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Anticorps à domaine unique qui se lient à la protéine G alpha
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine des anticorps et notamment le
domaine des
anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lient à la protéine G alpha. Les sdAb
selon
l'invention sont particulièrement adaptés pour une utilisation en FRET, par
exemple sous la
forme d'anticorps à chaîne lourde (HcAbs) couplés à une molécule permettant
leur détection.
ARRIERE-PLAN TECHNIQUE
Les "récepteurs couplés aux protéines G", ou "RCPG", sont les récepteurs
membranaires les
plus représentés chez les mammifères. Ils sont à l'origine d'une grande
variété de réponses
cellulaires liées à divers processus physiologiques (ex. vision, olfaction,
médiation de l'action
de nombreuses hormones, de neuropeptides, etc.). Ils peuvent être activés par
des ligands
de natures très diverses comme par exemple les photons, les ions, les
molécules olfactives,
les molécules gustatives, les acides aminés, les acides nucléiques, les
lipides, les molécules
exogènes telles que les cannabinoïdes, les chimiokines, ou encore les
hormones.
Ces récepteurs, possèdent sept régions transmembranaires en forme d'hélices
alpha
comprenant chacune entre 22 et 24 acides aminés. Les RCPG peuvent être classés
chez
l'homme en 5 familles principales appelées rhodopsine, adhérence, sécrétine,
glutamate,
Frizzled / Taste2 (Fredriksson et al., 2003). Les RCPG changent d'état de
conformation
fonctionnelle selon leur niveau d'activation par un ligand par rapport à un
état
conformationnel basal. Lorsque le RCPG est activé par la liaison d'un ligand
spécifique, le
changement de conformation du complexe agoniste-récepteur, permet l'activation
de la
protéine G hétérotrimérique.
Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques qui transduisent un
signal d'activation
du RCPG en initiant des cascades de réactions biochimiques ayant pour finalité
la
transduction du signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la
cellule. Les protéines G
sont situées sur la face interne de la membrane plasmique et sont formées de
trois sous-
unités (o, P, y). La sous-unité alpha est capable de se lier aux nucléotides
guanyliques, soit
le GDP, soit le GTP.
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Le mécanisme d'action du RCPG et de la protéine G communément décrit est
présenté dans
la Figure 1 et résumé ci-après :
- dans son état inactif, de repos, la sous-unité alpha de la protéine G est
liée au
nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP) ;
- après
activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous-unité alpha de la protéine G
et
enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes
: 1) la
sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la
formation d'un
complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et 2) la fixation du GTP qui conduit
à la
formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine liée au
GTP).
Dans la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme
appelée
forme vide . Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire
puisqu'il
est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous-unité alpha de la
protéine
G. Par ailleurs, les sous unités bêta/gamma de la protéine G activée se
dissocient de la
sous unité alpha ;
- la sous unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux
effecteurs pour
les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation
entraînant une
réponse cellulaire ;
- le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous unité alpha de la protéine G
et la sous
unité alpha se réassocie aux sous unité bêta/gamma pour reformer la protéine G
pleine
liée au GDP (état inactif).
Il existe au moins 17 différentes sous-unités alpha : Galpha il, Galpha 12,
Galpha i3, Galpha
ol, Galpha o2, Galpha q, Galpha 12, Galpha 13, Galpha s, Galpha z, Galpha tl,
Galpha t2,
Galpha 11, Galpha 14, Galpha 15, Galpha 16 ou encore Galpha gus.
Etant donné l'implication des RCPG dans de nombreuses voies de signalisation
des outils ont
été générés dans l'art antérieur pour étudier leur activité, avec souvent pour
objectif
l'identification de nouveaux ligands de ces récepteurs ayant une potentielle
activité
thérapeutique. On peut citer à titre d'exemple de ces outils, l'utilisation
d'un dérivé radioactif
non hydrolysable ou lentement hydrolysable du GTP, notamment le GTP-gamma-S,
qui se
fixe sur la protéine G alpha lorsque le récepteur est activé. Il existe
également des systèmes
recombinants basés sur la mesure d'une activité enzymatique telle que la
luciférase dont
l'expression est contrôlée par les seconds messagers produits par l'activation
du récepteur.
Des anticorps ont également étés synthétisés pour détecter l'activation des
RCPG au niveau
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de la surface cellulaire (Damien Maurel. Oligomérisation des récepteurs
couplés aux
protéines G: deux ou plus? Application des technologies de FRET en temps
résolu au cas du
récepteur GABAB. Biologie cellulaire. Université Montpellier I, 2006.
Français). On peut
également faire référence au brevet EP2723764 B1 qui propose des nano-
anticorps qui se
lient à l'interface entre la protéine G alpha et la protéine G bêta/gamma,
permettant de
stabiliser le complexe RCPG/protéine G.
En revanche aucun des outils de l'art antérieur ne permet de détecter de façon
spécifique la
sous-unité alpha de la protéine G, et encore moins un sdAb qui se lie à la
protéine G alpha,
en particulier pour une utilisation en FRET. Ainsi, la présente invention
propose
avantageusement, des anticorps à domaine unique (sdAb), par exemple des
anticorps à
chaîne lourde (HcAb) qui se lient à la protéine G alpha (protéine G alpha).
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie
à la
protéine G alpha.
Un premier objet de la présente invention concerne un anticorps à domaine
unique
(sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides
aminés constituée
de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FR1 à FR4) selon la
formule (I)
suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
ledit anticorps présentant une constante de dissociation (Kd) pour la protéine
G alpha
pleine mesurée en FRET inférieure à 100 nM.
Un deuxième objet de la présente invention concerne un anticorps à domaine
unique
(sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides
aminés constituée
de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FR1 à FR4) selon la
formule (I)
suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
dans laquelle :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés
choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO : 25,
SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO: 57 et SEQ ID NO
: 65;
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- CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés
choisie parmi SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26,
SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO: 58 et SEQ ID NO
: 66; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés
choisie parmi SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO: 27,
SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO
: 67.
Un troisième objet de la présente invention concerne une séquence d'acides
nucléiques codant pour l'anticorps à domaine unique (sdAb) selon l'invention.
Un quatrième objet de la présente invention concerne un vecteur recombinant
comprenant la séquence d'acides nucléiques selon l'invention.
Un cinquième objet de la présente invention concerne une cellule comprenant le
vecteur selon l'invention ou la séquence d'acides nucléiques selon
l'invention.
Sans indication contraire, les termes anticorps selon l'invention ,
anticorps de
l'invention , sdAb selon l'invention ou sdAb de l'invention font
référence à la fois au
au premier objet selon l'invention et au deuxième objet selon l'invention.
Les objets de la présente invention sont décrits plus précisément ci-après.
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FIGURES
Figure 1 : Représente le mécanisme d'activation d'un RCPG et les différents
stades
d'activation de la protéine G alpha, à savoir la forme inactivée (protéine G
alpha liée au GDP)
et la forme activée (protéine Galpha liée au GTP).
Figure 2: Principe de l'essai HTRF (TR-FRET) pour la détermination de
l'affinité (Kd) des
domaines variables de chaîne lourde (VH), mis en uvre dans les figures 3 à
11.
Figure 3 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH F9 par essai TR-FRET. Le
principe de
l'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est
chargée avec un excès de
GTPgS (10pM). Un Kd de 32nM est obtenu pour l'interaction VH F9 / protéine
Galphail.
Figure 4: Détermination de l'affinité (Kd) du VH F11 par essai TR-FRET. Le
principe d'essai
détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec
un excès de
GTPgS (10pM). Un Kd de 3nM est obtenu pour l'interaction VH F11 / protéine
Galphail.
Figure 5 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH B11 par essai TR-FRET. Le
principe d'essai
détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec
un excès de
GTPgS (10pM). Un Kd de 1nM est obtenu pour l'interaction VH B11 / protéine
Galphail.
Figure 6 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH F4 par essai TR-FRET. Le
principe d'essai
détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec
un excès de
GTPgS (10pM). Un Kd de 31nM est obtenu pour l'interaction VH F4 / protéine
Galphail.
Figure 7 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH G6 par essai TR-FRET. Le
principe d'essai
détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec
un excès de
GTPgS (10pM). Un Kd de 95nM est obtenu pour l'interaction VH G6 / protéine
Galphail.
