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PROCÉDÉ OPTIMISÉ D'EXPLOITATION INDUSTRIELLE D'ALGUES ROUGES
UNICELLULAIRES
DOMAINE DE L'INVENTION.
La présente invention concerne un procédé de culture d'algues rouges
unicellulaires
(ARUs) optimisé pour la valorisation des produits de culture, tant la biomasse
obtenue, que
les phycocyanines qui en sont extraites ou les autres produits de culture
comme des
porphyrines ou des extraits protéiques.
ETAT DE LA TECHNIQUE.
On connaît différents moyens de cultiver des microalgues, en particulier des
algues
rouges unicellulaires (ARUs) pour la fabrication de différents produits pour
des usages
industriels ou alimentaires.
On citera notamment les procédés de culture et de transformation des
spirulines pour
la fabrication de compléments alimentaires riches en protéines ou encore pour
la fabrication
de phycocyanines utiles comme colorant alimentaires.
On citera également les procédés de cultures et de transformation d'ARUs pour
l'obtention de produits similaires et en particulier les procédés de culture
et de transformation
de Galdieria sulphuraria décrits dans les demandes de brevets VVO 2017/050917,
VVO
2017/093345 et VVO 2018/178334.
Un procédé industriel de culture et de transformation des ARUs comme Galdieria
sulphuraria est représenté sur la figure 1.
On notera toutefois que ces différents procédés peuvent encore être améliorés
à
chaque étape de la production et de la transformation des ARUs. En particulier
ces procédés
peuvent être améliorés au regard du fait que les ARUs comme Galdieria
sulphuraria
accumulent d'importantes quantités de glycogène lorsqu'elles sont cultivées
dans des
conditions usuelles de culture, quantités de glycogène qui impactent en
particulier les
conditions de traitement de la biomasse, lyse cellulaire notamment, les
conditions d'isolation
des produits à partir de la biomasse et la qualité de ces produits isolés, en
particulier les
phycocyanines.
En particulier, il est important de pouvoir optimiser ces différentes étapes
pour mieux
valoriser les produits obtenus.
EXPOSE DE L'INVENTION.
L'invention concerne un procédé optimisé de culture et de valorisation des
ARUs, en
particulier de Galdieria sulphuraria, comprenant des étapes (a) de culture par
fermentation
des ARUs, (b) de séparation de la biomasse du jus de fermentation, le cas
échéant (c) de
lyse cellulaire et le cas échéant une étape (d) d'extraction de produits
valorisables à partir de
la biomasse lysée, qui comprend au moins l'une des étapes suivantes de:
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(cl) de lyse par broyage avec maintien de la biomasse pendant le broyage à une
température inférieure à 50 C et/ou
(al) culture par fermentation avec une phase de maturation avec limitation de
l'apport
en source de carbone dans le milieu de culture, et/ou
(bl) extraction de porphyrines à partir du jus de fermentation, et/ou
(dl) d'extraction des phycocyanines de la biomasse lysée par au moins 2
lavages
successifs dans des quantités d'eau représentant au total moins de 4 fois le
volume total de
biomasse lysée.
L'invention concerne également les produits obtenus par le procédé, en
particulier les
porphyrines extraites du jus de fermentation, la biomasse, la biomasse lysée,
les protéines
et/ou les phycocyanines isolées.
DESCRIPTION DES FIGURES.
La Figure 1 représente un schéma simplifié du procédé de fabrication de
différents
produits à partir de la culture de Galdieria sulphuraria.
La Figure 2 représente la croissance de la souche de Galdieria sulphuraria en
mode
FedBatch sur glycérol avec phase de maturation.
La Figure 3 représente le suivi de la composition de la biomasse au cours de
la culture
en mode FedBatch sur glycérol avec phase de maturation.
La Figure 4 représente la croissance de la souche de Galdieria sulphuraria en
mode
Fed-Batch sur perméat de lait avec phase de maturation.
La Figure 5 représente le suivi de la composition de la biomasse au cours de
la culture
sur perméat de lait en mode FedBatch avec phase de maturation.
La Figure 6 représente le suivi de croissance d'une souche de Galdieria
sulphuraria
cultivée en continu sur glycérol sans production de porphyrines.
La Figure 7 représente le suivi de la composition de la biomasse au cours de
la culture
de Galdieria sulphuraria cultivée en continu sur glycérol.
La Figure 8 représente le suivi de croissance d'une souche de Galdieria
sulphuraria en
mode continu sur glucose.
La Figure 9 représente le suivi de la composition de la biomasse au cours de
la culture
de Galdieria sulphuraria cultivée en continu sur glucose.
La Figure 10 représente le suivi de croissance d'une souche de Galdieria
sulphuraria
en mode continu sur perméat de lait.
La Figure 11 représente le suivi de la composition de la biomasse au cours de
la
culture de Galdieria sulphuraria cultivée en continu sur perméat de lait.
La Figure 12 représente les données de broyage HHP Bertoli (1200bar5) sans
refroidissement.
La Figure 13 représente les données de broyage HHP Bertoli (1200bar5) avec
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refroidissement.
La Figure 14 représente la résistance de la Phycocyanine à 50 C sur des lysats
ajustés
à différents pH.
La Figure 15 représente l'effet du diamètre des billes sur le taux de lyse
cellulaire par
broyeur à billes.
La Figure 16 représente les quantités de phycocyanines extraites avec des
lavages en
série par comparaison à des lavages en une seule fois pour différents volumes
d'eau.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION.
Les différentes étapes du procédé selon l'invention sont décrites plus en
détail ci-après
et dans les exemples.
Par valorisation , on entend selon l'invention les étapes techniques qui
permettent
d'isoler des produits utiles pour une utilisation dans l'industrie,
En particulier, le procédé selon l'invention comprend les étapes successives
suivantes :
(al) de culture par fermentation avec une phase de maturation qui comprend la
limitation de l'apport en source de carbone dans le milieu de culture,
(bl) le cas échéant d'extraction de porphyrines à partir du jus de
fermentation,
(cl) le cas échéant de lyse par broyage avec maintien de la biomasse pendant
le
broyage à une température inférieure à 50 C et,
(dl) le cas échéant d'extraction des phycocyanines de la biomasse lysée par au
moins
2 lavages successifs dans des quantités d'eau représentant au total moins de 4
fois le
volume total de biomasse lysée.
Plus particulièrement le procédé selon l'invention comprend les étapes
successives
suivantes :
(al) de culture par fermentation avec une phase de maturation qui comprend la
limitation de l'apport en source de carbone dans le milieu de culture,
(bl) d'extraction de porphyrines à partir du jus de fermentation,
(cl) de lyse par broyage avec maintien de la biomasse pendant le broyage à une
température inférieure à 50 C et,
(dl) d'extraction des phycocyanines de la biomasse lysée par des lavages
successifs
dans des quantités d'eau représentant au total moins de 3 fois le volume total
de biomasse
lysée.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé comprend
au moins
les étapes suivantes :
(al) de culture par fermentation avec une phase de maturation par limitation
de l'apport
en source de carbone dans le milieu de culture, et
(bl) d'extraction de porphyrines à partir du jus de fermentation.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé
comprend au
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moins les étapes suivantes :
(cl) de lyse par broyage avec maintien de la biomasse pendant le broyage à une
température inférieure à 50 C et, le cas échéant
(dl) d'extraction des phycocyanines de la biomasse lysée par des lavages
successifs
dans des quantités d'eau représentant au total moins de 3 fois le volume total
de biomasse
lysée.
