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BACTERIE DE LA FAMILLE DES CHRISTENSENELLACÉES DANS LA PREVENTION ET/OU LE
TRAITEMENT DE MALADIES INFLAMMATOIRES CHRONIQUES ET/OU DE MALADIES
GASTRO-INTESTINALES INFLAMMATOIRES ET/OU DE CANCERS
[0001] L'invention concerne la prévention et le traitement des maladies
inflammatoires
chroniques, des maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou des cancers
avec des
bactéries spécifiques du microbiote intestinal et des compositions les
contenants.
[0002] L'inflammation est le processus normal de défense de l'organisme face à
une
agression. Elle permet de lutter et d'éliminer le ou les agents étrangers à
l'origine de ladite
agression. Cette inflammation, dite aiguë, est réversible et n'a qu'une durée
limitée allant de
quelques minutes à quelques jours. Toutefois, dans certains cas, le processus
inflammatoire
se dérègle et l'inflammation devient chronique. Au lieu de contribuer à la
défense de
l'organisme, les acteurs impliqués dans le processus inflammatoire deviennent
dangereux et
entraînent un état pathologique souvent grave et invalidant. Les maladies
inflammatoires
chroniques sont donc des maladies dont la physiopathologie est directement
liée à une
inflammation, ladite inflammation étant d'origine auto-immune et/ou auto-
inflammatoire.
[0003] Tous les organes peuvent être concernés par une inflammation chronique,
comme par
exemple le système digestif (maladie de Crohn, colite ulcéreuse, gastrite auto-
immune, etc.),
le foie (hépatite, NAFLD, stéatohépatite non alcoolique, etc.), le pancréas
(pancréatite), les
poumons (asthme), la peau (dermatite atopique comme le psoriasis), le système
nerveux
(scléroses en plaques), les articulations (polyarthrites). Par ailleurs,
l'inflammation chronique
est également présente dans d'autres situations où d'autres mécanismes sont en
cause
comme en particulier les cancers.
[0004] L'inflammation chronique, et en particulier les maladies chroniques
inflammatoires,
touchent une large portion de la population, dans des proportions variées en
fonction de la
pathologie concernée. Les conséquences pour la santé sont majeures, car ces
maladies, bien
qu'a évolution lente, sont invalidantes, douloureuses et associées à un risque
élevé de
mortalité précoce.
[0005] Actuellement, les traitements proposés pour ces maladies sont des anti-
inflammatoires, des immunomodulateurs et/ou immunosuppresseurs. On peut citer
par
exemple :
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- les médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens tels que l'ibuprofen,
le naproxen et
l'aspirine qui sont dédiés à un usage de courte durée et qui sont inadaptés
aux douleurs
chroniques,
- les modulateurs du métabolisme des purines qui sont des
immunomodulateurs, tels que le
methotrexate et l'azathioprine,
- des médicaments biologiques tels que des anti-TNF-a, des antagonistes des
récepteurs à
l'IL1 et l'IL6, ou encore
- la sulfasalazine.
[0006] Tous ces médicaments ont des taux de réponses très variables du fait de
la
dégradation des molécules lorsqu'elles sont administrées et présentent des
effets
secondaires importants. De plus, les immunomodulateurs entravent la réponse
immunitaire
normale et saine face aux pathogènes, si bien que les patients traités sont
susceptibles aux
infections. Le méthotrexate quant à lui est spécifiquement connu pour ses
effets indésirables
sur la production de sperme et par conséquent sur la fertilité. Ainsi, la
plupart de ces maladies
inflammatoires restent sans traitement ou sans traitement adéquat.
[0007] Par conséquent, l'étude et la recherche de nouvelles stratégies de
traitement anti-
inflammatoire constituent un sujet majeur en médecine et en recherche
biomédicale, en
particulier le développement d'un traitement efficace des maladies chroniques
inflammatoires, des maladies gastro-intestinales et des maladies induites par
une
inflammation chronique, qui soit facile à administrer et qui ne présente pas
d'effets
secondaires.
[0008] C'est l'objectif de la présente invention, qui, pour y répondre, vise
l'utilisation de
bactéries particulières du microbiote intestinal humain, à savoir des
bactéries de la famille
des Christensenellacées, préférentiellement du genre Christensenella. Ces
bactéries peuvent
être éventuellement combinées à d'autres bactéries et notamment des bactéries
de l'espèce
Akkermansia muciniphila.
[0009] Des bactéries de la famille des Christensenellacées, notamment du genre
Christensenella, ont déjà été étudiées et décrites. C'est le cas en
particulier de Christensenella
minuta, Christensenella massiliensis et Christensenella timonensis.
Christensenella minuta en
particulier a été décrite pour la première fois en 2012. En 2014, une étude a
montré qu'il
s'agissait du taxon le plus héritable dans une cohorte de jumeaux britanniques
et que leur
présence est associée à un indice de masse corporel faible. Cette corrélation
entre
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Christensenella minuta et l'indice de masse corporel faible a ensuite été
observée dans une
dizaine d'études parues depuis 2014 dans des populations géographiquement
diverses.
[0010] 1 1 a été décrit dans la demande W02016/156527 l'intérêt de rétablir
une population
minimale en Christensenella chez des individus présentant une maladie
inflammatoire
intestinale liée à une déficience en Christensenella dans le microbiote
intestinal. Toutefois,
aucune des bactéries précitées n'a démontré de lien direct avec ces
pathologies chez
l'homme.
[0011] Par ailleurs, les demandes W02018/162738 et W02018/162726 enseignent
que
l'utilisation de bactéries particulières de la famille Christensenellacées,
appartenant à des
espèces définies comme étant spécifiquement éloignées de celles du genre
Christensenella et
notamment des espèces Christensenella minuta et Christensenella timonensis,
permettent de
lutter notamment contre le surpoids et l'obésité, en intervenant par exemple
sur la présence
de gras viscéral et sur la perméabilité intestinale.
[0012] Akkermansia muciniphila, appartenant à la famille Verrucomicrobiaceae
et au genre
Akkermansia, est une bactérie identifiée pour la première fois en 2004 et qui
représente
environ là 3% en nombre sur le total des genres bactériens du microbiote
intestinal d'adultes
en bonne santé (Derrien et al., 2004, 54: 1469- 1476; Derrien et al. Applied
Environmental
Microbiology 2008, 74, 1646-1648).
[0013] La population en nombre d'Akkermansia muciniphila a déjà été rapportée
comme
étant réduite dans les échantillons de selles d'individus obèses et de
patients atteints d'une
maladie gastro-intestinale inflammatoire (Png, et al. Gastroenterol. 2010;105:
2420-2428).
Akkermansia muciniphila est associé à un état métabolique plus sain et à de
meilleurs
résultats cliniques après une intervention de restriction calorique chez les
adultes en surpoids
voire obèses.
[0014] De façon surprenante, et selon l'invention, les bactéries du genre
Christensenella, et
notamment les espèces Christensenella minuta, Christensenella massiliensis et
Christensenella timonensis, lorsqu'elles sont administrées à l'homme ou à
l'animal, sont
capables d'agir sur les marqueurs de l'inflammation à l'origine des maladies
inflammatoires,
en particulier des maladies gastro-intestinales inflammatoires et maladies
chroniques
inflammatoires ; et des cancers. En outre, les inventeurs, inopinément ont
déterminé des
propriétés anti-inflammatoires synergiques issues de la mise en uvre d'une
bactérie du
genre Christensenella en association avec une bactérie du genre Akkermansia,
en particulier
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Akkermansia muciniphila, un probiotique de nouvelle génération (NGP) bien
connu issu de la
famille Verrucomicrobiaceae.
[0015] C'est pourquoi, l'invention a pour objet une bactérie du genre
Christensenella, pour
son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies
inflammatoires chroniques
et/ou des maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers chez
l'être humain ou
l'animal.
[0016] Avantageusement, une telle bactérie, lorsqu'elle est administrée à un
être humain ou
un animal présentant une inflammation chronique, est capable d'agir sur les
molécules
produites en excès lors d'une inflammation chronique comme la kynurenine,
l'interleukine 6,
l'interleukine 8, le TNFalpha, l'interleukine lb, les lipocalines ou la
calprotectine fécale, et/ou
en stimulant la production de la cytokine anti-inflammatoire interleukine 10.
[0017] L'invention a également pour objet les compositions comprenant au moins
une
bactérie du genre Christensenella, seule ou en association avec au moins une
bactérie
additionnelle, préférentiellement au moins une bactérie additionnelle du genre
Akkermansia,
pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies
inflammatoires
chroniques et/ou des maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de
cancers chez l'être
humain ou l'animal.
[0018] Une telle composition comprenant, dans un milieu physiologiquement
acceptable, au
moins l'une de ces bactéries (au moins une bactérie du genre Christensenella
seule ou en
association avec au moins une bactérie additionnelle du genre Akkermansia)
et/ou leur
surnageant, est également visée perse.
[0019] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description
détaillée et des
figures de l'invention qui va suivre.
[0020] BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
[0021] La Figure 1 représente la production d'interleukine-8 (IL-8) (en pg/mL)
(ordonnée)
dans des cellules HT-29 stimulées par du TNF-a en présence de souches de
Christensenella
minuta, Christensenella timonensis, Akkermansia municiphila, Christensenella
minuta +
Akkermansia municiphila et Christensenella timonensis + Akkermansia
municiphila (abscisse).