Figure 8 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH A10 par essai TR-FRET. Le
principe d'essai
détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec
un excès de GDP
(10pM). Un Kd de 15nM est obtenu pour l'interaction VH A10 / protéine
Galphail.
Figure 9 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH G7 par essai TR-FRET. Le
principe d'essai
détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec
un excès de GDP
(10pM). Un Kd de 31nM est obtenu pour l'interaction VH G7 / protéine Galphail.
Figure 10 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH F2 par essai TR-FRET. Le
principe d'essai
détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec
un excès de GDP
(10pM). Un Kd de 14nM est obtenu pour l'interaction VH F2 / protéine Galphail.
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Figure 11 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH E2 par essai TR-FRET. Le
principe d'essai
détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphai1 est chargée avec
un excès de GDP
(10pM). Un Kd de 72nM est obtenu pour l'interaction VH E2 / protéine Galphai1.
Figure 12 : Principe de l'essai TR-FRET (HTRF) pour la détermination de
l'affinité (Kd) des
.. HcAb de type VH (HcAb VH), mis en oeuvre pour les figures 13 à 16.
Figure 13 : Détermination de l'affinité (Kd) du HcAb-B11 par essai TR-FRET. Le
principe
d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphai1 est
chargée avec un excès
de GTPgS (10pM). Un Kd de 1nM est obtenu pour l'interaction HcAb-B11 /
protéine Galphai1.
Figure 14 : Détermination de l'affinité (Kd) du HCAb-F9 par essai TR-FRET. Le
principe
d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphai1 est
chargée avec un excès
de GTPgS (10pM). Un Kd de 3nM est obtenu pour l'interaction HcAb-F9 / protéine
Galphai1.
Figure 15 : Détermination de l'affinité (Kd) du HcAb-G7 par essai TR-FRET. Le
principe
d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphai1 est
chargée avec un excès
de GDP (10pM). Un Kd de 5nM est obtenu pour l'interaction HcAb-G7 / protéine
Galphail.
Figure 16 : Détermination de l'affinité (Kd) du HcAb-A10 par essai TR-FRET. Le
principe
d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphai1 est
chargée avec un excès
de GDP (10pM). Un Kd de 3nM est obtenu pour l'interaction HcAb-A10 / protéine
Galphai1.
Figure 17: Schéma de différentes formes possibles d'anticorps sdAb selon
l'invention.
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DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les Demandeurs ont mis au point des anticorps à domaine unique (sdAb) qui se
lient
à la protéine G alpha avec une bonne affinité pour la protéine G alpha pleine.
Ces sdAb
constituent des outils particulièrement performants comme agent thérapeutique,
comme
agent de diagnostic et/ou comme agent de détection de la protéine G alpha, en
particulier
comme agent de détection de la protéine G alpha dans un procédé de type FRET.
Définitions
Les termes anticorps anti-protéine G alpha , anticorps qui se lie à la
protéine G alpha
et anticorps qui se lie spécifiquement à la protéine G alpha sont
interchangeables et
désignent un anticorps qui se lie à la protéine G alpha avec une affinité
suffisante pour que
l'anticorps soit utile comme agent de détection (ex. pour la mise en oeuvre
d'un FRET), de
diagnostic et/ou thérapeutique en ciblant la protéine G alpha.
On entend par anticorps un polypeptide codé par un gène d'immunoglobuline
capable de
se lier à un antigène. Le terme anticorps est utilisé ici dans son sens le
plus large et
englobe diverses structures d'anticorps qui présentent l'activité de liaison à
l'antigène
souhaité, y compris, mais sans s'y limiter, les anticorps monoclonaux, les
anticorps
polyclonaux, les anticorps multispécifiques (par exemple, des anticorps
bispécifiques) et des
fragments d'anticorps. Les anticorps conventionnels , c'est le cas par
exemple des
immunoglobulines de type G (IgG) chez l'homme, se présentent sous la forme
d'un
tétramère comprenant deux paires de chaînes polypeptidiques identiques dites
chaines
légères et deux chaînes polypeptidiques identiques dites chaînes lourdes. Un
domaine
variable se situe au niveau de l'extrémité N-terminale de chacune des chaînes
( VH pour
les chaînes lourdes et VL pour les chaînes légères) et les deux domaines
variables VH et
VL permettent la reconnaissance de l'antigène. Chaque domaine variable
comprend
généralement 4 régions charnières (appelées FR1, FR2, FR3, FR4) et 3
régions
directement responsables de la liaison avec l'antigène, dites CDR
(appelées CDR1, CDR2,
CDR3). En général, chaque domaine variable se présente sous la forme suivante:
FR1-CDR1-
FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Généralement, c'est le cas par exemple des IgG chez
l'homme, la
liaison à l'antigène est effectuée par un couple de deux domaines variables
(i.e. un domaine
variable de chaine légère VL et un domaine variable de chaine lourde VH),
c'est-à-dire que 6
CDRs sont impliqués dans la formation d'un site de liaison à l'antigène.
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A l'inverse, pour les anticorps à domaine unique, seulement 3 CDRs sont
impliqués dans la
formation d'un site de liaison à l'antigène. Ainsi, le site de liaison à
l'antigène d'un anticorps
à domaine unique est formé par 3 CDRs. Ainsi, les termes anticorps à domaine
unique ,
Single domain Antibody et sdAb sont interchangeables et font référence à
un anticorps
.. dans lequel la liaison à l'antigène est effectuée par un seul domaine
variable. Un sdAb peut
être i) un anticorps comprenant ou consistant en un domaine variable de chaîne
lourde (VH)
ou un fragment de celui-ci capable de se lier à l'antigène, qui se lie à
l'antigène
indépendamment de tout autre domaine variable, ii) un anticorps comprenant ou
consistant
en un domaine variable de chaîne légère (VL) ou un fragment de celui-ci
capable de se lier à
l'antigène, qui se lie à l'antigène indépendamment de tout autre domaine
variable, ou ii) un
anticorps comprenant ou consistant en un domaine variable de chaîne lourde de
type VHH
(VHH) ou un fragment de celui-ci capable de se lier à l'antigène, qui se lie à
l'antigène
indépendamment de tout autre domaine variable.
On entend par anticorps à chaîne lourde de type VH ou HcAb VH , un
anticorps
constitué de deux chaînes lourdes comprenant chacune un domaine variable de
type VH. En
particulier, chaque chaine lourde est constituée des fragments CH2 et CH3, et
dudit domaine
variable de type VH.
On entend par anticorps à chaîne lourde de type VHH ou HcAb VHH , un
anticorps
constitué de deux chaînes lourdes comprenant chacune un domaine variable de
type VHH.
En particulier, chaque chaine lourde est constituée des fragments CH2 et CH3,
et dudit
domaine variable de type VHH.
Au sens de l'invention, les termes Protéine Galpha pleine ou forme
pleine de la
protéine G alpha désignent une protéine Galpha liée au GTP, au GDP ou à un
analogue de
ceux-ci, par exemple au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable. Ces
termes
désignent donc la protéine Galpha liée au GDP ou à un analogue du GDP (
Protéine Galpha
liée au GDP ) ou la protéine Galpha liée au GTP ou à un analogue du GTP, par
exemple au
GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable ( Protéine Galpha liée au GTP
). La
protéine Galpha pleine (protéine Galpha liée au GDP ou protéine Galpha liée au
GTP) est
représentée à la Figure 1.
Le terme GDP désigne la guanosine diphosphate.
Le terme GTP désigne la guanosine triphosphate.
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Le terme GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable désigne un
analogue du GTP
qui n'est pas hydrolysé ou peu hydrolysé en GDP. On peut citer par exemple le
GTPgammaS
(connu également sous les acronymes GTPgS et GTPyS ) (CAS no. 37589-80-
3), le
GppNHp (CAS no. 148892-91-5) ou le GppCp (CAS no. 10470-57-2).
Au sens de l'invention, les termes Protéine Galpha vide ou forme vide de
la protéine G
alpha désignent une protéine Galpha qui n'est pas liée au GTP ou au GDP. La
protéine
Galpha vide est décrite dans la littérature comme un état transitoire entre la
protéine Galpha
liée au GDP et la protéine Galpha liée au GTP. La protéine Galpha vide est
représentée à la
Figure 1.
