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PROCEDE D'AMPLIFICATION IN VITRO OU EX VIVO DE CELLULES
SOUCHES DU TISSU ADIPEUX HUMAIN
Domaine technique de l'invention
La présente invention concerne un procédé
d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du
tissu adipeux humain. Elle concerne en outre un procédé
d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules
différenciées, une matrice extracellulaire, une
composition comprenant un mélange d'une matrice
extracellulaire et d'une fraction stroma-vasculaire, une
utilisation de la matrice extracellulaire ou de la
composition comprenant un mélange de la matrice
extracellulaire et de la fraction stroma-vasculaire, et
des cellules différenciées obtenues selon le procédé de
l'invention pour leur utilisation.
Art antérieur
La thérapie cellulaire consiste en une greffe de
cellules visant à restaurer les fonctions d'un tissu ou
d'un organe lorsqu'elles sont altérées par un accident,
une pathologie ou le vieillissement. Elle permet de soigner
durablement un patient grâce une unique injection de
cellules dites thérapeutiques . Ces cellules sont
obtenues, en particulier, à partir de cellules souches
multipotentes provenant du patient lui-même.
Le lipofilling est une technique particulière de
thérapie cellulaire permettant de transférer des cellules
graisseuses, ou adipocytes, d'une zone du corps à une autre
afin de remodeler le corps ou le visage.
A ce jour, seuls les adipocytes présents dans certains
sites adipeux sont utilisés pour la thérapie cellulaire
et, plus particulièrement, pour le lipofilling. Or, selon
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les cas, la quantité d'adipocytes disponible chez un
patient peut être limitante. Par exemple, lorsqu'un
patient a un indice de masse corporelle trop bas ou a subi
une chimiothérapie, il peut ne pas avoir suffisamment de
tissu adipeux pour procéder à un lipofilling.
Dans ce contexte, il existe un besoin de réaliser des
cultures d'adipocytes autologues et, par suite, de
développer des méthodes d'amplification cellulaire
permettant l'obtention de quantités importantes
d'adipocytes de grade thérapeutique en vue, notamment,
d'un lipofilling.
La procédure standard, pour isoler et amplifier les
précurseurs d'adipocytes à partir de prélèvements de tissu
adipeux, passe par une dissociation enzymatique puis par
leur expansion en deux dimensions (2D) par attachement au
plastique de boîtes de culture. Cette procédure est
coûteuse, longue, et nécessite de nombreuses manipulations
qui augmentent les risques de contaminations. De plus,
elle entraîne une destruction de la structure
tridimensionnelle du tissu, ainsi que la perte de types
cellulaires d'intérêts comme les cellules endothéliales
qui jouent un rôle essentiel à la fois pour la
vascularisation du greffon et la physiologie de
l'adipocyte.
La dissociation non-enzymatique du tissu adipeux, le
plus souvent basée sur un procédé mécanique, permet
d'isoler les précurseurs d'adipocytes. Ce type de
dissociation apparaît comme une méthode alternative
beaucoup moins coûteuse, plus rapide et qui présente des
avantages incontestables pour la fabrication d'un produit
conforme aux standards d'une production de grade
thérapeutique (exposition réduite à des produits ou
contaminants extérieurs). En revanche, les procédés de
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dissociation non-enzymatique présentés à ce jour ne sont
pas satisfaisants car le nombre de précurseurs
d'adipocytes obtenu est faible comparé à la dissociation
enzymatique. Cela nécessite alors leur amplification en 2D
sur boite de culture. De plus, les cellules endothéliales,
la matrice extracellulaire ainsi que la structure
tridimensionnelle du tissu adipeux sont perdues à la fin
du processus.
Il a été proposé différentes matrices synthétiques
pour y ensemencer les précurseurs d'adipocytes et ainsi
essayer de reconstituer au mieux la structure du tissu
adipeux. La matrice sert également à orienter in vitro les
précurseurs d'adipocytes vers un type cellulaire non
adipeux (essentiellement osseux ou cartilagineux) avant
implantation. Du tissu adipeux décellularisé a également
été proposé pour augmenter la différenciation des
précurseurs et mieux mimer la structure du tissu adipeux.
La fabrication de tous ces types de matrices nécessite de
nombreuses étapes faisant intervenir des réactions
enzymatiques ou de longs traitements chimiques. De plus,
le tissu décellularisé, par définition, perd ces cellules
endogènes mais perd également les facteurs d'intérêt
thérapeutique qui sont ancrés sur la matrice native, ce
qui réduit la valeur clinique de ce type de matrice. Le
tissu adipeux non décellularisé et enrichi en précurseurs
d'adipocytes (préalablement isolés par dissociation
enzymatique) suivi d'une amplification en 2D a été proposé
récemment comme matrice pour une meilleure reconstruction
osseuse. Le temps pour générer cette matrice biologique
est long, nécessite trois semaines de culture in vitro, et
ne permet pas l'amplification des précurseurs
d'adipocytes. Seul l'intérêt pour la réparation osseuse a
été mis en avant par les auteurs.
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La culture en suspension en trois dimensions (3D)
représente une méthode alternative de choix à la méthode
standard en 2D car elle permet essentiellement de conserver
la structure et les qualités intrinsèques du tissu. Cet
avantage est important car, par exemple, l'absence d'un
modèle humain pertinent qui mime au mieux in vitro le tissu
adipeux est une limitation majeure lors des essais de
phases précliniques pour la découverte de nouveaux
médicaments efficaces pour lutter contre l'obésité et les
maladies métaboliques associées comme le diabète de type
2 et les maladies cardiovasculaires. De plus la culture
3D est réalisable en système clos ce qui diminue les
manipulations et les risques de contamination.