Les ARUs sont bien connues de l'homme du métier, en particulier les ARUs
susceptibles d'être cultivées de manière industrielle pour la production de
biomasse et de
ses produits dérivés, protéines ou phycocyanines. On citera en particulier les
algues (ou
microalgues) des ordres des Cyanidiales. L'ordre des Cyanidiales, englobe les
familles des
Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, elles-mêmes subdivisées en les genres
Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, auxquelles appartiennent entre autres
les
espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium
caldarum, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium
rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore
Galdieria
sulphuraria. On citera en particulier la souche Galdieria sulphuraria (aussi
appelée
Cyanidium caldarium (UTEX 2919).
On citera aussi des producteurs connus de phycocyanines comme les
cyanobactéries
filamenteuses du genre Arthrospira, cultivées industriellement sous le nom
commun de
spiruline.
Les microorganismes qui produisent de la phycocyanine avec une teneur élevée
en
glycogènes sont plus particulièrement identifiés parmi les microorganismes
cités
précédemment, en particulier les espèces des genres Arthrospira, Spirulina,
Synechococcus,
Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, plus particulièrement Galdieria
sulphuraria.
L'invention concerne également les produits obtenus par le procédé, en
particulier la
biomasse, les porphyrines isolées du jus de fermentation, la biomasse lysée,
les protéines et
les phycocyanines isolées de la biomasse lysée.
Les phycocyanines (PC) produites par les microorganismes comprennent les c-
phycocyanines (C-PC) et les allophycocyanines. Selon l'invention on entend par
phycocyanines les C-PC et les allophycocyanines, isolées ou leurs mélanges en
toutes
proportions, en particulier les C-PC.
La culture des ARUs (al).
La culture en fermenteur d'ARUs et en particulier de Galdieria sulphuraria a
largement
été décrite dans la littérature scientifique que ce soit en hétérotrophie ou
en mixotrophie, en
Fed-batch ou en continu.
La biomasse produite comprend non seulement des phycocyanines et des
protéines,
mais également des sucres de réserve comme le glycogène. Les teneurs en
glycogène dans
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la biomasse sont de l'ordre de 20 à 50% en masses par rapport à la masse
totale de matière
sèche. Or plus la teneur en glycogène est importante dans la biomasse finale
et plus la
concentration en phycocyanine (PC) et en protéine est faible. Le glycogène
produit par les
ARUs en en particulier chez Galdieria est soluble à l'eau froide et se
retrouve donc dans la
5 phase aqueuse lors de l'extraction de la PC, ce qui pose des problèmes
techniques lors de
la filtration comme une augmentation de la viscosité, le colmatage des
membranes de
filtration, des montés en pression, une accumulation de glycogène dans la
fraction contenant
la phycocyanine et donc l'obtention d'une phycocyanine moins pure. L'invention
permet, par
un pilotage de fermentation, de réduire les taux de glycogène à des
valeurs inférieures à
20 % en masse/MS.
L'invention concerne donc un procédé de production de biomasse de selon
l'invention
qui comprend la culture par fermentation d'ARUs telles que définies
précédemment avec une
phase de maturation qui comprend la limitation de l'apport en source de
carbone dans le
milieu de culture,
Les cultures par fermentation se font sur un milieu de culture comprenant
différents
éléments nutritifs permettant la croissance cellulaire. Ces milieux de culture
bien connus de
l'homme du métier comprennent notamment une source de carbone, une source
d'azote,
une source de phosphore, des macroéléments, des microéléments, dans des
concentrations
appropriées pour permettre la croissance cellulaire.
L'étape de maturation est en particulier mise en uvre dans des modes de
cultures en
FedBatch ou en continu.
La source de carbone peut être toute source de carbone connue de l'homme du
métier
et pouvant être employée pour la culture des ARUs et en particulier de
Galdieria sulphuraria,
comme les polyols, en particulier le glycérol, les sucres, comme le glucose ou
le saccharose
ou encre le lactose ou des milieux complexes comprenant du lactose comme les
perméats
lactés, comme le perméat de lait, le perméat de sérum, le babeurre et leurs
mélanges et en
particulier le perméat de lait.
Il est connu que certains substrats carbonés comme le glucose inhibent
fortement la
synthèse de PC alors que d'autres moins. Toutefois, pour la viabilité d'un
procédé industriel
de production de PC, de nombreux paramètres économiques sont à prendre en
considération, et notamment le coût des matières premières. Ainsi, l'emploi
d'une source de
carbone comme le perméat de lait comprenant du lactose ne permet pas d'obtenir
des
rendements en PC aussi élevés qu'avec le glycérol mais l'économie globale du
procédé
avec l'emploi du perméat de lait reste avantageuse du fait qu'il s'agit d'un
sous-produit de
l'industrie laitière difficile à recycler. Elle est d'autant plus avantageuse
que la mise en uvre
du procédé selon l'invention permet d'obtenir une forte densité cellulaire
avec une faible
teneur en glycogène, ce qui facilite l'extraction de la PC en fin de procédé.
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La biomasse obtenue après maturation a la composition suivante :
Biomasse maturée Composition en % de la
matière sèche
Protéines glycogène C-PC
Biomasse cible > 45% <20% > 1,5%
Biomasse préférée 55% à 70% 5% à 20% 5 à 10%
Les conditions particulières de mise en uvre de la phase de maturation par
limitation
de la source de carbone pour ces deux modes de culture sont précisées ci-
après.
Culture en Batch/Fed Batch.
Sur une culture en mode Fedbatch , le procédé de culture par fermentation
selon
l'invention comprend une première phase de croissance cellulaire sur un milieu
de culture
comprenant une source de carbone telle que définie précédemment, de manière à
obtenir
une densité cellulaire dans le milieu de culture d'au moins 30 g/L de MS.
L'homme du métier
saura définir la composition des milieux de culture appropriés pour obtenir
une telle densité
cellulaire et en particulier la teneur en source de carbone, notamment au
regard des
procédés de l'état de la technique décrits notamment dans les demandes de
brevets VVO
2017/050917, VVO 2017/093345 et VVO 2018/178334.
Une fois la densité cellulaire recherchée obtenue on effectue une phase de
maturation qui consiste à sevrer la souche en substrat carboné organique.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la phase de
maturation est
déclenchée une fois que la culture en phase de croissance atteint au moins 30
g/L de MS,
de préférence au moins 80 g/L de MS, plus préférentiellement au moins 100 g/L
de matière
sèche.
Durant la phase Fed-batch on alimente la culture avec un milieu d'alimentation
comprenant au moins 100 g/I de substrat carboné, de préférence au moins 200
g/I de
substrat carboné, plus préférentiellement au moins 500 g/I de substrat
carboné. Afin de
limiter l'accumulation de glycogène pendant la phase Fed-batch. L'homme de
métier saura
définir les débits d'alimentation permettant d'avoir des teneurs en substrat
carboné dans le
moût de fermentation inférieures 5 g/L, de préférence inférieures à 1 g/L,
plus
préférentiellement inférieures à 0,1 g/L.
