
gauche) illustrent les performances des sécrétomes sur peuplier à 24h et les
boites les plus
foncées (à droite) les performances des sécrétomes sur peuplier à 96h.
Figure 3 : conservation du module catalytique et séquence consensus.
Représentation graphique des acides aminés consensus lors de l'alignement de
378 modules X273, générée en utilisant l'application WebLogo (Crooks et al.,
2004). En
ordonnée, unité de conservation de séquence exprimée en bits. En abscisse,
position dans
la séquence consensus référence du module. La taille des acides aminés est
représentée en
fonction de la fréquence observée, telle que défini selon l'algorithme précisé
dans Crooks
et al. (2004).
Figure 4: Synergie des X273 avec CBHI pour la libération de cellobiose à
partir de nanofibrilles de cellulose. Les enzymes AaX273 et PaX273 (8 itg) ont
réagi
avec un mélange de nanofibrilles de cellulose (NFC) à 0,1% pendant 16h en
présence
d'ascorbate (1mM), puis les NFC ont été lavées et hydrolysées par la cellulase
CBHI de T.
reesei (0,8 itg) pendant 30 minutes. En ordonnée : Aire des pics de cellobiose
(en nC.min).
En abscisse : (à gauche) cellulase CBHI en présence de NFC, contrôle. (au
centre)
cellulase CBHI supplémentée d'enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue
de
Aspergillus aculeatus (référencée AaX273). (à droite) cellulase CBHI
supplémentée
d'enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue de Podospora anserina
(référencée
PaX273). La marge d'erreur représente l'écart type.
Figure 5: Concentration de glucose libéré après 24h d'hydrolyse du
miscanthus par le cocktail de référence, avec ou sans ajout de X273. Le test
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 9 PCT/EP2019/067771
séquentiel : les X273 (2,2 ILLM) ont agi pendant 24h, puis le cocktail
K975+SP188 (lmg/g
MS) a été ajouté pendant 24h. Le test simultané : les X273 et le cocktail
K975+SP188 ont
été ajouté ensemble pour 24h. Les barres d'erreur représentent l'écart-type
calculé sur 3
réplicas. En ordonnée : concentration de glucose libéré (en g/L). En abscisse
: (à gauche)
substrat miscanthus en présence de cocktail T. reesei, contrôle. (au centre)
en présence de
cocktail T. reesei supplémenté d'enzyme à activité polysaccharide-oxydase
issue de
Aspergillus aculeatus (référencée AaX273). (à droite) en présence de cocktail
T. reesei
supplémenté d'enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue de Podospora
anserina
(référencée PaX273). Pour chacune des trois expériences, deux types
d'hydrolyse sont
effectuées, séquentiel (à gauche) ou simultanée (à droite).
Figure 6 : Amélioration de l'accessibilité de la cellulose par X273, par
mesure du cellobiose libéré en présence d'une cellulase de Triehoderma reesei
(CBH1). Le test est réalisé sur PASC (Phosphoric Acid Swollen Cellulose),
traité en
l'absence d'enzyme X273 (colonne de gauche), en présence de AaX273 issu de
Aspergillus aculeatus (SEQ ID N 2), de AjX273 issu de Aspergillus japon icus
(SEQ ID
N 383), de P1X273 issu de Pestalotiopsis fici (SEQ ID N 175) ou de ApX273 issu
de
Aureobasidium pullulans (SEQ ID N 208) ¨ de gauche à droite. En ordonnée, la
quantité
de cellobiose libérée, exprimée en mg/L.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Afin de remédier aux inconvénients précités de l'état de la technique, les
inventeurs ont cherché à identifier des sécrétomes d'Aspergillus capables de
supplémenter
un cocktail cellulolytique référence issu de T. reesei sur une série de
biomasses
lignocellulosiques dites récalcitrantes, telles que la paille, le peuplier ou
le miscanthus.
Pour ce faire, les inventeurs ont produit des sécrétomes à partir de cultures
dans
différentes conditions et de plusieurs souches d'Aspergillus, sélectionnées
dans la
collection CIRM-CF (Centre International de Ressources Microbiennes ¨
Champignons
Filamenteux) de l'INRA.
Notamment, des sécrétomes apportant les plus fortes améliorations de
rendement d'hydrolyse du miscanthus ont été sélectionnés.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 10 PCT/EP2019/067771
Une protéine d'intérêt est apparue durant l'exploration du contenu des
sécrétomes, laquelle est présente uniquement dans les sécrétomes capables
d'améliorer
l'hydrolyse du miscanthus. Celle-ci n'avait pas été reconnue lors de
l'annotation CAZy.
Cependant, en comparant sa séquence à la base de données de l'outil NCBI
BLAST, et en
.. utilisant un serveur de prédiction de structure 3D, il est apparu que cette
protéine contient
un module présentant des similitudes avec ceux retrouvés dans la famille AA10,
suivi
d'une extension C-terminale prédite comme région désordonnée. Après
vérification en
utilisant les outils CAZy, il a alors été établi que cette protéine
n'appartient pas à la famille
AA10, mais à une famille encore non caractérisée nommée X273 (référencement
interne à
CAZy).
De manière surprenante, il a été montré que cette famille d'enzymes présente
un comportement de type polysaccharide oxydase (LPMO), lequel se matérialise
notamment par la présence d'un ion cuivre au sein de son centre actif et la
production
d'H202 en présence d'un donneur d'électrons tels que l'acide ascorbique.
Il a aussi été montré que cette famille enzymatique présente, en présence de
cellulases, une activité synergique sur la cellulose et tout particulièrement
sur les
nano fibrilles de celluloses (NCF).
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les inventeurs sont d'avis
que
la famille X273 (aussi mentionnée dans la description comme polypeptide à
activité
.. polysaccharide oxydase selon l'invention), présente dans les génomes
fongiques, est
caractérisée par un module catalytique appartenant à une nouvelle famille de
LPMO.
Selon l'invention, cette nouvelle famille de LPM0s est donc caractérisée par
un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence
présentant une
identité d'acides aminés d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N 2 (provenant de
Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
En particulier, selon l'invention, cette nouvelle famille de LPM0s est
caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant
une
séquence présentant une identité d'acides aminés d'au moins 40% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou
SEQ ID
N 2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de
comparaison
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 11 PCT/EP2019/067771
BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18
ou
moins.
En particulier, selon l'invention, cette nouvelle famille de LPM0s est
caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant
une
séquence présentant une identité d'acides aminés d'au moins 50% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou
SEQ ID
N 2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de
comparaison
BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18
ou
moins.
En particulier, selon l'invention, cette nouvelle famille de LPM0s est
caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant
une
séquence présentant une identité d'acides aminés d'au moins 60% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou
SEQ ID
N 2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de
comparaison
BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18
ou
moins.
En particulier, selon l'invention, cette nouvelle famille de LPM0s est
caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant
une
séquence présentant une identité d'acides aminés d'au moins 70% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou
SEQ ID
N 2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de
comparaison
BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18
ou
moins.
En particulier, selon l'invention, cette nouvelle famille de LPM0s est
caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant
une
séquence présentant une identité d'acides aminés d'au moins 80% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou
SEQ ID
N 2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de
comparaison
BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18
ou
moins.
En particulier, selon l'invention, cette nouvelle famille de LPM0s est
caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant
une
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 12 PCT/EP2019/067771
séquence présentant une identité d'acides aminés d'au moins 90% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou
SEQ ID
N 2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de
comparaison
BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18
ou
moins.
Les deux séquences références SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2 correspondent
chacune à la forme entière du polypeptide, incluant (i) un peptide signal en
position N-
terminale, tel que prédit par le logiciel SignalP 4.1, (ii) le module
catalytique incluant une
le" histidine en N-terminal, et (iii) une extension C-terminale.
Le module catalytique est responsable de l'activité polysaccharide-oxydase, et
est caractérisé par la présence d'un centre actif de type Histidine brace
également
retrouvé dans les enzymes de type LPMO connues, et capable de fixer le cuivre.
Les polypeptides à activité polysaccharide oxydase selon l'invention sont en
particulier caractérisés par la présence d'un site actif formé par deux
résidus Histidine
conservés, l'un des deux résidus Histidine étant généralement à l'extrémité N-
terminale du
module catalytique.
A ce titre, la présence du peptide signal et de l'extension C-terminale sont
optionnelles pour l'obtention d'une activité polysaccharide oxydase.
Pour référence, les séquences SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4 correspondent
respectivement aux peptides signal des séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2.
Pour référence, les séquences SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6 correspondent
respectivement aux modules catalytiques des séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N
2.
Pour référence, les deux séquences de référence SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2
partagent entre elles 45% d'identité de séquence, avec une E-value de 2e-53.
Pour référence, les deux séquences de référence SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6
partagent entre elles 45% d'identité de séquence, avec une E-value de 6e-52.
En particulier, 379 séquences polypeptidiques, toutes d'origine fongique ont
été identifiées (recherche réalisée en mai 2018 sur la base de données nr de
l'outil NCBI
BLAST-P): soit 335 séquences provenant d'ascomycètes, 41 séquences provenant
de
basidiomycètes et 3 de champignons non classifiés (répertoriées SEQ ID N 7 à
383).
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 13 PCT/EP2019/067771
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l'invention concerne un
polypeptide
isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une
séquence
polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N 5 à SEQ ID N 382 et SEQ ID
N 383.
Selon un mode de réalisation, un polypeptide isolé à activité polysaccharide-
oxydase selon l'invention est apte à se lier à la ceullose, et/ou comprend un
module de
liaison à la cellulose.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un polypeptide isolé à
activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence
polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N 2, 34, 40, 50, 51, 60, 61,
82, 84, 86,
87, 89, 93, 97, 103, 110, 121, 146, 156, 166, 174, 179, 181, 185, 188, 189,
207, 210, 220,
227, 233, 239, 266, 270, 273, 285, 287, 291, 297, 300, 310, 319, 326.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un polypeptide isolé à
activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence
.. polypeptidique ayant au moins 20% d'identité avec une séquence référence
choisie parmi
SEQ ID N 2, 34, 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86, 87, 89, 93, 97, 103, 110, 121,
146, 156,
166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207, 210, 220, 227, 233, 239, 266, 270,
273, 285, 287,
291, 297, 300, 310, 319, 326.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un polypeptide isolé à
activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence
polypeptidique ayant au moins 40% d'identité avec une séquence référence
choisie parmi
SEQ ID N 2, 34, 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86, 87, 89, 93, 97, 103, 110, 121,
146, 156,
166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207, 210, 220, 227, 233, 239, 266, 270,
273, 285, 287,
291, 297, 300, 310, 319, 326.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un polypeptide isolé à
activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence
polypeptidique ayant au moins 80% d'identité avec une séquence référence
choisie parmi
SEQ ID N 2, 34, 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86, 87, 89, 93, 97, 103, 110, 121,
146, 156,
166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207, 210, 220, 227, 233, 239, 266, 270,
273, 285, 287,
.. 291, 297, 300, 310, 319, 326.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un polypeptide isolé à
activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 14 PCT/EP2019/067771
polypeptidique ayant au moins 90% d'identité avec une séquence référence
choisie parmi
SEQ ID N 2, 34, 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86, 87, 89, 93, 97, 103, 110, 121,
146, 156,
166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207, 210, 220, 227, 233, 239, 266, 270,
273, 285, 287,
291, 297, 300, 310, 319, 326.
Des modes de réalisation particuliers, mettant en oeuvre un polypeptide à
activité polysaccharide oxydase selon l'invention, sont développés ci-après.
Definitions générales
De manière générale, et tout au long du présent texte, les termes de type
"comprendre" ou "inclure", ainsi que leurs variations, sont susceptibles
d'englober
d'autres éléments que ceux explicitement mentionnés. Ces termes peuvent, le
cas échéant,
être remplacés par "consister en". Les articles "un" et "une" incluent
également "plus
d'un" ou "plus d'une", ce qui inclut "une pluralité", ou encore "deux ou
plus".
Par méthode BLAST-P (appelée aussi Protein Basic Local Alignement
Search Tool method), on entend une méthode d'analyse bien connue pour l'homme
du
métier. La méthode BLAST-P a notamment été décrite dans Altschul et al. (1990,
J Mol
Biol, Vol. 215 (n 3) :403-410), Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. Vol.
25:3389-
3402) et Altschul et al. (2005, FEBS J. Vol. 272:5101-5109). La méthode BLAST-
P peut
être réalisée en utilisant l'outil de NCBI disponible en ligne (adresse
internet :
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE= Proteins). Quand la méthode
BLAST-P est
utilisée dans la présente demande, elle est utilisée de préférence selon les
paramètres
suivants: (i) Expected threshold : 10; (ii) Word Size : 6; (iii) Max Matches
in a Query
range : 0; (iv) Matrix : BLOSSUM62; (v) Gap costs : Existence 11, Extension 1;
(vi)
Compositional Adjustments : Conditional compositional score matrix adjustment,
(vii) No
filter; (viii) No mask.
Comme cela est bien connu, le score d'un alignement, S, est calculé comme la
somme des scores de substitution et de gap. Les scores de substitution sont
donnés dans
une table (voir PAM, BLOSUM ci-dessous). Les scores de gap sont généralement
calculés
comme la somme des G, la pénalité d'ouverture d'un gap et L, la pénalité
d'extension d'un
gap. Pour un gap d'une longueur n, le coût d'un gap serait de G+Ln. Le choix
des coûts
des gaps, G et L sont empiriques, mais il est habituel de choisir une valeur
élevée pour G
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 15 PCT/EP2019/067771
(10-15) et une faible valeur pour L (1-2). Un alignement optimal signifie
l'alignement de
deux séquences avec le score le plus haut possible.