[0022] La Figure 2 représente la sécrétion de l'IL-8 par les cellules
intestinales de la lignée
HT29 après co-incubation en présence de surnageants de souches de
Christensenella minuta
(DSMZ: DSM22607) et stimulation par le TNF- a. Test statistique non
paramétrique de Dunn:
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*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. IL-8 : Interleukine 8; TNF- a : Tumor Necrosis
Factor alpha.
Moyennes de 4 expériences répétées en triplicats.
[0023] La Figure 3 représente la mesure de la résistance trans-épithéliale sur
des cellules
intestinales de la lignée Caco-2 après co-incubation en présence bactéries
Christensenella
5 minuta (DSMZ: DSM22607) et après stimulation par le TNF- a. Test
statistique non
paramétrique de Dunn: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. IL-8 : Interleukine 8;
TNF-a : Tumor
Necrosis Factor alpha. Moyennes de 3 expériences répétées en triplicats.
[0024] La Figure 4 représente les effets de Christensenella minuta (DSM 22607)
sur un modèle
d'inflammation induit par le DNBS. (A) Suivi de la perte de poids des groupes
traités à partir
du jour de l'injection (JO). (B) Diminution significative des scores
macroscopiques indiquant
une réduction de la sévérité de l'inflammation suite aux traitements DSM 22607
et 5ASA.
Effets immunomodulateurs de D5M22607 à travers la diminution de l'activité de
la
myélopéroxydase (C) et de l'augmentation de l'interleukine-10 (IL-10), une
cytokine anti-
inflammatoire, dans la rate (D). ANOVA non paramétrique suivie par un test
statistique de
Dunn : *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. DNBS : Dinitrobenzene sulfonic acid.
[0025] La Figure 5 démontre la généralisation des effets anti-inflammatoires
des espèces de
Christensenella minuta sur un modèle d'inflammation induite par le DNBS. (A)
Réduction des
scores macroscopiques indiquant une réduction de la sévérité de l'inflammation
suite aux
traitements avec différentes espèces de Christensenella minuta. (B) Effets
immunomodulateurs de différentes espèces de Christensenella minuta à travers
la diminution
de l'activité de la myélopéroxydase (C). ANOVA non paramétrique suivie par un
test
statistique de Dunn : *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. DNBS : Dinitrobenzene
sulfonic acid.
[0026] La Figure 6 représente l'effet des surnageants des souches de
Christensenella minuta
(DSMZ : D5M22607, C. minuta 1 et C. minuta 2) sur la prolifération des
cellules HT-29
.. (adénocarcinome du colon). RLU : Relative Luminescence Unit (Unité de
Luminescence
Relative). Test de Dunnett où le groupe contrôle est le groupe GAM (qui
représente le milieu
de culture Gifu Anaerobic Broth). Code : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001,
****p<0.0001.
[0027] DEFINITIONS
[0028] Par bactéries au sens de l'invention, on entend également le terme
souches
bactériennes . Une souche bactérienne étant à comprendre comme étant une
bactérie d'une
souche donnée appartenant à une espèce particulière, par exemple l'espèce
Christensenella
minuta. On peut citer par exemple la souche bactérienne ou bactérie
Christensenella minuta
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DSM22607. Ainsi, les deux termes peuvent être indifféremment employés pour
désigner une
(des) bactérie(s) dans le contexte de l'invention.
[0029] Par hyperproduction d'interleukine 6 au sens de l'invention, on
entend une
production excessive d'interleukine 6 par rapport à la production chez une
personne ou un
animal sain sans inflammation.
[0030] Par hyperproduction d'interleukine 8> au sens de l'invention, on
entend une
production excessive d'interleukine 8 par rapport à la production chez une
personne ou un
animal sain sans inflammation.
[0031] Par sous-production d'interleukine 10)> au sens de l'invention, on
entend une
production insuffisante d'interleukine 10 par rapport à la production chez une
personne ou
un animal sain sans inflammation.
[0032] Par maladie chronique inflammatoire au sens de l'invention, on entend
en
particulier toute maladie chronique dont la physiopathologie, à évolution
lente et
progressive, est en lien direct avec une inflammation d'origine auto-immune
et/ou auto-
inflammatoire.
[0033] Par maladie gastro-intestinale inflammatoire au sens de
l'invention, on entend en
particulier, une affection intestinale inflammatoire, plus particulièrement
une affection
intestinale inflammatoire colique. Ladite affection intestinale inflammatoire
colique peut, en
particulier, être choisie dans le groupe constitué de la maladie de Crohn
(MC), la recto-colite
hémorragique (RCH) et la pochite, en particulier la MC et la RCH. La MC et la
RCH sont deux
maladies qui se caractérisent par l'inflammation de la paroi d'une partie du
tube digestif, liée
à une hyperactivité du système immunitaire digestif.
[0034] Par prévenir)> ou prévention au sens de l'invention, on entend la
réduction à un
degré moindre du risque ou de la probabilité d'occurrence d'un phénomène
donné, c'est-à-
dire, dans le contexte de la présente invention, une inflammation chronique,
une
inflammation gastro-intestinale et les pathologies en découlant tel un cancer,
en particulier
une inflammation intestinale.
[0035] Par traiter)> ou traitement)> au sens de l'invention, on entend une
diminution de
la progression de la maladie, une stabilisation, une inversion ou régression,
voire une
interruption ou inhibition de la progression d'une maladie inflammatoire
chronique, d'une
maladie gastro-intestinale inflammatoire, d'un cancer. Dans le contexte de
l'invention, ces
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termes s'appliquent également sur un ou plusieurs symptômes desdites maladies
de la
présente invention.
[0036] Par non-déficient en Christensenella dans le microbiote intestinal,
au sens de la
présente invention, on entend un être humain ou un animal dont les bactéries
du genre
Christensenella dans son microbiote intestinal représente au moins 0,01% en
nombre du total
des genres bactériens décelés dans son microbiote intestinal, en particulier
au moins 0,1%, et
préférentiellement au moins 0,5%. Recueilli dans les selles, l'abondance en
Christensenella
peut par exemple être mesurée par un test de séquençage quantitatif, de
l'hybridation
fluorescente in situ (FISH), de la qPCR (PCR quantitative) ou par des analyses
du métagénome
(quantification relative), bien connus de l'homme du métier.
[0037] Par milieu physiologiquement acceptable)> au sens de l'invention on
entend un
milieu qui est compatible avec l'organisme de l'individu auquel ladite
composition doit être
administrée. Il peut s'agir, par exemple, d'un solvant non toxique tel que
l'eau. En particulier,
ledit milieu est compatible avec une administration orale.
[0038] Par microbiote , on entend l'ensemble des micro-organismes ayant
colonisé un
individu et avec lesquels il cohabite : des bactéries pour l'essentiel, mais
également des virus,
des champignons, des levures et des protozoaires. La composition du microbiote
diffère selon
les surfaces colonisées : on distingue ainsi le microbiote cutané, le
microbiote vaginal, le
microbiote urinaire, le microbiote respiratoire, le microbiote ORL
(otorhinolaryngologie) et le
microbiote intestinal, autrefois appelé flore intestinale, de loin le plus
important avec ses 100
000 milliards de germes. Ainsi, on entend par microbiote intestinal
l'ensemble des micro-
organismes, notamment des bactéries, qui peuplent l'intestin d'un individu
donné.
[0039] Par Indice de masse corporel)> (IMC), on désigne, selon une
définition officielle de
l'Organisme Mondiale de la Santé (OMS), l'indicateur des risques pour la santé
associée à un
poids excessif et à un poids insuffisant. L'IMC se calcule en divisant le
poids de l'individu (en
kilogrammes) par sa taille (en mètres) élevée au carré. Une valeur d'IMC est
associée à une
corpulence spécifique selon la classification donnée
par l'OMS
( htt ps ://www.who .i nt/features/factfiles/obesity/facts/fr/).
[0040] Par quantité effective , quantité effective à , quantité de X
efficace pour)> et
autres, se réfèrent à une quantité d'un ingrédient actif qui est efficace pour
soulager ou
réduire dans une certaine mesure un ou plusieurs des symptômes de la maladie
dans la
nécessité d'un traitement, ou pour retarder l'apparition de marqueurs
cliniques ou de
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symptômes d'une maladie qui ont besoin de prévention, lorsque le composé est
administré.
Ainsi, la quantité se réfère à une quantité de l'ingrédient actif qui présente
des effets tels que
(i) inverser le rythme de progression d'une maladie, (ii) inhiber dans une
certaine mesure
l'évolution de la maladie, et/ou, (iii) soulager dans une certaine mesure (ou,
de préférence,
.. en éliminant) un ou plusieurs symptômes associés à la maladie. L'efficacité
de la quantité peut
être déterminée empiriquement en expérimentant les composés concernés dans des
systèmes modèles in vivo et in vitro connus pour une maladie nécessitant
traitement.
[0041] DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
[0042] L'invention a donc pour objet l'utilisation dans la prévention et/ou le
traitement de
.. maladies inflammatoires chroniques et/ou de maladies gastro-intestinales
inflammatoires
et/ou de cancers, en particulier de cancers à caractère inflammatoire, chez
l'être humain ou
l'animal, d'au moins une bactérie de la famille des Christensenellocées,
préférentiellement du
genre Christensenella ou d'une composition comprenant au moins un telle
bactérie et/ou un
surnageant de culture d'au moins ladite bactérie du genre Christensenella. La
bactérie peut
être toute souche bactérienne d'une des espèces du genre Christensenella.
Préférentiellement, ladite composition comprenant en outre une bactérie
additionnelle de la
famille Verrucomicrobiaceoe et/ou un surnageant de culture de ladite bactérie
additionnelle,
en particulier ladite bactérie est du genre Akkermansia, plus particulièrement
de l'espèce
Akkermansia muciniphila.