Résumé de l'invention
Compte tenu de ce qui précède, un problème technique
que se propose de résoudre l'invention est d'obtenir in
vitro ou ex vivo une grande quantité de cellules souches
du tissu adipeux humain ou de cellules différenciées, de
grade thérapeutique.
La solution de l'invention à ce problème technique a
pour premier objet, un procédé d'amplification in vitro ou
ex vivo de cellules souches du tissu adipeux humain,
comprenant les étapes suivantes : extraction, d'une part,
d'une fraction stroma-vasculaire d'un tissu adipeux humain
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu
adipeux humain et, d'autre part, d'une matrice
extracellulaire dudit tissu adipeux humain, ladite matrice
extracellulaire comprenant des cellules endothéliales du
réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules
souches du tissu adipeux humain et du collagène ; mélange
de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice
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extracellulaire ; et culture du mélange obtenu à l'étape
précédente, en suspension, dans un milieu de culture.
Ainsi, la culture en suspension de la fraction stroma-
vasculaire, rendue possible grâce à la présence de la
5 matrice
extracellulaire, permet une amplification en 3D,
donnant accès à un grand nombre de cellules et limitant
ainsi les manipulations qui augmentent les risques de
contaminations.
Avantageusement,
l'extraction de la matrice
extracellulaire comprend une étape de dissociation non-
enzymatique et, en particulier, l'extraction de la matrice
extracellulaire comprend une étape de dissociation
mécanique ; - l'extraction de la fraction stroma-
vasculaire et de la matrice extracellulaire comprend les
étapes suivantes : centrifugation du tissu adipeux humain
pour obtenir au moins deux fractions distinctes, une
fraction A comprenant une matrice extracellulaire
centrifugée, et la fraction stroma-vasculaire ; et
dissociation mécanique de la fraction A pour obtenir la
matrice extracellulaire ; - le collagène de la matrice
extracellulaire est du collagène de type I et du collagène
de type III ; et - la culture du mélange de ladite fraction
stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire
comprend les étapes suivantes : transfert dudit mélange de
manière stérile dans une poche de culture en suspension
comprenant du milieu de culture ; amplification dudit
mélange formant des agrégats cellulaires ; et dissociation
mécanique desdits agrégats cellulaires.
Selon un second objet, l'invention concerne un procédé
d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules
différenciées comprenant les étapes
suivantes :
extraction, d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire
d'un tissu adipeux humain comprenant, des cellules
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endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain
et des cellules souches du tissu adipeux humain et, d'autre
part, d'une matrice extracellulaire dudit tissu adipeux
humain, ladite matrice extracellulaire comprenant des
cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu
adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux
humain et du collagène ; mélange de ladite fraction stroma-
vasculaire et de ladite matrice extracellulaire ; culture
du mélange obtenu à l'étape précédente, en suspension,
dans un milieu de culture ; et induction
d'une
différenciation des cellules souches du tissu adipeux pour
obtenir des cellules différenciées.
Avantageusement - les cellules différenciées sont des
adipocytes ou des ostéoblastes, préférentiellement des
adipocytes ; - l'extraction de la matrice extracellulaire
comprend une étape de dissociation non-enzymatique, en
particulier l'extraction de la matrice extracellulaire
comprend une étape de dissociation mécanique ;
l'extraction de la fraction stroma-vasculaire et de la
matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes :
centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au
moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant
une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction
stroma-vasculaire ; et dissociation mécanique de la
fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire ; - le
collagène de la matrice extracellulaire est du collagène
de type I et du collagène de type III ; et - la culture du
mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite
matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes :
transfert dudit mélange de manière stérile dans une poche
de culture en suspension comprenant du milieu de culture ;
amplification dudit mélange formant des agrégats
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cellulaires ; et dissociation mécanique desdits agrégats
cellulaires.
Selon un troisième objet, l'invention concerne une
matrice extracellulaire isolée susceptible d'être obtenue
selon le procédé défini ci-dessus, comprenant des cellules
endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux
humain, des cellules souches du tissu adipeux humain, et
du collagène.
Avantageusement - le collagène est du collagène de
type I et du collagène de type III ; - la matrice
extracellulaire comprend en outre de la fibronectine.
Selon un quatrième objet, l'invention concerne une
composition comprenant le mélange de la matrice
extracellulaire et de la fraction stroma-vasculaire tel
que défini ci-dessus, la matrice extracellulaire
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu
adipeux humain, et du collagène, et la fraction stroma-
vasculaire comprenant des cellules endothéliales du réseau
vasculaire du tissu adipeux et des cellules souches du
tissu adipeux.
Avantageusement - le collagène est du collagène de
type I et du collagène de type III ; - la matrice
extracellulaire comprend en outre de la fibronectine.
Selon un cinquième objet, l'invention concerne
l'utilisation in vitro de la matrice extracellulaire telle
que définie ci-dessus ou l'utilisation in vitro de la
composition telle que définie ci-dessus pour le criblage
d'actifs pharmacologiques contre l'obésité et les maladies
métaboliques associées.
Selon un sixième objet, l'invention concerne des
cellules différenciées obtenues selon le procédé défini
ci-dessus destinées à une utilisation, ou pour leur
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utilisation, en thérapie cellulaire, en particulier en
chirurgie plastique et réparatrice et,
plus
particulièrement, pour le lipofilling.
