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HUILE DE MICROORGANISMES RICHES EN ACIDE DOCOSAHEXAÉNOIQUE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une huile de microorganismes riche en acide
docosahexénoïque (DHA, 022:6n3), comprenant plus de 60% de DHA par rapport à
la masse
totale de matière grasse et au moins 80% de triglycérides par rapport à la
masse totale de
matière grasse.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les huiles contenant du DHA proviennent de plusieurs sources, les plus connues
sont
le poisson, le krill et les microorganismes comme les microalgues. On connaît
de nombreuses
souches de microorganismes productrices de PUFA, notamment d'acide
docosahexaénoïque
(DHA), d'acide arachidonique (ARA) ou d'acide eicosapentaénoïque (EPA)
également
identifiés par les signes (03 et (06. Ces PUFA sont largement employés en
industrie,
notamment pour l'alimentation humaine ou animale ou en cosmétique, et leur
production
industrielle fait l'objet de constantes améliorations depuis de nombreuses
années (WO
1997/037032, WO 2001/054510, WO 2013/136028, WO 2015/004402, US 2017/016036,
US
2017/335356). Les critères de sélection de souches adaptées à la production
industrielle sont
leur productivité élevée en biomasse, une accumulation importante de
triglycérides (TG) et
une teneur élevée en PUFA dans la matière grasse. On connaît aujourd'hui de
nombreuses
souches industrielles qui répondent à ces trois premiers critères, avec une
teneur en PUFA
dans la matière grasse de l'ordre de 35 %, voire 50% dans le meilleur des cas.
Or, il existe une demande d'huiles concentrées à fortes teneurs en PUFA, soit
pour la
fourniture de produits concentrés, comme des gélules d'huile concentrée qui
permettent de
diminuer les prises pour une quantité équivalent de PUFA. Pour obtenir des
huiles à forte
teneur en PUFA (par exemple supérieur à 55% de DHA), les huiles peuvent être
enrichies par
l'ajout de PUFA (US 2014/323569) et/ou les huiles sont concentrées par un
procédé qui
transforme les triglycérides en ethyl esters en impliquant l'utilisation de
solvant tel que
l'éthanol. Les ethyl esters sont une forme chimique artificielle, ils ne sont
pas présents dans
la nature. La biodisponibilité des acides gras sous forme d'ethyl esters est
bien moindre que
sous forme de triglycérides (Ghasemifard et al., 2014). De plus, le procédé
élimine les
vitamines et les anti-oxydants qui sont présents dans l'huile brute. Par
conséquent, l'huile
concentrée est plus vulnérable à l'oxydation.
Il est possible de convertir ces ethyl esters à nouveau en triglycérides, ce
sont des
triglycérides reformés , afin d'améliorer la biodisponibilité. Des anti-
oxydants peuvent
également être ajoutés pour accroitre la stabilité de l'huile dans le temps.
Cependant, cette
huile concentrée est assez différente de l'huile naturelle, elle a subi de
nombreux procédés
de transformation qui ont changé sa composition : profil en acides gras,
vitamines, pigments
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et autres molécules anti-oxydantes, privant les PUFAs de leur protection
naturelle. Or les
PUFAs sont des molécules sensibles, notamment à la température qui peut
convertir les
liaisons cis en liaison trans (Tsuzuki W, 2012). Il faut également noter que
la re-formation des
triglycérides n'est pas complète, l'huile ainsi traitée contient encore une
proportion variable
.. d'éthyl esters, ce qui la distingue de l'huile non traitée. L'éthanol
libéré lors de la trans-
estérification (conversion des ethyl esters en triglycérides) est généralement
éliminé par
évaporation. Il reste néanmoins des traces d'éthanol dans l'huile concentrée.
Une autre raison pour vouloir minimiser les procédés de traitement de l'huile
est la
formation de contaminants comme les monochloropropanediol (2-MCPD5, 3-MCPD5)
et le
glycidol ainsi que leurs dérivés (esters de 2-MCPDs, de 3-MCPDs et esters
d'acides gras de
glycidol). La présence de ces contaminants a été détectée notamment suite aux
étapes de
purification et de désodorisation de l'huile de poisson (Miyazaki and Koyama,
2017). Il y a peu
de données disponibles pour l'instant concernant l'impact des procédés de
concentration sur
la formation des contaminants. Cependant, la re-formation des triglycérides à
partir des ethyl
esters peut engendrer une augmentation des diglycérides, composés précurseurs
des
contaminants. Le niveau de glycidol (et d'esters de glycidol) fait l'objet
d'une régulation (EU)
2018/290/EC afin de limiter sa teneur dans les aliments : la concentration ne
doit pas
dépasser 1000 pg/kg dans les huiles alimentaires exceptés pour les huiles
alimentaires
destinées à la préparation d'aliments pour bébés et nourrissons où la limite
est de 500 pg/kg.
Dans les préparations pour bébés et nourrissons, la teneur maximale est encore
plus basse :
75 pg/kg dans les poudres et 10 pg/kg dans les liquides. Cette teneur sera
encore réduite (50
et 6 pg/kgrespectivement) en 2019. L'évaluation des concentrations maximales
en MCPD est
actuellement en cours pour les huiles et les aliments pour bébés. Pour
l'instant, la
réglementation ne concerne que les protéines végétales hydrolysées et la sauce
soja (limite
de 20 pg/kg).
Il est donc intéressant d'obtenir une huile naturellement riche en PUFAs, dont
la
composition est la plus proche possible des substances liposolubles du
microorganisme
producteur, avec un minimum de contaminants produits lors des traitements.
Cela la rend
particulièrement indiquée pour l'intégration de DHA dans les produits
alimentaires. Sa très
faible teneur en 3-MCPD et en glycidol, combinée avec sa haute teneur en DHA
la rend idéale
pour la préparation d'aliments destinés aux bébés et aux nourrissons.
De plus, ces huiles concentrées sont généralement obtenues par des procédés de
traitements coûteux et non-respecteux de l'environnement.
Une autre solution connue consiste à générer des microorganismes génétiquement
.. modifiés pour chercher à favoriser les voies métaboliques de production de
PUFA (Hamilton
& al., 2016) ou des murtants supposés produire plus de DHA (WO 2017/09804).
Toutefois, le
choix des solutions techniques est limité par l'usage fait des huiles
obtenues, notamment en
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alimentation humaine (Fedorova-Dahms I. & al., 2011).
Il existe un besoin d'huiles naturellement concentrées en PUFA, qui ne
nécessitent pas
d'autres traitements que des méthodes d'extraction, c'est à dire pour lesquels
les PUFA sont
essentiellement sous la forme de triglycérides tels que produits par les
microorganismes. Plus
particulièrement il existe un besoin d'huiles à forte teneur en PUFA et une
plus faible teneur
en acides gras saturés. Outre la question de la qualité des huiles, l'intérêt
d'une faible teneur
en acides gras saturés va vers une huile moins visqueuse, plus aisée à
employer à des
niveaux industriels, notamment nécessitant moins d'énergie pour sa
manipulation.
L'invention répond à cette demande avec une huile à forte teneur en DHA,
comprenant
au moins 60% de DHA par rapport à la masse totale de matière grasse. Cette
huile ne contient
pas d'ethylesters, ni de traces de solvant (ethanol ou methanol) et une teneur
réduite en 3-
MCPD et en glycidol (par comparaison avec les huiles contenant plus de 60% de
DHA
actuellement sur le marché).
EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une huile microbienne qui comprend de l'acide
docosahexénoïque (DHA), caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 80% de
triglycérides par rapport à la masse totale de matière grasse, plus de 60% de
DHA par rapport
à la masse totale de matière grasse et la teneur en acides gras saturés est
inférieure à 25%
par rapport à la masse totale de matière grasse.
Elle concerne également une huile microbienne diluée qui comprend une huile
microbienne riche en triglycérides et en DHA selon l'invention, mélangée avec
une autre huile.
Un autre objet de l'invention est une biomasse de microorganismes qui comprend
une
huile riche en triglycérides et en DHA selon l'invention.
L'invention concerne aussi l'utitilisation d'une huile riche en triglycéride
et en DHA selon
l'invention éventuellement diluée ou d'une biomasse qui contient cette huile
pour
l'alimentation humaine ou animale, en particulier pour l'alimentation des
nouveaux nés, des
enfants, ou des femmes enceintes ou allaitantes.
Un autre objet de l'invention est un aliment, caractérisé qui comprend une
huile riche en
triglycérides et en DHA selon l'invention, éventuellement diluée.
DESCRIPTION DETAILLÉE DE L'INVENTION
L'huile selon l'invention est une huile microbienne qui comprend plus de 60%
de DHA
par rapport à la masse totale de matière grasse, avantageusement au moins 62%
de DHA,
plus avantageusement au moins 65% de DHA, de préférence plus de 67%, plus
préférentiellement au moins 70%, encore plus préférentiellement 75% de DHA par
rapport à
la masse totale de matière grasse.
Ces caractéristiques de l'huile selon l'invention concernent tant l'huile
telle que présente
dans la biomasse de microorganismes que dans l'huile extraite de cette
biomasse, qu'elle soit
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brute ou purifiée.
L'invention concerne aussi une huile diluée, comprenant l'huile selon
l'invention
mélangée avec une autre huile.
L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique, cosmétique ou
alimentaire
qui comprend une huile selon l'invention, qu'elle soit brute, raffinée ou
diluée.
L'invention concerne également l'utilisation d'une huile selon l'invention,
brute, raffinée
ou diluée, ou d'une biomasse contenant l'huile, pour l'alimentation humaine ou
animale, en
particulier pour l'alimentation des nouveaux nés, des enfants, ou des femmes
enceintes ou
allaitantes.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'huile selon l'invention est une huile d'origine microbienne, obtenue à
partir d'une
biomasse de cellules de microorganismes cultivés dans des conditions
permettant à la fois la
croissance cellulaire (pour produire la biomasse) et la production d'une huile
à forte teneur en
DHA.
L'huile selon l'invention est une huile microbienne qui comprend plus de 60%
de DHA
par rapport à la masse totale de matière grasse, avantageusement au moins 62%
de DHA,
plus avantageusement au moins 65% de DHA, de préférence plus de 67%, plus
préférentiellement au moins 70%, encore plus préférentiellement au moins 75%
de DHA par
rapport à la masse totale de matière grasse.
De préférence l'huile selon l'invention a une teneur élevée en acides gras
insaturés par
rapport aux acides gras saturés. Les acides gras insaturés dans l'huile selon
l'invention sont
essentiellement du DHA et du DPA (acide docosapentanoïque, 022:5n6). La teneur
en ARA
(acide arachidonique, 020:4n6) est généralement inférieure à 0,5%, voire
inférieure à 0,3%,
avantageusement inférieure à 0,1%. La teneur en EPA (acide eicosapentaénoïque,
020:5n3)
est généralement inférieure à 1,5%, avantageusement inférieure à 1%, plus
avantageusement inférieure à 0,5%. Les pourcentages en ARA et EPA sont donnés
par
rapport à la masse totale de matière grasse.
De manière avantageuse, la teneur cumulée en DHA et en DPA est d'au moins 70%
par rapport à la masse totale de matière grasse, avantageusement d'au moins
75%, plus
avantageusement d'au moins 80%, voire plus de 85% par rapport à la masse
totale de matière
grasse. Dans certains cas, le total DHA+DPA représente jusqu'à 90% de la masse
totale de
matière grasse. Pour les huiles où la teneur en DHA est la plus forte, d'au
moins 70%, la
teneur cumulée en DHA et en DPA est d'au moins 80%, préférentiellement d'au
moins 85%.
Pour une huile riche en DHA selon l'invention, le rapport DHA/DPA est de
préférence
d'au moins 3, plus préférentiellement d'au moins 4, pouvant aller de 4 à 9.
Pour les huiles où
la teneur en DHA est la plus forte, d'au moins 70%, le rapport DHA/DPA est
avantageusement
de 4 à 7.
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La teneur en acides gras saturés est inférieure à 25% par rapport à la masse
totale de
matière grasse, voire inférieure à 20%, plus préférentiellement inférieure à
15%, encore plus
préférentiellement inférieure à 10%.
Les acides gras saturés sont essentiellement de l'acide palmitique (016 :0).
Les autres
5 acides gras saturés sont présents à une teneur inférieure à 2%, voire
inférieure à 1%,
notamment l'acide pendadécylique (015:0) ou l'acide myristique (014:0) ou
encore l'acide
stéarique (018:0). Avantageusement, les acides gras saturés en 010 à C22autres
que l'acide
palmitique sont, indépendamment les uns des autres, présents à l'état de
traces, chacun en
teneur inférieure à 0,1%, voire absents (0% tenant compte des incertitudes des
méthodes
d'analyse), en particulier pour les acides gras saturés en 010, 01 1, 012,
017, 020, 021 et
022. Les pourcentages sont donnés par rapport à la masse totale de matière
grasse.
La teneur en acide palmitique est de préférence inférieure à 20% de la masse
totale de
matière grasse, plus préférentiellement inférieure à 15%, encore plus
préférentiellement
inférieure à 10%.
Pour les huiles où la teneur en DHA est la plus forte, d'au moins 70%, la
teneur en
acides gras saturés en 010 à 022 est de préférence inférieure à 15%, plus
préférentiellement
inférieure à 10%.
Une manière de mesurer la forte teneur en DHA de l'huile selon l'invention et
la faible
teneur en acides gras saturés (AGS) consiste à établir un rapport DHA/AGS.
Il est avantageusement d'au moins 2,5, préférentiellement d'au moins 3, plus
préférentiellement d'au moins 5, encore plus préférentiellement d'au moins 6.
Il peut aller
jusqu'à au moins 8 dans certains cas, voire d'au moins 9. Pour les huiles où
la teneur en DHA
est la plus forte, d'au moins 70%, le rapport DHA/AGS est d'au moins 4,
préférentiellement
d'au moins 6, plus préférentiellement d'au moins 8, jusqu'à environ 9.
On peut aussi mesurer la forte teneur en acides gras polyinsaturés par rapport
aux
acides gras saturés (AGS) en faisant le rapport (DHA+DPA)/AGS.
Il est avantageusement d'au moins 2,5, préférentiellement d'au moins 3, plus
préférentiellement d'au moins 4, encore plus préférentiellement d'au moins 5.