La phase de croissance est suivie par une phase de maturation. Durant cette
phase de
maturation on peut observer surtout une baisse de la masse sèche par litre de
moût liée à la
consommation des sucres de réserve accumulés pendant la croissance, en
particulier le
glycogène. De façon concomitante on peut observer une augmentation de la
quantité de
phycocyanine par gramme de matière sèche. Il en est de même pour la teneur en
protéines.
Ce procédé de maturation permet d'obtenir une biomasse à teneur faible en
glycogène.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention on alimente la culture
avec un
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milieu d'alimentation de maturation ne comprend pas de source de carbone. Il
est entendu
que l'absence de source de carbone est observée également dans le cas où le
milieu
d'alimentation de maturation comprendrait des traces détectables de source de
carbone.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le sevrage est total,
c'est à dire
que l'on arrête d'alimenter la culture des cellules en milieu de culture, les
cellules engageant
leur maturation en se nourrissant des éléments résiduels du mout de
fermentation et de leurs
réserves cellulaires.
De manière avantageuse, la biomasse obtenue comprend moins de 20% de glycogène
en masse par rapport à la masse de matière sèche (% de la MS), de préférence
moins de
15% de la MS, plus préférentiellement de moins de 10% de la MS.
Le temps de maturation peut-être plus ou moins long en fonction de la
température de
culture. Plus la température se rapprochera de celle de l'optimum de
croissance plus la
phase de maturation sera courte.
Il est possible de réaliser également des cultures en mode FedBatch en
réalisant
de manière concomitante les phases de croissance et de maturation en imposant
par
l'alimentation en source de carbone un taux de croissance plus faible,
limitant ainsi
l'accumulation de glycogène dans la souche. Le taux de croissance pour
effectuer cette
maturation est déterminé en fonction du taux de croissance maximal de la
souche que
l'homme du métier saura déterminer. Ce taux de croissance devra être inférieur
à 80 % du
taux de croissance maximal de la souche, préférentiellement inférieur à 70% du
taux de
croissance maximal de la souche, plus préférentiellement inférieur à 50% du
taux de
croissance maximal de la souche.
Le procédé selon l'invention en mode FedBatch permet d'obtenir des moûts
de
fermentation comprenant au moins 70 g/L de MS (figure 4), et une biomasse avec
une
.. teneur en PC, en particulier en C-PC, d'au moins 10 mg/g de MS (figure 5)
et une teneur en
protéines d'au moins 40% de la MS (figure 5).
Culture en continu.
La croissance en continu avec une limitation en substrat a déjà été décrite
par Sloth et
al., 2006 avec des niveaux de détection inférieurs à 0,05 g/I, ce que les
auteurs estiment être
la limite de détection analytique. Dans ce cas de figure le milieu
d'alimentation est apporté
en continu dans la culture mais est consommé presque instantanément par les
cellules et
donc n'est pas quantifiable. Le but des auteurs dans cet article est de
limiter l'inhibition de la
synthèse de PC lié à une concentration en glucose significative dans le
milieu, le glucose
étant connu pour réprimer la synthèse de PC. Les teneurs en PC dans ces
conditions sont
très faibles environ 28 mg/g de matière sèche, avec une teneur en biomasse de
l'ordre de
5g/I de matière sèche.
L'objet de l'invention est de réaliser une culture en continu pour augmenter
la
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productivité en biomasse et en PC par rapport à une culture en Fed-Batch. Il
est possible,
par le procédé selon l'invention, d'atteindre une masse sèche de 65 -70 g/I,
voir plus, et un
contenu en PC compris entre 25 et 90 mg/g de MS, voire plus.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la phase de maturation
est mise
en uvre par transfert d'une partie du moût de la culture en continu dans une
cuve sans
apport nutritif. Comme pour le mode de culture en FedBatch décrit
précédemment, il y a
de manière concomitante une diminution de la teneur en glycogène et une
augmentation de
la teneur en phycocyanines et en protéines.
L'homme du métier saura déterminer le temps nécessaire à la maturation en
fonction
de paramètres connus comme la température à laquelle la biomasse est maintenue
sans
alimentation et en fonction de l'objectif recherché. Ce temps de maturation
sera d'au moins
12h, préférentiellement au moins 48h, plus préférentiellement au moins 72h.
On peut aussi mettre en uvre simultanément les étapes de croissance et de
maturation en imposant un taux de croissance réduit via le débit du milieu
d'alimentation. De
manière avantageuse, le taux de croissance est inférieur à 0,06 h-1,
préférentiellement
inférieur à 0,03 h-1, plus préférentiellement inférieur à 0,015h-1.
De manière avantageuse, le taux de croissance est inférieur à 80% du taux de
croissance maximal de la souche, préférentiellement inférieur à 60% du taux de
croissance
maximal de la souche, plus préférentiellement inférieur à 40% du taux de
croissance
maximal de la souche. Dans la figure 7, après 400h de culture, le taux de
croissance a été
réduit à une valeur inférieure à 80% du taux de maximal de croissance, ce qui
a permis
d'augmenter la teneur en PC et en protéines dans la biomasse et de réduire la
teneur en
glycogène, par rapport au taux de croissance initialement imposé.
La teneur en source de carbone assure l'obtention d'une teneur en matière
sèche d'au
moins 65 g/L, voire d'au moins 70 g/L, plus particulièrement d'au moins 80
g/L.
La biomasse ainsi obtenue avec maturation séparée ou simultanée à un contenu
en
glycogène inférieur à 20%, avantageusement de moins de 15% voire de moins de
10%. La
biomasse obtenue a une teneur en protéines d'au moins 45% de la MS,
avantageusement
d'au moins 50%.
La teneur en phycocyanine, en particulier en C-PC sera d'au moins 20 mg/g de
MS,
avantageusement de 25 à 50 mg/g de MS. Avec certaines sources de carbone,
comme les
polyols, on peut atteindre des teneurs en C-PC supérieures à 50 mg/g de MS.
Production de Porphyrine dans le moût de fermentation (b.1).
Plusieurs études ont démontré que plusieurs étapes clés de la voie de synthèse
de la
phycocyanine et de la chlorophylle sont induites par la lumière et d'autres
réprimées en
présence de substrat organique dans le milieu (Foley et al., 1982 ; Brown et
al., 1982 ;
Troxler et al., 1989; Rhie and Beale, 1994; Stadnichuck et al., 1998). D'après
la littérature la
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culture en hétérotrophie conduit à l'excrétion de coproporphyrine dans le
milieu de
croissance et provoque une réduction des teneurs en pigment dans la cellule
(phycocyanobiline et chlorophylle) lors du passage du coproporphyrinogène III
au
protoporphyrinogène IX. En condition mixotrophe, la lumière induit à la fois
la biosynthèse de
pigments photosynthétiques et l'excrétion de porphyrines dans le milieu. Le
passage d'une
forme de porphyrine à une autre se faisant parfois par réaction spontanée, il
est donc
possible de retrouver plusieurs formes de porphyrines dans le milieu de
croissance (Brown
et al., 1982 ; Stadnichuck et al., 1998).