Dans le cadre de la présente invention, le pourcentage d'identité entre deux
polypeptides signifie que le pourcentage d'acides aminés identiques entre les
deux
séquences polypeptidiques à comparer, obtenu après un alignement optimal, ce
pourcentage étant entièrement statistique et les différences entre les deux
séquences
polypeptidiques étant distribués aléatoirement sur leur longueur. La
comparaison de deux
séquences polypeptidiques est traditionnellement réalisée en comparant les
séquences
après les avoir alignées de façon optimale, la dite comparaison doit pouvoir
être conduite
par segment ou en utilisant une fenêtre d'alignement . L'alignement optimal
des
séquences pour leur comparaison est réalisé en utilisant le software de
comparaison
BLAST-P.
Dans son principe, le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides
aminés est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon
optimale au sein
desquelles les séquences d'acides nucléiques à comparer peuvent contenir des
additions ou
délétions par rapport à la séquence de référence de l'alignement optimal entre
les deux
séquences polypeptidiques. Le pourcentage d'identité est calculé en
déterminant le nombre
de positions dans lesquelles un acide aminé est identique entre les deux
séquences, de
préférence entre deux séquences complètes, puis en divisant ce nombre de
positions
identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre d'alignement et en
multipliant le
résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité entre les deux
séquences.
Comme il est entendu dans la présente demande, des séquences
polypeptidiques ayant au moins 20% d'identité en acides aminés avec une
séquence de
référence comprennent celles qui ont au moins 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%,
27%,
28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%,
43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,
28%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%,
73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,
88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% et 99% d'identité en
acides
aminés avec ladite séquence de référence.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 16 PCT/EP2019/067771
En particulier, on entend par séquence polypeptidique ayant au moins 20%
d'identité , les séquences comprenant au moins 40% d'identité, tout
particulièrement au
moins 80% d'identité, et préférentiellement au moins 90% d'identité avec une
séquence
référence ; telle que SEQ ID N 1 ou 2.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l'invention concerne un
polypeptide
isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une
séquence
polypeptidique de référence présentant au moins 40% d'identité avec une
séquence de
référence SEQ ID N 5 à SEQ ID N 383.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l'invention concerne un
polypeptide
isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une
séquence
polypeptidique de référence présentant au moins 50% d'identité avec une
séquence de
référence SEQ ID N 5 à SEQ ID N 383.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l'invention concerne un
polypeptide
isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une
séquence
polypeptidique de référence présentant au moins 60% d'identité avec une
séquence de
référence SEQ ID N 5 à SEQ ID N 383.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l'invention concerne un
polypeptide
isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une
séquence
polypeptidique de référence présentant au moins 70% d'identité avec une
séquence de
référence SEQ ID N 5 à SEQ ID N 383.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l'invention concerne un
polypeptide
isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une
séquence
polypeptidique de référence présentant au moins 80% d'identité avec une
séquence de
référence SEQ ID N 5 à SEQ ID N 383.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l'invention concerne un
polypeptide
isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une
séquence
polypeptidique de référence présentant au moins 90% d'identité avec une
séquence de
référence SEQ ID N 5 à SEQ ID N 383.
De manière similaire, le pourcentage d'identité entre deux séquences
d'acides nucléiques représente le pourcentage de résidus nucléotidique
identiques entre les
deux séquences d'acides nucléiques à comparer, obtenus après un alignement
optimal, ce
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 17 PCT/EP2019/067771
pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux
séquences étant
distribuées de façon aléatoire sur la longueur des séquences. La comparaison
de deux
séquences d'acides nucléiques est traditionnellement réalisée en comparant les
séquences
après les avoir alignées de façon optimale, la dite comparaison pouvant être
conduite par
segment ou en utilisant une fenêtre d'alignement . L'alignement optimal des
séquences
en vue de leur comparaison est réalisé en utilisant le software de comparaison
BLAST-N.
En principe, le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides
nucléiques est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon
optimale dans
lesquelles les séquences d'acides nucléiques à comparer peuvent contenir des
additions ou
.. des délétions par rapport à la séquence de référence de l'alignement
optimal entre les deux
séquences Le pourcentage d'identité est calculé selon le nombre de positions
auxquels les
résidus nucléotidiques sont identiques entre les deux séquences, de préférence
entre les
deux séquences complètes, puis en divisant ce nombre de positions identiques
par le
nombre total de positions dans la fenêtre d'alignement et en multipliant le
résultat par 100
afin d'obtenir le pourcentage d'identité entre les deux séquences.
Comme il est entendu ici, les séquences nucléotidiques ayant au moins 20%
d'identité avec la séquence de référence incluent celles ayant au moins least
21%, 22%,
23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%,
38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%,
53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 28%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%,
68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%,
83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98% et 99% d'identité en nucléotides avec la séquence de référence.
En particulier, on entend par séquence nucléotidique ayant au moins 20%
d'identité , les séquences comprenant au moins 40% d'identité, tout
particulièrement au
moins 80% d'identité, et préférentiellement au moins 90% d'identité avec une
séquence
référence ; telle que SEQ ID N 1 ou 2.
Les matrices BLOSUM (Blocks Substitution Matrix) sont des matrices de
score de substitution dans lesquelles les scores pour chaque position sont
dérivés de
l'observation de la fréquence de substitution des blocks dans des alignements
locaux pour
des protéines apparentées. Chaque matrice est dessinée pour une distance
d'évolution
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 18 PCT/EP2019/067771
particulière. Dans la matrice BLOSUM62, par exemple, l'alignement à partir
duquel les
scores ont été dérivés a été créé à partir de séquences ne partageant pas plus
de 62%
d'identité. Les séquences qui possèdent plus de 62% d'identité sont
représentées par une
séquence unique dans l'alignement afin de ne pas surreprésenter des membres
proches
d'une même famille.
Comme utilisé ici, une E-valeur (aussi appelé Expect Value ou e-value) est un
paramètre calculé quand la méthode BLAST-P est utilisée, le dit paramètre
représentant le
nombre d'alignements différents avec des scores équivalents ou avec meilleur
que S dont
l'apparition est attendue lors d'une recherche dans la base de données par
hasard. Ainsi,
plus la E-valeur (ou E-value ) sera basse, et plus le score et l'alignement
seront
significatifs.
Ainsi, une e-value de 1e-'8 ou moins englobe les e-values de le' ou moins, 1e
25 ou moins, le' ou moins, le' ou moins, 1 e-5 ou moins, 1 e-6 ou moins, 1
e" ou
moins, 1 e" ou moins, 1 e-9 ou moins et 1 e-m ou moins.
Par substrat cellulosique ou substrat lignocellulosique , on entend en
toute matière de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine
végétale, algues
incluses, animale ou fongique) et contenant de la cellulose, notamment sous
forme de
fibres cellulosiques (c.à.d. des fibres de cellulose).
Par biomasse lignocellulosique , on entend toute biomasse susceptible
d'être
mise en oeuvre en tant que substrat lignocellulosique. La biomasse
lignocellulosique peut
notamment être classée en fonction de son origine :
- résidus agricoles produits lors de la culture de différentes plantes
destinées à
l'alimentation ;
- déchets forestiers de bois dur ou de bois tendre, issus de l'industrie du
bois ou des
pâtes et papiers ;
- plantes énergétiques issues de cultures dédiées (i.e. herbes vivaces et
taillis à courte
rotation) ;
- déchets solides municipaux et industriels.
Par exemple, un substrat lignocellulosique peut être obtenu à partir d'une
biomasse lignocellulosique englobant: le peuplier, le pin, le miscanthus, le
saule, le panic
érigé (ou switchgrass ), le maïs, la canne à sucre, le blé, le riz,
l'avoine, l'orge, la
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 19 PCT/EP2019/067771
betterave, l'olivier, la vigne, le coton, l'eucalyptus, les arbres fruitiers.
Le substrat cellulosique est obtenu avantageusement à partir de bois (dont la
cellulose est le composant principal), mais aussi de tout végétal fibreux
riche en cellulose,
comme par exemple, le coton, le lin, le chanvre, le bambou, le kapok, les
fibre de noix de
coco (coir), la ramie, la jute, le sisal, le raphia, le papyrus et certains
roseaux, la bagasse de
canne à sucre, la betterave (et notamment la pulpe de betterave), les agrumes,
les tiges de
maïs ou de sorgho, ou encore les plantes annuelles à paille.
Les substrats cellulosiques peuvent également être obtenus à partir d'animaux
marins (comme le tunicier par exemple), d'algues (comme par exemple Valonia ou
Cladophora) ou de bactéries pour la cellulose bactérienne (comme par exemple
les souches
bactériennes de type Gluconacetobacter).
On choisira, selon les applications, de la cellulose issue de parois primaires
comme le parenchyme des fruits (par exemple les betteraves, les agrumes etc.)
ou de parois
secondaires, comme le bois.
Le substrat cellulosique consiste avantageusement en un matériau cellulosique
préparé par des moyens chimiques ou mécaniques, à partir de toute source
cellulosique
telle que mentionnée ci-dessus (et notamment à partir du bois).
Le matériel contenant la lignocellulose est généralement présent, par exemple,
dans les tiges, les feuilles, le son, les enveloppes et les rachis des plantes
ou feuilles,
branches, et le bois des arbres. De manière non-limitative, le matériel
contenant la
lignocellulose peut aussi être du matériel herbacé, des restes de
l'agriculture et de la
sylviculture, des déchets municipaux solides, des déchets papier, et des
restes de broyage
de pulpe et de papier. Il faut comprendre ici que le matériel contenant la
lignocellulose
peut se trouver sous la forme de matériel de la paroi cellulaire de la plante
contenant de la
lignine, cellulose, et hémicellulose dans une matrice mixte.
Selon certains modes de réalisation particuliers, notamment ceux visant la
production de fibres de cellulose, le matériel contenant de la lignocellulose
est une
biomasse lignocellulosique choisie dans le groupe consistant en: l'herbe, le
switchgrass, la
spartine, l'ivraie, la baldingère faux-roseau, le miscanthus, les résidus de
transformation du
sucre, la bagasse de canne à sucre, les déchets agricoles, la paille de riz,
la balle de riz, la
paille d'orge, l'épi de maïs, la paille de céréales, la paille de blé, la
paille de canola, la
paille d'avoine, la coque d'avoine, la canne de maïs, la farine de soja, la
farine de maïs, les
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 20 PCT/EP2019/067771
déchets forestiers, la fibre de pâte de bois recyclée, la boue de papier, la
sciure de bois, le
bois dur, le bois résineux, l'agave et ses combinaisons. Dans un mode de
réalisation
préféré, le matériel contenant de la lignocellulose est choisi dans un groupe
comprenant : la
farine de maïs, la fibre de maïs, la paille de riz, le bois de pin, les
copeaux de bois, le
peuplier, la bagasse, le papier et les déchets de traitement de la pâte.
Par cellulose , on entend un homopolysaccharide linéaire issu de la
biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues
incluses, la
cellulose d'origine animale ainsi que la cellulose d'origine bactérienne) et
constitué
d'unités (ou cycles) de glucose (D-Anhydroglucopyranose ¨ AGU pour Anhydro
glucose
unit ) reliées entre elles par des liaisons glycosidiques 1341-4). Le motif
de répétition est
un dimère de glucose également appelé cellobiose.
Les AGU possèdent 3 fonctions hydroxyles : 2 alcools secondaires (sur les
carbones en positions 2 et 3 du cycle de glucose) et un alcool primaire (sur
le carbone en
position 6 du cycle de glucose).
Ces polymères s'associent par des liaisons intermoléculaires de type liaison
hydrogène, conférant ainsi une structure fibreuse à la cellulose. En
particulier, l'association
des chaînes formées de dimères de cellobiose forme une nano fibrille
élémentaire de
cellulose (dont le diamètre est d'environ 5 nm). L'association de
nanofibrilles élémentaires
forme une nano fibrille (dont le diamètre varie généralement de 50 à 500 nm;
ce qui inclut
50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm).
L'agencement de
plusieurs de ces nanofibrilles forme ensuite ce qui est généralement appelé
une fibre de
cellulose.
Le terme fibre de cellulose désigne l'ensemble des formes de cellulose
susceptibles d'être obtenues à l'issue d'un procédé de défibrillation, ou
délamination d'un
substrat cellulosique ; ce qui inclut les formes de cellulose ayant une
dimension de l'ordre
du nanomètre, ainsi que les formes de cellulose ayant une dimension
supérieure.
Le terme nanocelluloses désigne les différentes formes de cellulose ayant
une dimension de l'ordre du nanomètre. Ce terme englobe en particulier selon
l'invention,
deux familles de nanocelluloses : les nanocristaux de cellulose et les
fibrilles de cellulose.
Les termes fibrilles de cellulose , nanofibrilles (de cellulose) ,
nanofibres (de cellulose) , cellulose nanofibrillée , microfibrilles (de
cellulose) ,
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 21 PCT/EP2019/067771
cellulose microfibrillée , microfibrillated cellulose , cellulose
nanofibrils sont
synonymes.
Chaque nano fibrille de cellulose contient des parties cristallines
stabilisées par
un solide réseau de liaisons hydrogènes inter- et intra-chaines. Ces régions
cristallines sont
séparées par des régions amorphes.
L'élimination des parties amorphes des nanofibrilles de cellulose, permet
d'obtenir des nanocristaux de cellulose (NCCs).
Les NCCs comportent avantageusement au moins 50% de partie cristalline, de
préférence encore au moins 55% de partie cristalline. Ils ont généralement un
diamètre
allant de 5 à 70 nm (de préférence inférieur à 15 nm) et une longueur allant
de 40 nm à
environ 1 ium, de préférence allant de 40 nm à 500 nm; ce qui inclut 50, 60,
70, 80, 90,
100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm.
Les termes nanocristaux de cellulose , cellulose nanocristalline ,
cellulose whiskers , microcristaux ou cellulose nanocrystal sont
synonymes.
Dans la suite de la présente demande, le terme nanocristaux de cellulose
(NCCs) sera
utilisé de manière générique.
Comme utilisé ici, un matériel contenant des polysaccharides englobe une
substance ou une composition comprenant des polysaccharides.