Il peut aller
jusqu'à au moins 8 dans certains cas, voire d'au moins 9. Pour les huiles où
la teneur en DHA
est la plus forte, d'au moins 70%, le rapport (DHA+DPA)/AGS est d'au moins 5,
préférentiellement d'au moins 7, plus préférentiellement d'au moins 10,
jusqu'à environ 11 ou
plus.
Les huiles selon l'invention sont essentiellement sous la forme de
triglycérides. Les
triglycérides représentent au moins 80% de la masse totale de matière grasse,
de manière
avantageuse au moins 90%, de manière plus avantageuse au moins 93% de la masse
totale
de matière grasse. La teneur en triglycérides est par exemple analysée par
chromatographie
sur couche mince (Jouet et al., 2003).
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Ces caractéristiques de l'huile selon l'invention concernent tant l'huile
telle que présente
dans la biomasse de microorganismes que dans l'huile extraite de cette
biomasse, qu'elle soit
brute ou purifiée.
Dans certains cas, selon le procédé employé, l'extraction de l'huile à partir
de la
.. biomasse peut conduire à une légère augmentation de la teneur en DHA et en
DPA, favorisant
l'extraction de ces PUFA par rapport à aux acides gras saturés de plus bas
poids moléculaire.
Toutefois, cette concentration ne modifie pas de manière substantielle les
propriétés
intrinsèques de l'huile contenue dans la biomasse, notamment la teneur en
triglycérides. Dans
tous les cas, l'huile selon l'invention est une huile qui n'a pas subi de
modifications
substantielles de sa teneur en acides gras par l'ajout de PUFA, par exemple
sous forme
d'esters, par concentration et/ou par l'élimination d'acides gras saturés
comme l'acide
palmitique.
L'huile selon un mode particulier de l'invention contient plus 10 mg de
caroténoïdes
natifs par kg d'huile, voire plus de 30 mg/kg, préférentiellement plus de 40
mg/Kg, encore plus
préférentiellement plus de 60 mg/kg, voire au moins 65 mg/kg. Les caroténoïdes
présents
sont majoritairement de l'astaxanthine et des bêta-carotènes. L'huile contient
plus de 20
mg/kg d'astaxanthine, voire plus de 30 mg/kg, plus préférentiellement plus de
40 mg/kg. La
canthaxanthine est également présente mais en quantité moindre. D'autre
caroténoïdes
comme la lutéine et la zéaxanthine peuvent être présents mais ils sont à la
limite de détection
de la méthode utilisée. Le terme caroténoïdes natifs signifie que les
caroténoïdes n'ont
pas été ajouté, ils proviennent de la même biomasse que l'huile et sont
extraits de cette
biomasse en même temps que l'huile. Ils sont produits par la souche dans des
conditions de
fermentation en hétérotrophie, sans stimulus particulier. Ces caroténoïdes
natifs sont donc
présents tout au long du procédé, protégeant les acides gras, en particulier
le DHA, contre
.. l'oxydation. Le procédé de raffinage peut éliminer les pigments, donc
l'huile raffinée pourra
contenir moins, voire plus du tout, de caroténoïdes.
La couleur de l'huile est habituellement évaluée par la mesure de l'indice de
Gardner,
selon la méthode décrite dans la norme AOCS Cc 13j-97 (révisée en 2017) avec
un
spectrophotomètre. L'échelle de mesure comprend 18 grades, allant du
transparent (1) au
rouge foncé/marron (18). Certains caroténoïdes, dont l'astaxanthine et les
bêta-carotènes,
présentent une coloration, plus au moins intense suivant leur concentration.
Leur présence
se traduit donc par un indice de Gardner plus haut. L'huile selon un mode
particulier de
l'invention présente un indice de Gardner supérieur à 8, voire supérieur à 10,
de préférence
entre 12 et 17.
L'échelle de Gardner est traditionnellement utilisée pour évaluer le
vieillissement des
huiles car l'oxydation des huiles riches en acides gras polyinsaturés (PUFAs)
peut se traduire
par un jaunissement de la couleur (pour une huile transparente), donc une
valeur de Gardner
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plus haute. Cependant, l'oxydation des huiles riche en PU FAs est plus
précisément mesurée
par l'indice d'anisidine et l'indice de peroxydation. Les huiles selon
l'invention possèdent à la
fois des indices d'anisidine et de peroxide bas, gages d'un produit peu oxydé,
et un indice de
Gardner haut, due à la présence de caroténoïdes. Les huiles selon l'invention
possèdent un
indice d'anisidine inférieur à 5, voir inférieur à 2, de préférence inférieur
à 1,5 et un indice de
peroxydation inférieur à 5, voir inférieur ou égal à 1, de préférence
inférieur ou égal à 0,5.
Les huiles selon l'invention possèdent une température de fusion assez basse,
qui
baisse en corrélation avec l'augmentation du taux du DHA. La température de
fusion est
mesurée selon la norme ISO 6321. En effet, les huiles, à plus de 600 mg de DHA
/g d'acides
gras (soit environ plus de 62% de DHA) ont une température de fusion
inférieure à 20 C, voir
inférieure ou égale à 5 C. Elles sont donc liquides à température ambiante.
Les huiles à plus
de 700 mg de DHA par g d'acides gras (soit environ plus de 73% de DHA) ont une
température
de fusion inférieure à -5 C. Une température de fusion basse facilite le
stockage et la
manipulation (le pompage en particulier), puisqu'il est possible de conserver
l'huile sous forme
liquide tout en la réfrigérant afin de limiter le vieillissement. Les huiles
qui figent lors de la
conservation doivent être réchauffées pour les prélèvements et pour leur
intégration dans des
mélanges. Or la température est un facteur accélérateur de l'oxydation.
Cette propriété se traduit également par la valeur de viscosité, mesurée par
un
viscosimètre à 22 C (Viscoman, Gilson). Les huiles selon l'invention ont une
valeur de
viscosité à température ambiante inférieure ou égale à 50 Pa.s, voire
inférieure à 40, de
préférence inférieure à 30.
Les huiles selon l'invention sont obtenues par culture de microorganismes
producteurs
d'huiles riches en DHA. Les souches de microorganismes qui permettent
d'obtenir de telles
huiles sont des souches industrielles, c'est à dire selon l'invention, des
souches dont la teneur
en matière grasse représente au moins 45 % de la matière sèche,
préférentiellement au moins
environ 50 % de la matière sèche, et qui ont une capacité de croissance à une
densité
cellulaire d'au moins 50 g/L, préférentiellement d'au moins 70 g/L, plus
préférentiellement d'au
moins 100 g/L.
L'homme du métier connaît bien les souches industrielles de microorganismes
productrices de PUFA principalement parmi les traustochytrides, les
dinophycées, les
diatomées, les eustigmatophycées, notamment les microorganismes des genres
Crypthecodinium, Schizochytrium, Traustochytrium ou Aurantiochytrium pour la
production de
DHA.
L'analyse de la teneur en PUFA dans la matière grasse se fait selon les
méthodes
usuelles de l'homme du métier, notamment décrites dans l'article suivant : Gas
Chromatographic Quantification of Fatty Acid Methyl Esters: Flame lonization
Detection vs.
Electron Impact Mass Spectrometry, Dodds et al., Lipids, Vol. 40, no. 4
(2005).
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On citera plus particulièrement les souches Aurantiochytrium mangrovei
CCAP4062/7
et CCAP4062/8 et Schizochytrium sp. CCAP4087/7 qui produisent des huiles
comprenant
plus de 60% de DHA par rapport à la masse totale de matière grasse.