Contrairement à ce qui est décrit dans la littérature, la mise en uvre du
procédé selon
l'invention n'entraine pas d'excrétion de porphyrine tant qu'une source de
carbone
organique, notamment glucose, glycérol, lactose, ou saccharose, est présente
dans le
milieu. Les porphyrines ne sont détectées que pendant la phase de maturation
(sans
carbone organique dans le milieu) que ce soit pour une culture en Fed-batch ou
en continu.
Lors d'ajout de substrat organique dans le milieu après une phase de
maturation on peut
observer une re-consommation des porphyrines par les cellules et un retour à
des niveaux
non détectables de ces porphyrines dans le jus de fermentation.
Après une phase de maturation selon l'invention, on obtient un moût de
fermentation
comprenant une biomasse avec une teneur faible en glycogène, riche en
protéines et en PC,
telle que définie plus haut, et un jus contenant des porphyrines.
Ces porphyrines produites par les ARUs, en particulier par Galdieria
sulphuraria sont
des chélatants naturels qui peuvent être utilisés par exemple pour des
traitements contre des
nématodes (US 2006/0206946). Certaines molécules comme la Protoporphyrine IX
pourraient également avoir un intérêt dans le domaine médical pour des
traitements de
cancers par photothérapie (Huang et al., 2015)
L'invention concerne donc un procédé qui comprend une étape de récupération du
jus
de fermentation et d'extraction des porphyrines à partir de ce jus.
Le jus de fermentation est récupéré par toutes méthodes usuelles de séparation
de la
biomasse, en particulier par centrifugation (centrifugeuse à assiettes ou
sedicanteur), bien
connues de l'homme du métier, ou par filtration (filtre plaque, filtre presse,
filtration
tangentielle céramique ou organique).
Les porphyrines peuvent être extraites par des méthodes usuelles, comme la
chromatographie (Chromatographie d'affinité ou d'exclusion de taille).
Les porphyrines extraites peuvent être purifiées puis conditionnées pour leur
usage
ultérieur, en particulier en thérapie.
Broyage de la biomasse (c.1).
Pour extraire les phycocyanines et/ou les protéines de la biomasse, il est
nécessaire
d'effectuer une lyse cellulaire qui libérera les produits recherchés. Les ARUs
et en particulier
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Galdieria sulphuraria ont une paroi cellulaire très résistante qui rend
difficile la lyse par des
méthodes usuelles à moins de se mettre dans des conditions opératoires qui
vont dégrader
les phycocyanines recherchées.
Or le rendement de produit récupéré, phycocyanines et/ou protéines, ne dépend
pas
5 que de la teneur en produit dans la biomasse, mais aussi de la capacité à en
extraire le
maximum de cette biomasse. Cette capacité d'extraction dépendra d'une part de
l'efficacité
de la lyse cellulaire, mais aussi de sa mise en uvre dans des conditions qui
n'entrainent
pas de dégradation substantielle des phycocyanines.
Le broyage s'axe autour de deux problématiques majeures, à savoir : le taux de
10 broyage, et la chaleur générée par la friction mécanique. Dans le cas de la
phycocyanine,
cette maitrise de la chaleur est d'autant plus importante car il s'agit d'une
molécule
thermosensible. Des essais ont été réalisés avec un homogénéisateur à haute
pression de
type Bertoli dans les conditions décrites dans l'exemple 7. Le broyage par
homogénéisateur
haute pression nécessite d'effectuer plusieurs passages pour obtenir un taux
de lyse
conséquent. Le passage d'une biomasse de Galdieria sulphuraria n'a pas permis
d'obtenir
un taux de lyse supérieur à 40 % malgré 3 passages successifs. A chacun des
passages
une hausse de la température a pu être observée jusqu'à atteindre une biomasse
ayant une
température aux alentours de 70 C ayant une couleur verte marron où la
majorité de
phycocyanine a été dégradée.
L'invention concerne donc un procédé de lyse des cellules d'ARUs, en
particulier de
Galdieria sulphuraria caractérisé en ce que la lyse est faite par broyage avec
un broyeur à
billes en maintenant la biomasse d'ARUs pendant le broyage à une température
inférieure à
50 C.
L'invention consiste à réguler la température de la biomasse pendant le
broyage, à
l'intérieur de la chambre de broyage, pour que celle-ci n'excède pas les 50 C,
préférentiellement 47 C, plus préférentiellement 40 C et moins. Cette
régulation de
température peut se faire par un système de refroidissement par eau de la
double enveloppe
du broyeur ou bien par injection dans le broyeur d'une biomasse préalablement
refroidie à
des températures inférieures à 20 C.
Le procédé de broyage selon l'invention s'applique pour une biomasse
indépendamment de son mode d'obtention (mode de fermentation et isolation). Il
est
particulièrement adapté et de manière préférentielle pour une biomasse obtenue
par le
procédé de culture selon l'invention décrit plus haut avec une teneur diminuée
en glycogène.
L'invention concerne aussi la biomasse lysée ainsi obtenue.
Les inventeurs ont pu constater que la biomasse broyée selon l'invention
permettait
une meilleure digestibilité des protéines que la biomasse non broyée. Cette
amélioration de
la digestibilité est montrée par des tests de digestibilité in vitro (Boisen
and Fernandez,
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WO 2020/161280 PCT/EP2020/053081
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1995).
Echantillons Digestibilité Protéines totales
Spiruline 79,3 ( 2) % 68,2 ( 2) %
G. sulphuraria (broyée) 92,2 ( 2) % 63,4 ( 1,9) %
G. sulphuraria (non broyée) 66 ( 2) % 63,9 ( 1,9) %
L'invention concerne donc une biomasse d'ARUs broyée et en particulier une
biomasse
de Galdieria sulphuraria susceptible d'être obtenue par le procédé de broyage
selon
l'invention.
L'invention concerne en particulier une la biomasse broyée de Galdieria
sulphuraria de
composition décrite ci-dessous.
Facteurs Nutritionnels
Valeur Energétique 394 ( 22) kca1/100 g
Protéines 64.8( 9.3) g/100 g
Lipides 6.15 ( 0.5) g/100 g
Fibres 7.65 ( 5.16) g/100 g
Carbohydrates 16.1 ( 2.2) g/100g
Cendres 4.1 ( 0.6) g/100 g
Humidité 4.1 ( 0.6) g/100 g
Phycocyanine 7 ( 0.3) g/100 g
La composition en acides aminés est donnée dans le Tableau suivant.
g/100g Spiruline Galdieiria sulphuraria
Tryptophan 0,84 0,76
Threonine 2,78 3,06
Aspartic acid 5,47 4,73
Serine 2,74 3,54
Lysine 2,7 3,45
Valine 3,48 3,15
Proline 2,04 2,17
Alanine 4,11 3,44
Phénylalanine +Tyrosine 5 5,55
Isoleucine 3,17 2,6
Glycine 2,85 2,30
Arginine 3,6 3,14
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Leucine 5,02 4,1
Histidine 1,09 0,86
Acide Glutamique 8,02 7,41
Méthionine + cystéine 2,19 1,88
La composition Lipidique est la suivante :
Acides gras % lipids totaux g/100g
C14:0 Ac. myristique 2,6 0,16
C16:0 Ac. palmitique 27,9 1,7
C18:0 Ac. stéarique 8,8 0,54
018:1 (n-9c) Ac. oléique 33,5 2,1
018:2 (n-6c) Ac. linoléique (LA) w6 19,3 1,18
018:3 (n-3) Ac. a-linolénique (ALA) w3 1,8 0,1
Ratio w6 / w3 10,32
L'invention concerne aussi l'utilisation de cette biomasse broyée comme
complément
alimentaire ou comme aliment pour l'alimentation humaine ou animale.