Le terme polysaccharide est utilisé dans son sens conventionnel et désigne
des carbohydrates polymériques composés de longues chaines de monosaccharides
maintenus ensemble par des liaisons glycosidiques. Lors de leur hydrolyse, les
polysaccharides libèrent les monosaccharides ou oligosaccharides solubles les
constituant.
Les polysaccharides qui sont préférentiellement considérés sont les
polysaccharides dérivés de plantes, et tout particulièrement la cellulose,
telle que celle
retrouvée dans la lignocellulose.
Ce terme englobe ainsi tout matériel (ou substrat ou biomasse) comprenant au
moins un (ou une pluralité de) polysaccharide(s) choisis parmi : la cellulose,
l'hémicellulose et la pectine; ce qui inclut notamment les substrats
polysaccharidiques
comprenant au moins 30 % en poids de cellulose et d'hémicellulose.
Le terme matériel contenant de la lignocellulose utilisé ici fait référence
à
un matériel constitué principalement de cellulose, d'hémicellulose et de
lignine. Ce terme
est synonyme de matériel lignocellulosique . Un tel matériel est aussi
référencé comme
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 22 PCT/EP2019/067771
biomasse . Selon cette définition, un matériel contenant de la lignocellulose
est un
exemple de substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose.
Ce terme englobe ainsi tout matériel (ou substrat ou biomasse)
lignocellulosique contenant au moins 30 % en poids (wt), de préférence au
moins 50% en
poids, de préférence au moins 70% en poids, de préférence au moins 90% en
poids de
lignocellulose. A cet égard, un matériel lignocellulosique est susceptible de
comprendre
d'autres composés tels que des polypeptides et sucres, ce qui inclut des
sucres fermentables
et/ou non-fermentables.
Ainsi, un matériel contenant de la lignocellulose particulièrement considéré
selon l'invention peut être choisi parmi le pin, le peuplier, la paille et le
miscanthus.
Comme utilisé dans la présente demande, une enzyme oxydant les
polysaccharides ou un polypeptide à activité polysaccharide oxydase
englobent les
polypeptides avec les propriétés suivantes :
- le dit polypeptide produit du peroxyde d'hydrogène en présence d'oxygène
et d'un
composé donneur d'électrons, tel que les ascorbates,
- le dit polypeptide augmente de manière dose dépendante, en l'absence ou
en présence
d'un composé donneur d'électrons, la dégradation d'un matériel contenant des
polysaccharides tel que la lignocellulose, causée par des cellulases et/ou des
hémicellulases
telles que, par exemple, les xylanases,
- le dit polypeptide augmente de manière dose dépendante, en l'absence ou en
présence
d'un composé donneur d'électrons, la dégradation d'un matériel contenant des
polysaccharides tel que la lignocellulose, causé par des cellulases.
Le terme composé donneur d'électron est utilisé ici dans son sens habituel
pour un homme du métier. Ainsi, un composé donneur d'électron est une entité
chimique
capable de donner des électrons à un autre composé. Un composé donneur
d'électron est
un agent réducteur grâce à sa capacité à donner des électrons et est lui-même
oxydé quand
il donne des électrons à une autre entité chimique. Un composé donneur
d'électrons
comme spécifié plus haut pour les propriétés d'oxydation des polysaccharides,
englobe, de
manière non exhaustive, des ascorbates et des cellobiose déshydrogénases
(CDH). En
l'absence d'un réducteur, tel que l'ascorbate, l'agent réducteur peut de façon
avantageuse
être fourni par la biomasse (la lignine) qui peut agir en tant que donneur
d'électron.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 23 PCT/EP2019/067771
Le terme "LPMO", ou "Lytic Polysaccharide Monooxygenase", désigne dans
son sens le plus large, et sauf indication contraire, l'ensemble des familles
répertoriées
dans la base de données CAZy (Carbohydrate Active enzymes, Lombard et al.,
2014) et
aptes à oxyder des polysaccharides. Ce terme inclut donc en particulier
l'ensemble des
polypeptides à activité polysaccharide oxydase appartenant aux familles AA9,
AA10,
AA11, AA13, AA14 et AA15. Ce terme inclut aussi les LPMO de type I (capables
d'oxyder les liaisons glycosidiques sur le carbone Cl), de type II (capables
d'oxyder les
liaisons glycosidiques sur le carbone C4) et de type III (capables d'oxyder
les liaisons
glycosidiques à la fois en Cl et en C4).
Le terme enzyme dégradant les polysaccharides ou un polypeptide à
activité polysaccharide dégradase englobe les polypeptides qui, outre les
polysaccharides oxydases, contribuent à la dégradation des substrats
polysaccharidiques
tels que les biomasses lignocellulosiques. Ainsi, des polypeptides à activité
polysaccharide
dégradase peuvent être choisis parmi les cellulases, hémicellulases,
ligninases et
carbohydrate oxydases.
Les cellulases englobent les endoglucanases, cellobiohydrolases et beta-
glucosidases. Les hemicellulases englobent les xylanases, mannanases,
xylosidases,
mannosidases, arabinofuranosidaes et esterases. Ainsi le terme cellulase
est susceptible
d'inclure les exo-glucanases, endo-glucanases, cellobiohydrolases, cellulose
phosphorylases, pectinases, pectate lyases, polygalacturonase, pectin
esterases, cellobiose
dehydrogenases, mannanases, arabino furano sidas es,
feruoyl esterases,
arabino furanosidases, fructofuranosidases, galactosidases, galacto sidas es,
amylases,
.. acetylxylan esterases, chitin deacetylases, chitinases, et glucosidases.
Les ligninases englobent les peroxydases, copper radical oxydases
(i.e. laccases). Les carbohydrate oxydases englobent les lytic polysaccharide
monooxygenases (LPMO) et les GMC oxydoreductases (i.e. glucose dehydrogenases,
cellobiose dehydrogenases).
Le terme "traitement chimique" fait référence à tous les prétraitements
chimiques qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose,
hémicellulose
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 24 PCT/EP2019/067771
et/ou lignine. Des exemples de ces prétraitements chimiques adéquats incluent,
par
exemple des acides dilués, de la chaux, des bases, des solvants organiques, de
l'ammoniaque, du dioxyde de soufre, du dioxyde de carbone. De plus l'oxydation
humide
et l'hydrothermolyse à pH contrôlé sont aussi considérées comme des
prétraitements
chimiques. Les méthodes de prétraitements utilisant de l'ammoniaque sont
notamment
décrites dans les demandes PCT WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900,
et WO 2006/110901.
D'autres exemples de prétraitement adéquat sont décrits par Schell et al.,
2003,
Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108: 69-85, et Mosier et al., 2005,
Bioresource
Technology 96: 673-686, et U.S. Publication No. 2002/0164730.
Le terme prétraitement mécanique fait référence à tous les traitements
mécaniques (ou physiques) qui permettent la séparation et/ou la libération de
la cellulose,
de l'hémicellulose et/ou de la lignine à partir d'un matériel contenant de la
lignocellulose.
Par exemple, les prétraitements mécaniques incluent différents types de
broyage,
irradiation, explosion à la vapeur et l'hydrothermolyse. Le prétraitement
mécanique inclut
la fragmentation d'un solide (comminution ou réduction mécanique de la
taille). La
fragmentation d'un solide inclut les techniques de broyages en milieu sec, de
broyage en
milieu humide et de broyage par balles vibrantes. Le prétraitement mécanique
peut aussi
inclure des fortes pressions et/ou des températures élevées (explosion à la
vapeur). Dans
certaines représentations de l'étape de prétraitement, la dite étape peut
combiner un
prétraitement mécanique et chimique.
Comme il a été utilisé dans la présente invention, le terme prétraitement
biologique fait référence à tous les traitements biologiques qui permettent
la séparation
et/ou la libération de la cellulose, hémicellulose et/ou lignine à partir d'un
matériel
contenant de la lignocellulose. Les prétraitements biologiques peuvent
impliquer
l'application de microorganismes capables de solubiliser la lignine (voir, par
exemple,
Hsu, 1996, Pretreatment of biomass, dans le Handbook on Bioethanol: Production
and
Utilization, Wyman, ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh et
Singh,
1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial
conversion of
lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, 1994,
Pretreating
lignocellulosic biomass: une revue, dans Enzymatic Conversion of Biomass for
Fuels
Production, Himmel, Baker, and Overend, eds., ACS Symposium Series 566,
American
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 25 PCT/EP2019/067771
Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, Cao, Du, et Tsao, 1999,
Ethanol
production from renewable resources, dans Advances in Biochemical
Engineering/Biotechnology, Scheper, ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg,
Germany,
65: 207-241 ; Olsson et Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic
hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331 ; et
Vallander et
Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of
the art, Adv.
Biochem. Eng J Biotechnol. 42: 63-95).
Polypeptides et compositions à activité polysaccharide-oxydase
Selon un mode de réalisation principal, l'invention concerne un polypeptide
isolé à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant
une identité
d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence
SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N 2 (provenant de
Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
En particulier, l'invention concerne un polypeptide isolé à activité
polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il
comprend une
séquence présentant une identité d'acide aminé d'au moins 40% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, la dite méthode de
comparaison
BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Par exemple, un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon
l'invention peut être caractérisé en ce qu'il comprend une séquence présentant
une identité
d'acide aminé d'au moins 45% avec une séquence polypeptidique de référence
SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-
value de 1e-18 ou moins.
En particulier, l'invention concerne un polypeptide isolé à activité
polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il
comprend une
séquence présentant une identité d'acide aminé d'au moins 60% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, la dite méthode de
comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
En particulier, l'invention concerne un polypeptide isolé à activité
polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il
comprend une
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 26 PCT/EP2019/067771
séquence présentant une identité d'acide aminé d'au moins 80% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, la dite méthode de
comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
En particulier, l'invention concerne un polypeptide isolé à activité
polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il
comprend une
séquence présentant une identité d'acide aminé d'au moins 90% avec une
séquence
polypeptidique de référence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, la dite méthode de
comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon certains modes de réalisation, l'invention concerne un des dits
polypeptides isolés à activité polysaccharide oxydase, tels que définis ci-
dessus, caractérisé
en ce qu'il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant une
identité
d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence choisie parmi SEQ ID N 5 à
SEQ ID N 383, ce qui inclut SEQ ID N 7 à 382 et SEQ ID N 383.
Selon certains modes de réalisation, l'invention concerne un des dits
polypeptides isolés à activité polysaccharide oxydase, tels que définis ci-
dessus, caractérisé
en ce qu'il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant une
identité
d'acide aminé d'au moins 80% avec une séquence choisie parmi SEQ ID N 5 à
SEQ ID N 383, ce qui inclut SEQ ID N 7 à 382 et SEQ ID N 383.
Selon certains modes de réalisation, l'invention concerne un des dits
.. polypeptides isolés à activité polysaccharide oxydase, tels que définis ci-
dessus, caractérisé
en ce qu'il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant une
identité
d'acide aminé d'au moins 90% avec une séquence choisie parmi SEQ ID N 5 à
SEQ ID N 383, ce qui inclut SEQ ID N 7 à 382 et SEQ ID N 383.
Par exemple, l'invention concerne un polypeptide isolé à activité
.. polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il
comprend une
séquence polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N 5 à SEQ ID N 382
et
SEQ ID N 383.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un polypeptide
isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé
en ce qu'il
comprend une séquence présentant une identité d'acide aminé d'au moins 20%
avec une
séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6, la dite méthode
de
comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 27 PCT/EP2019/067771
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un polypeptide
isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé
en ce qu'il
comprend une séquence présentant une identité d'acide aminé d'au moins 40%
avec une
séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6, la dite méthode
de
comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Par exemple, un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon
l'invention peut être caractérisé en ce qu'il comprend une séquence présentant
une identité
d'acide aminé d'au moins 45% avec une séquence polypeptidique de référence
SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-
value de 1e-18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un polypeptide
isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé
en ce qu'il
comprend une séquence présentant une identité d'acide aminé d'au moins 60%
avec une
séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6, la dite méthode
de
comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un polypeptide
isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé
en ce qu'il
comprend une séquence présentant une identité d'acide aminé d'au moins 80%
avec une
séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6, la dite méthode
de
comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un polypeptide
isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé
en ce qu'il
comprend une séquence présentant une identité d'acide aminé d'au moins 90%
avec une
séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6, la dite méthode
de
comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon un mode de réalisation alternatif, l'invention concerne une composition
à
activité polysaccharide-oxydase, caractérisée en ce qu'elle comprend un
polypeptide à
activité polysaccharide oxydase tel que défini ci-dessus.
En particulier, l'invention concerne une composition à activité polysaccharide-
oxydase telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend en
outre au moins
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 28 PCT/EP2019/067771
un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase choisi parmi : une
cellulase, une
hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase.