[0043] Bactéries selon l'invention.
[0044] L'invention vise donc une bactérie de la famille des
Christensenellocées, en particulier
du genre Christensenella pour son utilisation dans la prévention et/ou le
traitement de
maladies inflammatoires, préférentiellement de maladies inflammatoires
chroniques et/ou
de maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers chez l'être
humain ou
l'animal, en particulier chez des personnes ou des animaux présentant une
maladie
inflammatoire ou un cancer avec une hyperproduction d'interleukine 6 et/ou une
hyperproduction d'interleukine 8 et/ou une sous-production d'interleukine 10.
[0045] Selon l'invention, les bactéries du genre Christensenella, lorsqu'elles
sont administrées
à un être humain ou un animal présentant une inflammation chronique, une
inflammation
.. gastro-intestinale ou un cancer, sont capables d'agir sur les molécules
produites en excès lors
d'une inflammation chronique, d' une inflammation gastro-intestinale ou d'un
cancer, en
particulier sur l'interleukine 6, l'interleukine 8 et la kynurenine, mais
également sur le
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TNFalpha, l'interleukine lb, les lipocalines ou la calprotectine fécale.
Ainsi, les inventeurs ont
découvert que les bactéries du genre Christensenella possèdent la capacité
inattendue de
réduire in vitro et in vivo l'inflammation et la prolifération cellulaire, en
particulier
l'inflammation gastro-intestinale et plus particulièrement l'inflammation
chronique de
l'intestin. Plus particulièrement les bactéries selon la présente invention
sont capables de
réduire significativement la production de molécules pro-inflammatoires,
telles que
l'interleukine 6 (IL-6) et l'interleukine 8 (IL-8).
[0046] En effet, dans les maladies inflammatoires et cancers qui présentent
une
augmentation de l'un de ces marqueurs tels que l'interleukine 6,
l'interleukine 8, la
kynurénine, le TNFalpha, l'interleukine lb, la lipocaline ou la calprotectine,
leur diminution
est le signe de la réduction de la voie de signal pro-inflammatoire, c'est-à-
dire que les cellules
immunitaires à l'origine de cette production sont moins stimulées. Dès lors,
la réaction
immunitaire excessive en cause de l'inflammation est ralentie et le système
retourne
progressivement à la norme.
[0047] Selon un mode de réalisation, la ou les bactéries utiles selon
l'invention sont
administrées à des êtres humains ou des animaux dans une quantité efficace
pour une action
sur au moins un de ces marqueurs de l'inflammation, c'est-à-dire pour diminuer
la production
d'au moins une de ces molécules dans l'organisme. Selon un mode de réalisation
adapté, la
ou les bactéries peuvent être administrées à raison d'une dose de 107 à 1011
unités formant
des colonies (CFU) par jour, quel que soit le poids de la personne ou de
l'animal,
préférentiellement une dose de 109 à 1012 CFU par jour est administré, plus
préférentiellement une dose égale à 109 CFU. En particulier, la dose comprend
au moins une
bactérie choisie parmi Christensenella timonensis, Christensenella minuta,
Christensenella
massiliensis et/ou leurs mélanges. Préférentiellement il s'agit d'une dose
unique, c'est-à-dire
.. administrée en une seule fois ou une dose avant chaque repas soit trois
fois par jour.
[0048] Préférentiellement, la bactérie de la famille des Christensenellacées,
en particulier du
genre Christensenella est utile dans le traitement d'au moins une maladie
inflammatoire
chronique choisie parmi les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin,
les maladies
inflammatoires chroniques du foie, les maladies inflammatoires chroniques du
pancréas, les
polyarthrites, les dermatites atopiques, les maladies neuro-inflammatoires, de
la
bronchopneumopathie chronique obstructive. En particulier, elle présente un
effet dans la
prévention et/ou le traitement d'au moins une maladie choisie parmi la maladie
de Crohn, la
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recto-colite hémorragique, la pochite, la colite ulcéreuse, la maladie c
liaque, la gastrite
auto-immune, les hépatites, la stéatohépatite non alcoolique, la cholangite
sclérosante
primitive, la pancréatite, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite
psoriatique, le psoriasis,
l'eczema.
5 [0049] En outre, la bactérie de la famille des Christensenellacées, en
particulier du genre
Christensenella est utile dans le traitement d'au moins une maladie gastro-
intestinale
inflammatoire tel qu'une affection intestinale inflammatoire, plus
particulièrement une
affection intestinale inflammatoire colique. Par affection on entend au
sens de l'invention
une maladie, une pathologie. Ladite affection intestinale inflammatoire
colique peut, en
10 particulier, être choisie dans le groupe constitué de la maladie de
Crohn, de la recto-colite
hémorragique et de la pochite, en particulier dans le groupe constitué de la
maladie de Crohn
et de la recto-colite hémorragique.
[0050] En outre, la bactérie de la famille des Christensenellacées, en
particulier du genre
Christensenella est utile dans le traitement d'une maladie proliférative
choisie parmi les
lymphomes, les glioblastomes, les myélomes, les leucémies, les cancers
colorectaux, les
cancers du sein, de la prostate, de l'ovaire, de l'utérus, du pancréas, des
poumons, du foie,
de la vésicule biliaire et des reins.
[0051] La ou les bactéries utiles selon l'invention sont des bactéries du
genre Christensenella.
Il peut s'agir en particulier de Christensenella massiliensis, Christensenella
timonensis,
Christensenella intestinihominis, et/ou Christensenella minuta. Selon une
variante
particulièrement adaptée, il s'agit de Christensenella minuta.
[0052] Ces bactéries peuvent être isolées à partir de selles humaines par
exemple selon les
protocoles publiés par Morotomi et al. 2012 (Morotomi, M., Na gai, F. &
Watanabe, Y.
Description of Christensenella minuta gen. nov., sp. nov., isolated from human
faeces, which
forms a distinct branch in the order Clos tridiales, and proposai of
Christensenellaceae fam.
nov. INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMA TIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY 62,
144-149 (2012)) et NDongo et al. 2016 (Ndongo, S., Dubourg, G., Khelaifia, S.,
Fournier, P. E.
& Raoult, D. Christensenella timonensis, a new bacterial species isolated from
the human gut.
New Microbes and New Infections 13, 32-33 (2016)). Ces documents décrivent
également les
méthodes de culture des bactéries utiles selon l'invention.
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[0053] Eventuellement, lesdites bactéries sont disponibles et accessibles dans
la collection
des microorganismes et cultures cellulaires allemande GmbH, en particulier
sous les numéros
de dépôt DSM 22607, DSM 102344, DSM 102800.
[0054] Composition selon l'invention.
[0055] La ou les bactéries utiles selon l'invention, pour leur utilisation
précédemment décrite,
sont préférentiellement administrées dans une composition. Ladite composition
comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins la ou les
bactérie(s)
utile(s) et/ou leur surnageant.
[0056] Ainsi, l'invention a également pour objet une composition comprenant au
moins une
bactérie du genre Christensenella dans la prévention et/ou le traitement de
maladies
inflammatoires chroniques et/ou de maladies gastro-intestinales inflammatoires
et/ou de
cancers, chez l'être humain ou l'animal, préférentiellement chez des personnes
ou des
animaux présentant une hyperproduction d'interleukine 6.
[0057] En particulier, l'invention permet de fournir une quantité efficace de
bactéries de la
famille des Christensenellacées, telles que Christensenella massiliensis,
Christensenella
timonensis, Christensenella intestinihominis et/ou Christensenella minuta,
pour une
utilisation dans le traitement :
- des maladies associées à une augmentation de l'interleukine 6 telles qu'un
trouble
inflammatoire, un trouble allergique, un trouble auto-immun, un trouble de
rejet de greffe,
l'athérosclérose, l'ostéoporose, une douleur neuropathique, une septicémie, la
maladie de
Castleman, un état fibrotique, l'arthrite rhumatoïde, l'arthrite rhumatoïde
juvénile, l'arthrite
psoriasique, l'arthrose, l'arthrite rhumatoïde réfractaire, l'arthrite non
rhumatoïde
chronique ou la spondylarthrite ankylosante,
- des maladies associées à une augmentation de l'interleukine 8 telles que la
dermatite
atopique, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires
de l'intestin, la
maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, l'accident vasculaire cérébral, le choc
septique, le
choc endotoxique, le psoriasis, la septicémie à Gram négatif, le syndrome de
choc toxique,
les lésions de reperfusion rénale, la glomérulonéphrite, la thrombose, la
réaction du greffon
contre l'hôte, rejets d'allogreffes, paludisme, resténose, angiogenèse,
athérosclérose,
ostéoporose, gingivite et libération indésirable de cellules souches
hématopoïétiques,
maladies causées par des virus respiratoires, le virus de l'herpès et des
virus de l'hépatite,
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méningite, encéphalite herpétique, vascularite du SNC, lésions cérébrales
traumatiques,
tumeurs du SNC, hémorragie sous-arachnoïdienne, traumatisme post-chirurgical,
mucoviscidose, prurit, pneumonie interstitielle, hypersensibilité, arthrite
cristalline, arthrite
de Lyme, fibrodysplasie ossifiante progressive, pancréatite aiguë et
chronique, entérocolite
nécrosante, sinusite chronique, uvéite, polymyosite, vascularite, acné,
ulcères gastriques et
duodénaux, maladie c liaque, lupus, et/ou
- des maladies associées à une baisse de l'interleukine 10 ou pouvant être
traitées en
augmentant l'interleukine 10 telles que les maladies auto-immunes, le rejet de
greffes
d'organes et de moelle osseuse, la maladie du greffon contre l'hôte, les
infections
parasitaires, les granulomes, la maladie de Crohn, la colite, la pancréatite,
les maladies
inflammatoires des poumons, les maladies inflammatoires des yeux, la dermatite
atopique
et la rhinite.