L'invention concerne
également ces souches capables de produire des huiles comprenant plus de 60%
de DHA.
Les procédés de culture industrielle de microorganismes pour la production
d'un moût
de fermentation qui servira ensuite à la production d'huile sont bien connus
de l'homme du
métier, qu'ils soient en mode autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe. La
culture industrielle
en hétérotrophie ou mixotrophie permet d'obtenir des densités cellulaires d'au
moins 50 g/L,
préférentiellement d'au moins 70 g/L, plus préférentiellement d'au moins 100
g/L.
Par culture industrielle on entend selon l'invention une culture des
souches dans un
milieu de culture approprié à leur croissance et à la production de PUFA et
dans un volume
approprié pour la production des quantités suffisantes pour adresser un
marché.
Ces cultures industrielles sont réalisées par fermentation en mode discontinu
dit "batch",
en mode semi-continu dit "fed batch" ou en mode continu. Les fermenteurs ont
des volumes
qui peuvent aller de 1000 L à plus de 200 rn3.
Le milieu de culture approprié est de préférence un milieu de culture
chimiquement
défini qui comprend une source de carbone, une source d'azote, une source de
phosphore et
des sels. Par "milieu de culture chimiquement défini ", on entend un milieu de
culture dans
lequel la teneur de chaque élément est connue. Avantageusement, le milieu ne
comporte pas
de matières organiques riches ou complexes. Par matières organiques riches ou
complexes
on entend des matières organiques non purifiées, se présentant sous la forme
de mélanges
pour lesquels la composition exacte et les concentrations des divers
composants du mélange
ne sont pas connues avec exactitude, pas maitrisées, et peuvent présenter une
variabilité
significative d'un lot à un autre. Comme exemple de matière organique riche ou
complexe, on
peut citer les extraits de levure ou les peptones qui sont des produits d'une
réaction
d'hydrolyse de protéines ou encore les matières minérales riches comme par
exemple les
sels minéraux marins ou autres agents de croissance complexes, n'ayant pas de
concentration fixe de chacun de leurs composants.
Généralement, les procédés de culture industrielle comprennent une étape de
croissance pour favoriser la production de biomasse, puis une étape
d'accumulation pour
favoriser la production de matière grasse et de PUFA en particulier. C'est le
cas notamment
pour le procédé décrit dans la demande de brevet WO 2001/054510. Plus
récemment, des
procédés ont été décrits mettant en oeuvre des conditions de cultures qui
favorisent de
manière concomitante la production de biomasse et celle des PUFA. On citera en
particulier
les méthodes de culture décrites dans les demandes WO 2012/035262, WO
2015/004402 et
WO 2015/004403. Bien entendu, l'homme du métier pourra adapter les conditions
de culture,
notamment la composition du milieu, les conditions d'ajout de nutriments au
cours de la
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culture, les cycles de température, d'oxygénation et les conditions
d'éclairage pour favoriser
la production de biomasse.
Les températures de culture industrielle sont avantageusement supérieures à 17
C.
On entend avantageusement par "biomasse" selon l'invention un ensemble de
cellules
de microorganismes produits par leur culture, en particulier par les méthodes
décrites ci-
dessus, cellules qui peuvent avoir conservé ou non leur intégrité physique. On
comprend donc
que ladite biomasse peut comprendre une quantité de cellules de
microorganismes
dégradées allant de 0% à 100%. Par "dégradée" on entend que l'intégrité
physique desdites
cellules de microorganismes a pu être altérée comme par exemple des
microorganismes
lysés, résultant par exemple d'un procédé d'homogénéisation ou lyse
enzymatique. Une fois
produite, cette biomasse pourra être brute, juste séparée de son milieu de
culture, séchée ou
non, dégradée ou non.
La biomasse, selon qu'elle soit séchée ou non, totalement ou en partie, peut
comprendre un taux d'humidité de 1% à 90%.
L'invention concerne donc aussi une biomasse de microorganismes comprenant une
huile telle que définie précédemment.
Selon un premier mode de réalisation, la biomasse a un taux d'humidité de 70%
à 90
%, préférentiellement 80% à 85 %. C'est en particulier le cas lorsqu'elle est
essentiellement
constituée des microorganismes industriels optimisés cultivés après filtration
du mout de
fermentation pour séparer les microorganismes cultivés du milieu de culture,
avant séchage.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la biomasse est séchée,
totalement
ou en partie et présente un taux d'humidité de 1% à 10%, préférentiellement de
2% à 7%.
La biomasse pourra être conditionnée pour son stockage ou pour son utilisation
en tant
que telle, par exemple comme complément alimentaire ou aliment pour
l'alimentation humaine
ou animale.
Les méthodes permettant d'isoler une huile selon l'invention à partir d'une
biomasse
produite par la culture de microorganismes sont bien connues de l'homme du
métier. On citera
en particulier l'extraction solide-liquide qui repose sur l'utilisation d'un
solvant (phase liquide)
pour extraire l'huile contenue dans la biomasse séchée (phase solide) par
aspersion ou
macération ; l'extraction liquide-liquide qui repose sur la séparation de la
phase aqueuse de
l'huile après la lyse préalable des cellules puis décantation ou
centrifugation. De préférence
l'extraction est faite sans solvants organiques. On citera en particulier les
demandes WO
01/53512, WO 02/10423, WO 2014/122092, WO 2015/092546 et WO 2015/095694.
On citera aussi une méthode préférée qui permet d'améliorer les rendements
d'extraction de matières grasses de microorganismes pour des huiles riches en
PU FA. Cette
méthode consiste à effectuer une lyse cellulaire à une première température,
cette dernière
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étant poursuivie à une deuxième température inférieure à la première, puis une
séparation
mécanique de l'huile de la biomasse lysée (filtration, décantation).
La lyse cellulaire est faite par lyse enzymatique ou mécanique (broyage). La
température de la première partie de lyse est de préférence d'au moins 50 C
tout en restant
5 inférieure à des températures qui viendraient dégrader la composition des
huiles en plus de
favoriser la lyse cellulaire, c'est à dire des températures inférieures à 80
C, de préférence
d'au plus 70 C.
On connaît les enzymes susceptibles d'être employées, notamment décrites dans
W02015/095688, W02011/153246, US6750048 et W02015/095694, en particulier des
10 protéases ou des cellulases telles que les enzymes commercialisées par
la société Novozyme
sous les appellations Alcalase 2,5 L, Alcalase 2,4 L, Novozym 37071,
Flavourzyme 1000 L,
Novozym FM 2,4 L, Protamex, Viscozyme. Les conditions de mise en oeuvre sont
celles
préconisées par le fournisseur, la température étant celle préconisée pour une
activité
optimale des enzymes, d'au moins 50 C et jusqu'à 70 C, de préférence
d'environ 65 C.
Avantageusement la lyse enzymatique est mise en oeuvre sous une atmosphère
pauvre en
oxygène.
Les méthodes de lyse mécaniques sont également bien connues, notamment par
broyeur à billes, mélangeur-disperseur, homogénéisateur haute pression broyeur
à broches
ou broyeur à impact, ultra-sons, champs électrique pulsés. On citera notamment
pour le
broyeur à billes : Netzsch / Discus-1000 ; WAB / ECM-AP60 ; pour
l'homogénéisateur haute
pression : GEA / Ariete ; pour le mélangeur-disperseur : Silverson / 700-X,
pour le broyeur à
broche : Hosakawa / Contraplex ; pour le broyeur à impact : Netzsch / Condux.