Extraction de la phycocyanine (dl).
L'invention concerne aussi un procédé d'extraction de la phycocyanine à partir
d'une
biomasse de cellules lysées d'ARUs, en particulier de Galdieria sulphuraria,
caractérisé en
ce qu'il comprend des lavages successifs dans des quantités d'eau représentant
au total
moins de 4 fois, de préférence de 2 à 3 fois, plus préférentiellement environ
3 fois le volume
total de biomasse lysée.
Cette biomasse lysée comprend une suspension de résidus cellulaires insolubles
dans
une solution aqueuse comprenant différents extraits cellulaires solubilisés
suite à la lyse
cellulaire, dont les phycocyanines. La biomasse lysée comprend avantageusement
une
matière sèche d'au moins 2%, préférentiellement d'au moins 5%, plus
préférentiellement
d'au moins 7%.
Le volume total d'eau (Ve) nécessaire à l'extraction est calculé en fonction
du volume
de la biomasse lysée à traiter (Vb) et représentera jusqu'à 4 fois ce volume
(Ve/Vb est
inférieur ou égal à 4). On peut bien entendu mettre en uvre l'invention avec
un volume total
d'eau plus important, mais l'économie du procédé reste alors moins
intéressante du fait des
volumes d'eau à traiter par la suite pour récupérer la phycocyanine.
Ce volume total d'eau est ensuite scindé en plusieurs fractions qui serviront
à extraire
la phycocyanine par des passages successifs sur la biomasse, le nombre de
fractions (n)
étant d'au moins 2, de préférence au moins 3. L'homme du métier peut prévoir
d'effectuer
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l'extraction avec plus de 3 fractions d'eau, tout en devant prendre en
considération
l'ensemble des paramètres économiques de la mise en uvre du procédé, comme le
prix de
revient de l'immobilisation du matériel et de la répétition des manipulations
de la biomasse.
De manière préférée, le nombre de fraction est de 3.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, les fractions ont des
volumes
respectifs différents les uns des autres. Selon un autre mode de réalisation
de l'invention,
toutes les fractions ont le même volume égal à Ve/n.
L'homme du métier saura déterminer le nombre de fractions et le volume
respectif de
chaque fraction de manière à optimiser le procédé de préparation de
phycocyanine qu'il
mettra en uvre.
Des lavages successifs des éléments insolubles culotés sont nécessaires pour
extraire
une quantité appropriée de la phycocyanine de la biomasse. Après plusieurs
lavages, on
constate que les proportions de C-PC et d'APC dans le culot sont inversées. On
voit bien sur
la figure 16 qu'il est préférable d'extraire la phycocyanine avec de petits
volumes successifs
d'eau plutôt qu'avec un grand volume équivalent d'eau (figure 16).
On trouve en ordonnée et en partant de la gauche du diagramme trois blocs 51,
S2 et
S3 qui correspondent à 3 extractions successives faites avec 3 fractions d'eau
de volume
égal, le volume total d'eau Ve étant de 1 fois le volume de biomasse Vb pour
le premier bloc
(dilution 1/2 en série), de 2 fois pour le deuxième bloc (dilution 1/3 en
série) et de 3 fois pour
le troisième bloc (dilution 1/4 en série). La barre 51 donne la valeur de PC
extraite par la
première extraction. La barre S2 donne la valeur cumulée de PC extraite par la
première et
la deuxième extraction. La barre S3 donne la valeur cumulée pour les 3
fractions employées
de manière successive. On trouve ensuite 5 essais d'extraction en une seule
fois avec
différents volumes d'eau, de 5X à 12X.
D'après la figure 16, on peut voir qu'un volume d'eau initial plus important,
lors de la
première extraction, donne de meilleurs résultats jusqu'à une certaine limite
(5X à 12X). En
utilisant la méthode des extractions en série, nous pouvons constater un gain
réel en termes
d'efficacité d'extraction et de réduction d'utilisation d'eau. Par exemple, 3
séries d'extractions
donnent de meilleurs résultats qu'une seule extraction et réduisent la
quantité totale d'eau
utilisée d'au moins un facteur 2.
Les eaux de lavages récupérées pour chaque extraction successive comprenant la
phycocyanine peuvent être traitées séparément pour récupérer la phycocyanine
ou bien
assemblées avant cette récupération.
Le procédé d'extraction selon l'invention est adapté pour toute biomasse
d'ARUs, en
particulier de Galdieria sulphuraria, lysée, quel que soit la méthode de
culture employée pour
la production de la biomasse et la méthode employée pour la lyse cellulaire.
De manière
préférentielle, la méthode d'extraction selon l'invention est particulièrement
adaptée pour une
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biomasse avec de faibles teneurs en glycogène obtenues par le procédé selon
l'invention
décrit plus haut et/ou pour la biomasse lysée par la méthode de broyage selon
l'invention
définie plus haut.
La solution de phycocyanine obtenue est généralement traitée de manière à en
isoler
la phycocyanine. Les méthodes pour récupérer la phycocyanine d'une solution
aqueuse sont
bien connues de l'homme du métier. On citera en particulier la précipitation
acide décrite
dans la demande de brevet VVO 2018/178334.
Elle peut également être isolée par précipitation sélective qui consiste à
ajuster le pH
de la solution initiale à une valeur choisie dans une plage de valeurs de pH
dans laquelle la
phycocyanine est moins soluble (également appelée plage d'instabilité) et à
concentrer la
phycocyanine dans la solution pour favoriser sa précipitation, puis à
récupérer la
phycocyanine précipitée. Cette plage d'instabilité va en particulier de pH 4,4
à 5,5 pour des
phycocyanines résistantes aux pH acides produites par Galdieria sulphuraria.
Bien entendu,
l'homme du métier saura déterminer une telle plage d'instabilité pour d'autres
phycocyanines
produites par d'autres ARUs par simple expérimentation. Une telle méthode est
décrite en
particulier dans la demande de brevet FR 1900278 déposée le 11 janvier 2019.