[0058] Selon un mode de réalisation, l'invention concerne une composition pour
son
utilisation dans le traitement et/ou la prévention de maladies inflammatoires
chroniques
et/ou de maladie gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers chez un
être humain ou
un animal, ladite composition comprenant, dans un milieu physiologiquement
acceptable (i)
au moins bactérie du genre Christensenella, et/ou (ii) un surnageant de
culture d'au moins
une bactérie du genre Christensenella.
[0059] La présente invention concerne également une composition pour son
utilisation dans
le traitement et/ou la prévention d'une maladie gastro-intestinale
inflammatoire chez un
individu, ladite composition comprenant, dans un milieu physiologiquement
acceptable
(i) au moins une souche bactérienne choisie dans le groupe constitué de
Christensenella
timonensis, Christensenella minuta et/ou leurs mélanges,
et/ou
(ii) un surnageant de culture d'au moins l'une quelconque de ces souches
bactériennes et/ou
leurs mélanges.
[0060] Selon l'un des quelconques modes de réalisation précédents, la présente
composition
peut être administrée à un être humain souffrant de maladies inflammatoires
chroniques
et/ou de maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers, ledit
être humain
possédant un indice de masse corporel (IMC) inférieur à 25, en particulier
ladite composition
est administrée à un être humain souffrant de maladies gastro-intestinales
inflammatoires.
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[0061] Par /MC inférieur à 25 , on désigne un IMC strictement inférieur à
25, plus
particulièrement un IMC inférieur ou égale à 24,9. Selon l'un quelconque de
ces modes de
réalisation, ledit être humain peut en particulier posséder un IMC inférieur à
25 et supérieur
ou égal à 18,5.
[0062] Préférentiellement, ladite composition selon l'invention est
caractérisée en ce que la
bactérie du genre Christensenella est choisie parmi Christensenella
massiliensis,
Christensenella timonensis et/ou Christensenella minuta et/ou Christensenella
intestinihominis et/ou leurs mélanges. Il peut s'agir en particulier d'un
mélange de
Christensenella massiliensis et Christensenella timonensis ou Christensenella
massiliensis et
Christensenella minuta ou Christensenella massiliensis et Christensenella
intestinihominis ou
Christensenella timonensis et Christensenella minuta ou Christensenella
timonensis et
Christensenella intestinihominis ou Christensenella minuta et Christensenella
intestinihominis
ou Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis et Christensenella
minuta ou
Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis et Christensenella
intestinihominis ou
Christensenella timonensis et Christensenella minuta et Christensenella
intestinihominis ou
Christensenella massiliensis, Christensenella minuta et Christensenella
intestinihominis ou
Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis et Christensenella
minuta et
Christensenella intestinihominis.
[0063] Selon l'un quelconques des modes de réalisation précédents, la
composition peut être
utilisée chez un individu non déficient en Christensenella dans le microbiote
intestinal, en
particulier chez un être humain ou un animal dont le genre Christensenella
représente au
moins 0,01 % en nombre du total des genres bactériens de son microbiote
intestinal.
[0064] La ou les bactéries sont présentes dans une quantité efficace dans la
composition
permettant un effet sur les maladies chroniques inflammatoires et/ou les
maladies gastro-
intestinales inflammatoires et/ou les cancers dont sont atteints les personnes
ou les animaux
traités. Par personne , on entend un individu en particulier un être humain
ou un animal.
[0065] Préférentiellement, la composition utile selon l'un des quelconques
modes de
réalisation précédent comprend 106 à 1012 unités formant des colonies (CFU) de
bactéries du
genre Christensenella par dose quotidienne à administrer de ladite
composition.
Préférentiellement cela correspond à une dose quotidienne de bactéries à
administrer, quel
que soit le poids de la personne ou de l'animal. De façon préférée, cette dose
est administrée
en une seule fois. En particulier la composition utile comprend 107 à 1011 CFU
de bactéries du
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genre Christensenella par dose quotidienne à administrer, de préférence 109
CFU. En
particulier lesdites bactéries présentes dans la composition peuvent être
d'une même espèce,
d'un mélange d'espèces ou d'un mélange de souches bactériennes. La composition
utile selon
l'invention peut être sous forme liquide. Elle peut notamment comprendre des
bactéries de
la famille des Christensenellacées, en particulier du genre Christensenella
et/ou un milieu de
culture desdites bactéries qui permet de les conserver, comme par exemple
préférentiellement le milieu Columbia agar anaérobique enrichi en sang de
mouton, ou un
milieu équivalent ne contenant pas de produit dérivé d'origine animale. Par
milieu de
culture on entend au sens de la présente invention, le surnageant de culture
dans lequel les
bactéries ou les souches bactériennes ont séjourné lors de leur culture, ou
milieu
extracellulaire.
[0066] Selon une variante, la composition utile selon l'invention peut se
présenter sous forme
solide. Dans ce cas les bactéries peuvent être présentes sous forme
lyophilisée, et peuvent
comprendre également des excipients tels que par exemple la cellulose
microcrystalline, le
lactose, le saccharose, le fructose, le lévulose, les amidons, le stachyose,
le raffinose,
l'amylum, le lactate de calcium, le sulfate de magnésium, le citrate de
sodium, le calcium
stearate, la polyvinylpyrrolidone, la maltodextrine, les
galactooligosaccharides, les
fructooligosaccharides, les pectines, les béta-glucans, les lactoglobulines,
les
isomaltooligosaccharides, les polydextroses, le sorbitol et/ou le glycérol.
[0067] Les compositions utiles selon l'invention peuvent se présenter sous
forme de poudre,
de poudre microencapsulée, de gélule, de capsule, de comprimé, de pastille, de
granulés,
d'émulsion, de suspension, de suppositoire, d'un produit alimentaire, d'une
boisson, d'un
produit pharmaceutique, d'un nutraceutique, d'un additif alimentaire, d'un
complément
alimentaire ou d'un produit laitier.
[0068] Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, elles peuvent se
présenter sous
une forme gastro-résistante, telles qu'un comprimé enrobé contenant des
bactéries
microencapsulées. Ladite composition peut ainsi être pourvue d'un enrobage
résistant au suc
gastrique, afin d'assurer que la bactérie de l'invention comprise dans ladite
composition
puisse traverser l'estomac endommagé. La libération de(s) la bactérie(s) peut
ainsi se
produire pour la première fois dans le tractus intestinal supérieur.
[0069] Plus particulièrement, la composition selon l'invention peut être
comprise dans un
complément alimentaire. Un complément alimentaire pour une administration par
la voie
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orale peut être présent dans des capsules, des gélules, des capsules molles,
des comprimés,
des comprimés dragéifiés, des pilules, des pâtes, des pastilles, des gommes,
des solutions ou
émulsions buvables, un sirop ou un gel.
[0070] Un complément alimentaire selon la présente invention peut comprendre
en outre un
5 .. édulcorant, un stabilisant, un antioxydant, un additif, un agent
aromatisant et/ou un colorant.
La formulation de celui-ci est effectuée au moyen des procédés usuels pour
produire des
comprimés dragéifiés, des gélules, des gels, des hydrogels pour libération
contrôlée, des
émulsions, des comprimés ou des capsules.
[0071] Une composition selon la présente invention peut également être sous la
forme d'une
10 composition nutritionnelle. Une telle composition nutritionnelle selon
la présente invention
est sous la forme d'un yogourt, une barre de céréale, des céréales pour le
petit-déjeuner, un
dessert, un aliment congelé, une soupe, un aliment pour animaux de compagnie,
une
suspension liquide, une poudre, un comprimé, une gomme ou un bonbon.
[0072] Une composition selon la présente invention peut comprendre en outre au
moins un
15 ingrédient choisi parmi : des antioxydants, des huiles de poisson, DHA,
EPA, des vitamines,
des minéraux, des phytonutriments, une protéine, un lipide, des probiotiques
et des
combinaisons de ceux-ci. Les bactéries selon l'invention seules ou comprises
dans la
composition selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents peuvent
être
utilisées vivantes, semi-actives, inactivées, ou mortes, préférentiellement
sous une forme
vivante. Les bactéries sous forme semi-actives, inactivées, ou mortes peuvent
l'être par
exemple par irradiation, inactivation thermique ou lyophilisation, en
particulier par la chaleur,
l'exposition à un pH approprié, aux UV, aux rayons gamma, aux rayons X ou à la
mise sous
haute pression. Le terme "semi-active" désigne ainsi une bactérie à faible
activité
physiologique dont la capacité à proliférer est réduite, temporairement ou
définitivement. Le
terme inactivé désigne une bactérie qui n'est plus capable, temporairement
ou
définitivement, de proliférer. Le terme morte désigne une bactérie qui
n'est plus capable,
définitivement, de proliférer. Les bactéries mortes ou inactivées peuvent
avoir les
membranes cellulaires intactes ou rompues. Ainsi le terme inactivé désigne
également les
extraits et lysats de bactéries obtenues.