Le terme "affinité" fait référence à la force de l'ensemble des interactions
non-covalentes
entre une molécule, par exemple un sdAb et son partenaire, par exemple un
antigène tel
que la protéine G alpha pleine. L'affinité est généralement représentée par la
constante de
dissociation (Kd). La constante de dissociation (Kd) peut être mesurée par des
méthodes
bien connues, par exemple en FRET ou en SPR.
Le terme FRET (de l'anglais Fluorescence Resonance Energy Transfer )
désigne le
transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes. Le FRET est défini
comme un
transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle¨dipôle
entre un donneur et
un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité
énergétique
entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit
recouvrir, au
moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la
théorie de
Fôrster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux
molécules,
donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de
l'autre, un signal de
FRET sera émis. Dans le cadre de la présente invention, la constante de
dissociation (Kd) est
mesurée par FRET, par exemple comme décrit dans les exemples.
.. Au sens de la présente invention, l' homologie est calculée en comparant
deux séquences
alignées dans une fenêtre de comparaison. L'alignement des séquences permet de
déterminer le nombre de positions (nucléotides ou acides aminés) communes aux
deux
séquences dans la fenêtre de comparaison. Le nombre de positions communes est
ensuite
divisé par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et
multiplié par 100
pour obtenir le pourcentage d'homologie. La détermination du pourcentage
d'homologie de
séquence peut être effectuée manuellement ou en utilisant des programmes
informatiques
bien connus.
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Par "purifié" et "isolé", on entend, en se référant à un anticorps selon
l'invention, que
l'anticorps est présent en l'absence substantielle d'autres macromolécules
biologiques du
même type. Le terme "purifié" tel qu'utilisé ici signifie de préférence au
moins 75% en poids,
plus préférablement au moins 85% en poids, encore plus préférablement au moins
95% en
.. poids, et le plus préférablement au moins 98% en poids d'anticorps, par
rapport à l'ensemble
des macromolécules présentes.
Anticorps sdAb
Un premier objet de l'invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb)
qui se lie à
.. la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3
régions
déterminantes complémentaires dites CDRs (CDR1 à CDR3) et de 4 régions
charnières
dites FRs (FR1 à FR4) selon la formule (I) suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
dont la constante de dissociation (Kd) pour la protéine G alpha pleine mesurée
en FRET est
inférieure à 100 nM.
Selon le premier objet, le sdAb se lie à la protéine G alpha pleine (soit la
protéine G alpha
liée au GTP ou un de ses analogue soit la protéine G alpha liée au GDP ou un
de ses
analogues) avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure
à 100 nM,
par exemple une constante d'affinité inférieure à 75 nM, inférieure à 50 nM,
inférieure à 25
.. nM ou encore inférieure à 10 nM, par exemple entre 1 et 10 nM, entre 10 et
100 nM, entre
10 et 75 nM ou entre 10 et 50 nM.
Selon le premier objet, le sdAb peut être obtenu par immunisation d'un
camélidé comprenant
l'administration d'une protéine G alpha pleine, seule ou en combinaison avec
un adjuvant tel
que par exemple, un sel d'aluminium, l'adjuvant de Freund ou une huile
minérale.
L'administration peut être faite par voie sous-cutanée, intraveineuse,
intramusculaire ou
intra-péritonéale, de préférence par voie sous-cutanée à raison d'une dose
comprise entre 10
pg et 10 mg. Ladite administration peut être renouvelée plusieurs fois, chaque
administration
pouvant être espacée d'un ou plusieurs jours afin d'obtenir une réponse
immunitaire
optimale. Les anticorps générés peuvent alors être récupérés à partir des
cellules
.. mononuclées du sang périphérique via des techniques de purification
classiques connues de
l'homme du métier, par exemple en procédant à une transcription inverse (RT-
PCR) des
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ARNm codant pour cet anticorps afin d'obtenir des ADNc qui vont ensuite être
clonés au sein
d'un vecteur avant d'être sélectionnés par phage display library en
utilisant la protéine G
alpha pleine fixée sur une plaque d'ELISA.
En particulier, les anticorps selon l'invention peuvent être obtenus par la
mise en oeuvre du
protocole décrit dans l'Exemple 1.
Dans un mode de réalisation particulier du premier objet de l'invention :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID
NO : 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ
ID NO: 57 et SEQ ID NO: 65;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID
NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO: 50, SEQ
ID NO: 58 et SEQ ID NO: 66; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97 /o, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO :11, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO: 51, SEQ
ID NO: 59 et SEQ ID NO: 67.
Les séquences d'acides aminés des CDR1, CDR2 et CDR3 peuvent facilement être
combinées
les unes avec les autres pour répondre à la formule (I). L'homme du métier
sait déterminer
sans difficulté dans quelle mesure ces séquences peuvent être combinées de
façon à obtenir
des sdAb selon l'invention présentant la constante de dissociation (Kd)
souhaitée.
Un second objet de la présente invention concerne un anticorps à domaine
unique (sdAb)
qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés
constituée de 3
régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FR1 à FR4) selon la
formule (I)
suivante :
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FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
dans laquelle :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID
NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ
ID NO: 57 et SEQ ID NO: 65;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID
NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO: 50, SEQ
ID NO: 58 et SEQ ID NO: 66; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO :11, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO: 51, SEQ
ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
La protéine G alpha peut être d'origine humaine ou animale. Avantageusement,
le sdAb
selon l'invention se lie à la protéine Galphai (Gai), par exemple la protéine
Galphai1, la
protéine Galphai2 ou la protéine Galphai3. La protéine Galphai1 d'origine
humaine porte
Ildentifiant UniProt P63096-1 pour Ilsoforme 1 et Ildentifiant UniProt P63096-
2 pour
l'isoforme 2. Le gène codant pour la protéine Galphai1 d'origine humaine est
connu sous le
nom de GNAI1 (Gene ID : 2770, NCBI).
Le sdAb selon l'invention peut se présenter sous différentes formes. Il peut
s'agir par
exemple d'un domaine variable de chaîne lourde (VH), d'un domaine variable de
chaîne
lourde de type VHH (VHH), d'un anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb VH),
d'un
anticorps à chaîne lourde de type VHH (HcAb VHH), d'un anticorps à chaîne
lourde IgG anti-
nouveaux récepteurs d'antigène d'immunoglobuline dérivés des poissons
cartilagineux (Ig
NAR) ou encore d'un domaine variable d'Ig NAR (V-NAR). Des exemples de
structures
d'anticorps selon l'invention sont présentés à la Figure 17.
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Dans un mode de réalisation préféré de l'anticorps selon l'invention :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO: 1, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO : 2 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO: 3;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO: 9, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO : 10 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO: 11;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO: 17, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO : 18 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO : 19 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
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14
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO: 25, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO: 26 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO: 27;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO: 33, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO : 34 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO : 35 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO: 41, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO : 42 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO : 43 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO: 49, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO: 50 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
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moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO: 51;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO: 57, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO: 58 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO: 59 ; ou
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID
NO : 65, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO: 66 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins
90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ
ID NO : 67.
Dans un mode de réalisation préféré de l'anticorps selon 'Invention :
- FR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 12, SEQ ID
NO : 20, SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 52, SEQ
ID NO: 60 et SEQ ID NO: 68;
- FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 13, SEQ ID
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NO : 21, SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO: 53, SEQ
ID NO : 61 et SEQ ID NO: 69; et
- FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 14, SEQ ID
NO : 22, SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO: 54, SEQ
ID NO: 62 et SEQ ID NO: 70; et
- FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 15, SEQ ID
NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO: 55, SEQ
ID NO : 63 et SEQ ID NO: 71.