A titre non exhaustif, la dite composition à activité polysaccharide-oxydase
peut être caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à partir
d'un ou plusieurs
organismes choisis parmi : Agaricus bisporus, Alternaria alternata, Amanita
thiersii,
Armillaria ostoyae, Armillaria solidipes, Ascochyta rabiei, Aspergillus
arachidicola,
Aspergillus bombycis, Aspergillus brasiliensis, Aspergillus campestris,
Aspergillus
candidus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus clavatus, Aspergillus
cristatus, Aspergillus
fischeri, Aspergillus fiavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus,
Aspergillus
kawachii, Aspergillus lentulus, Aspergillus luchuensis, Aspergillus nidulans,
Aspergillus
niger, Aspergillus nomius, Aspergillus novofumigatus, Aspergillus
ochraceoroseus,
Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ruber, Aspergillus
steynii,
Aspergillus sydowii, Aspergillus taichungensis, Aspergillus terreus,
Aspergillus
thermomutatus, Aspergillus tubingensis, Aspergillus turcosus, Aspergillus
udagawae,
Aspergillus versicolor, Aspergillus wentii, Aureobasidium melanogenum,
Aureobasidium
namibiae, Aureobasidium pullulans, Aureobasidium subglaciale, Auricularia
subglabra,
Bipolaris maydis, Bipolaris oryzae, Bipolaris sorokiniana, Bipolaris
victoriae, Bipolaris
zeicola, Botryobasidium botryosum, Botrytis cinerea, Ceratocystis fimbriata,
Ceratocystis
platani, Cercospora berteroae, Cercospora beticola, Cercospora zeina,
Chaetomium
globosum, Chaetomium globosum, Clohesyomyces aquaticus, Colletotrichum
chlorophyti,
Colletotrichum fioriniae, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum
graminicola,
Colletotrichum higginsianum, Colletotrichum incanum, Colletotrichum nymphaeae,
Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum orchidophilum, Colletotrichum
salicis,
Colletotrichum simmondsii, Colletotrichum sublineola, Colletotrichum
tofieldiae, Coniella
lustricola, Coniochaeta ligniaria, Corynespora cassiicola, Cylindrobasidium
torrendii,
Daldinia sp., Diaporthe ampelina, Diaporthe helianthi, Diplocarpon rosae,
Diplodia
corticola, Diplodia seriata, Dothistroma septosporum, Elsinoe, Elsinoe
australis,
Emergomyces pasteuriana, Epicoccum nigrum, Eutypa tata, Exidia glandulosa,
Fungi,
Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Fusarium fujikuroi, Fusarium
graminearum,
Fusarium langsethiae, Fusarium mangiferae, Fusarium nygamai, Fusarium
oxysporum,
Fusarium poae, Fusarium proliferatum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium
venenatum, Fusarium verticillioides, Gaeumannomyces tritici, Glarea
lozoyensis, Glonium
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 29 PCT/EP2019/067771
stellatum, Grosmannia clavigera, Helicocarpus griseus, Heterobasidion
irregulare,
Hirsutella minnesotensis, Histoplasma capsulatum, Hortaea werneckii,
Hydnomerulius
pinastri, Hypoxylon sp., Jaapia argillacea, Leptosphaeria maculans,
Leucoagaricus,
Lomentospora prolificans, Magnaporthe oryzae, Magnaporthiopsis poae,
Marssonina
brunnea, Marssonina coronariae, Meliniomyces bicolor, Meliniomyces variabilis,
Microdochium bolleyi, Moniliophthora roreri, Mycosphaerella eumusae,
Neofusicoccum
parvum, Neonectria ditissima, Ophiocordyceps australis, Ophiocordyceps
camponoti-
rufipedis, Ophiocordyceps unilateralis, Panaeolus cyanescens,
Paraphaeosphaeria
sporulosa, Parastagonospora nodorum, Penicilliopsis zonata, Penicillium
arizonense,
Penicillium brasilianum, Penicillium camemberti, Penicillium coprophilum,
Penicillium
digitatum, Penicillium expansum, Penicillium fiavigenum, Penicillium freii,
Penicillium
griseofulvum, Penicillium italicum, Penicillium nordicum,Penicillium oxalicum,
Penicillium polonicum,Penicillium roqueforti, Penicillium rubens, Penicillium
solitum,
Penicillium subrubescens, Penicillium vulpinum, Peniophora, Pestalotiopsis
fici,Phellinus
noxius, Phialocep hala, scopiformis, Phialocep hala,
subalpina, Pleurotus
ostreatus,Plicaturopsis crispa, Pseudogymnoascus verrucosus,Pseudomassariella
vexata,Punctularia strigosozonata, Pyrenochaeta,Pyrenophora teres,Pyrenophora
tritici-
repentis, Rhizoctonia solani, Rhynchosporium commune, Rosellinia necatrix,
Rutstroemia,
Scedosporium apiospermum, Schizophyllum commune, Sclerotinia borealis,
Sclerotinia
sclerotiorum,Serpula lacrymans,Setosphaeria turcica,Sordaria
macrospora,Sphaerulina
musiva,Sporothrix brasiliensis,Sporothrix insectorum,Sporothrix
schenckii,Stachybotrys
chartarum, Stachybotrys chlorohalonata, Stagonospora, Stemphylium lycopersici,
Thermothelomyces thermophila, Thielavia terrestris, Thielaviopsis punctulata,
Valsa mali,
Verruconis gallopava,Verticillium alfalfae,Verticillium dahliae,Verticillium
longisporum.
En particulier, la dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut
être
caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à partir d'un ou
plusieurs
organismes de type bactérie, champignon (par exemples champignons filamenteux)
ou
levure, choisis parmi les genres : Escherichia, Lactococcus, Bacillus,
Streptomyces,
Pseudomonas, Phanerochaete, Achlya, Acremonium, Aspergillus, Cephalosporium,
Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium, Gliocladium, Humicola,
Hypocrea,
Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Pyricularia, Thielavia,
Tolypocladium,
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 30 PCT/EP2019/067771
Trichoderma, Podospora, Pycnoporus, Fusarium, Thermonospora; tout
particulièrement
Aspergillus ou Trichoderma ou Podospora; préférentiellement Aspergillus ou
Podospora.
En particulier, la dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut
être
caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à partir d'un ou
plusieurs
organismes de type champignon ou levure, choisis parmi les genres : Achlya,
Acremonium,
Aspergillus, Cep halosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium,
Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora,
Penicillium,
Pyricularia, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Podospora, Pycnoporus,
Fusarium,
Thermonospora; tout particulièrement Aspergillus ou Trichoderma ou Podospora;
préférentiellement Aspergillus ou Podospora.
Selon un mode de réalisation, la dite composition à activité polysaccharide-
oxydase peut être caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à
partir de
Aspergillus japonicus.
Un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention peut
également être obtenu de façon recombinante.
Ainsi, une composition à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention
peut être caractérisée en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-
oxydase est
obtenu de façon recombinante.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharide-
oxydase selon l'invention comprend seulement un polypeptide (ou enzyme ) à
activité
polysaccharide-oxydase selon l'invention, soit un polypeptide ayant une
séquence
présentant une identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence
polypeptidique
de référence SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N 2
(provenant
de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharide-
oxydase selon l'invention comprend une pluralité de polypeptides à activité
polysaccharide-oxydase selon l'invention, soit plus d'un polypeptide ayant une
séquence
présentant une identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence
polypeptidique
de référence SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N 2
(provenant
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 31 PCT/EP2019/067771
de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon certains de ces modes de réalisation, une composition à activité
polysaccharide-oxydase selon l'invention comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9 ou 10
polypeptides à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharide-
oxydase selon l'invention comprend en outre au moins un autre polypeptide à
activité
polysaccharide oxydase ; en particulier choisi(s) parmi les lytic
polysaccharide
monooxygenases, ce qui inclut les polypeptides appartenant aux groupes de LPMO
AA9,
AA10, AA11, AA13 et AA14.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharide-
oxydase selon l'invention peut être mise en oeuvre en tant que composition
pour dégrader
un substrat polysaccharidique, tel que les biomasses lignocellulosiques.
Selon certains autres modes de réalisation, composition à activité
polysaccharide-oxydase selon l'invention peut être mise en oeuvre en tant que
composition
auxiliaire en combinaison avec un ou plusieurs polypeptides à activité
polysaccharide-
dégradase.
Aussi, selon un mode de réalisation alternatif un polypeptide à activité
polysaccharide oxydase selon l'invention peut être mis en oeuvre sous forme de
kit.
Avantageusement, un tel kit peut comprendre un polypeptide à activité
polysaccharide-oxydase ou une composition à activité polysaccharide-oxydase
selon
l'invention ; et d'autre part un polypeptide à activité polysaccharide-
dégradase ou une
composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-dégradase.
Ainsi, l'invention concerne également un kit comprenant au moins :
- une première partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-
oxydase selon l'invention, ou une composition comprenant le dit polypeptide à
activité
polysaccharide-oxydase;
- une seconde partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-
dégradase choisi parmi une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une
carbohydrate
oxydase, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité
polysaccharide-
dégradase.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 32 PCT/EP2019/067771
De tels kits peuvent, notamment, correspondre à des kits pour :
- l'obtention d'un sucre à partir d'un substrat polysaccharidique ;
- la préparation d'un produit de fermentation d'un substrat
polysaccharidique ;
- la production d'alcool à partir d'un substrat lignocellulosique ;
- la préparation d'un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres
de cellulose ;
- la défibrillation d'un substrat cellulosique ;
- la fabrication de fibres de cellulose.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un hôte apte à
exprimer de manière recombinante un polypeptide à activité polysaccharide-
oxydase selon
l'invention. Le dit hôte peut être notamment une cellule procaryote ou
eucaryote. Selon un
mode particulier de réalisation, le dit hôte est une levure ou une bactérie ou
un
champignon, par exemple un champignon filamenteux.
Selon l'invention, un hôte peut notamment être une levure choisie dans un
groupe comprenant : Saccharomyces, Kluyveromyces,
Candida, Pichia,
Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, et Yarrowia.
En particulier, les levures peuvent être choisies parmi: S. cerevisiae, S.
bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K.
marxianus, or K.
fragilis.
Selon certains modes de réalisation, la levure est choisie parmi:
Saccharomyces
cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Issatchenkia orientalis, Candida
albicans,
Candida mexicana, Pichia pastoris, Pichia mississippiensis, Pichia mexicana,
Pichia
stipitis, Pichia farinosa, Clavispora opuntiae, Clavispora lusitaniae,
Yarrowia lipolytica,
Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans,
Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe,
Hansenula polymorpha, et Schwanniomyces occidentalis.
Selon d'autres modes de réalisation un hôte peut notamment être une
bactérie choisie dans un groupe comprenant : Escherichia, Lactococcus,
Bacillus,
Streptomyces, Pseudomonas.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 33 PCT/EP2019/067771
Selon d'autres modes de réalisation un hôte peut notamment être un
champignon choisi dans un groupe comprenant : Aspergillus, Trichoderma,
Podospora,
Myceliophthora, Chrysosporium, Neurospora, Fusarium, Phanerochaete,
Penicillium.
Selon un mode de réalisation préféré, le dit hôte est une levure.
L'invention concerne également un acide nucléique isolé codant pour un
polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention.
Ainsi, un acide nucléique permettant l'expression d'un polypeptide à activité
polysaccharide-oxydase selon l'invention peut être introduit dans le génome
d'un hôte (i.e.
levure) d'intérêt, ou encore introduit en tant que vecteur non-intégré selon
des techniques
d'ingénierie génétique connues dans le domaine.
L'invention concerne également un procédé de production d'un polypeptide à
activité polysaccharide oxydase; comprenant une étape de mise en culture d'un
hôte apte à
exprimer un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention.
Aussi, l'invention concerne des vecteurs incluant un acide nucléique codant
pour un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l'invention. Les
dits vecteurs
(i.e. plasmides ou YAC) sont en particulier des vecteurs d'expression capable
de diriger
l'expression d'un gène donné, et associés à un opéron.
L'invention concerne donc également un procédé de production d'un
polypeptide à activité polysaccharide oxydase; consistant à:
(a) cultiver un hôte apte à la production d'un polypeptide à activité
polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence
présentant une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 1 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N 2 (provenant de
Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins ; et
(b) récupérer le dit polypeptide du dit hôte.
Procédés d'obtention de sucres à partir de substrats polysaccharidiques
Les polypeptides à activité polysaccharide-oxydases selon l'invention peuvent
être mis en oeuvre à la fois dans des procédés d'obtention d'un sucre à partir
d'un substrat
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 34 PCT/EP2019/067771
polysaccharidique, des procédés de fermentation et de production d'alcool à
partir d'un
substrat lignocellulosique.
Des procédés d'obtention d'éthanol à partir de substrats polysaccharidiques,
tels que les biomasses lignocellulosique, sont ainsi décrit dans Margeot et
al. ("New
improvements for lignocellulosic ethanol"; Current Opinion in Biotechnology;
20:372-380,
2009). Ainsi, un procédé complet de production d'éthanol à partir de biomasse
lignocellulosique comprend généralement quatre étapes principales:
1. un pré-traitement du substrat polysaccharidique (i.e. biomasse
lignocellulosique); pour casser la structure de la paroi lignocellulosique, en
liquéfiant
certains composants et en diminuant la cristallinité de la cellulose.
Il existe des pré-traitements physiques (mécaniques ou hydrothermaux) qui
permettent la réduction de la taille des particules et la solubilisation d'une
partie des
hémicelluloses, des pré-traitements chimiques qui utilisent des acides, bases
ou agents
oxydants pour solubiliser les hémicelluloses et retirer la lignine, et des
prétraitements
biologiques qui utilisent des espèces fongiques capables de dégrader la
lignine. Certains
pré-traitements combinent des méthodes physiques et chimiques comme par
exemple
l'explosion à la vapeur en présence d'acide dilué ou l'explosion à froid à
l'ammoniaque.
2. une hydrolyse enzymatique du dit substrat, consistant à dépolymériser la
cellulose et les hémicelluloses restantes en monomères, à l'aide d'enzymes
spécifiques.
Ces enzymes sont secrétées par une variété d'organismes cellulolytiques,
aérobies ou anaérobies, mésophiles ou thermophiles, appartenant notamment aux
genres
Clostridium, Thermomonospora, Cellulomonas, Bacteriodes ou Streptomyces pour
les
bactéries, et Phanerochaete, Trichoderma, Aspergillus ou Penicillium pour les
champignons filamenteux.
3. une fermentation du dit substrat pour obtenir le dit éthanol à partir des
sucres
(i.e. pentoses et hexoses) issus de l'étape d'hydrolyse.
Cette étape de fermentation est notamment mise en oeuvre par des
microorganismes tels que la levure Saccharomyces cerevisiae, qui est le
microorganisme le
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 35 PCT/EP2019/067771
plus utilisé dans l'industrie grâce à ses forts rendements et sa faible
sensibilité aux
inhibiteurs. Cependant, elle n'est naturellement pas capable d'utiliser les
pentoses produits
lors de l'hydrolyse enzymatique. Aussi, afin d'améliorer les rendements, des
souches
modifiées capables de fermenter des sucres tels que le xylose ou l'arabinose
ont été
développés.