Brève description des figures
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la
description non limitative qui suit, rédigée au regard des
dessins annexés, dans lesquels :
- la figure lA représente schématiquement les étapes
nécessaires et suffisantes pour l'extraction d'une matrice
extracellulaire et d'une fraction stroma-vasculaire
(étapes 1 à 3), et leur mise en coculture (étape 4), selon
l'invention ;
- la figure 1B est une représentation schématique plus
détaillée de la méthode qui permet l'extraction
séquentielle de matrices extracellulaires (M1-M4) et de
populations de cellules (C1-C3) de fraction stroma-
vasculaire (étapes 1 à 5), et de leur mise en coculture
(étape 6), selon l'invention ;
- la figure 2 représente la population cellulaire Cl
en milieu de culture Endothelial Growth Medium supplémenté
en facteurs de croissance (EGM+), en suspension,
constituée d'une majorité de cellules de type
endothéliales ;
- la figure 3A montre le marquage immuno-fluorescent
CD31+ (marqueur de cellules endothéliales) de la
population cellulaire Cl en culture adhérente ;
- la figure 3B montre le marquage immuno-fluorescent
PDGFRa+ (marqueur de cellules souches adipocytaires) de la
population cellulaire Cl en culture adhérente ;
- la figure 4 illustre la population cellulaire C2 en
milieu de culture EGM+ en suspension montrant la formation
d'un réseau de type capillaire constitué de cellules
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endothéliales CD31+ et présence d'agrégats constitués de
cellules souches du tissu adipeux PDGFRa+ ;
- la figure 5 est une image par microscopie de la
population cellulaire 03 en milieu de culture EGM+ en
suspension montrant la présence d'agrégats constitués de
cellules souches du tissu adipeux PDGFRa+ ;
- la figure 6A représente une PCR quantitative des
populations cellulaires C2 et C3 permettant de déterminer
la proportion relative de cellules endothéliales CD31+ et
des cellules souches du tissu adipeux PDGFRa+ ;
- la figure 6B est une image de microscopie à
fluorescence montrant la capacité de différenciation
adipocytaire des populations cellulaires C2 ; Noyaux (gris
foncé) Gouttelettes lipidiques (gris clair) ;
- la figure 6C illustre, par une image de microscopie
à fluorescence, la capacité de différenciation
adipocytaire des populations cellulaires C3 ; Noyaux (gris
foncé) Gouttelettes lipidiques (gris clair) ;
- la figure 7 caractérise, en microscopie, le type
fibreux de la matrice M1 ;
- la figure 8 montre, par microscopie, que la matrice
M2 est hétérogène en termes de types matricielles : type
fibreux et type riche en collagène ;
- la figure 9 est une image de microscopie illustrant
le type fibreux de la matrice M3 ;
- la figure 10A montre, par microscopie à fluorescence,
que la matrice M2 est de type riche en collagène ;
collagène marqué au Picro-Sirius Red (gris clair) et
marquage des noyaux (blanc) ;
- la figure 10B montre, par microscopie à fluorescence,
que la matrice M3 est de type fibreux ; collagène marqué
au Picro-Sirius Red (gris clair et fibres blanches) et
marquage des noyaux (blanc) ;
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- la figure 11A est une photographie du tissu adipeux
centrifugé de la fraction A après dissociation mécanique
contenant la matrice M4 ;
- la figure 11B met en évidence par microscopie en
5 fluorescence, dans la matrice M4, des adipocytes matures
par coloration Oil red 0 (gris clair) et une matrice riche
en collagène par marquage du collagène de type I (gris
très clair) ;
- la figure 11C montre, par l'immunomarquage CD31, les
10 structures capillaires formées par des cellules
endothéliales CD31+ (blanc) dans la matrice M4 ; marquage
des noyaux (gris foncé) ;
- la figure 11D illustre la présence du réseau de
cellules souches du tissu adipeux PDGFRa+ (points gris
clair) dans la matrice M4 ; marquage des noyaux (gris
foncé) ;
- la figure 12 montre, par incorporation d'Edu, 5-
ethylny1-2'-deoxyuridine, dans le noyau des cellules en
prolifération, que les cellules endogènes, dans la matrice
extracellulaire de l'invention sont maintenues en
prolifération dans le milieu EGM+ en suspension ; noyaux
(gris foncé), cellules en prolifération (blanc) auto-
fluorescence de la matrice (gris clair) ;
- la figure 13 montre que des cellules souches du tissu
adipeux exogènes, mises en coculture avec la matrice
extracellulaire de l'invention, forment des structures
composées de ces cellules souches du tissu adipeux et des
cellules endogènes présentent dans la matrice ; image
prise après 3 jours de coculture, noyaux (gris foncé),
collagène (gris clair), cellules souches exogènes du tissu
adipeux (gris clair/blanc) ;
- la figure 14A montre la formation d'un agrégat
cellulaire sans prolifération de cellules lors de la
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culture cellulaire des cellules souches du tissu adipeux
et des cellules endothéliales en suspension sans matrice
extracellulaire ; image prise après 10j de co-culture ;
noyaux (gris foncé), noyaux de cellules en prolifération
(gris très clair) ;
- la figure 14B met en évidence une capacité de
prolifération des cellules souches du tissu adipeux et des
cellules endothéliales mises en co-culture, en suspension,
avec la matrice extracellulaire de l'invention ; image
prise après 10j de co-culture ; noyaux (gris foncé),
matrice collagène (gris clair), noyaux de cellules en
prolifération par marquage Edu (blanc) ;
- la figure 15A montre le niveau d'expression du
marqueur de cellules endothéliales CD31 dans les
populations cellulaires différenciées obtenues par