.. Avantageusement, dans un mode de réalisation préféré de l'anticorps selon
l'invention :
- FR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 5, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 6, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 7 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98 h au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 8;
- FR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 12, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
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: 13, FR3, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95%
d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou
même 100% d'homologie présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO :
14 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 15;
- FR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 20, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 21, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 22 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
:23;
- FR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 28, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 29, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 30 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 31;
- FR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
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97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 36, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 37, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 38 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 39;
- FR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 44, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 45, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 46 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 47;
- FR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 52, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
970/0, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 53, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 54 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
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97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 55;
- FR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 60, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 61, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 62 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 63; ou
- FR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec un SEQ ID
NO : 68, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 69, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 70 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO
: 71.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'anticorps selon
l'invention, la
séquence d'acides aminés de formule (I) présente au moins 80% d'homologie, de
préférence
au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%,
au
moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une
séquence
d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 24,
SEQ ID NO :
32, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64 et SEQ ID NO:
72.
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WO 2020/021213 20 PCT/FR2019/051858
L'anticorps selon l'invention peut se lier à la protéine Galpha sous une forme
isolée et/ou
présente dans un environnement membranaire, par exemple il peut se lier à une
protéine
Galpha présente dans une préparation de membranes portant un ou plusieurs RCPG
et une
ou plusieurs protéines G alpha.
Etant donné que l'anticorps selon l'invention se lie à la protéine, il n'est
pas nécessaire que la
protéine G alpha soit complexée avec le RCPG pour que l'anticorps selon
l'invention puisse se
lier à la protéine G.
Dans un premier mode de réalisation particulier, l'anticorps selon l'invention
a une meilleure
affinité pour la protéine Galpha pleine par rapport à la protéine Galpha vide,
en particulier
une meilleure affinité pour la protéine Galpha liée au GTP gamma S. Ainsi, le
rapport Kd
pour la protéine Galpha vide/Kd pour la protéine Galpha pleine mesuré en
FRET de
l'anticorps de l'invention est au moins égal à 2, par exemple au moins égal à
2,5, au moins
égal à 5, au moins égal à 10, et :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une des
séquences d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID
NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la
séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ
ID NO: 26, SEQ ID NO: 34 ; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la
séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO : 19, SEQ
ID NO: 27, SEQ ID NO: 35.
Dans un second mode de réalisation particulier, l'anticorps selon l'invention
a une meilleure
affinité pour la la protéine Galpha vide par rapport à la protéine Galpha
pleine. Ainsi, le
rapport Kd pour la protéine Galpha pleine/Kd pour la protéine Galpha vide
mesuré en
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WO 2020/021213 21
PCT/FR2019/051858
FRET de l'anticorps de l'invention est au moins égal à 5, par exemple au moins
égal à 10, au
moins égal à 20, au moins égal à 50, et:
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une des
séquences d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ
ID NO: 57, SEQ ID NO : 65;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la
séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58, SEQ
ID NO : 66; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la
séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59, SEQ
ID NO: 67.
L'anticorps selon l'invention est particulièrement avantageux dans la mise en
uvre d'un
FRET, notamment pour détecter une protéine Galpha pleine ou une protéine
Galpha vide.
L'anticorps selon l'invention, peut être ainsi couplé à une molécule
permettant sa détection.
Il peut s'agir d'un tag peptidique, par exemple le tag 6XHis. Il peut
également s'agir d'une
enzyme capable de générer un signal détectable par colorimétrie, fluorescence
ou
luminescence lorsqu'elle est en présence de son substrat, par exemple la P-
galactosidase, la
phosphatase alcaline ou la peroxydase de raifort. Il peut également s'agir
d'un radionucléide,
d'un composé fluorescent, d'un composé luminescent ou d'un colorant.
Avantageusement,
l'anticorps selon l'invention est couplé à un membre d'un couple de
partenaires de FRET.
Couples de partenaires de FRET
Les couples de partenaires de FRET sont de préférence constitués par un
composé
fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur d'énergie.
Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une
interaction
dipôle¨dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène
physique
nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que
le spectre
d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre
d'absorption de
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l'accepteur. En accord avec la théorie de Fiirster, le FRET est un processus
qui dépend de la
distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces
molécules sont à
proximité l'une de l'autre, et que le composé donneur est excité à une
longueur d'onde
correspondant à un de ses pics d'absorption, un transfert d'énergie aura lieu,
provoquant
une diminution de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission du
donneur, et une
augmentation de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission de
l'accepteur.
La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal
de FRET est à
la portée de l'homme du métier. Des couples donneur-accepteur utilisables pour
étudier les
phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz
(Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edition, Kluwer academic/plenum
publishers,
NY (1999)), auquel l'homme du métier pourra se référer.
Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms,
de
préférence comprise dans la gamme 0,5-6 ms), en particulier les chélates ou
cryptates de
terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en
temps résolu,
c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET en s'affranchissant du
phénomène d'auto-
fluorescence émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de
manière générale
préférés pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Snn3+), de néodyme (Nd3+),
d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres
rares également
appropriés aux fins de l'invention, mais les chélates et cryptates d'europium
(Eu3+) et de
terbium (Tb3+) sont particulièrement préférés.
De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont
actuellement
commercialisés par les sociétés PerkinElmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays.
Des exemples de chélates ou cryptates de terres rares appropriés aux fins de
l'invention
sont :
= Les cryptates de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine.
De tels
cryptates de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180
492,
EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96 877. Les
cryptates
de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux
fins de la
présente invention. Des cryptates de lanthanides sont commercialisés par la
société Cisbio
Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptates
d'europium de formules
ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe
réactif, ici par
exemple un groupe NH2) :
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WO 2020/021213 23 PCT/FR2019/051858
H
0 /
N..........õ. NH2
I
¨ .
/ \ N
+ N¨,
\ / H N EU3 -N N
_ \ /
TrisBiPy-Eu Py-BiPy-Eu
H
0 0 N ,vµNH2
HOOC \ N.--.,õ. NH2
¨ H
/ \
N E 113+ W., NLE113 N-,
\ /
HOOC ¨ \ /COOH HOOC ¨ COOH
HOOC COOH HOOC COOH
TrisBiPy-tetraacide-Eu Py-BiPy-tetraacide-Eu
= Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761
481,
US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801
722,
US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les
brevets
EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates
composés
d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont
commercialisés par la société PerkinElmer.
= Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le
tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles
aromatiques,
tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-
1024 "Synthesis
and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide
complexes suitable
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WO 2020/021213 24 PCT/FR2019/051858
for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser
les complexes
décrits dans la demande WO 2009/010580.
= Les cryptates de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP
1 154 990 sont
également utilisables.
= Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un
composé à
marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
Her¨(c112)4
0 NH 0 NH Tb3' HN 0 HN
0 0
NH HN
ÇeN\
et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721
(composé
6a page 89).
= Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lunniphore, commercialisé par
Cisbio
Bioassays.
= Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous
(qui peut être
couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) :
=
H3C CH3
rN Eu N
)- CH,-(0)- NOS
N
h
CH3
0
= Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion
ruthénium et
de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(II) tris(2,2'-bipyridine).
= Le chélate de terbium DTPA-cs124 Tb, commercialisé par la société Life
technologies de
formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe
réactif R) et
dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821.
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WO 2020/021213 PCT/FR2019/051858
CH3
NH
C'
" 0
0
COi
\-00,11334.
sR
= Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al
(Journal of
5 Luminescence 1997, 75: 149-169) :
NCS
N¨N
N- I
,
\
-0 0=Cµ0-
HO OH
Tb-W14016
De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est
choisi parmi :
un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un
cryptate de
10 terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; les chélates et
les cryptates
d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
Le composé fluorescent accepteur doit posséder un spectre d'absorption qui
recouvre le
spectre d'émission du donneur (Mathis G, Clin. Chem. 1993, 39(9):1953-1959) et
peut être
choisi dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles
connues sous la
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WO 2020/021213 26 PCT/FR2019/051858
dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes,
telles que les
rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les
coumarines, les
proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-
dipyrrométhène
(commercialisés sous la dénomination Bodipy ), les fluorophores connus sous
la
dénomination Atto , les fluorophores connus sous la dénomination DY , les
composés
connus sous la dénomination Alexa , le nitrobenzoxadiazole.
Avantageusement, les
composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les
rhodamines,
les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines,
les fluorescéines,
les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
Les expressions les cyanines et les rhodamines doivent être
respectivement
comprises comme les dérivés de cyanine et les dérivés de rhodamine .
L'homme du
métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce.