[0073] Une bactérie selon l'invention seules ou dans la composition selon
l'invention peut
être mise en uvre sous forme entière, c'est-à-dire pour l'essentiel dans sa
forme native, ou
sous forme d'extraits ou de lysats comprenant des fractions et/ou des
métabolites de ce
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microorganisme. Un tel lysat peut désigner l'intégralité du lysat obtenu par
lyse ou seulement
une fraction de celle-ci et peut être préparé selon une des méthodes
classiques bien connues
de l'homme du métier telles que par exemple un choc thermique, par ultrasons,
un choc
osmotique, ou sous contrainte mécanique, telle que par centrifugation. Elles
peuvent être
toutes vivantes, toutes semi-actives, toutes inactivées ou toutes mortes. En
particulier, il peut
s'agir d'un mélange de bactéries vivantes, semi-actives, inactivées et mortes.
[0074] Préférentiellement, au moins une partie des bactéries sont vivantes, en
particulier au
moins 50% (en nombre), encore plus préférentiellement au moins 90% (en
nombre).
[0075] Ainsi, selon un mode de réalisation adapté, les bactéries présentes
dans la
composition utile selon l'invention sont pour au moins 50% des bactéries
vivantes (en
nombre), préférentiellement pour au moins 90% des bactéries vivantes (en
nombre), encore
plus préférentiellement toutes vivantes.
[0076] Les conditions de conservation selon l'invention se présentent pour des
formulations
liquides sous la forme d'un produit congelé maintenu à -20 C dans un sachet
hermétique.
Pour les formulations solides, les conditions de conservation selon
l'invention comprennent
une capsule ou un enrobage hermétique à la lumière et à l'oxygène maintenu à
une
température ambiante comprise entre 15 C et 40 C et un taux d'humidité compris
entre 3%
et 70%.
[0077] Une composition selon l'un quelconque des modes de réalisation
précédents est
prévue pour le tube digestif, en particulier l'intestin. Par conséquent, les
bactéries utiles selon
l'invention, et en particulier les compositions l'incluant, peuvent être
administrées par voie
orale, topique, inhalée ou rectale, préférentiellement rectale ou
intrarectale.
[0078] En particulier, une administration rectale ou intrarectale est conduite
sous la forme
d'un suppositoire, un lavement ou une mousse.
[0079] Les inventeurs ont également déterminé, de manière surprenante, la
capacité de
souches de Christensenella à augmenter les propriétés anti-inflammatoires
d'une souche
d'Akkermansia, et en particulier de la souche Akkermansia muciniphila. Ainsi,
les inventeurs
ont mis en évidence l'existence d'un effet synergique d'une association d'une
souche de
Christensenella (ou d'un surnageant de culture d'une telle souche) et d'une
souche
d'Akkermansia (ou d'un surnageant de culture d'une telle souche) sur la
prévention et/ou le
traitement d'une inflammation gastro-intestinale, et en particulier l'effet
synergique d'une
association d'une souche de Christensenella minuta et/ou de Christensenella
timonensis (ou
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de surnageants de culture de telles souches) et d'une souche d'Akkermansia
muciniphila (ou
d'un surnageant de cette souche) sur la prévention et/ou le traitement d'une
inflammation
gastro-intestinale.
[0080] Ainsi, selon l'un quelconque des modes de réalisation précédent, la
composition peut
comprendre en outre :
(i) au moins une bactérie additionnelle de la famille Verrucomicrobiaceae;
et/ou
(ii) un surnageant de culture de ladite bactérie additionnelle.
[0081] Préférentiellement, la bactérie additionnelle de la famille
Verrucomicrobiaceae est
une bactérie du genre Akkermansia, plus particulièrement de l'espèce
Akkermansia
muciniphila. Par bactérie de l'espèce Akkermansia muciniphila on entend au
sens de
l'invention également la bactérie dénommé Akkermansia municiphila .
[0082] Selon un mode de réalisation, la bactérie et la bactérie additionnelle
telles que
mentionnées ci-dessus sont, indépendamment l'une de l'autre, sous une forme
vivante, semi-
active, inactivée et/ou morte, et sont en particulier sous une forme vivante.
[0083] Dans certains modes de réalisation, une composition selon l'invention
est adaptée
pour l'administration d'une dose journalière représentant de 107 à 1011 unités
formant des
colonies (UFC), de préférence une dose journalière équivalente à 109 UFC,
d'une bactérie de
la famille Verrucomicrobiaceae, en particulier du genre Akkermansia, plus
particulièrement
d'une bactérie Akkermansia muciniphila.
[0084] Dans le cas de la mise en uvre d'un surnageant de culture de l'une
quelconque des
bactéries susmentionnées, une composition selon l'invention peut notamment en
comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 10 à
90 % en
poids, en particulier de 25 à 70 % en poids et plus particulièrement de 30 à
50% en poids, par
rapport au poids total de la composition.
[0085] Ainsi, une composition selon l'un quelconque des modes de réalisation
susmentionnés
peut comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de
10 à 90%,
en particulier de 25 à 70 % en poids, plus particulièrement de 30 à 50 % en
poids, de
surnageant par rapport au poids total de la composition.
[0086] Les compositions utiles selon l'invention, en plus des bactéries utiles
selon l'invention
peuvent comprendre au moins un probiotique, et/ou au moins un prébiotique.
[0087] Les compositions utiles selon l'invention, en plus des bactéries utiles
selon l'invention
peuvent comprendre d'autres composés, tels que :
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- au moins un probiotique, et/ou
- au moins une bactérie produisant de l'acide lactique qui permet de créer
un environnement
anaérobique favorable aux Christensenellacées telle qu'au moins une bactérie
choisie parmi
les bactéries du genre Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus
spp. et/ou au
moins un autre organisme favorisant les conditions anaérobiques nécessaires à
la survie des
Christensenellacées telle qu'au moins une levure choisie parmi des
Saccharomyces spp. ou
des micro-organismes de la famille des Methanobacteriaceae et/ou
- au moins une bactérie associée à l'écosystème des Christensenellacées car
elles facilitent
leur survie dans l'intestin telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les
bactéries du phylum
Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Tenericutes, et Verrucomicrobia,
et/ou
- au moins une bactérie choisie parmi les bactéries de l'ordre des
Clostridales, des
Verrucomicrobiales, des Aeromonadales, des Alteromonadales, ML615.1-28, RF32,
YS2, de la
famille des Clostridiacées, des Lachnospiracées, des Ruminococcacées, des
Bacteroidacées,
des Enterococcacées, des Rikenéllacées, des Dehalobactériacées, des
Veillonellacées et/ou
- au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Faecalibacterium,
Akkermansia,
Eubacterium et Oscillospira telle que par exemple Faecalibacterium
prausnitzii, Akkermansia
muciniphila, Eubacterium halii, Oscillospira guilliermondii., et/ou
- au moins un prébiotique tel que par exemple au moins un prébiotique
choisi parmi les
galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les inulines, les
arabinoxylans, les béta-
glucanes, les lactoglobulines et/ou les béta-caséines, et/ou
- au moins un polyphénol tel que par exemple au moins un polyphénol choisi
parmi la
quercetin, le kaempferol, le resvératrol, les flavones (comme la lutéoline),
les flavan-3-ols
(comme les catéchines), les flavanones (comme la narinénine), les isoflavones,
les
anthocyanidines, les proanthocyanidines, et/ou
- au moins un minéral et/ou au moins une vitamine et/ou au moins un agent
nutritionnel,
et/ou
- au moins un principe actif pharmaceutique préférentiellement choisi parmi
les anti-
inflammatoires non stéroïdien, les anticorps dirigés contre des cibles pro-
inflammatoires
(anti-TNFalpha), les antirhumatismaux, les analgésiques, les antimicrobiens,
les
corticostéroïdes, les anaboliques stéroïdiens, les antidiabétiques, les agents
thyroïdiens, les
antidiarrhéiques, les antitussifs, les antiémétiques, les anti ulcères, les
laxatifs, les
anticoagulants, l'érythropoïétine, les immunoglobulines, les
immunosuppresseurs, les
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hormones de croissance, les médicaments hormonaux, les modulateurs des
récepteurs aux
strogènes, les agents alkylant, les antimétabolites, les inhibiteurs
mitotiques, les
radiopharmaceutiques, les anti-dépresseurs, les antipsychotiques, les
anxiolytiques, les
hypnotiques, les sympathomimétiques, les stimulants, le donepezil, la tacrine,
les
médicaments pour l'asthme, les bêta-agonistes, les stéroïdes inhalés, les
inhibiteurs de
leucotriène, les cromoglycates ou acides cromoglycidiques, l'épinéphrine, la
dornase alpha,
les cytokines, les antagonistes de cytokines.
[0088] Selon un dernier objet, la présente invention concerne une composition
comprenant,
dans un milieu physiologiquement acceptable :
(I) (a) au moins une bactérie choisie dans le groupe constitué de
Christensenella timonensis,
Christensenella minuta, Christensenella massiliensis, Christensenella
intestinihominis, et/ou
leurs mélanges ;
et/ou
(b) au moins un surnageant de culture d'au moins une bactérie choisie dans le
groupe
constitué de Christensenella timonensis, Christensenella minuta,
Christensenella
massiliensis, Christensenella intestinihominis, et/ou leurs mélanges;
et
(Il) (a) au moins une bactérie additionnelle du genre Akkermansia, plus
particulièrement de
l'espèce Akkermansia muciniphila ;
et/ou
(b) au moins un surnageant de culture d'au moins une bactérie additionnelle du
genre
Akkermansia, plus particulièrement de l'espèce Akkermansia muciniphila.
[0089] Méthode de prévention et/ou traitement.