4. une purification du dit éthanol, généralement en vue de son utilisation en
tant que carburant, qui doit répondre à un certain nombre de spécifications.
Cette
purification consiste donc généralement en une distillation, une rectification
et une
déshydratation.
Selon un mode de réalisation, ces étape peuvent être réalisées séparément, ou
encore simultanément. Par exemple, ces différentes étapes peuvent être
réalisées
séparément, comme c'est le cas dans un procédé noté SHF ("Separate Hydrolysis
and
Fermentation") où les enzymes et les levures peuvent être utilisés chacun dans
leurs
conditions optimales. Il est aussi possible de réaliser ces étapes
simultanément, par un
procédé que n'on nomme SSCF ("Simultaneous Saccharification and Co-
Fermentation").
Enfin, le concept de bioprocédé consolidé ("Consolidated Bioprocessing" ou
CBP)
propose d'effectuer la production de cellulases, l'hydrolyse enzymatique et la
fermentation
à l'aide d'un seul microorganisme.
Afin de rendre le bioéthanol lignocellulosique rentable, il est généralement
nécessaire d'optimiser chacune des étapes de sa production. Il est notamment
essentiel de
bien choisir le pré-traitement adapté au type de biomasse traitée, afin de
maximiser son
effet, tout en limitant la formation d'inhibiteurs et en réduisant les coûts
et la
consommation d'énergie. L'hydrolyse enzymatique est souvent considérée comme
l'étape
la plus critique et termes de rendements et de coût.
Les polypeptides à activité polyssaccharide oxydases selon l'invention sont
particulièrement avantageux dans le cadre d'une étape d'hydrolyse de substrats
polysaccharidiques.
Ainsi, selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé
d'obtention d'un sucre à partir d'un substrat polysaccharidique, comprenant au
moins une
étape de mise en contact du dit substrat avec un polypeptide à activité
polysaccharide-
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 36 PCT/EP2019/067771
oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d'acide aminé d'au
moins 20%
avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 1 (provenant de
Podospora
anserina) ou SEQ ID N 2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une
méthode
de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-
value de 1e'8 ou moins, ou d'une composition à activité polysaccharide oxydase
comprenant le dit polypeptide.
En particulier, l'invention concerne un procédé d'obtention d'un sucre à
partir
d'un substrat polysaccharidique, comprenant au moins une étape de mise en
contact du dit
substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une
séquence
présentant une identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence
polypeptidique
de référence SEQ ID N 5 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N 6
(provenant
de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e'8 ou moins, ou d'une
composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide.
Ainsi, l'invention concerne un procédé d'obtention d'un sucre à partir d'un
substrat polysaccharidique, comprenant les étapes de :
a) disposer d'un substrat polysaccharidique;
b) mettre en contact le dit substrat polysaccharidique avec un un polypeptide
à
activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une
identité d'acide
aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 1
(provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N 2 (provenant de Aspergillus
aculeatus),
en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de
comparaison
BLAST-P donnant une e-value de 1e'8 ou moins, ou d'une composition à activité
polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide ;
c) collecter le dit sucre obtenu à l'issue de l'étape b).
En particulier, l'invention concerne un procédé d'obtention d'un sucre à
partir
d'un substrat polysaccharidique, comprenant les étapes de :
a) disposer d'un substrat polysaccharidique;
b) mettre en contact le dit substrat polysaccharidique avec un un polypeptide
à
activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une
identité d'acide
aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 5
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 37 PCT/EP2019/067771
(provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N 6 (provenant de Aspergillus
aculeatus),
en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de
comparaison
BLAST-P donnant une e-value de 1e'8 ou moins, ou d'une composition à activité
polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide ;
c) collecter le dit sucre obtenu à l'issue de l'étape b).
En particulier, l'invention concerne un procédé d'obtention d'un sucre tel que
défini ci-dessus, caractérisé en ce que le dit substrat est un substrat
lignocellulosique, et
tout particulièrement une biomasse lignocellulosique.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de
préparation d'un produit de fermentation à partir d'un substrat
polysaccharidique,
caractérisé en ce qu'il comprend l'obtention d'un sucre par un procédé tel que
défini ci-
dessus, et la fermentation dudit sucre de sorte à obtenir un produit de
fermentation.
Ainsi, l'invention concerne un procédé de préparation d'un produit de
fermentation à partir d'un substrat polysaccharidique, caractérisé en ce qu'il
comprend les
étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité
polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité
d'acide aminé
d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 1
(provenant
de Podospora anserina) ou SEQ ID N 2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en
utilisant
une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P
donnant une e-value de 1e'8 ou moins, ou d'une composition à activité
polysaccharide
oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre de sorte à obtenir un produit de fermentation.
En particulier, l'invention concerne un procédé de préparation d'un produit de
fermentation à partir d'un substrat polysaccharidique, caractérisé en ce qu'il
comprend les
étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité
polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité
d'acide aminé
d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 5
(provenant
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 38 PCT/EP2019/067771
de Podospora anserina) ou SEQ ID N 6 (provenant de Aspergillus aculeatus), en
utilisant
une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P
donnant une e-value de 1e'8 ou moins, ou d'une composition à activité
polysaccharide
oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre de sorte à obtenir un produit de fermentation.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de
production d'alcool à partir d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en
ce qu'il
comprend l'obtention d'un sucre par un procédé tel que défini ci-dessus, et la
fermentation
alcoolique dudit sucre par un microorganisme alcooligène.
Le produit de la fermentation est préférentiellement le butanol, d'éthanol,
d'isopropanol ou d'un de leurs mélanges.
Ainsi, dans le cadre de la fermentation ethanolique, le produit de
fermentation
alcoolique considéré est l'éthanol.
Aussi, de manière préférée, un procédé de fermentation et/ou production
d'alcool selon l'invention est un procédé de production de butanol, d'éthanol,
d'isopropanol ou d'un de leurs mélanges.
Ainsi, l'invention concerne un procédé de production d'alcool à partir d'un
substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes
suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité
polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité
d'acide aminé
d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 1
(provenant
de Podospora anserina) ou SEQ ID N 2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en
utilisant
une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P
donnant une e-value de 1e'8 ou moins, ou d'une composition à activité
polysaccharide
oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre par un microorganisme alcooligène de sorte à
produire
le dit alcool.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 39 PCT/EP2019/067771
En particulier, l'invention concerne un procédé de production d'alcool à
partir
d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes
suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité
polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité
d'acide aminé
d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N 5
(provenant
de Podospora anserina) ou SEQ ID N 6 (provenant de Aspergillus aculeatus), en
utilisant
une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P
donnant une e-value de 1e'8 ou moins, ou d'une composition à activité
polysaccharide
oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre par un microorganisme alcooligène de sorte à
produire
le dit alcool.
Fibres de cellulose, procédés de préparation de substrats et de défibrillation
Différentes formes de cellulose ont été identifiées avec une dimension de
l'ordre du nanomètre, désignées sous le nom générique de nanocelluloses .
Les
propriétés notamment mécaniques des fibres de cellulose, dont ces
nanocelluloses, leur
capacité à former des films et leur viscosité, leur confèrent également un
intérêt majeur
dans de nombreux domaines industriels. Plusieurs stratégies de prétraitements
des fibres de
cellulose ont ainsi été développées afin de réduire la consommation d'énergie
requise pour
leur délamination mécanique.
Les procédés définis ci-après concernent l'obtention de fibres de celluloses à
partir d'un substrat cellulosique. Ils impliquent la mise en oeuvre d'un
polypeptide à
activité polysaccharide-oxydase selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de préparation
d'un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel
procédé
comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
b) mettre en contact, en présence d'un donneur d'électron, le dit substrat
avec
au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, dans des conditions
aptes à
assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 40 PCT/EP2019/067771
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase
présente une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un procédé de
préparation d'un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de
cellulose, lequel
procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
b) mettre en contact, en présence d'un donneur d'électron, le dit substrat
avec
au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, dans des conditions
aptes à
assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase
présente une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de
défibrillation
d'un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes
suivantes
consistant à:
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose,
lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d'électrons et un
polypeptide à
activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un
clivage oxydatif
desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défibriller le
dit
substrat,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase
présente une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 41 PCT/EP2019/067771
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un procédé de
défibrillation d'un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins
les étapes
suivantes consistant à :
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose,
lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d'électrons et un
polypeptide à
activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un
clivage oxydatif
desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défibriller le
dit
substrat,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase
présente une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de fabrication
de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes
consistant à:
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
b) mettre en contact, en présence d'un donneur d'électron, ledit substrat
cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase
dans des
conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer
lesdites
fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase
présente une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un procédé de
fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les
étapes suivantes
consistant à:
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 42 PCT/EP2019/067771
b) mettre en contact, en présence d'un donneur d'électron, ledit substrat
cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase
dans des
conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer
lesdites
fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase
présente une
identité d'acide aminé d'au moins 20% avec une séquence polypeptidique de
référence
SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la
dite
méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de 1e-18 ou moins.
Le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention est
mélangé avec le substrat cellulosique, de manière à permettre la mise en
contact entre le dit
polypeptide et les fibres de cellulose.
L'étape de traitement enzymatique est de préférence réalisée sous agitation
douce, de façon à assurer une bonne dispersion des enzymes au sein des fibres.
Cette étape
de traitement enzymatique est par exemple mise en oeuvre pendant une durée
allant de 24h
à 72h (de préférence 48h).
De préférence, l'étape de traitement enzymatique est mise en oeuvre à une
température allant de 30 à 50 C, notamment de 30 à 45 C.
Le pH des conditions réactionnelles de l'enzyme au contact du substrat
cellulosique est généralement compris entre 3 et 7, ce qui inclut entre 4 et
7, et notamment
entre 4 et 6.
Selon l'invention le dit polypeptide peut être ajouté au substrat cellulosique
selon un rapport (ou ratio) enzyme/cellulose allant de 1 :1000 à 1 :50,
notamment de 1 :500
à 1 :50 ou de 1 :100 à 1 :50 ou encore de 1 :1000 à 1 :500, de 1 : 500 à 1 :
100.
De préférence, le dit polypeptide est utilisé à une concentration allant de
0,001 à
10 g/L, notamment de 0,1 à 5 g/L, et de préférence encore de 0,5 à 5 g/L.
Selon un mode de réalisation particulier, le substrat cellulosique est soumis
à au
moins deux (voire seulement à deux) étapes de traitement enzymatique
successives (en
série, avantageusement séparées par une étape de rinçage).
Le, ou les, polypeptide(s) mis en oeuvre au cours de chacune de ces étapes de
traitement enzymatique sont identiques ou différentes ; les conditions
(notamment le ratio
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 43 PCT/EP2019/067771
enzyme/substrat) sont identiques ou différentes entre ces étapes successives.
De manière non-exclusive, des tests de clivage de la cellulose par un
polypeptide
selon l'invention peuvent être menés selon le protocole suivant :
Par exemple un test de clivage peut être réalisé dans un volume de 300 iLt1 de
liquide contenant 4,4 ILLM d'enzyme LPMO et 1 mM d'ascorbate et 0,1 %
(poids/volume)
de poudre de cellulose gonflée à l'acide phosphorique (PASC phosphoric acid-
swoller
cellulose - préparée comme décrit dans Wood TM, Methods Enzym 1988, 160 :19-
25) dans
50 mM d'un tampon acétate de sodium à pH 4,8 ou 5 ILLM de cello-
oligosaccharides
(Megazyme, Wicklow, Ireland) dans 10 mM de tampon acétate de sodium à pH 4,8.
La réaction enzymatique peut être mise en oeuvre dans un tube de 2 ml incubé
dans un thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) à 50 C et 580 rpm (rotation
par
minute).
Les fibres sont mises en contact des enzymes (à une concentration comprise
entre 1 et 5 g/L et selon des rapports enzyme/cellulose de 1 :50, 1 :100, 1
:500 et 1 :1000)
et d'ascorbate (2 mM) puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures à
40 C.
Après 16 h d'incubation, l'échantillon est porté à 100 C pendant 10 minutes
afin
de stopper la réaction enzymatique, puis centrifugé à 16 000 tours par minutes
(rpm)
pendant 15 minutes à 4 C afin de séparer la fraction solution de la fraction
insoluble
restante.
Les fibres traitées sont ensuite soumises à une action mécanique avec un
homogénéiseur-disperseur (Ultra-Turrax puissance 500 W, vitesse maximum
pendant 3
minutes), suivie d'un traitement aux ultrasons pendant 3 minutes.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que
les
fibres de cellulose obtenues à l'issue du procédé sont des nanofibrilles de
cellulose.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que
le
donneur d'électron est choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le catéchol, le
glutathion réduit,
les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques ; et
de préférence
l'ascorbate.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 44 PCT/EP2019/067771
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que
le
substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche
en cellulose, de
betterave, d'agrumes, de plantes annuelles à paille, d'animaux marins,
d'algues, de
champignons ou de bactéries.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que
le
substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de
préférence les
pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l'une au moins des
pâtes
papetières suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les
pâtes écrues, les
pâtes au bisulfite, les pâtes au sulfate, les pâtes à la soude, les pâtes
kraft.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que
le
substrat cellulosique est une pâte papetière dérivée du bois, de plantes
annuelles ou de
plantes à fibres.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que
ladite
au moins une étape de traitement mécanique comprend l'un au moins des
traitements
mécaniques suivants :
- un traitement d'homogénéisation,
- un traitement de micro fluidisation,
- un traitement d'abrasion, et/ou
- un traitement de cryobroyage.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que,
suite
à ladite étape de traitement mécanique, ledit procédé comprend une étape de
post-
traitement choisie parmi : un traitement acide, un traitement enzymatique, une
oxydation,
une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de groupements
chimiques
portés par les dites fibres de cellulose.