La première partie de la lyse est mise en oeuvre dans les conditions usuelles
préconisées de l'état de la technique pour une lyse cellulaire, notamment en
termes de durée
de la lyse enzymatique ou les cycles de broyages.
L'étape de poursuite de la lyse permet de compléter cette dernière en
modifiant les
conditions de mise en oeuvre sans avoir à extraire la biomasse lysée au
préalable. La
température de lyse dans cette deuxième partie est inférieure d'au moins 10 C
à celle de la
première partie. De préférence, la température de la seconde partie de lyse
est inférieure ou
égale à 40 C, avantageusement allant de 5 C à 40 C. Cette deuxième partie de
lyse à
température inférieure, ou fin de lyse, est avantageusement mise en oeuvre
pendant au moins
30', pouvant aller jusqu'à 30 h.
La séparation mécanique d'une huile à partir d'une biomasse lysée est
également bien
connue de l'homme du métier, comme une séparation gravitaire, notamment par
centrifugation comme décrite dans la demande de brevet WO 01/53512. On peut
aussi
employer une séparation continue, en particulier par séparateur centrifuge à
assiettes. De tels
séparateurs sont connus pour extraire en continu des huiles de milieux
complexes
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WO 2020/053372 PCT/EP2019/074458
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comprenant des résidus solides et de l'eau, tels que décrits dans la demande
de brevet WO
2010/096002, notamment commercialisés par les sociétés Alfa Laval, Flottweg ou
SPX Flow
Technology Santorso, notamment. Cette étape de séparation continue est
préférée dans le
procédé employé pour obtenir l'huile selon l'invention.
L'huile obtenue est généralement une huile appelée huile brute, qui peut être
employée
telle quelle ou faire l'objet d'un raffinage, notamment pour faciliter sa
conservation, en évitant
qu'elle ne rancisse, ou pour modifier sa couleur de manière à la rendre plus
acceptable pour
un consommateur. Ces étapes de raffinage sont bien connues de l'homme du
métier,
notamment de dégommage, clarification et de désodorisation. Elles permettent
d'éliminer
(tout ou bien en partie) les phospholipides, les pigments, les volatiles et
les acides gras libres.
De fait, ces méthodes ne viennent pas modifier substantiellement la teneur
relative en acides
gras, saturés ou insaturés, ni la teneur en triglycérides de l'huile raffinée
obtenue par rapport
à l'huile brute.
L'invention concerne aussi une huile conditionnée comprenant un récipient de
volume
approprié pour contenir ladite huile, l'huile étant une huile riche en DHA
telle que définie
précédemment, brute ou raffinée, et conditionnée en une quantité d'huile
supérieure à 1 L,
avantageusement en une quantité d'huile supérieure à 10 L, plus
particulièrement en une
quantité d'huile de l'ordre de 220 L, et plus particulièrement en une quantité
d'huile de l'ordre
de 20m3.
Tout récipient capable de contenir le volume d'huile ou de biomasse et les
protéger pour
leur conservation et leur transport pourra être employé par l'homme du métier.
De manière
avantageuse, le volume du récipient sera égal ou sensiblement supérieur à
celui de l'huile ou
de la biomasse conditionnée de manière à limiter la présence d'air dans le
récipient et limiter
l'oxydation. Le récipient sera avantageusement opaque afin d'éviter
l'altération du produit par
les rayons lumineux, en particulier les UV. De manière avantageuse, le
récipient sera étanche
à l'air de telle manière que tout volume non occupé avec de l'huile ou de la
biomasse puisse
être rempli d'un gaz inerte.
L'huile selon l'invention peut être mélangée à d'autres huiles pour leur
utilisation finale.
Cette dilution vient modifier la teneur globale en DHA et autres acides gras
insaturés dans la
composition de l'huile diluée. Il reste toutefois possible d'identifier dans
l'huile finale, au vu du
profil en acide gras de l'huile employée pour la dilution, les pourcentages
relatifs en acides
gras qui proviennent de l'huile riche en DHA selon l'invention et de l'huile
de dilution.
L'invention concerne donc aussi une huile diluée, comprenant l'huile selon
l'invention
mélangée avec une autre huile. Les huiles employées pour diluer l'huile riche
en DHA selon
l'invention sont généralement et de préférence des huiles végétales adaptées à
une
consommation alimentaire humaine ou animale. On citera en particulier les
huiles de
tournesol, de colza, de soja, de noix, de sésame, de chanvre, de noisette,
d'argan, d'olive, de
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lin, ou de toute autre huile adaptée à un usage alimentaire. L'huile ajoutée
peut aussi être une
huile comprenant d'autres PUFA, en particulier de l'ARA et/ou de l'EPA, en
particulier d'autres
huiles d'origine microbienne ou encore des huiles de poisson.
L'invention concerne aussi une composition qui comprend une huile selon
l'invention,
.. qu'elle soit brute, raffinée ou diluée, ou encore qui comprend la biomasse
selon l'invention.
Une composition selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs excipients.
Un
excipient est un composant, ou mélange de composants, qui est utilisé dans la
présente
invention pour donner des caractéristiques souhaitables à la composition pour
sa
conservation et son usage, y compris des aliments et des compositions
pharmaceutiques,
cosmétiques et industrielles. Un excipient peut être décrit comme un excipient
"pharmaceutiquement acceptable" lorsqu'il est ajouté à une composition
pharmaceutique dont
les propriétés sont connues de la pharmacopée pour être employés au contact
des tissus
humains et animaux sans toxicité excessive, irritation, réaction allergique ou
autres
complications. Différents excipients peuvent être utilisés comme une base
organique ou
minérale, un acide organique ou minéral, un tampon de pH, un stabilisant, un
antioxydant, un
agent d'adhésion, un agent de séparation, un agent de revêtement, un composant
de phase
extérieure, un composant à libération contrôlée, un agent tensioactif, un
humectant, une
charge, un émollient ou des combinaisons de ceux-ci.
Selon leur destination, les compositions selon l'invention sont en particulier
des
compositions pharmaceutiques, cosmétiques, nutraceutiques ou des aliments.
Les aliments sont destinés tant aux humains qu'aux animaux et comprennent des
compositions solides, pâteuses ou liquides. On citera en particulier les
aliments courants, les
produits liquides, y compris laits, boissons, boissons thérapeutiques et
boissons
nutritionnelles, les aliments fonctionnels, les suppléments, les
nutraceutiques, les
préparations pour nourrissons, y compris les préparations pour nourrissons
prématurés, les
aliments pour femmes enceintes ou allaitantes, les aliments pour adultes, les
aliments
gériatriques et aliments pour animaux.
L'huile riche en DHA selon l'invention, qu'elle soit brute ou raffinée ou la
biomasse qui
la contient peut être utilisée directement comme ou ajouté en tant qu'additif
dans une huile,
une pâte à tartiner, un autre ingrédient gras, une boisson, une sauce à base
de soya ou à
base de soja, des produits laitiers (lait, yaourt, fromage, crème glacée), des
produits de
boulangerie, des produits nutritionnels, par exemple sous forme de complément
nutritionnel
(sous forme de gélule ou de comprimé), des suppléments vitaminiques, des
compléments
alimentaires, des poudres à diluer pour boissons, comme des boissons
énergétiques ou des
poudres de laits pour des formulations infantiles, des produits alimentaires
en poudre fini ou
semi-fini, etc., selon les usages connus de l'homme du métier.