[0090] Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une méthode
pour réduire
et/ou prévenir l'inflammation chez un individu en ayant besoin, comprenant
l'administration
d'une quantité effective d'une bactérie de la famille Christensenellacées
audit individu, en
particulier une bactérie de l'espèce Christensenella.
[0091] L'invention concerne également une méthode pour réduire le niveau d'IL-
6 et/ou
stabiliser le niveau d'IL-6 et/ou prévenir une augmentation du niveau d'IL-6
chez un individu
en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité effective d'une
bactérie de la
famille Christensenellacées audit individu, en particulier une bactérie de
l'espèce
Christensenella. Préférentiellement, ledit individu présentant des taux
sériques élevés d'IL-6
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avant le traitement. En particulier, lesdits taux sériques élevés d'IL-6 sont
supérieurs à 5
pg/ml, supérieur à 10 pg/ml, supérieur à 20 pg/ml, supérieur à 30 pg/ml,
supérieur à 40 pg/ml,
supérieur à 50 pg/ml, supérieur à 70 pg/ml, supérieur à 90 pg/ml ou supérieur
à 100 pg/ml.
[0092] L'invention concerne également une méthode pour réduire le niveau d'IL-
8 et/ou
5 stabiliser le niveau d'IL-8 et/ou prévenir une augmentation du niveau
d'IL-8 chez un individu
en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité effective d'une
bactérie de la
famille Christensenellacées audit individu, en particulier une bactérie de
l'espèce
Christensenella. Préférentiellement, ledit individu présentant des taux
sériques élevés d'IL-8
avant le traitement. En particulier, lesdits taux sériques élevés d'IL-8 sont
supérieurs à 5
10 pg/ml, supérieur à 10 pg/ml, supérieur à 20 pg/ml, supérieur à 30 pg/ml,
supérieur à 40 pg/ml,
supérieur à 50 pg/ml, supérieur à 70 pg/ml, supérieur à 90 pg/ml ou supérieur
à 100 pg/ml.
[0093] L'invention concerne également une méthode pour augmenter le niveau
d'IL-10 et/ou
stabiliser le niveau d'IL-10 et/ou prévenir une diminution du niveau d'IL-10
chez un individu
en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité effective d'une
bactérie de la
15 famille Christensenellacées audit individu, en particulier une bactérie de
l'espèce
Christensenella. Préférentiellement, ledit individu présentant des taux
sériques faibles d'IL-10
avant le traitement. En particulier, lesdits taux sériques faibles d'IL-10
sont inférieurs à 15
pg/ml, inférieur à 10 pg/ml ou inférieur à 5 pg/ml.
[0094] En outre, l'invention concerne une méthode pour réduire le niveau de
kynurenine
20 et/ou stabiliser le niveau de kynurenine et/ou prévenir une augmentation
du niveau de
kynurenine chez un individu en ayant besoin, comprenant l'administration d'une
quantité
effective d'une bactérie de la famille Christensenellacées audit individu, en
particulier une
bactérie de l'espèce Christensenella. Préférentiellement, ledit individu
présentant des taux
élevés de kynurénine fécale avant le traitement.
[0095] L'invention concerne également une méthode de traitement et/ou de
prévention d'un
cancer associé à une inflammation chez un individu en ayant besoin, comprenant
l'administration d'une quantité effective de la bactérie Christensenellacées
audit individu.
[0096] La méthode selon la présente invention permet de réduire le niveau d'au
moins un
des marqueurs de l'inflammation cité ci-avant chez ledit individu, ledit
marqueur étant
préférentiellement réduit dans le sérum, le sang ou les selles.
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[0097] Préférentiellement, les présentes méthodes sont mises en uvre chez un
individu
souffrant d'une ou plusieurs maladies précédemment décrites dans la
description. Ledit
individu étant préférentiellement un être humain.
[0098] Préférentiellement, la bactérie Christensenella comprend un gène d'ARN
ribosomique
16S présentant une identité de séquence d'au moins 50%, d'au moins 60%, d'au
moins 70%,
d'au moins 80% ou, de préférence, d'au moins 90% avec un gène d'ARN
ribosomique 16S de
Christensenella minuta, Christensenella massiliensis, ou Christensenella
timonensis, plus
préférablement encore, au moins 97 % d'identité de séquence avec une séquence
choisie
parmi les SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[0099] La SEQ ID NO: 1 est une séquence du gène d'ARN ribosomal 16S de la
bactérie
Christensenella minuta DSM 22607, qui a été isolée à partir d'un échantillon
fécal humain. La
séquence d'ARNr 16S de C. minuta est identifiée par le numéro d'accès Genbank
AB490809.
La SEQ ID NO: 2 est une partie de la séquence du gène d'ARN ribosomal 16S de
la bactérie
Christensenella minuta DSM 22607. Des séquences 16S supplémentaires pour les
bactéries
du genre de Christensenella sont fournies telles que les SEQ ID NOS: 3-6
(numéros OTU
701845, 177179, 1146771, et 361793 dans la base de données Greengenes,
respectivement).
L'identité de chaque séquence par rapport à SEQ ID NO: 1 est la suivante: SEQ
ID NO: 3, 93%
d'identité avec SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 4, 95% d'identité avec SEQ ID NO: 1;
SEQ ID NO: 5,
97% d'identité avec SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 6, 95% d'identité avec SEQ ID NO:
1.
[0100] En particulier, lesdites méthodes comprennent l'administration d'au
moins une
bactérie ou composition selon la présente invention caractérisé par l'un des
quelconques
mode de réalisation décrits précédemment, tel que le mélange ou non des
bactéries, la
quantité administrée, la quantité de bactéries viables, les composants
supplémentaires, par
exemple des principes actifs pharmaceutiques, des prébiotiques ou
probiotiques, des
vitamines, minéraux, agents nutritionnels, autres micro-organismes, la
formulation
particulière de ladite composition, par exemple, poudre, gélule etc.
[0101] Bien entendu, les présentes méthodes comprennent l'administration
orale, inhalée,
topique, rectale ou intrarectale d'une quantité suffisante.
[0102] L'invention est à présent illustrée par des exemples de bactéries
utiles selon
l'invention, de procédés de cultures de ces bactéries, des exemples de
compositions les
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contenant et des résultats d'essais démontrant l'efficacité de l'invention qui
sont présentés à
titre d'illustration uniquement.
[0103] EXEMPLES
[0104] Exemple 1 : Christensenella minuta.
Christensenella minuta peut-être cultivée selon le protocole opératoire décrit
en suivant.
1/ Dissoudre un milieu RCM ("Reinforced Clostridial Medium" milieu
clostridiale renforcé)
déshydraté dans de l'eau distillée
2/Ajouter 0,5 mL/L de solution de résazurine-Na (0,1% p/v)
3/Porter à ébullition et refroidir à température ambiante tout en injectant un
mélange
gazeux à 80% de N2 et à 20% de CO2
4/Etaler le milieu sous la même atmosphère gazeuse dans des tubes de type
Hungate
anoxiques ou dans des flacons de sérum puis autoclaver
5/Avant utilisation, ajoutez 1,0 g de carbonate de sodium par litre à partir
d'une solution
mère anoxique stérile préparée avec un mélange gazeux à 80% de N2 et à 20% de
CO2
6/ Vérifier le pH du milieu après autoclavage et ajuster le pH entre 7,3 et
7,5, en utilisant
une solution mère anoxique stérile de bicarbonate de sodium (5% p Iv) préparée
dans une
atmosphère gazeuse à 80% de N2 et à 20% de CO2.
[0105] Exemple 2 : Christensenella massiliensis.
Christensenella massiliensis peut-être cultivée selon le protocole opératoire
décrit en
suivant.
[0106] 1/Préparer un milieu carboxyméthylcellulose (N2 / CO2) en suivant les
instructions
suivantes fournies par DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen).
[0107] [Tableau 1]
Casitone 30.0 g
Extrait de levure 5.0 g
K2HPO4 5.0 g
Na-resazurin solution (0.1% w/v) 0.5 ml
L-Cysteine-HCI x H20 0.5 g
D-Glucose 4.0 g
Cellobiose 1.0 g
Maltose 1.0 g
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Viande hachée (sans gras) 500.0 g
NaOH 1 N 25.0 ml
Eau distillée 1000m1
Amidon (soluble) 1.0 g
Na2CO3 1.5 g
Filtrat de viande (voir Tableau 2) 1000m1
[0108] 2/Dissoudre les différents constituants listés dans le tableau ci-
dessus, sauf la
cystéine, les carbohydrates et le carbonate.
3/Faire bouillir le milieu pendant 1 min, puis le laisser refroidir à la
température ambiante
sous une atmosphère gazeuse à 80% de N2 et à 20% de CO2.
4/Ajouter 0,5 g/L de L-cystéine-HCI x H20 et le verser sous la même atmosphère
gazeuse
dans des tubes de type Hungate (pour les souches exigeant des particules de
viande,
introduire celles-ci en premier dans le tube, utiliser 1 partie de particules
de viande pour 4
ou 5 parties de liquide).
5/ Autoclavage à 121 C pendant 20 min.
6/ Après autoclavage, ajouter le glucose, le cellobiose, le maltose et
l'amidon provenant de
solutions mères anoxiques stériles préparées à 100% de gaz N2 et de carbonate
à partir
d'une solution mère anoxique stérile préparée sous des mélanges gazeux à 80%
de N2 et
20% de CO2.
7/ Ajuster le pH du milieu à 7, si nécessaire.