Selon un autre objet, l'invention concerne des fibres de celluloses issues
d'un
procédé de défibrillation et/ou d'un procédé de fabrication de fibres de
cellulose tels que
définis ci-dessus.
Les dites fibres de celluloses peuvent être caractérisées en ce que lesdites
fibres
de cellulose, de préférence de nanocellulose, comportent des cycles de glucose
dont au
moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou C4, voire
également C6.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 45 PCT/EP2019/067771
Selon un mode de réalisation préféré, les fibres de celluloses sont des
nanofibrilles de cellulose.
Etape(s) de traitement (s) mécanique(s)
Le substrat cellulosique mis en contact avec la dite enzyme est ensuite soumis
à
au moins une étape de traitement mécanique qui est destinée à délaminer les
fibres de
cellulose pour l'obtention des nanocelluloses.
La délamination (dite encore fibrillation ou défibrillation ) consiste à
séparer, par un phénomène mécanique, les fibres de cellulose au sein du
substrat
cellulosique, notamment pour la fabrication de nanocelluloses.
Comme démontré, le clivage oxydatif des fibres de cellulose, catalysé par
ladite
au moins une LPMO, facilite la délamination de ces fibres de cellulose lors de
l'étape de
traitement mécanique.
Cette étape de délamination mécanique des fibres de cellulose peut alors être
réalisée dans des conditions moins drastiques et donc moins coûteuses en
énergie.
Les traitements mécaniques visant à délaminer les fibres de cellulose sont
connus de l'homme du métier et peuvent être mis en oeuvre dans le(s)
procédé(s) de
l'invention.
De manière générale, on peut citer les traitements mécaniques faibles avec un
homogénéiseur-disperseur (par exemple du type d'Ultra-Turrax) et/ou les
traitements
ultrasons.
On peut encore par exemple se référer au document de Lavoine N et al
(Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (pages 740 à
744) des
traitements mécaniques pour la préparation de cellulose micro fibrillée (par
exemple des
nanofibrilles de cellulose).
Typiquement, un traitement mécanique peut être choisi parmi des traitements
mécaniques d'homogénéisation, de micro fluidisation, d'abrasion, ou de
cryobroyage.
Le traitement d'homogénéisation implique le passage du substrat cellulosique
prétraité, typiquement une pâte de cellulose ou une suspension liquide de
cellulose, au
travers d'un espace étroit sous pression élevée (tel que décrit par exemple
dans le brevet
US 4,486,743).
Ce traitement d'homogénéisation est de préférence effectué au moyen d'un
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 46 PCT/EP2019/067771
homogénéiseur de type Gaulin. Dans un tel dispositif, le substrat cellulosique
prétraité,
typiquement sous forme d'une suspension de cellulose, est pompé à haute
pression et
distribué au travers d'une valve automatique de faible orifice. Une succession
rapide
d'ouvertures et de fermetures de la valve soumet les fibres à une importante
chute de
pression (généralement d'au moins 20 MPa) et à une action de cisaillement à
vitesse élevée
suivie d'un impact de décélération à vitesse élevée. Le passage du substrat
dans l'orifice est
répété (généralement de 8 à 10 fois) jusqu'à ce que la suspension de cellulose
devienne
stable. Afin de maintenir une température du produit dans une gamme allant de
70 à 80 C
durant le traitement d'homogénéisation, de l'eau de refroidissement est
généralement
utilisée.
Ce traitement d'homogénéisation peut également être mis en oeuvre à l'aide
d'un
dispositif de type microfluidiseur (voir par exemple Sisqueira et al. Polymer
2010
2(4) :728-65). Dans un tel dispositif, la suspension de cellulose passe au
travers d'une fine
chambre typiquement en forme de z (dont les dimensions du canal sont
généralement
comprises entre 200 et 400 ium) sous pression élevée (environ 2070 bars). Le
taux de
cisaillement élevé qui est appliqué (généralement supérieur à 107.s-1) permet
d'obtenir des
nanofibrilles très fines. Un nombre variable de passages (par exemple de 2 à
30,
notamment de 10 à 30 ou de 5 à 25, et en particulier de 5 à 20) avec des
chambres de tailles
différentes peut être utilisé, pour augmenter le degré de fibrillation.
Le traitement d'abrasion ou de meulage (voir par exemple Iwamoto Set al., 2007
Applied Physics A89(2) :461-66) est basé sur l'utilisation d'un dispositif de
meulage apte à
exercer des forces de cisaillement fournies par des pierres de meulage.
Le substrat cellulosique prétraité, généralement sous forme d'une pâte de
cellulose, est passé entre une pierre de meulage statique et une pierre de
meulage en
rotation, typiquement à une vitesse de l'ordre de 1500 rotations par minute
(rpm). Plusieurs
passages (généralement entre 2 et 5) peuvent être nécessaires pour obtenir des
fibrilles de
taille nanométrique.
Un dispositif de type mixeur (par exemple tel que décrit dans Unetani K et
al.,
Biomacromolécules 2011, 12(2), pp.348-53) peut également être utilisé pour
produire des
microfibrilles à partir du substrat cellulosique prétraité, par exemple à
partir d'une
suspension de fibres de bois.
Le traitement de cryobroyage (ou cryoconcassage) (Dufresne et al., 1997,
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 47 PCT/EP2019/067771
Journal of Applied Polymer Science, 64(6) :1185-94) consiste à broyer une
suspension de
substrat cellulosique prétraité préalablement congelée avec de l'azote
liquide. Les cristaux
de glace formés à l'intérieur des cellules font exploser les membranes
cellulaires et libèrent
des fragments de parois. Ces procédés sont généralement utilisés pour la
production de
microfibrilles de cellulose à partir de produits, ou de résidus, de
l'agriculture.
Etape(s) de post-traitement du substrat cellulosique
Dans certains modes de réalisation, le procédé de défibrillation et/ou de
fabrication de fibres de cellulose comprend au moins une étape de post-
traitement du
substrat cellulosique, mise en oeuvre après que ledit substrat ait été soumis
au traitement
mécanique.
Généralement, ladite au moins une étape de post-traitement vise à augmenter le
degré de fibrillation des celluloses (notamment des nanocelluloses) obtenues
et/ou à
conférer auxdites nanocelluloses de nouvelles propriétés mécaniques, en
fonction des
applications envisagées.
Ladite au moins une étape de post-traitement peut notamment être choisie parmi
un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une
acétylation, une
silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques
portés par les
microfibrilles. On peut également se référer par exemple au document de
Lavoine N et al
(Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (point 2.3,
pages 747 à
748) des post-traitements qui peuvent être combinés à différents
prétraitements et
traitements mécaniques des fibres de celluloses.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 48 PCT/EP2019/067771
EXEMPLES
Exemple 1: Souches fongiques et conditions de culture
La souche d'Aspergillus japonicus utilisée dans cette étude est maintenue dans
la collection du Centre International de Ressources Microbiennes ¨ Champignons
Filamenteux (CIRM-CF, INRA, Marseille, France) sous le numéro d'accession CIRM
BRFM. Elle a été cultivée sur milieu gélosé MYA2, contenant 20 g/1 d'extrait
de malt, 20
g/1 d'agar et 1 g/1 d'extrait de levure. Les spores ont été récoltées et
conservées à -80 C
dans 20% de glycérol et 80% d'eau.
Les milieux de culture liquides contenant une fraction autoclavée de son de
maïs ou de la pulpe de betterave (fournis par ARD, Pomacle, France) en tant
que source de
carbone et inducteur de sécrétion de protéines ont été préparés da la manière
suivante : 15
g/1 d'inducteur ; 2,5 g/1 de maltose; 1,84 g/1 de tartrate diammonium comme
source d'azote;
0,5 g/1 d'extrait de levure; 0,2 g/L de KH2PO4; 0,0132 g/L de CaC12.2H20 et
0,5 g/L de
MgSO4.7H20. Un autre milieu inducteur a été préparé en utilisant 4 g/1
d'Avicel (Sigma-
Aldrich, USA); 10 g/1 de xylose; 1,8 g/1 de tartrate diammonium; 0,5 g/1
d'extrait de levure;
0,2 g/1 de KH2PO4; 0,0132 g/L de CaC12.2H20 et 0,5 g/L de MgSO4.7H20.
Les trois milieux de culture ont été inoculés par 2x105spores/mL des cinq
souches, et incubés dans des fioles bafflées dans l'obscurité à 30 C sous
agitation rotative à
105 rpm (Infors HT, Suisse).
Exemple 2 : Préparation des sécrétomes
Après 7 jours d'incubation, les cultures ont été arrêtées et le milieu liquide
a été
séparé du mycélium à l'aide de Miracloth (Calbiochem, USA). 40 mL ont été
filtrés sur des
membranes de polyéthersulfone 0,22 um (Merck-Millipore, Allemagne) puis
diafiltrés et
concentrés sur des membranes de polyéthersulfone avec un seuil de coupure de
10kDa
(Vivaspin, Sartorius, Allemagne) dans du tampon acétate de sodium 50mM pH5
jusqu'à un
volume final de 2 mL. Les sécrétomes ont été conservés à -20 C, et leur
concentration
totale de protéines a été évaluée par les méthodes de Bradford (Bio-Rad
Protein Assay,
Ivry, France) et du BCA (Bicinchoninic Acid Protein Assay, Sigma-Aldrich) en
utilisant
une gamme standard d'albumine sérique bovine (BSA).
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 49 PCT/EP2019/067771
Exemple 3 : Clonage de gènes et expression recombinante chez Pichia pastoris:
Les séquences protéiques sélectionnées, desquelles on a ôté les séquences
prédites des peptides signaux natifs, ont été utilisées pour générer des
séquences
nucléotidiques codantes optimisées pour une expression chez P. pastoris. La
synthèse
totale des gènes a été réalisée (Genewiz, USA) et ils ont été clonés dans le
vecteur
d'expression pPICZaA (Invitrogen), de manière à être en phase avec la séquence
signal
utilisée (celle du facteur a de la levure) et avec la séquence codant pour
l'étiquette poly-
histidine C-terminale.
Les plasmides ont été amplifiés via une transformation de cellules compétentes
DH5a d'Escherichia cou, puis purifiés à l'aide d'un kit HiSpeed Plasmid Midi
(Qiagen,
Pays-Bas), linéarisés par l'enzyme de restriction Pmel et transformés dans des
cellules X-
33 de Pichia pastoris (Invitrogen) par électroporation. Les transformants ont
été isolés sur
un milieu gélosé contenant de la zéocine (100 et 500 mg/L).
Pour tester l'expression de chaque vecteur, plusieurs transformants résistants
à
la zéocine ont été cultivés en plaque de 24 puits, dans 5 mL de milieu de
croissance
BMGY contenant 0,2 g/L de biotine, à 30 C et 250 rpm pendant environ 16h,
jusqu'à
atteindre une densité optique à 600 nm comprise entre 2 et 6. Après
centrifugation, les
cellules ont été reprises dans 1 mL de milieu BMMY et incubées à 20 C et 200
rpm
pendant 3 jours afin d'induire l'expression des protéines; le milieu a été
supplémenté
chaque jour par du méthanol à 3% (vol/vol). Les surnageants de culture ont été
purifiés par
chromatographie d'affinité avec des billes Ni-NTA selon une procédure
automatisée décrite
par Haon et al. ( Recombinant protein production facility for fungal biomass-
degrading
enzymes using the yeast Pichia pastoris . Front. Microbiol. 6. 2015), et les
protéines
purifiées ont été déposées sur un gel SDS-PAGE sans coloration avec révélation
par photo-
activation et fluorescence (BioRad, France) pour vérifier leur production.
Afin de produire les protéines en quantités suffisantes, les transformants
ayant
le meilleur taux de sécrétion ont été cultivés dans 2 L de milieu BMGY
contenant 1 mL/L
de sels PTM4 (Pichia Trace Minerais 4), 0,2 g/L de biotine dans des fioles à
30 C et 250
rpm pendant environ 16h, jusqu'à atteindre une densité optique à 600 nm
comprise entre 2
et 6. L'expression des protéines a été induite en incubant les cellules dans
400 mL de
milieu BMMY contenant 1 mL/L de sels PTM4 à 20 C et 200 rpm pendant 3 jours,
durant
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 50 PCT/EP2019/067771
lesquels le milieu a été supplémenté par du méthanol à 3% (vol/vol) chaque
jour. Les
surnageants ont été récupérés par centrifugation (4000xg, 4 C, 10 min) et
filtrés sur des
membranes de 0,45 iam (Millipore) pour éliminer les cellules restantes. Une
colonne de
nickel chélaté His-Bind Resin (1,9 cm3 ; GE Healthcare, UK) a été connectée à
un appareil
de FPLC Åkta (GE Healthcare) et équilibrée avec du Tris-HC1 50 mM (pH 7,8), de
NaCl
50 mM et de l'imidazole 10 mM. Après avoir ajusté le pH à 7,8, les surnageants
ont été
chargés sur la colonne à 4 C. La colonne a été lavée avec le tampon
d'équilibrage (Tris-
HC150 mM pH 7,8, NaCl 50 mM, imidazole 10 mM) et les enzymes ont été éluées
avec le
même tampon contenant 150 mM d'imidazole. Les éluats ont été concentrés à
l'aide
d'unités de centrifugation Amicon (seuil de coupure 10 kDa ; Millipore) à
4000xg et lavés
à plusieurs reprises avec du tampon acétate de sodium 50 mM (pH 5).
Une fraction de chaque éluat a été chargée sur un gel SDS-PAGE sans
coloration avec révélation par photo-activation et fluorescence (Bio Rad,
France) pour
vérifier leur pureté. La concentration en protéines a été déterminée par
absorption à 280
mn à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific)
et des
masses et coefficients molaires théoriques calculés à partir des séquences
protéiques.