On peut également, avant récupération de la phycocyanine, traiter la solution
aqueuse
pour baisser sa teneur en glycogène, par une dégradation enzymatique du
glycogène. Les
traces de ces polysaccharides susceptibles d'être entrainés avec la
précipitation des
phycocyanines, déjà faibles, sont encore plus réduites lorsque les
polysaccharides sont
lyses en polyosides de faibles poids moléculaires encore plus solubles. Au
surplus, lorsque
l'étape de concentration est réalisée par filtration tangentielle, les
polyosides de faibles poids
moléculaires sont éliminés avec les autres petites molécules en solution, ce
qui favorise
l'obtention de solution en phycocyanines à plus grande teneur encore. En
particulier, la lyse
enzymatique du glycogène est mise en uvre à un pH inférieur ou égal à 5, de
préférence
d'environ 4,5, à température ambiante. Ces conditions de température et de pH
sont
particulièrement adaptées pour préserver la phycocyanine au cours de la
réaction
enzymatique. Les enzymes actives en condition de pH acide et à température
ambiante
sont choisies parmi des enzymes connues pour une activité glucuronidase a1-4 ,
glucosidase a1-4 (ou alpha-glucosidase). On citera en particulier des
pectinases connues
pour dégrader la pectine et en particulier des pectinases extraites de
champignons
filamenteux comme Aspergillus, plus particulièrement de pectinases extraites
d'Aspegillus
aculeatus, comme les enzymes commercialisées sous la dénomination Pectinex
par la
société Novozymes. La lyse enzymatique du glycogène pourra également être
réalisée avec
une glucosidase a1-6 en plus de la glucuronidase a1-4 ou glucosidase a1-4. Des
glucosidases a1-6 actives dans les conditions de pH et de température exposées
ci-dessus
sont également connues de l'homme du métier. Il s'agit en particulier des
pullulanases
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WO 2020/161280 PCT/EP2020/053081
connues pour hydrolyser les liaisons glucosidiques a1-6 de la pullulane,
notamment connues
pour supprimer les ramifications de l'amidon. Il s'agit généralement d'enzymes
extraites de
bactéries, notamment des genres Bacillus. US 6,074,854, US 5,817,498 et VVO
2009/075682
décrivent de telles pullulanases extraites de Bacillus deramificans ou de
Bacillus
5 acidopullulyticus. On connaît aussi des pullulanases disponibles dans le
commerce,
notamment sous les dénominations Promozyme D2 (Novozymes), Novozym 26062
(Novozymes) et Optimax L 1000 (DuPont-Genencor). On notera que des
mélanges
pullulanases/alpha-amylases sont décrits dans l'état de la technique, mais en
particulier pour
produire du sirop de glucose à partir de l'amidon (US 2017/159090). L'homme du
métier
10 saura déterminer les conditions réactionnelles appropriées pour réduire au
mieux les
quantités de glycogène en fonction de la teneur initiale en glycogène dans la
solution à
traiter, la quantité d'enzymes employée et la pureté recherchée pour la
phycocyanine
produite. Une telle méthode est décrite en particulier dans la demande de
brevet FR
1900278 déposée le 11 janvier 2019.
15 La phycocyanine récupérée peut ensuite être purifiée par des méthodes
connues de
l'homme du métier, comme la diafiltration.
La phycocyanine obtenue par le procédé d'extraction selon l'invention a un
indice de
pureté d'au moins 2, de préférence d'au moins 3, voire supérieur à 4. Cet
indice de pureté
est mesuré par mesure d'absorbance avec la méthode décrite par Moon & al.
(2014).
De manière avantageuse, la phycocyanine obtenue est une phycocyanine qui a un
rapport glycogène/phycocyanines (en poids sec) inférieur à 6, avantageusement
inférieur à
4, de préférence inférieur à 3, plus préférentiellement inférieur à 2,5,
encore plus
préférentiellement inférieur à 1.
L'invention concerne également l'utilisation des phycocyanines obtenues comme
colorants, en particulier comme colorants alimentaires. Elle concerne aussi
des aliments,
solides ou liquides, en particulier des boissons qui comprennent une
phycocyanine obtenue
par le procédé d'extraction selon l'invention.
Les résidus solides restant après lavage sont également récupérés. Il s'agit
d'un résidu
de biomasse enrichi en protéines qui peut également être employé pour la
préparation de
compléments alimentaires ou d'aliments pour l'alimentation humaine ou animale.
Selon un mode particulier de réalisation, le lavage de la biomasse lysée
comprend une
acidification de la suspension de biomasse à un pH inférieur ou égal à 5. La
biomasse
résiduelle obtenue après extraction de la phycocyanine comprend au moins 60%
de
protéines par rapport à la matière sèche, et au moins une teneur en sucres
totaux inférieure
à 20% par rapport à la matière sèche et/ou une teneur en glycogène inférieure
à 10% par
rapport à la matière sèche et/ou teneur en matières grasses d'au moins 5% par
rapport à la
matière sèche. Une telle méthode de récupération d'une biomasse enrichie en
protéines est
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WO 2020/161280 PCT/EP2020/053081
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notamment décrite dans la demande de brevet FR 1857950 déposée le 5 septembre
2018.
EXEMPLES.
MATÉRIEL ET MÉTHODES.
Souche.
Galdieria sulphuraria UTEX#2919, également appelée Cyanidium caldarium.
Conditions de culture en mode FedBatch .
Les cultures sont réalisées dans des bioréacteurs de 1 à 2 L de volume utile
avec
automates dédiés et supervision par station informatique. Le pH de la culture
est régulé via
l'ajout de base (solution d'ammoniaque 14% NH3 w/w) et/ou d'acide (solution
d'acide
sulfurique 4N). La température de culture est fixée à 37 C. L'agitation est
réalisée grâce à 2
mobiles d'agitation : 1 turbine Rushton à 6 pâles droites positionnées à
l'extrémité inférieure
de l'arbre d'agitation au-dessus du "sparger" et 1 hélice tripâle HTPG2 placé
sur l'arbre
d'agitation. La pression en oxygène dissout dans la phase liquide est régulée
dans le milieu
tout au long de la culture par la vitesse de rotation de l'arbre d'agitation
(250-1800 t/min), le
débit de ventilation par l'air et/ou d'oxygène. Les paramètres de régulation,
intégrés dans
l'automate de supervision, permettent de maintenir une pression partielle en
oxygène dissout
dans la phase liquide comprise entre 5 et 30 % de la valeur de saturation par
l'air dans des
conditions identiques de température, de pression et de composition du milieu.
Le temps de
culture a été compris entre 50 et 300 heures.
Conditions de culture en mode continu.
Les cultures sont réalisées dans des réacteurs de 1 à 2 L de volume utile avec
automates dédiés et supervision par station informatique. Le pH de la culture
est régulé via
l'ajout de base (solution d'ammoniaque 14% (w NH3/w) et/ou d'acide (solution
d'acide
sulfurique 4N). La température de culture est fixée à 37 C. L'agitation est
réalisée grâce à 2
mobiles d'agitation : 1 turbine Rushton à 6 pâles droites positionnée à
l'extrémité inférieure
de l'arbre d'agitation au-dessus du "sparger" et 1 hélice tripâle HTPG2 placée
sur l'arbre
d'agitation. La pression en oxygène dissout dans la phase liquide est régulée
dans le milieu
tout au long de la culture, par la vitesse de rotation de l'arbre d'agitation
(250-1800 t/min), le
débit de ventilation par l'air et/ou d'oxygène. Les paramètres de régulation,
intégrés dans
l'automate de supervision, permettent de maintenir une pression partielle en
oxygène dissout
dans la phase liquide comprise entre 5 et 30 % de la valeur de saturation par
l'air dans des
conditions identiques de température, de pression et de composition du milieu.
Le temps de
culture a été compris entre 50 et 300 heures. Le débit d'alimentation du
fermenteur en
continu est ajusté pour qu'a aucun moment la source de carbone ne soit
détectée dans le
milieu de culture.