Les composés Alexa sont commercialisés par la société Invitrogen; les
composés
Atto sont commercialisés par la société Atto-tec ; les composés DY sont
commercialisés par la société Dyomics ; les composés Cy sont
commercialisés par la
société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par
divers
fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou
Acros.
Aux fins de l'invention, les dérivés de cyanines ou de la fluorescéine sont
préférés comme
composés fluorescents accepteurs.
Marquage des anticorps par des composés donneurs ou accepteurs d'énergie
Les anticorps selon l'invention peuvent être marqués par les fluorophores de
manière directe
(covalente) ou indirecte. De manière préférée, au moins un des partenaires de
FRET est lié
de manière covalente au premier ou au second anticorps, et de manière encore
plus
préférée, les deux partenaires de FRET sont respectivement liés de manière
covalente au
premier et au second anticorps.
Le marquage direct d'un anticorps selon l'invention par un composé donneur ou
accepteur
fluorescent est effectué par les techniques classiques de conjugaison faisant
appel à
l'utilisation de groupes réactifs. Les composés donneurs ou accepteurs
fluorescents sont
généralement commercialisés sous forme fonctionnalisée , c'est-à-dire
qu'ils portent un
groupe réactif susceptible de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur le
composé à
marquer, en l'occurrence, l'anticorps selon l'invention.
Typiquement, le groupe réactif présent sur le composé fluorescent donneur ou
accepteur est
un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente
lorsqu'il est mis
.. en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié,
respectivement. A titre
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d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de
liaison covalente
formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous :
Groupe électrophile Groupe nucléophile Type de liaison
acrylamide thiol thioéther
halogénure d'acyle amine/aniline carboxamide
aldéhyde amine/aniline imine
aldéhyde ou cétone hydrazine hydrazone
aldéhyde ou cétone hydroxylamine oxime
alkylsulfonate thiol thioéther
anhydride amine/aniline carboxamide
halogénure d'aryle thiol thiophénol
halogénure d'aryle amine arylamine
aziridine thiol thioéther
carbodiimide acide carboxylique N-acylurée ou anhydride
ester activé* amine/aniline carboxamide
haloacétamide thiol thioéther
halotriazine amine/aniline aminotriazine
imido ester amine/aniline amidine
isocyanate amine/aniline Urée
isothiocyanate amine/aniline thiourée
maléimide thiol thioéther
su lfon ate ester amine/aniline alkylamine
halogénure de sulfonyle amine/aniline sulfonamide
* : par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est:
= un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-0C41-002),
sulfo-
succinimidyloxy (-0C4H3NO2-S03H) ;
= un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant
électrophile tel
que les groupes nitro, fluoro, chloro, cyano, trifluorométhyle, formant ainsi
un aryle
ester activé ;
= un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un
anhydride -
OCORa ou ¨OCNRaNHRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou différents et
sont
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choisis parmi les groupes alkyle en C1-C6, perfluoroallryle en C1-05, alkoxy
en C1-C6,
cyclohexyle ;
= le 3-diméthylaminopropyle, ou le N-morpholinoéthyle.
Les composés fluorescents donneurs et accepteurs disponibles dans le commerce
comportent généralement une fonction maléimide ou un ester activé, le plus
souvent par un
groupe NHS (N-hydroxysuccinimidyle), qui réagissent avec les groupes thiol et
amines
respectivement et peuvent donc être utilisés pour le marquage d'anticorps. Les
anticorps
marqués sont caractérisés par le rapport molaire final (RMF) qui représente le
nombre
moyen de molécules de marqueur greffés à l'anticorps selon l'invention.
Il peut être avantageux d'utiliser l'un des groupes fonctionnels naturellement
présent dans
les anticorps selon l'invention : le groupe amino terminal, le groupe
carboxylate terminal, les
groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines
des lysines,
les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les
groupes phénols
des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des
méthionines,
les groupes imidazoles des histidines.
Une autre approche pour le marquage d'un anticorps selon l'invention par un
composé
fluorescent consiste à introduire un groupe réactif dans l'anticorps, par
exemple un groupe
NHS ou un groupe maléimide, et de le mettre en présence d'un fluorophore
portant un
groupe fonctionnel qui réagira avec le groupe réactif pour former une liaison
covalente.
Il est important de vérifier que l'anticorps selon l'invention marqué conserve
une affinité
suffisante pour la protéine Galpha ; cela peut être contrôlé de manière simple
par des
expériences de liaison classiques, permettant de calculer la constante
d'affinité de l'anticorps
selon l'invention marqué pour la protéine Galpha.
L'anticorps selon l'invention peut également être marqué par un composé
fluorescent de
manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu d'incubation un
anticorps dit
secondaire , lui-même lié de manière covalente à un composé fluorescent, cet
anticorps
reconnaissant de manière spécifique l'anticorps selon l'invention ou bien un
haptène présent
sur cet anticorps selon l'invention (tel qu'un groupe dinitrophényle,
dogoxigénine, la
fluorescéine, les étiquettes FLAG, c-myc, 6-HIS). L'anticorps secondaire peut
être un
anticorps anti-espèce.
Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de la
biotine sur
l'anticorps selon l'invention à marquer, puis d'incuber ce ligand biotinylé en
présence de
streptavidine marquée par un fluorophore. Le marquage de l'anticorps selon
l'invention par la
biotine relève des connaissances générales de l'homme du métier, et la société
Cisbio
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Bioassays commercialise par exemple de la streptavidine marquée avec le
fluorophore dont
la dénomination commerciale est d2 (réf 610SADLA).
Mesure du signal de TR-FRET
La mesure du signal de TR-FRET est effectuée après excitation du milieu de
mesure par une
source pulsée dans une bande d'excitation du composé donneur, de préférence
après un
délai de 1 à 500 microsecondes (ps) et pendant une durée de 10 à 2000 ps. De
manière
encore plus préférée, le délai est de 50 ps (temps résolu).
Le signal de TR-FRET peut être constitué par l'intensité de la luminescence
mesurée, soit par
sa durée de vie.
L'anticorps selon l'invention peut être compris dans un polypeptide. Il peut
également être
immobilisé sur un support solide.
Un autre aspect de l'invention concerne un complexe comprenant un anticorps
selon
l'invention, par exemple un complexe comprenant un anticorps selon l'invention
et une
protéine G alpha.
L'anticorps selon l'invention peut être une version humanisé , obtenue par
exemple en
remplaçant un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans la séquence d'acides aminés
de
l'anticorps (et en particulier dans les FRs) par un ou plusieurs acides aminés
apparaissant à
la ou aux position(s) correspondante(s) dans un anticorps conventionnel
tétramérique
humain. Plusieurs techniques d'humanisation sont décrites dans la littérature
et l'Homme du
métier n'aura aucune difficulté à les mettre en uvre pour préparer les
anticorps selon
l'invention.
L'anticorps selon l'invention peut être produit par toute technique connue
dans l'art, telle
que, sans limitation, toute technique chimique, biologique, génétique ou
enzymatique, seule
ou en combinaison.
Lorsque la séquence d'acides aminés de l'anticorps désiré est connue, l'Homme
de l'art peut
facilement produire ledit anticorps par des techniques conventionnelles pour
la production de
polypeptides. Par exemple, l'anticorps selon l'invention peut être synthétisé
en utilisant une
méthode en phase solide bien connue, de préférence en utilisant un appareil de
synthèse de
polypeptides disponible dans le commerce (tel que celui fabriqué par Applied
Biosystems,
Foster City, Californie) et en suivant les instructions du fabricant. En
variante, l'anticorps
selon l'invention peut être synthétisé par des techniques d'ADN recombinant
connues dans la
littérature. Par exemple, l'anticorps selon l'invention peut être obtenu en
exprimant une
séquence d'acides nucléiques codant ledit anticorps après incorporation de
ladite séquence
nucléique dans un ou plusieurs vecteurs d'expression et introduction de tels
vecteurs dans
une cellule hôte appropriée qui exprimera l'anticorps désiré.
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Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est purifié (ou isolé), par
exemple à partir du
surnageant de culture de cellules hôtes exprimant l'anticorps désiré, en
mettant en oeuvre
des techniques de purification connues, telle que la purification sur colonne
de
chromatographie et/ou d'affinité.