culture, en suspension, avec (droite) et sans (gauche) la
matrice extracellulaire de l'invention ;
- la figure 15B montre le niveau d'expression du
marqueur de cellules souches adipocytaires PDGFRa dans les
populations cellulaires différenciées obtenues par
culture, en suspension, avec (droite) et sans (gauche) la
matrice extracellulaire de l'invention ;
- la figure 15C montre le niveau d'expression du
marqueur d'adipocytes matures PLN1 dans les populations
cellulaires différenciées obtenues par culture, en
suspension, avec (droite) et sans (gauche) la matrice
extracellulaire de l'invention ;
- la figure 15D montre le niveau d'expression du
marqueur d'adipocytes matures Adiponectine dans les
populations cellulaires différenciées obtenues par
culture, en suspension, avec (droite) et sans (gauche) la
matrice extracellulaire de l'invention ;
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- la figure 16 représente une image par microscopie à
fluorescence de la fraction stroma-vasculaire après
amplification et différenciation en présence de la matrice
extracellulaire de l'invention ; noyau (gris foncé),
adipocyte mature (gris clair), matrice collagénique (gris
moyen) ;
- les figures 17A et 17B sont des images qui mettent
en évidence l'activation des capacités de prolifération du
procédé selon l'invention. En figure 17A, un tissu adipeux
non dissocié ne montre pas de cellules en prolifération.
En figure 17B, la composition montre des cellules en
prolifération, les noyaux des cellules en prolifération
étant représentés en blanc sur cette figure ;
- les figures 18A, 18B, 18C et 18D, illustrent
l'expression de la dipeptidyl peptidase-4 (DPP4), qui est
concentrée dans la fraction stroma vasculaire (SVF)
isolée, et l'expression de ICAM1, qui est concentrée dans
la matrice isolée ;
- les figures 19A et 19B illustrent la présence de
macrophages de type M1 et de type M2 respectivement, dans
la composition amplifiée selon l'invention ; et
- la figure 20 comprend un ensemble de photographies
qui démontrent la présence de certaines protéines dans la
matrice extracellulaire selon l'invention, et la
conservation d'un réseau capillaire.
Description détaillée de l'invention
Le tissu adipeux est fourni pour réaliser l'Invention.
L'invention a pour premier objet, un procédé
d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du
tissu adipeux humain comprenant les étapes suivantes :
extraction , d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire
d'un tissu adipeux humain comprenant des cellules
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endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain
et des cellules souches du tissu adipeux humain, et d'autre
part, d'une matrice extracellulaire dudit tissu adipeux
humain, ladite matrice extracellulaire comprenant des
cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu
adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux
humain et du collagène ; mélange de ladite fraction stroma-
vasculaire et de ladite matrice extracellulaire ; et
culture du mélange obtenu à l'étape précédente, en
suspension, dans un milieu de culture. Ce procédé est
également dénommé, ci-après, procédé ExAdEx (pour Ex
vivo Adipocytes Expansion).
Au sens de la présente invention, il est entendu par
fraction stroma-vasculaire les cellules présentes dans
un prélèvement de tissu adipeux humain. Cette fraction
stroma-vasculaire comprend des cellules endothéliales du
réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules
souches du tissu adipeux humain.
Au sens de l'invention, il est entendu par matrice
extracellulaire une matrice bioactive, c'est à dire une
matrice qui comprend différentes protéines du tissu
adipeux et des cellules endogènes. Cette matrice
extracellulaire permet l'amplification cellulaire en 3D,
c'est-à-dire la prolifération des cellules en trois
dimensions. La matrice extracellulaire de l'invention est
également notée ci-après EndoStem-Matrix ou matrice
EndoStem .
Les protéines de la matrice extracellulaire du tissu
adipeux comprennent du collagène. Ce collagène est de type
I et de type III. Les protéines de la matrice
extracellulaire du tissu adipeux comprennent en outre de
la fibronectine.
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L'extraction de la matrice extracellulaire comprend
une étape de dissociation non-enzymatique, en particulier
l'extraction de la matrice extracellulaire comprend une
étape de dissociation mécanique. La dissociation
mécanique de l'invention permet de conserver intacte la
structure de la matrice extracellulaire tandis qu'une
digestion enzymatique fait généralement intervenir de la
collagénase qui la détruit. La dissociation mécanique
permet ainsi le maintien de la vasculature et la micro-
structure de la matrice extracellulaire, qui présente en
conséquence une organisation semblable à l'organisation du
tissu adipeux in vivo.
L'extraction de la fraction stroma-vasculaire et de la
matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes :
centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au
moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant
une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction
stroma-vasculaire ; et dissociation mécanique de la
fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire.
L'étape de centrifugation du tissu adipeux humain
permet en outre d'éliminer de l'huile, du sang et du
liquide anesthésique contenus dans le tissu adipeux humain
fourni. Cette étape permet également d'éliminer du liquide
physiologique issu de lavages préalables du tissu adipeux
humain fourni.