Exemple 4 : Tests de dégradation de la cellulose en présence de polypeptides
selon
l'invention :
Les tests de dégradation de la cellulose par les polypeptides à activité
polysaccharide oxydase ont été effectués en triplicats, dans un volume de 300
iaL contenant
1% (m/v) d'Avicel (Sigma-Aldrich) ou de PASC (Phosphoric Acid Swollen
Cellulose),
préparée à partir d'Avicel selon la méthode décrite par Wood ( Preparation of
crystalline,
amorphous, and dyed cellulase substrates. In Methods in Enzymology, (Academic
Press),
pp. 19-25) dans du tampon phosphate 50 mM pH 6. Les LPMO (0,5 à 5 iaM) et le
donneur
d'électrons (L-cystéine ou ascorbate, 10 iaM à 1 mM) ont été ajoutés, en
présence ou non
d'H202 (100 1.1M), et les tubes ont été incubés dans un thermomixer
(Eppendorf,
Montesson, France) à 50 C et 850 rpm, pendant 4 à 16h. La réaction a été
arrêtée en
ébouillantant les échantillons à 100 C pendant au moins 10 min, puis ils ont
été centrifugés
à 15000xg pendant 5 min pour séparer les produits solubles de la fraction
insoluble.
Afin de tester la synergie des polypeptides d'intérêt avec la CBHI de T
reesei,
un mélange réactionnel d'un volume total de 800 iaL contenant 1% (m/v) de
nanofibrilles
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 51 PCT/EP2019/067771
de cellulose dans du tampon acétate 50 mM pH 5,2, ainsi que 8 lag de LPMO et 1
mM
d'ascorbate a été incubé dans un thermomixer (Eppendorf) à 50 C et 850 rpm,
pendant
16h. Les échantillons (en triplicats) ont été ébouillantés à 100 C pendant au
moins 10 min,
puis centrifugés à 15000xg pendant 5 min. La fraction insoluble restante du
substrat a été
lavée deux fois dans le tampon, et l'hydrolyse par la CBHI de T. reesei (0,8
lag; fournie par
IFPEN) a été réalisée dans un volume de 800 iaL contenant du tampon acétate 50
mM pH
5,2, pendant 30 min à 50 C et 850 rpm. La réaction a été arrêtée comme décrit
plus haut, et
les fractions solubles et insolubles ont été séparées.
Les mono et oligosaccharides issus de la dégradation des substrats
cellulosiques ont été détectés par HPAEC-PAD (Dionex, Thermo Fisher
Scientific), selon
la méthode décrite par Westereng et al. (2013), en utilisant des cello-
oligosaccharides (DP2
à DP6) non oxydés comme standards (Megazyme, Irlande).
Exemple 5 : Substrats et cocktails enzymatiques :
La paille de blé, le miscanthus et le peuplier prétraités ont été obtenus
auprès
d'IFP Energies Nouvelles (Rueil-Malmaison, France). Les biomasses ont été
prétraitées
par explosion à la vapeur en conditions acides, lavées à l'eau chaude pour
éliminer les
produits libres, et séchées à 55 C. Après une semaine à température ambiante,
elles ont été
broyées et tamisées afin de ne retenir que les particules de taille inférieure
à 0,8 mm, et
leur teneur en eau (% m/m) a été déterminée par séchage à 105 C en étuve à
convection
naturelle (VWR, USA).
Le cocktail dit K975 , est constitué du sécrétome de la souche CL847 de
Trichoderma reesei, produit en présence de lactose selon le protocole détaillé
dans
Herpoêl-Gimbert et al. (Comparative secretome analyses of two Trichoderma
reesei RUT-
C30 and CL847 hypersecretory strains, Biotechnology for Biofuels 2008, 1 :18),
et dont
l'activité 13-glucosidase spécifique est de 0,8 UI/mg. ) Il a été complété par
un cocktail
commercial de 13-glucosidases d'Aspergillus figer SP188 (Novozyme, Danemark).
Exemple 6 : Hydrolyses enzymatiques :
Les hydrolyses enzymatiques en tubes de 2 mL ont été réalisées en triplicats
dans un volume réactionnel de 1 mL, en présence de paille de blé, de
miscanthus ou de
peuplier (50 mg de biomasse sèche), dans du tampon acétate de sodium 50 mM (pH
4,8)
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 52 PCT/EP2019/067771
auquel a été ajouté du chloramphénicol (0,1 g/L) pour éviter les
contaminations
microbiennes. Ce mélange a été incubé pendant au moins lh à 45 C sous
agitation rotative
à 850 rpm (Infors) afin d'imprégner la biomasse, puis le cocktail K975 a été
ajouté à raison
de 5 mg/g de matière sèche (MS), et le cocktail SP188 dans des quantités
permettant
d'obtenir une activité 13-glucosidase totale de 80 UI/g MS.
Pour les tests de supplémentation, 10 uL de sécrétomes ont été ajoutés (ou 10
pl de tampon dans les conditions de référence). L'hydrolyse a été réalisée à
45 C sous
agitation rotative à 850 rpm (Infors). A chaque temps de prélèvement, les
triplicats ont été
ébouillantés à 100 C pendant au moins 5 min pour inactiver les enzymes, puis
refroidis et
centrifugés à 15000xg pendant 5 min, et le surnageant a été prélevé et
conservé à -20 C.
Les hydrolyses enzymatiques miniaturisées ont été réalisées en microplaques
de 96 puits, dans lesquelles ont été distribués 100 uL de suspension de
biomasse à 6,3%
(m/v) dans du tampon acétate de sodium 50 mM (pH 4,8) en présence de
chloramphénicol
(0,1 g/L). Pendant la distribution, la suspension de biomasse a été prélevée à
l'aide d'une
pipette multicanaux dans un bécher sous agitation magnétique constante, puis
les plaques
ont été scellées et conservées à -20 C.
Pour les tests de supplémentation, les enzymes ont été distribuées à l'aide
d'un
robot Tecan Genesis Evo 200 (Tecan, Lyon, France) : les cocktails K975 et
SP188 ont été
distribués dans les quantités indiquées plus haut, dans un volume de 15 pL,
puis 10 uL de
sécrétomes dilués 10x ont été ajoutés (ou 10 uL de tampon dans les conditions
de
référence, présentes sur chaque plaque). Chaque essai a été réalisé en
septuplicats, auquel
s'ajoute un puits contrôle contenant les enzymes seuls (sans biomasse) ; une
colonne de
chaque plaque a été consacrée aux conditions contrôles contenant la biomasse
seule (sans
enzymes). Pendant l'hydrolyse, les plaques scellées ont été incubées à 45 C
sous agitation
rotative à 850 rpm (Infors), pendant 24 à 96h. A chaque temps de prélèvement,
les plaques
correspondantes ont été centrifugées après ajout de 120 uL de tampon, puis le
surnageant a
été filtré et conservé à -20 C.
Pour les deux types d'hydrolyses ( séquentiel ou simultané ), la
concentration de glucose dans les échantillons a été mesurée à l'aide du
réactif Glucose
GOD-PAP (Biolabo, Maizy, France) à l'aide d'une gamme standard de glucose, et
les
rendements ont été calculés en tenant compte de la quantité de glucose
cellulosique
initialement présent.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 53 PCT/EP2019/067771
Plusieurs hydrolyses ont été réalisées pour chaque condition, et afin de
pouvoir combiner
les résultats, les rendements obtenus en présence de sécrétomes ont été
traduits en
pourcentage d'amélioration par rapport à la référence interne de chaque
hydrolyse. Un test t
de Student a été réalisé pour chaque condition afin de déterminer si la
moyenne des
résultats était statistiquement différente de la moyenne des références, en
utilisant la valeur
de la p-value comme critère.
Exemple 7: Tests de saccharification de biomasses en supplémentation de T.
reesei
Afin de déterminer si les sécrétomes produits peuvent présenter un intérêt
pour
l'amélioration des rendements d'hydrolyse enzymatique, ils ont été testés dans
des
conditions se rapprochant de celles envisagées dans les procédés industriels
de
bioconversion de la biomasse lignocellulosique. Trois biomasses modèles,
d'origine et de
compositions différentes, ont été choisies pour cette étude : la paille de
blé, le miscanthus
et le peuplier. Ces substrats, issus de déchets agricoles et de cultures
énergétiques dédiées,
sont fréquemment envisagés comme matières premières pour la production de
bioéthanol
en Europe. Ils ont été prétraités par explosion à la vapeur en présence
d'acide sulfurique
dilué (voir Tableau 1). Après lavage et séchage, leur composition en sucres a
été
déterminée par CPG après hydrolyse acide
Tableau 1: Conditions de prétraitement et composition des trois substrats
modèles de
cette étude
Peuplier Miscanthus Paille
Température vapeur ( C) 195 180/190 195
Pression (bar) 15 10.5/13 15
Durée prétraitement (min) 7.5 7.5 2
[H2SO4] 0.7% 0.4% 0.7%
Composition (% de poids sec)
Rhamnose 0.27 0.44 0.15
Arabinose 0.11 0.39 0.52
Xylose 0.63 2.09 1.58
Mannose 0.18 0 0.16
Glucose total 53.28 59.43 53.92
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 54 PCT/EP2019/067771
Glucose cellulosique 50.85 57.01 51.30
Teneur en eau (%m/m) 6.26% 5.66% 6.97%
Le cocktail cellulolytique de T. reesei utilisé (noté K975) est issu de la
souche
CL847, cultivée en présence de lactose ; celle-ci ayant une activité 13-
glucosidase assez
faible, une préparation commerciale de 13-glucosidases d'A. figer (SP188,
Novozyme) y a
été ajoutée en excès, afin de s'assurer que les potentielles améliorations de
performances
lors de la supplémentation ne soient pas dues à une simple augmentation de
l'activité 13-
glucosidase. Ce cocktail de référence a été utilisé pour réaliser l'hydrolyse
des trois
biomasses choisies, avec une concentration en biomasse relativement élevée (5%
m/v) afin
de se rapprocher de conditions réalistes du point de vue du procédé, et une
dose d'enzyme
faible (5 mg/g de matière sèche), correspondant pour l'industrie à des
conditions
permettant de réduire les coûts, et pour laquelle la marge d'amélioration des
rendements
d'hydrolyse est élevée.
La cinétique de cette hydrolyse sur 5 jours est présentée sur la Figure 1.
Dans
les conditions choisies, le rendement final d'hydrolyse de la paille de blé
est proche de
100%, ce qui signifie que la quasi-totalité de la cellulose a été transformée
en monomères
de glucose. Le miscanthus et le peuplier sont plus récalcitrants, puisque dans
les mêmes
conditions ils ne sont hydrolysés qu'à 50 et 60% respectivement. Les objectifs
d'amélioration sont multiples : dans le cas de la paille, il s'agira
d'augmenter les
rendements au début de l'hydrolyse (à 24 et 48h) et donc d'accélérer la
réaction, tandis que
pour le miscanthus et le peuplier il sera possible d'améliorer à la fois la
cinétique initiale et
le rendement après une période plus longue (96h par exemple).
Dans les mêmes conditions, le cocktail de référence a ensuite été supplémenté
par les différents sécrétomes d'Aspergillus. Dans un souci de simplification
expérimentale,
à une quantité fixe de cocktail, des volumes égaux de chacun des sécrétomes
concentrés
ont été ajoutés, selon le protocole établi dans Berrin et al. ( Exploring the
Natural Fungal
Biodiversity of Tropical and Temperate Forests toward improvement of Biomass
Conversion. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6483-6490, 2012). La quantité de
protéines
ajoutées n'est pas la même dans tous les échantillons, mais elle reflète les
proportions
initiales de protéines sécrétées par les souches fongiques sur chaque milieu
de culture. Ces
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 55 PCT/EP2019/067771
essais ont initialement été réalisés en tubes, en triplicats, mais les
biomasses utilisées étant
hétérogènes, il est apparu que la variabilité des résultats était importante.
Les tests de
saccharification ont été miniaturisés en microplaques et automatisés à l'aide
d'un robot
Tecan, selon une méthode déjà développée dans Navarro et al. ( Automated
assay for
screening the enzymatic release of reducing sugars from micronized biomass.
Microb. Cell
Factories 9, 58, 2010).
Ainsi, la biomasse est broyée finement et une suspension suffisamment
homogène est réalisée pour pouvoir être pipetée en microplaques, avant ajout
d'un cocktail
de référence et différents sécrétomes. Chaque test compte 7 réplicats. Les
données issues
de trois séries d'hydrolyse (une en tubes et deux en microplaques) ont été
traitées
statistiquement à l'aide d'un test de Student.
Grâce aux données issues du test de saccharification mis au point, l'influence
sur le rendement d'hydrolyse des sécrétomes peut être comparée pour chaque
biomasse
(Figure 2A-C). Les différences de performance sur les trois biomasses sont
importantes :
plusieurs sécrétomes permettent d'améliorer à la fois l'hydrolyse de la paille
et celle du
miscanthus, dès 24h.
Exemple 8 : Tests de saccharification de biomasse en présence de polypeptides
à
activité polysaccharide oxydase :
Les tests de supplémentation du cocktail de T. reesei par les polypeptides
pour
la saccharification du miscanthus ont été réalisés en triplicats selon la
méthode d'hydrolyse
enzymatique décrite plus haut, en utilisant 5 mg de biomasse, 1 mg/g MS du
cocktail K975
et 80 UI/g MS de 13-glucosidase apporté par le cocktail SP188, pendant 24h à
45 C et 850
rpm. Dans une partie des échantillons, un traitement par les LPMO (2,2 iaM) en
présence
d'ascorbate 1 mM a été effectué pendant 24h avant le début de l'hydrolyse ;
dans l'autre
partie, les LPMO et l'ascorbate ont été ajoutés au début de l'hydrolyse, en
même temps que
le cocktail cellulolytique.
Dans les échantillons de référence, les polypeptides n'ont pas été ajoutés.
Après
24h, la réaction a été arrêtée et la concentration de glucose dans les
échantillons a été
mesurée à l'aide du réactif Glucose GOD-POD (Biolabo).