Autres objets
Un troisième objet de la présente invention concerne une séquence d'acides
nucléiques
codant pour un anticorps selon l'invention.
Un quatrième objet de la présente invention concerne un vecteur recombinant
comprenant
une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Tout type de vecteur
adapté à la
production d'anticorps peut être utilisé dans le cadre de l'invention. Le
vecteur comprendra
les séquences nucléiques nécessaires pour produire l'anticorps selon
l'invention, par exemple
des séquences promotrices, des séquences régulatrices, etc. La préparation
d'un vecteur
approprié est largement décrite dans la littérature.
Un cinquième objet de l'invention concerne une cellule comprenant un vecteur
selon
l'invention ou une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. La cellule
selon l'invention
peut être obtenue par des méthodes largement décrites dans la littérature, par
exemple en
transfectant un clone cellulaire avec un vecteur selon l'invention ou une
séquence d'acides
nucléiques. L'invention n'est pas limitée à un type cellulaire particulier.
Toute cellule capable
de produire des anticorps peut être utilisée dans le cadre de l'invention. Il
peut s'agir de
cellules eucaryotes, telles que les cellules de mammifères, par exemple les
cellules humaines
ou de souris ou de cellules procaryotes, par exemple les bactéries ou encore
les levures.
.. L'invention sera davantage illustrée par les figures et exemples suivants.
Cependant, ces
exemples et ces figures ne doivent en aucun cas être interprétés comme
limitant la portée
de l'invention.
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LISTAGE DE SEQUENCES
SEQ ID
Nom SEQUENCE
NO:
F11 CDR1 1 GFAFSDTW
Fil CDR2 2 ITRGDQNT
Fil CDR3 3 AKEGPIGPPDY
F11 FR1 5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEAS
F11 FR2 6 MYWVRQAPGKGLEWVAT
F11 FR3 7 YYTESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYC
F11 FR4 8 WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFAFSDTWMYWVRQAPGKGLEWVATIT
F11 4 RGDQNTYYTESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKEGPIGPP
DYWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
B11 CDR1 9 GFTFNDYW
B11 CDR2 10 INTGGSST
B11 CDR3 11 AKEGPVGPPDY
B11 FR1 12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
B11 FR2 13 MYWVRQAPGKGLEWVSS
B11 FR3 14 YYSDSVKGRFTTARDNAKNSLYLQLNSLRPEDTAVYYC
B11 FR4 15 WGQGTQVWSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDYWMYWVRQAPGKGLEWVSSIN
B11 16 TGGSSTYYSDSVKGRFTTARDNAKNSLYLQLNSLRPEDTAVYYCAKEGPVGPP
DYWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
F9 CDR1 17 GFTFDDYA
F9 CDR2 18 ISSRGITT
F9 CDR3 19 ATDPSTWYRGTAH
F9 FR1 20 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
F9 FR2 21 MNVVVRQAAGKGPBNVAS
F9 FR3 22 DYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPDDAAVYYC
F9 FR4 23 WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMNWVRQAAGKGPEVVVASIS
F9 24 SRGITTDYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPDDAAVYYCATDPSTWY
RGTAHWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
G6 CDR1 25 GFTFSTYR
' G6 CDR2 26 ISSRGITT
CA 03107385 2021-01-22
WO 2020/021213 32
PCT/FR2019/051858
G6 CDR3 27 ATDPSTWYRGTAH
G6 FR1 28 EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAAS
G6 FR2 29 MNWVRQAPGKGLEWVAS
G6 FR3 30 DYAHPVKGRFIVSRDNTKNTLYLQMNSLKPDDAAVYYC
G6 FR4 31 WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYRMNWVRQAPGKGLEVVVASIS
G6 32 SRGITTDYAHPVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPDDAAVYYCATDPSTVVY
RGTAHWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
F4 CDR1 33 GFTFSSYY
F4 CDR2 34 IYNGDGDT
F4 CDR3 35 NAYDGTLLRDY
F4 FR1 36 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
F4 FR2 37 MNWVRQAPGKGLEWVSS
F4 FR3 38 DYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLEMSDLINQDTAIYYC
F4 FR4 39 WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSSIY
F4 40 NGDGDTDYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLEMSDLKVQDTAIYYCNAYDGTLLR
DYWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
A10 CDR1 41 GLTYSDYA
A10 CDR2 42 ISSRGITT
A10 CDR3 43 TTVSYWRYEY
A10 FR1 44 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
A10 FR2 45 MSWVRQAAGKGPEWVAS
A10 FR3 46 DYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYC
A10 FR4 47 WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTYSDYAMSWVRQAAGKGPEWVASIS
A10 48 SRGITTDYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCTTVSYWRYE
YWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
F2 CDR1 49 GFTFSSYA
F2 CDR2 50 ISSRGITT
F2 CDR3 51 VKGWMPTG
F2 FR1 52 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
F2 FR2 53 MSWVRQAAGKGPEVVVAS
_
F2 FR3 54 DYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPEDTALYYC
F2 FR4 55 WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS
59HHHHHHW9N7C133SFI)lb3VVVSSAJMI9b9MAGN1SAV9
SCIAM1AkIlDW9103d)11SNIARY1KUNNINCDJSALd2:19>IASHVACILLID2ISS ZL L9
ISVAM3d9)19dV2MMASIAJSAMSdIADSVVDS1111S99dbA7999S3b1bAb
S9HHHHHHvv9N1ca]srD1tmvvvssiunb1pbDrA TL 1711i L9
DMADICI3d>11SN14b1KIINDIINCIUSAId219)1ASHVAG 01 nd L9
SVNV13d9)19dteôUAMS14 69 ad ID
SWDS1211SD9dbA199DS3b1bAb 89 TUA L9
daN1SAVDSCIAM1/1111 19 1103 L9
LLIDUSSI 99 aaD L9
9AMSdIA9 S9 TUCID ID
S9HHHHHHWDN1033SI1>lb3VWSSAIMIDb9MACIN1SA
79N3AM1AIIIDAA1VICI3d>11NNWMAlINMVNCIUSLLe:19>IASHVACIII1911 179 Z3
SSISVAM3d9)199eMAMVIAJVASSAJLADS9IDS12:11S99dbA1999S3A1bA3
S9HHHHHHVY9N1033S17)1b3VWSSALAbl9b9M 9 i71Id Z3
DANIVIC1201NNWH1KIINNVNCIIISLIA119)1ASHVA0 Z9 Did Z3
SVAM3d9)19S\ibUAMVW 19 ai Z3
S913S1U1S99db/11999S3A1bAJ 09 I2ld Z3
dON7SA1DN3AM1/1211 6S 21CID Z3
IIIMISSI 8S aCID Z3
VASSA11.9 LS TUCID Z3
S9HHHHHHVV9N1C133S111b3VWSSALAbl9bDM
91d14M9>IADAKIVICI3d)11SNInlblICIINNINCRJSALAII9NASHVACILLIDUS 9S Zd
SISV/VV13dD>19WbUAMSIAIVASSAIADSWDS1211S9DdbA1999S3A1bAJ
8S8IS0/6IODIVIDd EE
UZIZO/OZOZ OM
ZZ-TO-TZOZ g8LOT0 VD
CA 03107385 2021-01-22
WO 2020/021213 34 PCT/FR2019/051858
EXEMPLES
Exemple 1 : Immunisation de lamas et construction d'une bibliothèque de sdAb
Deux lamas (Lama glama) ont été immunisés par voie sous-cutanée avec la
protéine TST-
Galphail humaine recombinante (protéine Galphai1 de séquence UniProt P63096-1
tagguée
en N-terminal avec le tag TwinStreptag (TST) (IBA) via un linker TEV) liée au
GDP ou au
GTPgS. La construction d'une bibliothèque de VH / VHH a été réalisées dans la
souche E. coli
TG1 comme décrit précédemment dans (Alvarez-Rueda, Behar et al., 2007, Behar
Chames et
al. 2009). La diversité des bibliothèques obtenue était supérieure à 108
clones.