Les aliments pour animaux sont également connus de l'homme du métier. Ils sont
en
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particulier destinés aux animaux d'élevage, comme les vaches, cochons,
poulets, moutons,
chèvres ou dans la pisciculture pour les crustacés ou les poissons d'élevage.
Les compositions pharmaceutiques comprenant une huile riche en DHA sont
également
connues de l'homme du métier, l'huile étant employée seule ou en combinaison
avec d'autres
médicaments.
L'huile selon l'invention, brute ou raffinée ou la biomasse qui la contient,
peut être
formulée sous la forme de compositions unidoses, notamment sous forme de
comprimés, de
gélules, de capsules, de poudres, de granulés, adaptés à une administration
per os.
L'avantage de l'huile riche en DHA selon l'invention, qu'elle soit brute ou
raffinée, ou de
la biomasse qui la contient, est qu'elle peut être employée en moindres
quantités dans ces
mélanges et compositions.
L'invention concerne également l'utilisation d'une huile selon l'invention,
brute, raffinée
ou diluée ou encore la biomasse qui la contient, pour l'alimentation humaine
ou animale, en
particulier pour l'alimentation des nouveaux nés, des enfants, ou des femmes
enceintes ou
allaitantes.
De tels usages sont bien connus de l'homme du métier, notamment décrits dans
la
demande de brevet WO 2010/107415 et sur le site Web de la société DSM
(https://www.dsm .com/ma rkets/fooda nd beverages/en_US/prod ucts/n utriti on
al-li pids/life-
dha.html)
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Profil de Acides Gras de la biomasse de traustochytrides à haute
teneur en DHA
Les souches de traustochytrides (Aurantiochytrium mangrovei-FCCB1897,
FCCB1800,
CCAP4062/8) sont cultivées en Erlenmeyer dans le milieu de culture ATCC 790
(modifié).
Des résultats similaires sont obtenus avec des souches de Schizochytrium sp.
((notamment
avec la souche CCAP4087/7).
Une fois les cultures en phase stationnaire, la biomasse est récupérée par
centrifugation
puis lyophilisée avant l'analyse de la composition de la biomasse en acides
gras par GC-FID
(méthode adaptée de la norme ISO 12966-2).
Composition du milieu ATCC 790 modifié :
Extrait de Levures 5.0 g/L
Peptone 5.0 g/L
D+-Glucose 30.0 g/L
Sels marins 20 g/L
Le Tableau 1 représente la composition en acides gras contenus dans la
biomasse. Les
résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à la teneur en acides gras
totale. Les AGS
sont les acides gras saturés.
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Tableau 1
FCCB1897 FCCB1800 CCAP4062/8
Cl 0 :0 0,0 0,0 0,0
011 :0 0,0 0,0 0,0
012 :0 0,0 0,0 0,0
013:0 0,0 0,0 0,0
014 :0 0,2 0,3 0,3
014 :1 0,0 0,0 0,0
015:0 0,6 1,0 1,7
015:1 0,0 0,0 0,0
016:0 6,8 6,5 8,3
016:1 0,0 0,0 0,0
016:2 0,0 0,0 0,0
016:3 0,0 0,0 0,0
016:4 0,0 0,0 0,0
017:0 1,1 1,4 1,5
017:1 0,3 0,3 0,2
018:0 0,5 0,5 0,4
018:1 0,0 0,0 0,0
018:2 0,0 0,0 0,0
018 :3n3 0,1 0,1 0,1
018 :3n6 0,1 0,1 0,0
018 :4n3 0,3 0,5 0 ,4
020 :0 0,1 0,1 0,0
020 :4n6 (ARA) 0,3 0,3 0,3
020 :5n3 (EPA) 1,1 1,0 1,2
021 :0 0,0 0,0 0,0
022 :0 0,0 0,0 0,0
022 :5n3 (DPAn3) 0,4 0,3 0,4
022 :5n6 (DPAn6) 16,7 16,5 16,8
022 :6n3 (DHA) 70,9 70,9 68
DHA+DPA 88,0 87,8 85,2
AGS 7,7 7,8 10,2
DHA/DPA 4,2 4,2 4,0
DHA/AGS 9,2 9,1 6,7
(DHA+DPA)/AGS 11,4 11,3 8,4
EXEMPLE 2 : Cultures en fermenteur de souches à haute teneur en DHA
Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 1 à 5 L
utiles avec
automates dédiés et supervision par station informatique. Elles sont
effectuées à partir de
deux souches d'Aurantiochytrium mangrovei et avec deux protocoles de cultures
différents.
Le système est régulé à pH 5 via l'ajout de base (NH4OH pour exemple bl et b2
et avec NaOH
pour exemple a) avec ajustement du pH réalisé sur toute la durée de la
culture, et fournissant
une alimentation d'azote (dans le cadre des exemples bl et b2). La température
de culture a
été fixée à 30 C puis 22 C et enfin 18 C sur la fin de la culture.
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La souche CCAP4062/7 est utilisée pour l'exemple a et bl tandis que la souche
FCCB1897 est utilisée pour l'exemple b2.
La composition des milieux de culture est donnée dans le Tableau 2.
Tableau 2
a b1 et b2
CaCl2, 2H20 0,55 0,55 g/L
MgSO4, 7H20 4-8 4-8 g/L
H3B03 0,00875-
0,175 0,00875-0,0175 g/L
K2SO4 2,08 0,00 g/L
KH2PO4 4,00 4,00 g/L
Na4EDTA, 2H20 0,12 0,12 g/L
FeSO4, 7H20 0,04 0,04 g/L
(NH4)2SO4 9,00 1,00-2,00 g/L
MnCl2, 4H20 0,0108 0,0108 g/L
ZnSO4, 7H20 0,0108 0,0108 g/L
CoCl2, 6H20 0,000108 0,000108 g/L
Na2Mo04, 2H20 0,000108 0,000108 g/L
Na2Se03 1,73E-07 1,73E-07 g/L
CuSO4, 5H20 0,0072 0,0072 g/L
NiSO4, 6H20 0-0,0056 0-0,0056 g/L
Thiamine 0,0320 0,0320 g/L
Vitamine B12 0,0005 0,0005 g/L
Panthotenate 0,0108 0,0108 g/L
Antimousse Biospumex 153K 0,40 0,40 mL/L
Glucose, 1 H20 55,00 55,00 g/L
5
Des ajouts de glucose sous forme d'une solution d'enrichissement sont faits
avec un
ratio molaire de carbone : azote : phosphore (CNP) de 533 : 11 : 1 (exemple a)
soit avec une
solution composée uniquement de glucose (exemples bl et b2).
Suivi des cultures :
10 La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la
masse sèche (filtration
sur filtre GF/F, Whatman, puis séchage en étuve, à 105 C, pendant 24 h minimum
avant
pesée). Les analyses des acides gras sont réalisées selon une méthode adaptée
de ISO
12966-2 pour la biomasse, et suivant la Pharmacopée Européenne 9.0 (2.4.29.)
pour les
huiles.