Milieu d'alimentation.
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WO 2020/161280 PCT/EP2020/053081
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Pour le milieu d'alimentation en mode Fed-batch ou en continu, la quantité
de
source de carbone est ajustée en fonction de la masse sèche cible de fin de
FedBatch
ou de 100g/L de masse sèche pour la culture en continu. Tous les autres
éléments du milieu
sont ajoutés en respectant les proportions utilisées pour le milieu pied de
cuve défini dans
les exemples.
Suivi des cultures.
Le suivi de croissance se fait par mesure de la masse sèche (filtration sur
filtre GF/F,
VVhatman, puis séchage en étuve, à 105 C, pendant 24 h minimum avant pesée).
Dosage des porphyrines.
Le dosage des acides organiques a été réalisé par HPLC (Shimatsu) en mode
isocratique H2SO4 (5 mM) et détection RI (Refractive Index).
Dosage de PC.
L'estimation de la teneur en phycocyanine par gramme de matière sèche a été
réalisée à différents temps de culture grâce à la méthode décrite par Moon et
collaborateur
[Moon et al., Korean J. Chem. Eng., 2014, 1-6]
Dosage du glycogène.
L'estimation de la teneur en glycogène par gramme de matière sèche a été
réalisée à
différents temps de culture grâce à la méthode d'extraction décrite par
Martinez-Garcia et
collaborateur [Martinez-Garcia et al., Int J Biol Macromol. 2016; 89:12-8].
Exemple 1 : Fermentation en mode Fed-batch avec phase de maturation sur
glycérol.
Milieu de culture.
Pied de cuve : 30 g/L glycérol, 8 g/L (NI-14)2SO4, 250mg/L KH2PO4, 716mg/L
MgSO4,
44mg/L CaCl2, 2H20, 0.2843849 g/L K2SO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H20, 0.01236 g/L
Na2EDTA,
0.00657 g/L ZnSO4,7H20, 0.0004385 g/L CoC12,6H20, 0.00728 g/L MnC12,4H20,
0.005976
g/L (NI-14)6Mo7024, 4H20, 0.005976 g/L CuSO4,5H20, 0.00016 g/L NaV03, 0.01144
g/L
H3B03, 0.00068 g/L Na2Se03.
Les résultats sont présentés dans les figures 2 et 3.
Exemple 2: Fermentation en mode Fed-batch sur glucose avec phase de
maturation.
Milieu de culture.
Pied de cuve : 30 g/L glucose, 8 g/L (NI-14)2SO4, 250mg/L KH2PO4, 716mg/L
MgSO4,
44mg/L CaCl2, 2H20, 0.2843849 g/L K2SO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H20, 0.01236 g/L
Na2EDTA,
0.00657 g/L ZnSO4,7H20, 0.0004385 g/L CoC12,6H20, 0.00728 g/L MnC12,4H20,
0.005976
g/L (NI-14)6Mo7024, 4H20, 0.005976 g/L CuSO4,5H20, 0.00016 g/L NaV03, 0.01144
g/L
H3B03, 0.00068 g/L Na2Se03.
Les résultats sont présentés sur les figures 4 et 5.
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Exemple 3: Fermentation en mode Fed-Batch sur saccharose avec phase de
maturation
Milieu de culture
Pied de cuve : 30 g/L saccharose, 8 g/L (N1-14)2SO4, 250mg/L KH2PO4, 716mg/L
MgSO4, 44mg/L CaCl2, 2H20, 0.2843849 g/L K2SO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H20, 0.01236
g/L
Na2EDTA, 0.00657 g/L ZnSO4,7H20, 0.0004385 g/L CoC12,6H20, 0.00728 g/L
MnC12,4H20,
0.005976 g/L (N1-14)6Mo7024, 4H20, 0.005976 g/L CuSO4,5H20, 0.00016 g/L NaV03,
0.01144
g/L H3B03, 0.00068 g/L Na2Se03.
Les résultats sont présentés sur les figures 6 et 7.
Exemple 4: Fermentation en mode Fed-Batch sur Perméat de lait avec phase
de maturation.
Milieu de culture.
Pied de cuve : 30 g/L perméat de lait, 8 g/L (NH4)2SO4, 716mg/L MgSO4, 0.07
g/L
FeSO4, 7H20, 0.01236 g/L Na2EDTA, 0.00657 g/L ZnSO4,7H20, 0.0004385 g/L
CoC12,6H20,
0.00728 g/L MnC12,4H20, 0.005976 g/L (N1-14)6Mo7024, 4H20, 0.005976 g/L
CuSO4,5H20,
0.00016 g/L NaV03, 0.01144 g/L H3B03, 0.00068 g/L Na2Se03.
Les résultats sont présentés sur les figures 8 et 9.
Exemple 5 : Culture en Continu d'une souche de Galdieria sur glycérol.
Milieu de culture.
Pied de cuve : Pied de cuve : 30 g/L glycérol, 8 g/L (N1-14)2SO4, 250mg/L
KH2PO4,
716mg/L MgSO4, 44mg/L CaCl2, 2H20, 0.2843849 g/L K2SO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H20,
0.01236 g/L Na2EDTA, 0.00657 g/L ZnSO4,7H20, 0.0004385 g/L CoC12,6H20, 0.00728
g/L
MnC12,4H20, 0.005976 g/L (NH4)6Mo7024, 4H20, 0.005976 g/L CuSO4,5H20, 0.00016
g/L NaV03, 0.01144 g/L H3B03, 0.00068 g/L Na2Se03.
Les résultats sont présentés sur les figures 10 et 11.
Exemple 6 : Culture en Continu d'une souche de Galdieria sur perméat de lait.
Milieu de culture.
Pied de cuve : Pied de cuve : 30 g/L perméat de lait, 8 g/L (N1-14)2SO4,
716mg/L
MgSO4, 0.2843849 g/L K2SO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H20, 0.01236 g/L Na2EDTA, 0.00657
g/L
ZnSO4,7H20, 0.0004385 g/L CoC12,6H20, 0.00728 g/L MnC12,4H20, 0.005976 g/L
(NH4)6Mo7024, 4H20, 0.005976 g/L CuSO4,5H20, 0.00016 g/L NaV03, 0.01144 g/L
H3B03,
0.00068 g/L Na2Se03.
Les résultats sont représentés sur les figures 12 et 13.
Exemple 7: Broyage par HHP sans refroidissement de biomasse.
Mode opératoire.
Une biomasse issue d'une culture selon un mode continu est lavée par
centrifugations
successives puis concentrée jusqu'à une concentration de 1.4.1010 cellules/mL.
Un volume
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de 1L de biomasse est alors refroidi à 16 C avant de subir 3 homogénéisations
successives
à 1200 bars sur homogénéisateur Bertoli Atomo, sans refroidissement entre
chaque série.
Pour chacune d'elle est suivi, la température de la biomasse, la lyse
cellulaire par
dénombrement avec cellules de Malassez et la concentration en phycocyanine
dans la
biomasse.
Les températures de broyage mesurées pour les 3 homogénéisations successives
sont
respectivement de 46,7 C, 57,6 C et 67 C.