Préparation du Filtrat de viande :
[0109] [Tableau 21
[0110] Utiliser du b uf maigre ou de la viande de cheval.
Enlever la graisse et le tissu conjonctif avant de hacher.
Mélanger la viande, l'eau et NaOH, puis faire bouillir pendant 15 min sous
agitation.
Laisser refroidir à la température ambiante, retirer la graisse de la surface
et filtrer, en
retenant les particules de viande et le filtrat.
Ajouter au filtrat de l'eau jusqu'à un volume final de 1000,0 ml.
Les bactéries doivent être cultivées en condition anaérobie à 37 C.
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[0111] Exemple 3 : Christensenella timonensis
Christensenella timonensis peut-être cultivée selon le même protocole
opératoire que celui
décrit à l'exemple 2 pour Christensenella massiliensis.
[0112] Exemple 4 : Souches particulière selon l'invention
Toutes les souches décrites ci-après ont été obtenues auprès de la collection
allemande DSMZ
(Institut Leibnitz DSMZ). Christensenella minuta DSM 22607, Christensenella
timonensis DSM
102800 et Akkermansia municiphila DSM 22959 ont été cultivées à 37 C dans un
milieu YBHI
[milieu de perfusion cerveau-coeur complété avec 0.5 % d'extrait de levure
(Difco)]
additionné de cellobiose (1 mg/mi ; Sigma), de maltose (1 mg/mi ; Sigma), de
cystéine (0,5
mg/mi ; Sigma) et de mucine (1 mg/ml; Sigma) dans une chambre anaérobie
remplie avec N2
= 85%, CO2 =10% et H2 = 5%.
[0113] Exemple 5 : Composition utile sur la base de surnageants
Un exemple de composition utile selon l'invention est une composition
comprenant entre
0,1 et 95% de surnageant de culture des souches Christensenella minuta DSM
22607,
Christensenella timonensis DSM 102800 et Akkermansia municiphila DSM 22959.
[0114] Exemple 6 : Composition utile selon l'invention sous forme liquide
Un exemple de composition utile selon l'invention sous forme liquide est une
composition
comprenant Christensenella minuta 109 CFU/mL dans le milieu de culture RCM
anaérobie
décrit ci-dessus modifié pour ne contenir aucun produit d'origine animale et
enrichi en
glycérol 5%.
La composition de l'exemple 6 est obtenue à partir d'une RCB ( research cell
bank banque
de cellules de recherche) préparée à base de Christensenella minuta 10' CFU/mL
puis
conservée congelée à -20 C dans un sachet hermétique à l'oxygène.
La composition congelée doit être réchauffée à température ambiante jusqu'à
retrouver une
forme liquide avant utilisation.
[0115] Exemple 7 : Composition utile selon l'invention sous forme solide
[0116] Un exemple de composition utile selon l'invention sous forme
lyophilisée peut être
obtenu par lyophilisation de la composition de l'exemple 6 à l'état congelé.
[0117] RESULTATS D'ESSAIS DEMONTRANT L'EFFET DE L'INVENTION
[0118] 1. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries
christensenella in vitro
(kvnurénine).
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[0119] L'objectif de cette étude est de démontrer l'effet anti-inflammatoire
in vitro de
bactéries christensenella selon l'invention. La démonstration de cet effet a
été réalisée sur la
kynurénine, un marqueur connu de l'inflammation. Des feces humaines ont été
prélevées et
cultivées dans un fermenteur. L'abondance de Christensenella spp. a été
corrélée avec
5 l'abondance de kynurénine présente dans le fermenteur.
[0120] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.
1/ Protocole de fermentation à partir de féces d'origine humaine contenant du
Christensenella spp. :
- Les donneurs ne devaient pas avoir pris d'antibiotiques durant les six
mois précédents
10 l'expérience et n'avoir aucun historique de désordres gastro-
intestinaux. Les donneurs
étaient âgés entre 18 et 60 ans.
- La collecte des échantillons frais de leur fèces est obtenue dans des
contenants stériles en
plastique, conservés dans des flacons anaérobies contenant un sachet de 2,51
d'AnaeroGenTM
d'OxoidTM (02 <0.1%; CO2: 7-15%). Ces échantillons ont été apportés au
laboratoire dans les
15 deux heures après leur production.
- Les échantillons de féces ont été dilués au 1/5 (poids/volumes) dans une
solution saline
tamponnée au phosphate (1M) (PBS), pH 7,4. La suspension a été homogénéisée
dans un
stomacher pendant 120 secondes.
- Milieu nutritif de base: le milieu nutritif de base a été preparé à
partir de 2g/L de bouillon
20 de tryptone de soja, 2g/L d'extrait de levure, 0,1g/L de NaCI, 0,04g/L
de K2HPO4, 0,01g/L de
MgS03.7H20, 0,01g/L de CaC12.6H20, 2g/L NaHCO3, 0,5g/L de L¨cystine HCI, 2mL/L
de tween
80, 10p.L/L de vitamine K1, 0,05g/L d'hème, 0,05g/L de sels biliaires, 4mI/L
de résazarin (pH7)
- Fermentation en biofermenteur : Les biofermenteurs de 20mL de contenance
contenaient
18mL de milieu nutritif de base autoclave (121 C pendant 15 minutes) et versé
aseptiquement
25 dans les biofermenteurs stériles. Ce système a été laissé au repos toute
la nuit avec un bullage
d'azote sans oxygène à travers le milieu à un taux de 2mL/min. Le pH était
maintenu entre
6,7 et 6,9 en utilisant du HCI ou NaOH (0,5M). La température de chaque
biofermenteur était
contrôlée à 37 C et le contenu du récipient homogénéisé avec un mélangeur
magnétique
- un mélange de protéines prédigérées (0,35g) a été ajouté dans les
récipients avant
l'inoculation avec 2mL d'inocula fécal à TO. Les protéines prédigérées ont été
obtenues selon
le protocole de digestion gastro-intestinale adapté de celui de Versantvoort
et al (2005).
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- les échantillons ont été collectés avant la fermentation (TO) et après 48
heures de
fermentation (T48), et congelés à -80 C jusqu'aux analyses.
2/ Quantification de la kynurenine
- 50 IAL d'échantillons collectés et conservés à -80 C ont été mélangés
avec 20 IAL d'eau Milli-
Q contenant des standards internes.
- Le mélange a été mélangé et filtré à travers un filtre de seuil 5-kDa
pour retirer les
macromolécules.
- Les métabolites ont été détectés par analyses en électrophorèse
capillaire- spectrométrie
de masse à temps de vol (CE-TOFMS). La limite de détection des pics a été
déterminée sur la
base du ratio signal/bruit, S/N=3.
Aire relative du pic = (aire du pic d'un métabolite)/(aire du pic du standard
interne x quantité
d'échantillon).
3/ Quantification de Christensenella spp.
- L'ADN contenu dans les échantillons a été extrait en utilisant le kit
NucleoSpin 96 Soil de
Macherey-Nagel selon les instructions du fabricant.
- L'ADN extrait total a ensuite été fragmenté aléatoirement en fragments de
350 bp puis
utilisé pour construire une librairie en utilisant le kit NEBNext Ultra II par
New England Biolabs
selon les instructions du fabricant.
- La librairie a ensuite été séquencée en utilisant du séquençage paired-
end de 2 x 150 bp sur
.. une plateforme Illumina HiSeq.
- L'abondance des bactéries a été mesurée en créant un catalogue d'espèces
métagénomiques (MGS) à partir d'un catalogue de référence contenant 22M de
gènes. Ces
MGS ont ensuite été associées à un niveau taxonomique adapté. Dans le cas des
christensenella, celles-ci ont été détectées au niveau du genre et sont donc
référencées dans
cette expérience par Christensenella spp.
[0121] La quantité relative de kynurénine (par rapport à la quantité totale
mesurée) et
l'abondance relative de Christensenella spp. (par rapport à la quantité totale
mesurée) ont
été analysées et corrélées, obtenant une régression linéaire de R=-0,44
(n=18). Les résultats
sont présentés dans le Tableau 3.
[0122] [Tableau 3]
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Echantillons Abondance relative de Quantité relative de
Kynurénine (x10-5)
Christensenella spp. (x10-2)
V1 7,55 0
V2 3,18 0
V3 8,19 0
V4 2,63 3,46
V5 1,26 3,67
V6 2,87 0
V7 7,20 8,18
V8 2,91 4,58
V9 6,32 0
V10 1,21 13,00
V11 4,23 14,19
V12 1,49 8,36
V13 9,83 0
V14 4,12 2,87
V15 6,45 0
V16 2,02 5,30
V17 5,23 4,76
V18 7,57 2,92
[0123] 2. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries
christensenella in vitro
(IL-8)
[0124] L'objectif de cette étude est de démontrer l'effet anti-inflammatoire
in vitro de
bactéries selon l'exemple 4. La démonstration a été réalisée sur un des
marqueurs de
l'inflammation : l'interleukine 8 (IL-8).
[0125] L'étude est réalisée sur des cellules HT-29 obtenues comme suit :
Des cellules épithéliales du colon humain HT-29 (ATCC HTB-38) (LGC-Standars)
ont été
cultivées dans un milieu minimum essentiel de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)
(Sigma-
Aldrich) complété avec 10% (p/v) de sérum foetal bovin (FBS) thermo-activé
(GibcoBRL,
Eragny, France) et de pénicilline G/ streptomycine (5000 IU/mL, 5000 ug/m1)
(Sigma-Aldrich).