15 Les profils en acides gras des biomasses obtenues avec les
conditions a, bl et b2
sont donnés dans le Tableau 3. Les résultats sont exprimés en pourcentage par
rapport à la
teneur en acides gras totale.
Tableau 3
a b1 b2
C10 :0 0,0 0,0 0,0
Cl 1 :0 0,0 0,0 0,0
C12 :0 0,0 0,0 0,0
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WO 2020/053372 PCT/EP2019/074458
16
013:0 0,0 0,0 0,0
014:0 0,8 1,2 0,3
014 :1 0,0 0,0 0,0
015:0 0,0 0,1 1,7
015:1 0,0 0,0 0,0
016 :0 13,6 19,6 10,9
016:1 0,1 0,2 0,2
016:2 0,0 0,0 0,0
016:3 0,0 0,0 0,0
016:4 0,0 0,0 0,0
017:0 0,0 0,0 0,0
017:1 0,0 0,0 0,3
018:0 0,5 0,6 0,6
018:1 0,2 0,3 0,4
018:2 0,0 0,0 0,0
018 :3n3 0,2 0,1 0,2
018 :3n6 0,1 0,1 0,1
018 :4n3 0,3 0,3 0,3
020 :0 0,1 0,1 0,1
020 :4n6 (ARA) 0,1 0,0 0,1
020 :5n3 (EPA) 0,4 0,6 0,6
021 :0 0,0 0,1 0,0
022 :0 0,1 0,0 0,0
022 :5n3 (DPAn3) 0,2 0,0 0,2
022 :5n6 (DPAn6) 12,9 9,6 12,7
022 :6n3 (DHA) 66,6 62,5 70,1
DHA+DPA 79,7 72 83
AGS 15,1 22 11,4
DHA/DPA 5,2 6,5 5,5
DHA/AGS 4,4 2,9 6,2
(DHA+DPA)/AGS 5,3 3,3 7,3
EXEMPLE 3 : Culture en conditions industrielles
Les souches à haute teneur en DHA produisent une biomasse de composition
similaire
en acides gras lorsque qu'elles sont cultivées en fermenteurs de taille
industrielle, comme des
cuves de 10 m3 ou bien de 180 m3, selon des conditions similaires à l'exemple
2, avec le
milieu de culture b et des ajouts de glucose sous forme d'une solution
d'enrichissement sont
faits avec un ratio molaire de carbone : azote : phosphore (ON P) de 533 : 0,4
: 1.
Les profils en acides gras de la biomasse de la souche 00AP4062/7 après une
culture
dans des cuves de 10 m3 et de 180m3 sont donnés dans le Tableau 4. Les
résultats sont
exprimés en pourcentage par rapport à la teneur en acides gras totale.
Tableau 4
10m3 180m3
010:0 0,0 0,0
CA 03112621 2021-03-12
WO 2020/053372 PCT/EP2019/074458
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011 :0 0,0 0,0
012 :0 0,0 0,0
013:0 0,0 0,0
014 :0 0,7 0,5
014 :1 0,0 0,0
015:0 0,0 0,0
015:1 0,0 0,0
016:0 18,1 13,6
016:1 0,0 0,0
016:2 0,0 0,0
016:3 0,0 0,0
016:4 0,0 0,0
017:0 0,0 0,0
017:1 0,0 0,0
018:0 0,8 0,0
018:1 0,0 0,0
018:2 0,0 0,0
018 :3n3 0,3 0,3
018 :3n6 0,0 0,0
018 :4n3 0,0 0,0
020 :0 0,0 0,0
020 :4n6 (ARA) 0,2 0,1
020 :5n3 (EPA) 0,9 0,4
021 :0 0,0 0,0
022 :0 0,0 0,0
022 :5n3 (DPAn3) 0,0 0,0
022 :5n6 (DPAn6) 11,2 13,4
022 :6n3 (DHA) 63,9 66,8
DHA+DPA 75,1 80,2
AGS 19,6 14,7
DHA/DPA 5,3 4,8
DHA/AGS 3,3 4,5
(DHA+DPA)/AGS 3,8 5,5
EXEMPLE 4 : extraction de l'huile à partir de la biomasse des souches à haute
teneur en DHA
L'huile est extraite à partir de la biomasse de l'exemple 3 (cuve de 180 rn3)
selon une
méthode décrite dans W02015/095694 (exemple 9). La composition en acide gras
de l'huile
est semblable à celle de la biomasse, donnée dans le Tableau 4.
EXEMPLE 5 : extraction de l'huile à partir de la biomasse des souches à haute
teneur en DHA
L'extraction de la biomasse produite dans les mêmes conditions que l'exemple 3
est
réalisée en suivant la séquence
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(a) lyse cellulaire par voie enzymatique (ex: avec l'Alcalase 2,5 L ou
Alcalase 2,4 L ou
Novozym 37071 de Novozymes) pendant 4h à une température de 65 C,
(b) poursuite de la lyse en abaissant la température comprise entre 5 et 40 C,
pendant une
durée comprise entre 30 minutes et 30h,
(c) séparation mécanique de l'huile par séparateur centrifuge à assiettes.
Le rendement d'extraction est de 60% de lipides extraits de la biomasse.
Le profil lipidique de l'huile extraite à partir de la biomasse est donné dans
le Tableau
6. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à la teneur en
acides gras totale.
Tableau 6
10m3 180m3
C10 :0 0,0 0,0
C11 :0 0,0 0,0
C12 :0 0,0 0,0
C13 :0 0,0 0,0
C14 :0 0,3 0,0
C14 :1 0,0 0,0
C15:0 0,0 0,0
C15:1 0,0 0,0
C16:0 15,3 8,3
C16 :1 0,0 0,0
C16 :2 0,0 0,0
C16 :3 0,0 0,0
C16 :4 0,0 0,0
C17 :0 0,0 0,0
C17 :1 0,0 0,0
C18 :0 0,4 0,4
C18 :1 0,0 0,0
C18 :2 0,0 0,0
C18 :3n3 0,0 0,0
C18 :3n6 0,0 0,0
C18 :4n3 0,0 0,0
C20 :0 0,0 0,0
C20 :4n6 (ARA) 0,0 0,0
C20 :5n3 (EPA) 0,5 0,2
C21 :0 0,0 0,0
C22 :0 0,0 0,0
C22 :5n3 (DPAn3) 0,0 0,0
C22 :5n6 (DPAn6) 11,6 15,3
C22 :6n3 (DHA) 71,1 75
DHA+DPA 82,7 90,3
SFA 16 8,7
DHA/DPA 5,9 4,8
DHA/SFA 4,4 8,6
(DHA+DPA)/SFA 5,2 10,4
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19
EXEMPLE 6 : qualité de l'huile : anti-oxydants et contaminants
Plusieurs fermentations en hétérotrophie sont réalisées suivant les conditions
de
l'exemple 3. L'huile est extraite à partir du moût de fermentation suivant les
conditions de
l'exemple 5. Les caroténoïdes sont mesurés dans l'huile extraite, par LC/DAD,
selon les
méthodes suivantes : Astaxanthine (formes esters incluses), Méthode de
référence : DSM
Ver. 1.5 2009 ; Bêta-carotène (somme de cis- & trans-), saponifié, Méthode de
référence : EN
12823-2:2000; Canthaxanthine, Méthode de référence: Roche Index n 2264;
Lutéine &
Zéaxanthine, Méthode de référence: Roche Index n 2264.