Dans un mode de réalisation particulier, l'extraction
de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice
extracellulaire comprend les étapes
suivantes :
centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au
moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant
une matrice extracellulaire centrifugée et une fraction B
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu
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adipeux humain ; dissociation mécanique de la fraction A
pour obtenir une fraction A' comprenant une matrice
extracellulaire dissociée ; centrifugation de la fraction
A' pour obtenir au moins la matrice extracellulaire et une
5 fraction B' comprenant des cellules endothéliales du
réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules
souches du tissu adipeux humain ; et mélange des fractions
B et B' pour obtenir la fraction stroma-vasculaire.
Dans ce mode de réalisation, l'étape de centrifugation
10 du tissu adipeux humain permet en outre d'éliminer de
l'huile, du sang et du liquide anesthésique contenus dans
le tissu adipeux humain fourni. Cette étape permet
également d'éliminer du liquide physiologique issu de
lavages préalables du tissu adipeux humain fourni. La
15 centrifugation de la fraction A' permet en outre d'éliminer
d'éventuels résidus d'huile et de liquide physiologique.
Cette étape de centrifugation de la fraction A' est
optionnelle.
La culture du mélange de ladite fraction stroma-
vasculaire et de ladite matrice extracellulaire comprend
les étapes suivantes : transfert dudit mélange de manière
stérile dans une poche de culture en suspension comprenant
du milieu de culture ; amplification dudit mélange formant
des agrégats cellulaires ; et dissociation mécanique
desdits agrégats cellulaires.
Le transfert de manière stérile , au sens de
l'invention, est un transfert, de préférence, réalisé en
système clos. Ce transfert de manière stérile permet de
limiter le nombre de contaminants lors de la culture
cellulaire. La dissociation mécanique des agrégats formés
au cours de l'amplification ne nécessite pas d'ouverture
du système, limitant ainsi l'exposition des produits
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cellulaires à une éventuelle contamination de la culture
par les éléments de l'environnement.
Dans un mode de réalisation, le milieu de culture,
dans la poche de culture en suspension, est un milieu EGM+.
Ce milieu de culture comprend le milieu de base pour la
prolifération des cellules endothéliales (EGM) enrichi en
Epidermal Growth Factor (EGF), Basic Growth Factor (FGF2),
Insulin-like Growth Factor, Vascular Endothelial Growth
Factor 165, acide ascorbique, héparine et hydrocortisone
(EGM+). Le milieu EGM+ permet également l'amplification
des cellules souches adipocytaires sans altérer leur
capacité de différenciation en adipocytes.
Le procédé de l'invention permet une amplification du
nombre de cellules souches du tissu adipeux avec un facteur
d'amplification supérieur à 10, avantageusement supérieur
à 20, en particulier supérieur à 30, de préférence
supérieur à 35. Le facteur d'amplification est le rapport
entre le nombre de cellules obtenues après culture de la
SVF isolée en présence de ladite matrice extracellulaire
et le nombre de cellules avant l'invention. Dans un mode
de réalisation particulier décrit dans l'exemple 2, le
procédé de l'invention présente un facteur d'amplification
de 36 en 8 jours.
Selon un second objet, l'invention concerne un procédé
d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules
différenciées comprenant les étapes
suivantes :
amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du
tissu adipeux humain telle que définie ci-dessus ; et
induction d'une différenciation des cellules souches du
tissu adipeux pour obtenir des cellules différenciées.
Plus précisément, le procédé d'amplification in vitro
ou ex vivo de cellules différenciées comprend donc les
étapes suivantes : extraction, d'une part, d'une fraction
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stroma-vasculaire d'un tissu adipeux humain comprenant,
des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu
adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux
humain, et d'autre part, d'une matrice extracellulaire
dudit tissu adipeux humain, ladite matrice extracellulaire
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu
adipeux humain et du collagène ; mélange de ladite fraction
stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire ;
culture du mélange obtenu à l'étape précédente, en
suspension, dans un milieu de culture ; et induction d'une
différenciation des cellules souches du tissu adipeux pour
obtenir des cellules différenciées.
Au sens de l'invention, les cellules différenciées
sont des adipocytes ou des ostéoblastes. De préférence,
les cellules différenciées sont des adipocytes.
Le procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de
cellules différenciées comprenant les étapes liées à
l'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du
tissu adipeux, les précisions données ci-dessus pour le
procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules
souches du tissu adipeux s'appliquent également pour le
procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules
différenciées.
En particulier, l'extraction de la matrice
extracellulaire comprend une étape de dissociation non-
enzymatique, en particulier l'extraction de la matrice
extracellulaire comprend une étape de dissociation
mécanique.
Dans un mode de réalisation, l'extraction de la
fraction stroma-vasculaire et de la
matrice
extracellulaire comprend les étapes
suivantes :
centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au
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moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant
une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction
stroma-vasculaire ; et dissociation mécanique de la
fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire.
Dans un autre mode de réalisation, l'extraction de la
fraction stroma-vasculaire et de la
matrice
extracellulaire comprend les étapes
suivantes :
centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au
moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant
une matrice extracellulaire centrifugée et une fraction B
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu
adipeux humain ; dissociation mécanique de la fraction A
pour obtenir une fraction A' comprenant une matrice
extracellulaire dissociée ; centrifugation de la fraction
A' pour obtenir au moins la matrice extracellulaire et une
fraction B' comprenant des cellules endothéliales du
réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules
souches du tissu adipeux humain ; et mélange des fractions
B et B' pour obtenir la fraction stroma-vasculaire.
Le collagène de la matrice extracellulaire comprend du
collagène de type I et du collagène de type III révélé par
coloration au Picro-Sirius Red.