Les pourcentages de cellules non lysées et les teneurs en phycocyanine sont
donnés
sur la figure 12.
Exemple 8: Broyage par HHP avec refroidissement de biomasse.
Mode opératoire.
Une biomasse issue d'une culture selon un mode continu est lavée par
centrifugations
successives puis concentrée jusqu'à une concentration de 2.1010 cellules/mL.
Un volume de
1L de biomasse est alors refroidi à 16 C avant de subir 3 homogénéisations
successives à
1200 bar sur homogénéisateur Bertoli Atomo. Entre chaque homogénéisation la
température
de la biomasse est ramenée à 16 C. De la même façon sont suivies, la
température de la
biomasse, la lyse cellulaire par dénombrement avec cellules de Malassez et la
concentration
en phycocyanine dans la biomasse.
Les températures de la biomasse mesurées en début et fin de broyage sont les
suivantes.
T début de broyage 16 C 16,1 C 15,4 C 14,4 C
T fin de broyage 42 C 45,2 C 47,7 C 46 C
Les pourcentages de cellules non lysées et les teneurs en phycocyanine sont
donnés
sur la figure 13.
Il est apparu également que plus le pH de la biomasse broyée est acide et plus
la
phycocyanine est sensible à la dégradation par la chaleur. Il est donc
préférable d'ajuster le
pH des cellules entre 5 et 7 avant de les broyer, et ce qu'elle que soit la
méthode de broyage
si celle-ci s'accompagne d'un dégagement de chaleur.
Exemple 9 : Thermosensibilité de la phycocyanine dans la biomasse.
Mode opératoire.
Une biomasse issue d'une culture selon un mode continu est lavée par
centrifugations
successives puis concentrée à une matière sèche de 150 mg/g avant d'être
broyée par
broyeur à billes (VVAB, multilab) dans des conditions permettant la
préservation du pigment
et un taux de lyse de 90%. Des échantillons de lysat sont ajustés à des pH de
2.4 à 6 et une
cinétique de 0 à 120 minutes est réalisée sur différentes températures allant
de 50 à 70 C.
Pour chaque temps une quantification de la phycocyanine est réalisée.
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Les résultats sont présentés sur la figure 14.
Exemple 10: Effet de la taille des billes sur le broyage et le contrôle de la
température.
Mode opératoire.
5 Des cellules de Galdieria sulphuraria sont centrifugées 5 min à 20 000g
puis re-
suspendues dans un tampon Tris-Cl 10 mM pH 7. Un aliquot de cellules 1/3 du
volume d'un
tube Eppendorf de 2 ml Safelock est rempli avec cette suspension, un autre 1/3
avec des
billes céramiques du diamètre testé (Netzsch 0,8 mm ; 0,6 mm ; 0,3 mm ; Plus
0,2 mm ;
Nano 0,2 mm ; Plus 0,1 mm; et 0,05 mm). Les tubes sont placés dans un appareil
de type
10 TissueLyser Il (Qiagen) et agités 2 min à 30Hz. Le taux de lyse se calcule
par
dénombrement à la cellule de Malassez comparativement au tube témoin ne
contenant pas
de billes.
Les résultats sont représentés sur la figure 15.
On voit que le diamètre des billes affecte grandement l'efficacité du broyage.
Plus le
15 diamètre de bille diminue plus le taux de lyse augmente jusqu'à atteindre
un optimum pour
des billes de 0,2 mm de diamètre. En dessous de ce diamètre l'efficacité de
lyse diminue de
nouveau jusqu'à atteindre le taux le plus faible pour les billes de 0,05 mm de
diamètre.
Des taux de broyage proche de 100% peuvent être atteint avec des billes plus
grosses
si le temps de broyage est augmenté. Toutefois, l'augmentation du temps de
broyage se
20 traduit par une élévation de la température dans la chambre de broyage avec
le débit
d'alimentation du broyeur à billes imposé. Cette élévation de température se
fait au détriment
de la teneur en phycocyanine de la biomasse lysée.
Exemple 11 : Effet du taux de remplissage de la chambre sur le taux de
broyage.
Mode opératoire.
Les cellules sont broyées dans un broyeur à billes de modèle Multilab de chez
VVAB.
La chambre de broyage est remplit avec des billes en céramique avec de 0,8 mm
de
diamètre a 50% et 65%. Le taux de remplissage à 65% étant le taux maximal de
remplissage. La vitesse de module de broyage et le débit sont identiques dans
les deux cas.
Le taux de lyse en sortie de broyage se calcule par dénombrement à la cellule
de Malassez
comparativement à la biomasse d'entrée non broyée.
On constate que le meilleur taux de lyse est obtenu lorsque la chambre est à
son taux
de remplissage maximum recommandé par le fabriquant soit 65%. Lorsque le taux
de
remplissage est inférieur à 65% le taux de lyse diminue.
Exemple 12: Effet de la concentration en cellules sur le taux de broyage et le
contrôle de la température.
Mode opératoire.
Les cellules sont broyées dans un broyeur à billes de modèle Multilab de chez
VVAB.
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La chambre de broyage est remplit avec des billes en céramique de diamètre 0,8
mm de
diamètre à un taux 65%. La vitesse de module de broyage et le débit sont
identiques dans
tous les cas. Le taux de lyse en sortie de broyage se calcule par dénombrement
à la cellule
de Malassez comparativement à la biomasse d'entrée non broyée.
On voit que pour les mêmes paramètres de broyage (vitesse de module de
broyage,
débit d'alimentation, taux de remplissage de la chambre, diamètre de bille) le
taux de lyse
obtenu était équivalent quelque soit la concentration en cellules dans le
produit à broyer
(biomasse à 10%, 20% ou 30% de matière sèche). Toutefois, il faut noter que
plus la masse
sèche du produit d'entrée est élevée plus la température du lysat en sortie de
broyeur est
élevée également. Pour augmenter la productivité de l'étape de broyage en
augmentant la
masse sèche d'entrée il faut prévoir également des capacités de
refroidissement adaptées
au maintien d'une température de lysat inférieure à 45 C.
Exemple 13 : Estimation des débits sur un broyeur à billes de type industriel.
Matériel et méthodes.
Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919
Mode opératoire.
Les cellules sont broyées dans un broyeur à billes de modèle Multilab de chez
VVAB.
La chambre de broyage (600 ml) est remplit avec des billes en céramique de
diamètre 0,8
mm à un taux de 65%. La vitesse de module de broyage et le débit
d'alimentation sont
identiques dans les deux cas. Le taux de lyse en sortie de broyage se calcule
par
dénombrement à la cellule de Malassez comparativement à la biomasse d'entrée
non
broyée. Pour un taux de broyage de 95 -100% le débit appliqué dans ces
conditions est
compris entre 1 et 2 litres par heure. Une extrapolation de ces débits a été
faite en utilisant
les résultats obtenus dans l'Exemple 10.
Multilab (0,6 mL) AP60 (60L)
Taille de billes Alimentation Lih Alimentation Lih
0,8 mm 1 à 2 100 à 200
0,6 mm 1,4 à 2,8 140 à 280
0,3 mm 1,7 à 3,4 170 à 340
0,2 mm 2,3 à 4,6 230 à 460
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