Production de particules de phage-VH / VHH
Cinquante mL de 2YTA (2YT contenant 100 pg/mL d'ampicilline) ont été inoculés
avec 50 pL
de la bibliothèque de bactéries et incubés à 37 C sous agitation (250 tr/min)
jusqu'à une
D0600 comprise entre 0,4 et 0,6. Les bactéries ont été infectées par le phage
KM13 en
utilisant une multiplicité d'infection de 20, pendant 30 min à 37 C sans
agitation. La culture a
été centrifugée pendant 10 minutes à 3000 g, et le culot bactérien a été remis
en suspension
dans 250 ml de 2YTA contenant 50 pg/ml de kanamycine pour produire les phages-
VH
pendant une nuit à 30 C sous agitation. La culture a été divisée en 10 tubes
et centrifugée
pendant 20 minutes à 3000 g à 4 C. Pour chaque tube, 5 mL de 20% de PEG 8000,
2,5 mM
de NaCI ont été ajoutés au surnageant dans un nouveau tube propre et incubés
pendant 1 h
sur de la glace pour induire la précipitation des particules phagiques. La
solution a été
centrifugée pendant 15 min à 3000 g à 4 C et le culot contenant les phages a
été remis en
suspension dans 1 ml de PBS. Une autre étape de centrifugation (2 min, 16000
g) a été
réalisée pour éliminer les contaminants bactériens et 200 pL de PEG 8000 NaCI
ont été
ajoutés aux surnageants dans un nouveau tube. Après 30 min sur de la glace et
une
dernière centrifugation (5 min, 16000 g), le culot contenant le phage a été
remis en
suspension dans 1 mL de PBS pour obtenir un phage-VH prêt à l'emploi pour les
sélections.
Sélection de VH / VHH par phage display
Après une étape de déplétion de la bibliothèque de phage sur plaque contenant
de la Strep-
Tactin immobilisée (IBA #2-4101-001) pour éviter la sélection de VH anti-Strep-
Tactin, un
premier cycle de sélection a été effectué sur une plaque Strep-Tactin
contenant la Galphai1
recombinante humaine fusionnée à un Twin-Strep-tag et pré-chargée avec 10 pM
de GDP
pendant 2h à 37 C et saturé avec 2% de BSA dans du PBS pendant 1 h à
température
ambiante. Après 2 heures d'incubation à température ambiante, les plaques ont
été lavées
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WO 2020/021213 35 PCT/FR2019/051858
avec du Tween PBS à 0,1% et du PBS. Les phages liés ont été élues en utilisant
une solution
de trypsine à 1 mg/mi (Sigma) pendant 30 minutes à température ambiante sous
agitation.
Les phages ont été récupérés et amplifiés par infection de la souche
bactérienne TG1. Un
second cycle de sélection a été effectué de manière similaire sur Galphai1 pré-
chargée avec
10 pM de GTP. Une seconde stratégie a consisté en deux tours de sélection
contre la
Galphai1 en absence de nucléotides. Une troisième stratégie visant à favoriser
la sélection de
VH spécifiques de la conformation active (GTP) de Galphai a consisté en deux
cycles de
sélection sur Galphai1 Twin-Strep-tag préchargée de GTPgS 10 pM, suite à une
étape de
déplétion réalisée sur plaque recouverte de Galphai1 Twin-Strep-tag préchargée
par 10 pM
de GDP. Des colonies individuelles de TG1 ont été cultivées dans des plaques
96 deep well
dans 400 ul de 2YTA contenant 2% de glucose. Après une croissance d'une nuit,
la culture a
été congelée à -80 C dans du glycérol à 20% et le reste de la culture a été
utilisé pour la
production de VH soluble induite par l'isopropy1-8-D-thiogalactopyranoside
(IPTG) dans du
2YTA. Les surnageants contenant les VH ont été utilisés pour les tests de
criblage.
Production et purification de VH.
Pour la production de VH à grande échelle, les phagemides positifs ont été
transformés dans
la souche E. coli BL21 DE3. Les bactéries transformées ont été cultivées dans
400 ml de
2YTA jusqu'à une valeur de D0600 de 0,7 et induites avec 100 pM d'IPTG pour
une croissance
pendant une nuit à 30 C sous agitation. Les bactéries ont été récupérées par
centrifugation
et lysées en utilisant le réactif BugbusterTM (Novagen). Après centrifugation
pendant 20
minutes à 3000 g, les VH ont été purifiés à partir du surnageant en utilisant
une
Chromatographie d'affinité TALON SuperflowTM (GE Healthcare) selon les
instructions du
fabricant.
Production des HcAb-VH
Les gènes des VH ont été clonés dans le vecteur pHLsec (Aricescu AR, Lu W,
Jones EY. Acta
Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006 Oct,62(Pt 10):1243-50) en fusion avec le
gène codant
pour les domaines CH2 et CH3 d'une IgG1 humaine, suivi d'une étiquette
6histidines, par
synthèse de gêne (Genecust). Le plasmide correspondant a été utilisé pour
transfecter la
lignée HEK293 adaptée à la suspension, et les cellules ont été incubées sous
agitation
suivant les instructions du fabricant (FreeStyle 293 Expression System,
Thermofisher). Après
5 jours, les surnageants ont été récupérés et directement utilisés pour
purifier les HcAb par
chromatographie d'affinité TALON SupertlowTM selon les instructions du
fabricant.
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Exemple 2: Détermination de la constante d'affinité (Kd) d'anticorps à domaine
unique (sdAb) selon l'invention en FRET (HTRF)
Matériel :
La protéine TST-Galphai1 recombinantes (protéine Galphai1 de séquence UniProt
P63096-1
tagguée en N-terminal avec le tag TwinStreptag (TST) (IBA) via un linker TEV)
a été
produite dans des cellules d'insectes Sf9 (infection par Baculovirus) puis
purifiée sur une
colonne d'affinité via le tag TwinStreptag (TST) (Strep-Tactin Superflow high
capacity resin
(IBA, Catalogue : 2-1208-002)).
Un anticorps anti-TST (anti Twin-Strep-Tag, référence catalogue 2-1517-001
chez IBA) a été
marqué avec la sonde fluorescente donneur Lumi4C)Tb, compatible pour une
détection TR-
FRET avec l'accepteur d2. L'anticorps ainsi obtenu a été appelé anticorps
anti TST-
Lu m i4Tb .
Pour la production des neuf domaines variables de chaine lourde (VH) (F9 : SEQ
ID No : 24,
F4: SEQ ID No : 40, B11 : SEQ ID No : 16, F11 : SEQ ID No : 4, G6 : SEQ ID No:
32, A10:
SEQ ID No: 48, E2: SEQ ID No : 64, F2: SEQ ID No: 56 et G7: SEQ ID No: 72) à
grande
échelle, les phagemides codant lesdits VH ont été transformés dans la souche
E. coli BL21
DE3. Les bactéries transformées ont été cultivées dans 400 ml de 2YTA jusqu'à
une valeur
de D0600 de 0,7 et induites avec 100 pM d'IPTG pour une croissance pendant une
nuit à
30 C sous agitation. Les bactéries ont été récupérées par centrifugation et
lysées en utilisant
le réactif BugbusterTM (Novagen). Après centrifugation pendant 20 minutes à
3000g, les VH
ont été purifiés à partir du surnageant en utilisant une Chromatographie
d'affinité TALON
SuperflowTM (GE Healthcare) selon les instructions du fabricant.
Pour la production des anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb-VH), les
gènes les VH ont
été clonés dans le vecteur pHLsec (Aricescu AR, Lu W, Jones EY. Acta
Crystallogr D Biol
Crystallogr. 2006 Oct;62(Pt 10):1243-50) en fusion avec le gène codant pour
les domaines
CH2 et CH3 d'une IgG1 humaine, suivi d'une étiquette 6histidines, par synthèse
de gène
(Genecust). Le plasmide correspondant a été utilisé pour transfecter la lignée
HEK293
adaptée à la suspension, et les cellules ont été incubées sous agitation
suivant les
instructions du fabricant (FreeStyle 293 Expression System, Thermofisher).
Après 5 jours, les
surnageants ont été récupérés et directement utilisés pour purifier les HcAb-
VH par
chromatographie d'affinité TALON SuperflowTM selon les instructions du
fabricant.
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Les sdAb obtenus (VH ou HcAb-VH) ont été marqués avec la sonde fluorescente
accepteur
d2, compatible pour une détection TR-FRET avec le donneur Lumi4Tb qui a été
utilisé pour
marquer l'anticorps anti-TST. Les anticorps marqués ont été appelés
anticorps anti
Galphai-d2 .