La culture du mélange de ladite fraction stroma-
vasculaire et de ladite matrice extracellulaire comprend
les étapes suivantes : transfert dudit mélange de manière
stérile dans une poche de culture en suspension comprenant
du milieu de culture ; amplification dudit mélange formant
des agrégats cellulaires ; et dissociation mécanique
desdits agrégats cellulaires.
Selon un troisième objet, l'invention concerne une
matrice extracellulaire isolée susceptible d'être obtenue
selon le procédé défini ci-dessus, comprenant des cellules
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endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux
humain, des cellules souches du tissu adipeux humain, et
du collagène.
Le collagène est du collagène de type I et du collagène
de type III. La matrice extracellulaire comprend en outre
de la fibronectine.
Selon un quatrième objet, l'invention concerne une
composition comprenant le mélange de la matrice
extracellulaire et de la fraction stroma-vasculaire tel
que défini ci-dessus, la matrice extracellulaire
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu
adipeux humain, et du collagène, et la fraction stroma-
vasculaire comprenant des cellules endothéliales du réseau
vasculaire du tissu adipeux et des cellules souches du
tissu adipeux.
Le collagène est du collagène de type I et du collagène
de type III. La matrice extracellulaire comprend en outre
de la fibronectine.
Selon un cinquième objet, l'invention concerne
l'utilisation in vitro de la matrice extracellulaire telle
que définie ci-dessus ou l'utilisation in vitro de la
composition telle que définie ci-dessus pour le criblage
d'actifs pharmacologiques contre l'obésité et les maladies
métaboliques associées comme le diabète de type 2 et les
maladies cardio-vasculaires.
Selon un sixième objet, l'invention concerne des
cellules différenciées obtenues selon le procédé défini
ci-dessus destinées à une utilisation, ou pour leur
utilisation, en thérapie cellulaire, en particulier en
chirurgie plastique et réparatrice, et
plus
particulièrement pour le lipofilling.
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Dans le cas d'une utilisation en chirurgie plastique
et réparatrice, la matrice extracellulaire est une matrice
autologue, qui contient, par définition, des cellules
propres au patient dont le tissu adipeux est issu.
5 Pour une utilisation pour le lipofilling, les cellules
différenciées obtenues par le procédé de l'invention sont
des adipocytes.
EXEMPLES
10 Exemple 1. Extraction mécanique
a) Procédé d'extraction mécanique en vue de la
caractérisation des populations cellulaires et
matricielles au cours du processus
L'extraction mécanique de la fraction stroma-
15 vasculaires et de la matrice extracellulaire, à partir
d'un prélèvement de tissu adipeux chez un donneur humain,
peut être réalisée selon les étapes suivantes (Fig. 1B) :
1. Prélèvement de tissu adipeux par aspiration dans
une seringue stérile de 10cc équipée d'une canule de
20 Coleman 2mm en dépression -20kPa.
2. Afin de séparer les différentes phases, la seringue
est centrifugée à 1600 rcf (force centrifuge relative), 3
min dans le tube de collecte. La fraction huile ainsi que
la fraction sang et liquide anesthésique sont éliminées.
La fraction culotée est conservée.
3. Une unité de sérum physiologique est injectée dans
la seringue, suivie d'une incubation de 30 min à 37 C en
agitation. La seringue est centrifugée à 1600 rcf, 3 min
dans le tube de collecte. La fraction de liquide
physiologique et la fraction huile sont éliminées. La
fraction culotée est conservée.
4. La seringue est connectée à une autre seringue de
type Luer-Lock mâle reliée par un connecteur de type Tulip
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afin de procéder à la dissociation du tissu par une
émulsification. Trois types de connecteur Tulip,O, 2,4 mm,
1,4 mm puis 1,2 mm, sont successivement utilisés, sur 30
passages.
5. Une unité de sérum physiologique est injectée dans
la seringue, suivie d'une incubation de 30 min à 37 C en
agitation. La seringue est centrifugée à 1600 rcf 3 min
dans le tube de collecte. La fraction de liquide
physiologique et la fraction huile sont éliminées. La
fraction culotée est conservée.
6. Le contenu de la seringue ainsi que les contenus des
tubes de collecte préalablement débarrassé des cellules
sanguines sont transférés par une connexion stérile dans
une poche de culture contenant le milieu de culture EGM+
à 37 C pour la phase d'expansion.
Lors de l'étape 4 ci-dessus de dissociation du tissu,
un connecteur d'une autre marque que la marque Tulip peut
être employé. Le nombre de connecteur employé est compris
entre 1 et 5. Le nombre de passages à travers ces
connecteurs est compris entre 10 et 50.
b) Caractérisation des populations cellulaires obtenues
Le procédé décrit ci-dessus permet d'extraire
séquentiellement la fraction stroma-vasculaire en 3
populations cellulaires. Ces populations cellulaires sont
caractérisées en particulier par microscopie optique et
par microscopie à fluorescence.
- La population cellulaire obtenue lors de l'étape 2,
nommée ici Cl, est composée d'une majorité de cellules de
type endothéliales CD31+ (Fig. 2 et Fig. 3).
- La population cellulaire obtenue lors de l'étape 3,
nommée ici C2, est composée de cellules de type
endothéliales CD31+ formant un réseau de type capillaire
lorsque maintenue en 3D et de cellules souches du tissu
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adipeux PDGFRa+ (Fig. 4 et Fig. 6A). La population
cellulaire C2 a la capacité de se différencier en
adipocytes matures (Fig. 6B).