Exemple 9 : Sélection et production de protéines fongiques d'intérêt
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 56 PCT/EP2019/067771
Afin de pouvoir étudier la fonction des polypeptides d'intérêt, il a été
décidé de
les produire de manière hétérologue dans la levure Pichia pastoris, à l'aide
de gènes
synthétiques placés dans un vecteur. Plusieurs versions de la séquence
d'Aspergillus
aculeatus ont été exprimées (avec le module X273 N-terminal seul, avec une
extension C-
terminale tronquée, et avec l'extension C-terminale complète), ainsi qu'une
protéine
similaire comportant une extension C-terminale très courte, retrouvée chez
Podospora
anserina (PaX273).
Chacune des constructions testées débute par un peptide signal, suivi de
l'histidine n-terminale impliquée dans la triade catalytique, et se termine à
une position
terminale variable. Pour les clones issus d'Aspergillus aculeatus, la séquence
polypeptidique de référence est SEQ ID N 2. Pour le clone issu de Podospora
anserina, la
séquence polypeptidique de référence est SEQ ID N 1.
Tableau 2: Séquences polypeptidiques choisies pour l'expression chez
Pichia pastoris.
Organisme source Taille (kDa) Position terminale
AaX273 complète Aspergillus aculeatus 30.2 314
AaX273 tronquée Aspergillus aculeatus 19.6 200
AaX273 Nter Aspergillus aculeatus 19.0 193
PaX273 Podospora anserina 20.7 209
Au total, 4 gènes ont donc été synthétisés et transformés chez Pichia pastoris
(voir Tableau 2). Les transformants correspondants ont été cultivés en petits
volumes,
selon la procédure accélérée mise en place au laboratoire (Haon et al.,
Recombinant
protein production facility for fungal biomass-degrading enzymes using the
yeast Pichia
pastoris. Front Microbiol. 6, 2015) afin de vérifier la bonne expression des
protéines.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 57 PCT/EP2019/067771
Exemple 10 : Etude d'une nouvelle famille de LPMO fongiques
Analyse bio-informatique de la famille X273
Afin de mesurer l'étendue de la famille X273 dans les génomes fongiques, une
recherche d'homologies basée sur la séquence du module X273 de Podospora
anserina,
d'une longueur de 165 acides aminés, a été effectuée, à l'aide de l'outil NCBI
Blast, et en
ne gardant que les séquences les plus proches (e-value égale ou inférieure à
le-18).
Dans un second temps, en vue d'optimiser la sélection des séquences
polypeptidiques d'intérêt, on se base sur un alignement de séquences réalisé à
l'aide de
Clustal Omega (EMBL-EBI), puis on réalise une curation manuelle afin d'écarter
les
.. séquences suivantes :
- Fragments N-ter ou C-ter ne correspondant pas à des protéines entières
(notamment
celles ne comportant pas la le" histidine, caractéristique des LPM0s) ;
- Séquences dont l'extrémité N-ter ne correspond pas à un peptide signal
selon le
logiciel SignalP 4.1. ;
- Séquences comportant des insertions ou des délétions importantes,
possiblement
dues à de mauvais modèles d'épissage. ;
- Séquences ayant une extension C-terminale très longue.
Outre SEQ ID N 1 et 2, on parvient ainsi à une liste affinée de prêt de 379
séquences polypeptidiques (SEQ ID N 7 à 383), provenant d'organismes
fongiques, et
principalement d'ascomycètes : 335 séquences, contre 41 provenant de
basidiomycètes et 3
de champignons non classifiés.
Les acides aminés consensus sont représentés graphiquement en figure 3, après
alignement des 378 modules catalytiques correspondant aux séquences protéiques
SEQ ID
N 1, 2 et 7 à 382. La figure est générée par l'application WebLogo, selon
Crooks et al.
(WebLogo : A Sequence Logo Generator. Genome Res. 14, 1188-1190 ; 2004).
L'alignement des séquences correspondant au module X273 révèle plusieurs
régions bien conservées au sein de la famille. Toutes les séquences comportent
notamment
une histidine N-terminale, ainsi qu'une deuxième histidine strictement
conservée, ce qui est
une caractéristique du centre actif ( Histidine brace ) de toutes les LPMO
caractérisées
jusqu'à présent. On compte une vingtaine d'autres résidus strictement
conservés, dont 6
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 58 PCT/EP2019/067771
cystéines potentiellement impliquées dans la formation de ponts disulfures. En
plus du
module X273, la plupart des protéines de la liste possèdent une extension C-
terminale, plus
ou moins longue selon les espèces. Pour 7 d'entre elles, trouvées chez 4
organismes
différents, cette extension comporte un module de liaison à la cellulose
(CBM1).
Dans le tableau 3, les positions relatives de ces acides aminés conservés sont
déterminées par rapport aux séquences références SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2.
Tableau 3: Positions conservées dans le module catalytique X273
Acides aminés conservés Position dans SEQ ID 1 Position dans SEQ
ID 2
Histidine (H) 19, 105 20, 109
Glycine (G) 31, 107 32, 111
Proline (P) 25 26
Arginine (R) 28 29
Cystéine (C) 38, 69, 74, 157, 163, 39, 73,78, 162,
168, 186
179
Asparagine (N) 110 114
Glutamine (Q) 166, 174 171, 181
Tryptophane (W) 169 174
Glycine (D) ou Alanine (A) 20, 76 21, 80
Glycine (D) ou Asparagine (N) 161 166
Acide aspartique (D) ou Asparagine (N) 49 50
Proline (P) ou Alanine (A) 151 155
Thréonine (T) ou Asparagine (N) 175 182
Tyrosyne (Y) ou Phénylalanine (F) 176 183
Acide aspartique (D) ou Leucine (L) 181 188
Production hétérologue et test d'activité
Les clones de P. pastoris exprimant les X273 d'A. aculeatus et de P. anserina
ont été utilisés pour produire les protéines en fioles de 1L. La version de la
protéine d'A.
aculeatus retenue est celle ayant été la plus produite en petits volumes,
c'est à dire celle qui
a été tronquée en laissant une dizaine d'acides aminés de l'extension C-
terminale. Après
purification, on obtient une quantité totale de 47,5 mg pour AaX273 et 61 mg
pour
PaX273. Les protéines purifiées ont ensuite été chargées en cuivre, afin que
leur centre
actif soit fonctionnel, et l'excédent de cuivre éliminé par diafiltration. Une
analyse par
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 59 PCT/EP2019/067771
spectrométrie de masse avec plasma à couplage inductif (ICP-MS) a permis de
confirmer
la présence d'environ un atome de cuivre par molécule de X273.
Grâce à un essai fluorimétrique en présence d'Amplex Red, la production
d'H202 par les enzymes X273 en présence d'un donneur d'électron (acide
ascorbique) et en
.. l'absence de substrat a pu être établie, ce qui indique que ces enzymes ont
une activité
d'oxydation et se comportent comme les autres familles de LPMO.
Caractérisation des produits de dégradation de la cellulose
Afin de déterminer si les LPMO ont une activité sur la cellulose, on peut
observer indirectement leur effet en utilisant leur synergie avec les
cellulases. Ainsi, après
avoir laissé agir les protéines X273 sur des nanofibrilles de celluloses
(NCF), celles-ci ont
été hydrolysées par la CBHI (Cel7A) de T. reesei. La quantité de cellobiose
mesurée par
chromatographie d'échange d'ions (HPAEC-PAD) à la suite de cette hydrolyse est
plus
importante dans les échantillons ayant été traités par les X273 que dans
l'échantillon
témoin (voir Figure 4).
Cela indique que les X273 semblent introduire dans les chaînes de cellulose
des coupures servant de nouvelles extrémités d'attaque à la cellobiohydrolase,
qui libère
donc plus de cellobiose que lorsqu'elle agit seule.
La visualisation de l'action directe des LPMO sur les fibres de cellulose est
plus difficile, étant donné que seuls les polysaccharides solubles (dont le
degré de
polymérisation est généralement inférieur à 6) sont détectés par les méthodes
de
chromatographie. On peut toutefois quantifier les courtes chaînes de cellulose
libérées par
l'accumulation de ces clivages, et déterminer s'il s'agit d'oligosaccharides
natifs, ou
oxydés (notamment en Ci et/ou en C4).
Ainsi, des tests ont menés sur PASC (Phosphoric Acid Swollen Cellulose) et
Avicel (cellulose microcristalline), en présence de H202, et en diminuant la
quantité de
donneur d'électrons selon les conditions proposées par Bissaro et al. (
Oxidative cleavage
of polysaccharides by monocopper enzymes depends on 11202 . Nat. Chem. Biol.
13, 1123-
1128; 2017). En augmentant les quantités d'enzyme AaX273, des produits ont pu
être
observés sur les deux substrats. Les deux enzymes libèrent du cellobiose, du
cellotriose, du
cellotetraose et du cellopentaose.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 60 PCT/EP2019/067771
Saccharification de biomasse prétraitée
Après aperçu de l'activité des X273 sur la cellulose, leur activité sur des
substrats plus complexes a été évaluée.
Les deux sécrétomes contenant des X273 ayant montré une amélioration de
l'hydrolyse sur le miscanthus prétraité, c'est cette biomasse qui a été
choisie pour réaliser
les tests de saccharification. Afin de faciliter l'homogénéisation, une
proportion plus faible
de biomasse a été utilisée que précédemment (0,5% m/v), et la dose d'enzyme du
cocktail
de référence a également été diminuée (1 mg/g de matière sèche). Une dose de
X273 de 0,2
mg/g de matière sèche a été ajoutée. Deux types d'hydrolyse ont été effectués
:
- en mettant en contact les protéines X273 avec la biomasse pendant 24h puis
en ajoutant le cocktail de référence ; et
- en faisant agir simultanément les dites protéines et le cocktail de
référence.
Les données obtenues après 24h d'hydrolyse du miscanthus par le cocktail de
référence, avec ou sans ajout de AaX273 ou PaX273, et en particulier de
AaX273, sont
illustrées en Figure 5.
Ainsi, après 24h d'hydrolyse, on observe une augmentation de la quantité de
glucose en présence des LPMO, principalement lorsque l'ajout des protéines
s'est fait de
manière simultanée. Il existe donc une synergie entre les X273 et le cocktail
cellulolytique
de T. reesei.
Exemple 11: pré-traitement de substrat cellulosique PASC en présence
d'une sélection d'enzymes appartenant à la famille X273.
Les résultats obtenus sont représentés en figure 6, selon un protocole
similaire
à celui utilisé pour la figure 4. Quatre enzymes sont testées, et leur impact
sur le niveau de
cellobiose libéré en présence d'une cellulase de Trichoderma reesei a été
comparé avec un
contrôle PASC sans mise en contact préalable avec la dite enzyme.
Il apparaît ainsi que l'ensemble de ces enzymes testées, de séquence SEQ ID
N 2, SEQ ID N 175, SEQ ID N 208, et SEQ ID N 383, améliore l'accessibilité de
la
cellulose aux cellulases, par rapport à un simple traitement PASC, en
améliorant la
cellobiose libérée après traitement avec une cellulase de T. reesei (effet
synergique).
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 61 PCT/EP2019/067771
Pour référence, la séquence SEQ ID N 383 présente au moins 40% d'identité
de séquence avec SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2.
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 62 PCT/EP2019/067771
LISTAGE DE SEOUENCES
SEQ ID Description Générale
1 Séquence Polypeptidique référence d'enzyme à activité
polysaccharide-
oxydase issue de Podospora anserina (référencée PaX273)
2 Séquence Polypeptidique référence d'enzyme à activité
polysaccharide-
oxydase issue de Aspergillus aculeatus (référencée AaX273)
3 Peptide signal de PaX273
4 Peptide signal de AaX273
Module catalytique de PaX273
6 Module catalytique de AaX273
7-383 Autres Séquences polypeptidiques apparentées à la famille X273
SEO ID NO. 1
MHF S TV S SAL GLAS LV SAHGVVLKPAS RKP GDATTEAC GRAMVNFYKQ DET SYP
5 EAFLRSNPLPDRNKCNLFLCKGYQFADNAANVQ SYKP GD SVEYEVYIRIPH S GYA
NV S IVD TTTNKVL G S PLV S WAS GYAAS SKPPADQTKFSVKIPELGAQCAAAGVCV
LQWHWFGAGQTYQSCTDFTVAAPVAPAEPAPEHGHGHRIRGQSRW
SEO ID NO. 2
MKQT G S ILALAGLV S MANAH GFVT S P QPRMP G SAMEKAC GQ QVYNNQEADNYG
NI Q GEL QIAS GQ S DYDAEACDIWL CKGYKYADNTANVQ SYKP GEVIDFTVDIRAP
HTGTANVSVVDTATNTML SQPLIYWSVYASTATGVTANETSFSVTMPTDLGDKC
NEAGACVLQWWWDARSIDQTYESCVDFTLSGSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSAA
AAVATSAAS S ST S SAAETTTAASAAVTSPAAANNIAPVS S SGPTTLATSVKQTATA
AAVS SATSTSVSLPTDGTAEEQLTWVASVFKALLNYAN
SEO ID NO. 3
MHFSTVS SALGLASLVSA
SEO ID NO. 4
MKQTGSILALAGLVSMANA
SEO ID NO. 5
HGVVLKPASRKPGDATTEACGRAMVNFYKQDETSYPEAFLRSNPLPDRNKCNLFL
CKGY QFADNAANVQ SYKP GD SVEYEVYIRIPH S GYANV SIVDTTTNKVL G SPLV S
WASGYAAS SKPPADQTKFSVKIPELGAQCAAAGVCVLQWHWFGAGQTYQSCTD
FT
CA 03104903 2020-12-23
WO 2020/007880 63 PCT/EP2019/067771
SEO ID NO. 6
HGFVT SPQPRMPGSAMEKACGQQVYNNQEADNYGNIQGELQIASGQSDYDAEAC
DIWLCKGYKYADNTANVQSYKPGEVIDFTVDIRAPHTGTANVSVVDTATNTMLS
QPLIYWSVYASTATGVTANETSF SVTMPTDLGDKCNEAGACVLQWWWDARSIDQ
TYESCVDFT