Les nucléotides GDP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références
catalogues
respectives G7127 et G8634).
Les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été achetées chez
Greiner Bio
One (référence Catalogue 784075).
Méthode :
1) Préparation des réactifs :
Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCl2
10mM, NaCI
10mM, BSA 0,1%. La protéine recombinante TST-Galphai1 a été préparée 4X pour
une
utilisation à 1nM en concentration finale dans le puits (hormis autres
spécifications). Les
nucléotides GDP ou GTPyS ont été préparés 4X pour une utilisation à 10 pM en
concentration
.. finale dans le puits. L'anticorps anti TST-Lumi4Tb a été préparé 4X pour
une utilisation à
0.25nM en concentration finale dans le puits. Les différents anticorps anti
Galphai-d2 ont été
préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits indiquées sur
les graphiques,
allant jusqu'à 200 nM.
2) Distribution des réactifs dans les olaaues 384 puits :
- Protéine TST-Galphai1 : 5pL
- Nucléotides (GDP ou GTPgS) : 5pL
- Anticorps anti TST-Lumi4Tb (donneur) : 5pL
- Anticorps anti Galphai-d2 (accepteur) : 5pL
Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des
puits ne
contenant que les deux réactifs de détection (marqués avec le donneur et
l'accepteur), c'est-
à-dire l'anticorps anti TST-Lumi4Tb (donneur) et l'anticorps anti Galphai-d2
(accepteur), les
autres composants ayant été remplacés par leur tampon de dilution.
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WO 2020/021213 38
PCT/FR2019/051858
3) Lecture du signal HTRF:
Les plaques ont été incubées à 21 C pendant 20h puis le signal HTRF a été
mesuré sur le
lecteur PHERAstar de chez BMG Labtech, avec la configuration suivante :
- Module : HTRF (Excitation 337nm, Emission 665nm et 620nm)
- Excitation : laser, 40 flashs
- Fenêtre de lecture : délais : 60ps ¨ Intégration : 400ps
4) Traitement du signal :
A partir des signaux bruts à 665nm et 620nm, le ratio HTRF a été calculé selon
la formule
suivante :
.. Ratio HTRF = Signal à 665nm / Signal à 620nm * 10,000
5) Principe de l'essai TR-FRET (HTRF) pour la détermination de l'affinité (Kd)
des
domaines variables de chaine lourde VH
Le test TR-FRET (HTRF) a permis de déterminer l'affinité (Kd) des différents
anticorps pour
la protéine Galphai1, la Figure 2 illustre le principe de ce test. Une
concentration fixe (1M)
de la protéine Galphai1 recombinante purifiée et tagguée avec TST (Protéine
TST-Galphai1)
a été mise en présence d'un excès de nucléotide (GDP ou GTPgS) (10pM), d'une
concentration fixe (0.5nM) d'anticorps anti TST marqué avec le donneur Lumi4Tb
(Anticorps
anti TST-Lumi4Tb) et de concentrations croissantes d'anticorps à domaine
unique de type
VH marqués avec l'accepteur d2 (Anticorps VH anti Galphai-d2). Le signal HTRF
total a été
alors obtenu.
En parallèle, une condition sans protéine Galphai1 a été réalisée pour
déterminer le signal
HTRF non spécifique.
Le signal HTRF spécifique de l'interaction entre l'anticorps et la protéine
Galphai1 a alors été
calculé par soustraction du signal non spécifique au signal total. Les données
du signal HTRF
spécifique ont ensuite été analysées sur le logiciel GraphPad Prism7 par
l'utilisation d'un fit
One site specific binding . La constante de dissociation (Kd) de l'anticorps
pour la protéine
Galphai1 a alors été déterminée. Les résultats qui ont été obtenus avec les
anticorps qui se
lient à la protéine Galpha liée au GTP gamma S et avec les anticorps qui se
lient à la protéine
Galpha liée au GDP sont indiqués dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessous.
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6) Principe de l'essai HTRF (TR-FRET) pour la détermination de l'affinité (Kd)
des
anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb VH)
La Figure 12 illustre le principe de l'essai TR-FRET (HTRF) qui a été mis en
uvre pour
déterminer l'affinité (Kd) des différents HcAb-VH pour la protéine Galphail.
Une
concentration fixe (1M) de la protéine Galphai1 recombinante purifiée et
tagguée avec TST
(Protéine TST-Galphai1) est mise en présence d'un excès de nucléotide (GDP ou
GTPgS)
(10pM), d'une concentration fixe (0.5nM) d'anticorps anti TST marqué avec le
donneur
Lumi4Tb (Ac anti Tag-Donneur), d'une concentration fixe (50nM) d'anticorps
anti 6HIS
marqué à l'accepteur d2 (Anticorps anti 6HIS-accepteur, Cisbio Bioassays
#61HISDLF et de
concentrations croissantes d'un anticorps HcAb-VH taggué au 6HIS (6HIS-Fc-
sdAb). Le signal
HTRF total a alors été obtenu.
En parallèle, une condition sans protéine Galphai1 est réalisée pour
déterminer le signal
HTRF non spécifique.
Le signal HTRF spécifique de l'interaction entre le HcAb-VH et la protéine
Galphai1 a alors
été calculé par soustraction du signal non spécifique au signal total. Les
données du signal
HTRF spécifique ont ensuite été analysées sur le logiciel GraphPad Prism7 par
l'utilisation
d'un fit One site specific binding . La constante de dissociation (Kd) du
HcAb-VH pour la
protéine Galphai1 a alors été déterminée. Les résultats obtenus avec les
anticorps HCAb-
B11, HCAb-F9,1-1CAb-G7, HCAb-A10 sont indiqués dans le tableau 3 ci-dessous.
Résultats :
Les Figures 3 à 11 présentent les courbes de saturation obtenues pour les VH.
Les VH (F9, F11, B11, F4 et G6) ont une affinité élevée pour la protéine G
alpha liée au GTP
gamma S, avec une constante de dissociation (Kd) inférieure à 100 nM allant
jusqu'à 1nM
par exemple pour l'anticorps B11.
Anticorps testé Affinité (moyenne Kd en Affinité (moyenne Kd en
nM) pour la protéine G nM)
pour la protéine G
alpha liée au GTPgS alpha vide
F9 32 nM > 200 nM
F11 3 nM 17
B11 1 nM 17
F4 31 nM 83
G6 95 nM >150 nM
Tableau 1. : Affinité (Kd en nM) des VH_pour la protéine G alphail liée au
GTPgammaS et pour la protéine G alphail vide
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Les VH (A10, G7, F2 et E2) présentent une affinité élevée pour la protéine G
alpha liée au
GDP, avec une constante de dissociation (Kd) inférieure à 100 nM allant
jusqu'à 14nM par
exemple pour l'anticorps F2.
Anticorps testé Affinité (moyenne Kd en Affinité (moyenne Kd en
nM) pour la protéine G nM)
pour la protéine G
alpha liée au GDP alpha vide
A10 15 nM 1
G7 31 nM 5
F2 14 nM 1
E2 72 nM 2
Tableau 2 : Affinité (Kd en nM) des VH pour la protéine G alphail liée au GDP
et
pour la protéine G alphail vide
Les Figures 13 à 16 présentent les courbes de saturation obtenues pour les
HcAb VH.
Les anticorps HcAb-B11, HcAb-F9, HcAb-G7 et HcAb-A10 présentent une affinité
élevée pour
la protéine G alpha liée au GDP ou au GTP gamma S, avec une constante de
dissociation
(Kd) inférieure à 10 nM allant jusqu'à 1nM par exemple pour l'anticorps HCAb-
B11 qui se lie
à la protéine Galpha liée au GTP gamma S.
Anticorps testé Affinité (moyenne Kd en nM)
pour la protéine G alpha
pleine (liée au GDP ou
GTPgammaS)
HcAb-B11 1 nM pour GTPgammaS
HcAb-F9 3 nM pour GTPgammaS
HcAb-G7 5 nM pour GDP
HcAb-A10 3 nM pour GDP
Tableau 3 : Affinité (Kd en nM) des HcAb-VH pour la protéine G alphail liée au
GDP ou au GTPgammaS