- La population cellulaire obtenue lors de l'étape 5,
nommée ici C3, est composée d'une majorité de cellules
souches du tissu adipeux PDGFRa+ capables de former des
sphères en suspension (Fig. 5 et Fig. 6A). La population
cellulaire C3 a la capacité de se différencier en
adipocytes matures (Fig. 6C).
c) Caractérisation des matrices M1 à M4 obtenues lors
des différentes étapes du procédé
- La matrice obtenue lors de l'étape 2, nommée ici M1
est de type fibreux (Fig. 7).
- La matrice obtenue lors de l'étape 3, nommée ici M2
est de type fibreux et riche en collagène (Fig. 8). Le
collagène est révélé par le Picro-Sirius Red (Fig. 10A)
qui permet, de plus, de visualiser une structure du
collagène en bâtonnets. Cette matrice contient des
cellules endogènes.
- La matrice obtenue lors de l'étape 5 et isolé dans le
tube de collecte, nommée ici M3 est de type fibreux (Fig.
9 et Fig. 10B). Cette matrice contient également des
cellules endogènes. Le collagène de la matrice isolée est
révélé, à la Fig. 10B, par le Picro-Sirus Red qui colore
les fibres de collagène de type I et de type III. La
coloration rouge (en nuance de gris à la Fig. 10B) obtenue
indique que le collagène reste organisé, à savoir que le
collagène présent présente toujours une structure
secondaire en hélice a et une structure quaternaire en
triple hélice. Il n'est pas dégradé. En effet, le collagène
désorganisé se colore en vert par le Picro-Sirus Red.
- La matrice obtenue lors de l'étape 5 et contenue dans
la seringue, nommée ici M4, est composée d'une majorité
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d'adipocytes matures et d'une trame de collagène de type
I (Fig. 11B). La matrice M4 est également composée de
structures capillaires formées par des cellules
endothéliales CD31+ (Fig. 11C) et par un réseau de cellules
souches du tissu adipeux PDGFRa+ (Fig. 11D).
La figure lA montre un procédé permettant de rassembler
dans l'étape 2 les populations Cl et C2 ainsi que les
matrices M1 et M2. Dans l'étape 3 sont regroupées la
population C3 et les matrices M3 et M4.
Exemple 2. Expansion cellulaire et différenciation
Une méthode d'expansion ex vivo de cellules souches du
tissu adipeux et de différenciation dans un environnement
mimant le tissu adipeux comprend les étapes suivantes :
1. Le produit final obtenu à l'exemple 1 contenant les
populations C1-C3 ainsi que les matrices dites EndoStem-
Matrix M1-M4 sont misent en culture en suspension dans des
poches et maintenues dans le milieu de prolifération EGM+
avec une agitation pendant 24h à 37 C 5% CO2, puis
maintenues dans les mêmes conditions, de préférence, avec
agitation.
2. Le milieu de prolifération EGM+ est changé à 50%
tous les deux jours.
3. Une dissociation mécanique en système clos, par
passage à travers 2 seringues ou deux poches de culture
montées en tulipe, est effectuée au jour 5 et jour 10.
4. Au jour 14, le milieu de prolifération EGM+ est
remplacé par le cocktail de différenciation I composé de
EGM+ enrichi en 250 pM Dexaméthasone ; 500 pM IBMX ; 1 pM
Rosiglitazone ; 2 pM 13 et 2,5 pg/ml insuline.
5. Au jour 17, le milieu de différenciation I est
remplacé par le milieu de différenciation II composé de
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EGM+ enrichi en 1 pM Rosiglitazone ; 2 pM 13 et 2,5 pg/ml
insuline.
Exemple 3. Caractérisation de la capacité
d'amplification de la matrice
Les matrices extracellulaires dites EndoStem-Matrix de
l'invention ont été caractérisées, notamment, par
microscopie à fluorescence, en présence de différents
marqueurs spécifiques. Des cellules en prolifération ont
ainsi été détectées par incorporation, lors de la phase de
réplication de l'ADN, de Edu (5-ethylny1-2'-deoxyuridine)
fluorescent dans les matrices EndoStem-Matrix de
l'invention, comme illustré sur la figure 12, prouvant que
celles-ci sont bioactives. En effet, la figure 12 montre
que les cellules endogènes aux matrices sont maintenues en
prolifération pendant la phase d'amplification.
Par ailleurs, la figure 13 met en évidence la présence
de cellules souches du tissu adipeux après trois jours de
co-culture avec la matrice extracellulaire de l'invention.
La matrice extracellulaire permet donc de fournir un
support pour la prolifération de la fraction stroma-
vasculaire : les cellules souches du tissu adipeux
ajoutées peuvent s'attacher à la matrice EndoStem-Matrix,
en suspension.
En référence à la figure 14B, la fraction stroma-
vasculaire est amplifiée par sa culture sur l'EndoStem
Matrix de l'invention. A l'inverse, en référence à la
figure 14A, lorsque la fraction stroma-vasculaire est mise
en culture en suspension sans la matrice extracellulaire,
des agrégats cellulaires sans prolifération sont observés.
La matrice extracellulaire de l'invention a donc la
capacité d'amplifier les cellules souches du tissu adipeux
ajoutées.