Tableau 7
N de lot A BCDE
DHA (mg/g AG) 670 674 663 700
707
DHA (% MG) 70,6 71,1 70,6
72,2 72,4
Béta-carotènes (mg/kg AG) 14 14,1 13,4 11,7 11,9
Astaxanthine (mg/kg AG) 46,1 41,4 38,2 .. 28 25,9
Esters d'astaxanthine (mg/kg AG) 2 4,5 4,7 4,8 5
Canthaxanthine (mg/kg AG) 3,5 3,3 3,2 3,7 3,8
Total caroténoïdes (mg/kg AG) 65,6 63,3 59,6
48,3 46,6
Indice de Gardner 14,8 16,7 >18 12,3 12,3
Indice d'anisidine 1,17 1,13 0,54 1,35 1,97
Indice de peroxyde (meq/kg) 1 0,1 0,1 1 0,1
Les contaminants comme le glycidol et les 2- et 3-MCPDs sont également dosés
dans
les mêmes lots.
Tableau 8
N de lot A B C D E
DHA (mg/g AG) 670 674 663 700
707
DHA (% MG) 70,6 71,1 70,6 72,2
72,4
Glycidyl esters (glycidol pg/kg) <100 45 <100 <100 <100
2-MCPD (libre et esters, pg/kg) <100 <100 <100 <100
<100
3-MCPD (libre et esters et glycidyl
esters) pg/kg <100 210 <100 <100
<100
EXEMPLE 7 : viscosité
La viscosité de l'huile produite et extraite dans des conditions similaires à
l'exemple 5
est mesurée par un viscosimètre (Viscoman, Gilson) à différentes températures.
La
température de fusion est évaluée selon la norme ISO 6321.
Tableau 9
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DHA (mg/g Viscosité à Viscosité à Viscosité à - Température
d'acides 22 C (Pa.$) 8 C (Pa.$) 20 C (Pa.$) de
fusion
gras - %MG) ( C)
Echantillon 1 582 ¨ 62 50 >2000 >2000 19
Echantillon 2 634 ¨ 67 39 >2000 >2000 11
Echantillon 3 689 ¨ 73 31 41 >2000 <-5 C
REFERENCES
- EP 0 223 960 ; EP 1 001 034
- US 2014/323569, US 2017/016036, US 2017/335356
5 - WO 1994/008467; WO 1997/037032; WO 2001/054510; WO 03/049832; WO
2010/107415; WO 2012/035262; WO 2013/136025; WO 2013/136028; WO
2014/146098; WO 2015/004402; WO 2015/004403; WO 2015/150716; WO
2016/030631, WO 2017/094804
- Fedorova-Dahms I. & al., Safety evaluation of DHA-rich algal ou l from
Schizochytrium sp,
10 Food and Chemical Toxicology, 2011, 49, 3310-3318
- Folch J, et al., A simple method for the isolation and purification of
total lipides from animal
tissues. J Biol Chem. 1957 May; 226(1):497-509
- - Hamilton M. & al., Heterotrophic Production of Omega-3 Long-Chain
Polyunsaturated
Fatty Acids by Trophically Converted Marine Diatom Phaeodactylum tricornum,
Marine
15 Drugs, 2016, 14, 53
- - Omega-3 long chain fatty acid "bioavailability": a review of evidence
and methodological
considerations.
- - Ghasemifard S, Turchini GM, Sinclair AJ. Prog Lipid Res. 2014 Oct;56:92-
108. doi:
10.1016/j.plipres.2014.09.001. Epub 2014 Sep 16. Review.
20 - Wakako TSUZUKI, Study of the Formation of trans Fatty Acids in Model Oils
(triacylglycerols) and Edible Oils during the Heating Process , JARQ 46 (3),
215 ¨ 220
(2012)
- Kinuko Miyazaki* and Kazuo Koyama, An Improved Enzymatic Indirect Method
for
Simultaneous Determinations of 3-MCPD Esters and Glycidyl Esters in Fish Oils
, J. Oleo
5ci. 66, (10) 1085-1093 (2017)
- Jouhet J., Marechal E., Bligny R., Joyard J., Block M. A. (2003).
Transient increase of
phosphatidylcholine in plant cells in response to phosphate deprivation. FEBS
Lett. 544
63-68.
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(Cette feuille ne fait pas partie de la demande internationale ni ne compte
comme une feuille de celle-ci)
0-1 Formulaire PCT/RO/134
Indications relatives à des micro-
organismes ou autre matériel
biologique déposés (règle 13bis du
PCT)
0-1-1 Préparée avec PCT Online Filing
Version 3.51.000.263e MT/FOP
20141031/0.20.5.20
0-2 Demande internationale n
0-3 Référence du dossier du déposant ou P100194PC -FT
du mandataire
1 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
1-1 page 8
1-2 ligne 1
1-3 Identification du dépôt
1-3-1 Nom de l'institution de dépôt CCAP Culture Collection of Algae and
Protozoa (CCAP)
1-3-2 Adresse de l'institution de dépôt SANS Ltd., Scottish Marine
Institute,
Oban, Argyll PA37 1QA, Scotland, United
Kingdom
1-3-3 Date du dépôt 06 septembre 2018 (06.09.2018)
1-3-4 Numéro d'ordre CCAP 4062/7
1-4 Indications supplémentaires page 15 ligne 1 et page 16 ligne 8
1-5 Etats désignés pour lesquels les De toutes les désignations
indications sont données
2 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
2-1 page 8
2-2 ligne 2
2-3 Identification du dépôt
2-3-1 Nom de l'institution de dépôt CCAP Culture Collection of Algae and
Protozoa (CCAP)
2-3-2 Adresse de l'institution de dépôt SANS Ltd., Scottish Marine
Institute,
Oban, Argyll PA37 1QA, Scotland, United
Kingdom
2-3-3 Date du dépôt 06 septembre 2018 (06.09.2018)
2-3-4 Numéro d'ordre CCAP 4062/8
2-4 Indications supplémentaires page 13 ligne 24 et pagel4 tableau
2-5 Etats désignés pour lesquels les De toutes les désignations
indications sont données
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(original sous forme électronique)
(Cette feuille ne fait pas partie de la demande internationale ni ne compte
comme une feuille de celle-ci)
3 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
3-1 page 8
3-2 ligne 2
3-3 Identification du dépôt
3-3-1 Nom de l'institution de dépôt CCAP Culture Collection of Algae and
Protozoa (CCAP)
3-3-2 Adresse de l'institution de dépôt SAMS Ltd., Scottish Marine
Institute,
Oban, Argyll PA37 1QA, Scotland, United
Kingdom
3-3-3 Date du dépôt 06 septembre 2018 (06.09.2018)
3-3-4 Numéro d'ordre CCAP 4087/7
3-4 Indications supplémentaires page 13 ligne 26
3-5 Etats désignés pour lesquels les De toutes les désignations
indications sont données
RÉSERVÉ A L'OFFICE RÉCEPTEUR
0-4 Cette feuille a été reçue en même
temps que la demande internationale
OUI
(oui ou non)
0-4-1 Fonctionnaire autorisé
Zurkinden, jolanda
RÉSERVÉ AU BUREAU INTERNATIONAL
0-5 Cette feuille est parvenue au Bureau
international le :
0-5-1 Fonctionnaire autorisé