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La capacité d'amplification cellulaire des différentes
matrices M1 à M4 obtenues au cours des étapes de l'exemple
1 a été vérifiée. Ainsi, environ 104 cellules souches du
tissu adipeux ont été maintenues en suspension en présence
5 des différentes matrices M1 à M4 en puits Ultra Low
Attachment (ULA). Huit jours après, les cellules sont
détachées de la matrice par de la trypsine/EDTA puis
comptées. Les valeurs obtenues sont montrées dans le
tableau 1 suivant :
10 [Table 1]
Nombre de Facteur
Conditions
cellules
d'amplification
Cellules souches du
tissu adipeux sans 2-104 1
matrice
Cellules souches du
tissu adipeux avec 5-104 2,5
matrice M1
Cellules souches du
tissu adipeux avec 53-104 26,5
matrice M2
Cellules souches du
tissu adipeux avec 7,4-104 3,7
matrice M3
Cellules souches du
tissu adipeux avec 72-104 36
matrice M4
Matrice M4 sans ajout
de cellules souches 5-104
du tissu adipeux
Dans le tableau ci-dessus, pour le cas particulier des
matrices individuelle M1 à M4, le facteur d'amplification
est le rapport entre le nombre de cellules obtenues après
15 culture en présence de la matrice extracellulaire et le
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nombre de cellules obtenu en absence de la matrice
extracellulaire.
Les matrices M2 et M4 ont un fort pouvoir
d'amplification des cellules souches du tissu adipeux. Le
volume de matrice M2 obtenu est très faible comparé au
volume de la M4 (Fig. 11A). La matrice M4 illustre une
matrice extracellulaire telle que définie dans
l'invention.
Le niveau d'expression de différents marqueurs
cellulaires (marqueur de cellules endothéliales CD31,
marqueur de cellules souches adipocytaires PDGFRa+, et
deux marqueurs d'adipocytes matures PLN1 et Adiponectine)
a été analysé après culture en suspension de la fraction
stroma-vasculaire sur la matrice extracellulaire de
l'invention. La figure 15 montre une comparaison de ces
niveaux d'expression avec ceux issus d'une culture en
suspension de la fraction stroma-vasculaire sans la
matrice extracellulaire de l'invention. Cette étude révèle
une amplification des cellules endothéliales du réseau
vasculaire du tissu adipeux (figure 15A) et des cellules
souches du tissu adipeux (figure 15B). Cette étude permet
également de mettre en évidence la meilleure capacité de
différenciation induite par la matrice extracellulaire de
l'invention (figure 15C et 15D). Ainsi, les cellules
souches du tissu adipeux amplifiées en 3D sur la matrice
extracellulaire de l'invention gardent leur capacité à se
différencier en adipocytes.
La figure 16 met en évidence la présence de noyaux,
d'adipocytes matures et d'une matrice collagénique après
amplification et différenciation de la fraction stroma-
vasculaire en présence de la matrice extracellulaire de
l'invention. Ainsi, la différenciation en présence de la
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matrice extracellulaire de l'invention permet de conserver
l'organisation structurelle in vivo du tissu adipeux.
On notera qu'un tissu adipeux non dissocié, qui peut
être assimilé à un explant, reste viable peu de temps ex
vivo. Ainsi que cela est montré notamment à la Fig. 12, la
matrice isolée par dissociation contient des cellules en
prolifération, au contraire d'un tissu non dissocié. Les
Figs. 17A et 17B permettent de comparer la prolifération
cellulaire dans le tissu non dissocié (Fig. 17A) et dans
la matrice isolée (Fig. 17B). En Fig. 17A, le tissu adipeux
non dissocié ne montre pas de cellules en prolifération.
En Fig. 17B, la composition montre des cellules en
prolifération. En effet, cette figure fait apparaître, en
blanc, les noyaux des cellules en prolifération.
On notera que les cellules isolées selon l'invention,
par centrifugation du liquide des lavages, sont
caractérisées moléculairement par le marqueur DPP4. DPP4
est un marqueur qui marque les cellules précurseurs des
pré-adipocytes ICAM1, qui ont une grande capacité de
prolifération et qui sont localisées dans le réticulum
interstitiel du tissu adipeux. Ce sont ces cellules qui
ont la capacité de prolifération dans la composition selon
l'invention. Il est important de noter que ces cellules
sont éliminées à la suite des lavages réalisés selon les
procédés de l'art antérieur. Ainsi que cela est montré
aux Figs. 18A et 18B, l'expression de DPP4 est concentrée
dans la fraction SVF isolée. La matrice en exprime peu. En
revanche, et ainsi que cela est montré aux Figs. 18C et
18D, l'expression de ICAM1, est concentrée dans la matrice
isolée. Les cellules qui portent l'amplification dans la
composition sont les cellules exprimant DPP4 ajoutées.
Par ailleurs, on notera que le tissu adipeux in vivo
contient des macrophages et que la composition amplifiée
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selon l'invention maintient la présence de macrophages de
type Ml, ainsi que cela est montré à la Fig. 19A et de
type M2 ainsi que cela est montré à la Fig. 19B. A la Fig.
19A, les macrophages de type M1 sont révélés par le
marqueur IL-lb et, à la Fig. 19B, les macrophages de type
M2 sont révélés par le marqueur MRC1.
Enfin, et ainsi que cela est montré à la Fig. 20, la
matrice isolée selon l'invention comprend des protéines de
la matrice extracellulaire, à savoir notamment, le
collagène de type I, le collagène de type IV, l'élastine,
la fibronectine, la laminine. Le marquage des cellules
endothéliales CD31 montre qu'un réseau capillaire est
conservé.