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Les cultures de cellules ont été incubées dans des flacons de culture
tissulaire de 25 crn2
(Nunc, Roskilde, Danemark) à 37 2C dans une atmosphère de CO2 à 5% (v/v)
jusqu'à
confluence.
[0126] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.
[0127] Les cultures simples et les co-cultures composées des combinaisons
entre les
souches énumérées sont préparées au temps 0. A 24h, les échantillons
bactériens sont
centrifugés pendant 10 minutes à 6000 tr/min. Les surnageants ainsi obtenus
sont
conservés à -80 C afin de poursuivre l'analyse des propriétés
immunomodulatrices in vitro.
[0128] Des tests anti-inflammatoires ont été effectués selon la procédure
décrite par
Kechaou et al., 2012 (Kechaou N et al. :Appl Environ Microbiol 2012, 79:1491-
1499).
Spécifiquement, 50000 cellules HeLa ou HT-29 par puits ont été semées dans des
plaques de
culture de 24 puits (Nunc). Vingt-quatre heures avant la mise en contact
bactérienne, le
milieu de culture a été remplacé par un milieu contenant 5 % de FBS. Les
expériences ont
été entreprises le 7e jour après l'ensemencement, alors que les cellules
étaient à la
confluence (1,83x106 cellules/puits). Vingt-quatre heures avant la co-culture
bactérienne
(jour 6), le milieu de culture a été remplacé par un milieu contenant 5% de
FBS inactivé à la
chaleur et 1% de glutamine. Le jour de la co-culture, 10 % de surnageant
bactérien ont été
ajoutés au DMEM dans un volume total de 500 ul. Les cellules ont été stimulées
simultanément avec du TNF-a humain (5 ng/ml ; Peprotech, Ni) pendant 6 h à 37
C dans
10% de CO2. Tous les échantillons ont été analysés en trois exemplaires. Après
la co-
incubation, les surnageants cellulaires ont été prélevés et stockés à -80 C
jusqu'à ce que
l'ELISA (Biolegend, San Diego, CA) effectue une analyse plus poussée des
concentrations
d'interleukine-8 (IL-8). Les expériences ont été faites au moins en trois
exemplaires.
[0129] La Figure 1 représente la production d'IL-8 dans des cellules HT-29
stimulées par du
TNF -a en présence de Christensenella minuta, Christensenella timonensis,
Akkermansia
muciniphila, Christensenella minuta + Akkermansia muciniphila et
CChristensenella
timonensis + Akkermansia muciniphila. Les résultats sont exprimés en IL-8
(pg/mL) et ont
été normalisés en utilisant comme valeur de référence l'IL-8 produit après la
co-incubation
avec le PBS comme témoin négatif. Les résultats ont été analysés à l'aide d'un
test de
Kruskal Wallis suivi d'un test de comparaison multiple de Dunns (*p< 0,05;
**p<0,01).
[0130] Le logiciel GraphPad (GraphPad Sofware, La Jolla, CA, USA) a été
utilisé pour l'analyse
statistique. Les résultats sont présentés sous forme de boîte à moustaches
(min à max). Des
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comparaisons ont été réalisées avec le test non paramétrique de Kruskal-Wallis
suivi d'une
comparaison multiple de Dunn. Une valeur p inférieure à 0,05 a été jugée
significative.
[0131] Les résultats sont décrits ci-après :
[0132] La souche de référence Akkermansia muciniphila DSM 22959 est bien
connue pour ses
propriétés immunomodulatrices et plus particulièrement pour ses effets anti-
inflammatoires
(Derrien M, Belzer C, de Vos WM. Microb Pathog. 2017 May; 106:171-181. doi:
10.1016/j.micpath.2016.02.005. Epub 2016 Feb 11). Pour déterminer si les
souches de C
Christensenella minuta DSM 22607 et Christensenella timonensis DSM 102800 sont
capables
de moduler la réponse immunitaire, les inventeurs ont testé in vitro les
propriétés
immunomodulatrices des surnageants des souches dans un modèle basé sur la
capacité à
bloquer la production de IL-8 (une cytokine pro-inflammatoire) induite par
stimulation TNF-a
dans des cellules épithéliales du colon HT-29.
[0133] Ainsi, les inventeurs ont observé que les deux souches sont capables de
bloquer la
production d'IL-8 de la même manière que notre témoin positif (Akkermansia
muciniphila
DSMZ 22959) (Figure 1).
[0134] Christensenella minuta DSM 22607 et Christensenella timonensis DSM
102800
augmentent les propriétés anti-inflammatoires d'Akkermansia muciniphila DSMZ
22959 in
vitro.
[0135] Afin de tester si les membres de Christensenella étaient capables
d'augmenter les
propriétés anti-inflammatoires d'autres membres du microbiote intestinal, des
co-cultures
avec Akkermansia muciniphila ont été réalisées. Comme le montre également la
Figure 1,
Christensenella minuta DSM 22607 et Christensenella timonensis DSM 102800 ont
pu
augmenter les propriétés anti-inflammatoires d'Akkermansia muciniphila DSMZ
22959 d'une
manière statistiquement significative.
[0136] 3. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries
christensenella in vitro
(IL-8).
[0137] L'objectif de cette étude est de démontrer l'effet anti-inflammatoire
in vitro de
bactéries selon l'invention. La démonstration a été réalisée sur un des
marqueurs de
l'inflammation : l'interleukine-8.
[0138] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.
[0139] Lorsque les cellules HT-29 sont à confluence (environ 7 jours après
ensemencement),
le milieu complet (DMEM Glutamax + 10% SVF) est alors retiré pour être
remplacé par du
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milieu à 5% de SVF (JO). A J+1, le milieu est enlevé. Deux milieux (DMEM
Glutamax + 5% SVF
+/- TNF-a) sont préparés. On ajoute alors 450u.L/puits d'un des deux milieux
puis 501.iL des
surnageants à tester. Après 6 heures de co-incubation, les surnageants sont
récupérés et
stockés à -80 C. Des dosages par ELISA de la chimiokine IL-8 sont alors
réalisés (ELISA MAX
5 Deluxe set Human IL-8 de Biolegend).
[0140] La Figure 2 représente le dosage de la chimiokine IL-8 sécrétée par les
cellules HT-29
(adénocarcinomes du côlon) dans un état inflammatoire induit par le TNF-a.
Différents
surnageants de bactéries (C. minuta 1, C. minuta 2, C. minuta 3, C. minuta 4
et DSMZ,
correspondant à la souche DSM22607) appartenant aux bactéries de l'espèce
Christensenella
10 minuta ont été testés afin d'évaluer leur capacité immunomodulatrice. Le
milieu de culture
bactérien (GAM) représente le contrôle permettant d'apprécier les effets des
surnageants.
L'expérience a été réalisée quatre fois en triplicat.
[0141] Toutes les souches de Christensenella minuta testées ont un effet
immunomodulateur
anti-inflammatoire (diminution de plus de 50% du niveau d'IL-8 sécrétée), ce
qui permet de
15 confirmer le potentiel anti-inflammatoire de Christensenella.
[0142] 4. Démonstration de l'effet de bactéries christensenella sur la
perméabilité de la
membrane épithéliale intestinale.
[0143] La Figure 3 représente la mesure de la résistance électrique trans-
épithéliale prise sur
cellules épithéliales Caco-2. Ces dernières en se différenciant établissent
des jonctions entre
20 elles (appelée les jonctions serrées) permettant de maintenir
l'intégrité de cette barrière
créée par les cellules, mimant la barrière intestinale présente dans notre
tube digestif.
[0144] L'ajout de la cytokine TNF -a (Tumor Necrosis Factor) perturbe ces
jonctions serrées,
et alors augmente la perméabilité membranaire, favorisant par exemple des
maladies
inflammatoires ou infectieuses et diminuant ainsi le ratio TEER (groupe
contrôle DMEM + TNF
25 -a). Le groupe contrôle "DMEM 2 représente les puits où seulement le
milieu de culture
cellulaire était présent, sans TNF -a ni bactérie.
[0145] La résistance électrique trans-épithéliale (TEER) est une méthode
permettant de
quantifier l'intégrité de la barrière d'un tissu épithélial en mesurant la
résistance électrique à
travers celui-ci. Les mesures TEER sont réalisées en plaçant des électrodes
aux deux pôles
30 d'une couche de cellules épithéliales ayant été cultivées sur une
membrane semi-perméable.
Les électrodes appliquent un courant alternatif permettant la mesure de la
résistance
électrique à travers la couche de cellules épithéliales.
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[0146] Le ratio TEER est obtenu par le calcul suivant :
TEER traitement t24/
Ratio TEER = I TEER traitement tO
TEER témoin t24/
1 TEER témoin tO
[0147] 7 jours après ensemencement de cellules Caco-2 (cellules épithéliales
intestinales)
dans des plaques Transwell, la TEER est mesurée à l'aide d'un automate (REMS).
Les valeurs
sont enregistrées et représentent notre valeur de départ (TO). Les cellules
sont alors co-
incubées en présence de bactéries (M01 1/40) pendant 3 heures, le temps que
celles-ci
adhèrent aux cellules. Puis les cellules sont challengées avec du TNF-a
induisant
une perturbation de la couche de cellules épithéliales et notamment au niveau
des jonctions
serrées. 24h (T24) après l'ajout des bactéries, la TEER est de nouveau
mesurée.
[0148] Cette figure nous montre que les bactéries Christensenella minuta
influent sur
l'intégrité de la barrière intestinale en améliorant la résistance trans-
épithéliale, indiquant un
potentiel effet sur les protéines de jonctions serrées et une diminution de la
perméabilité
intestinale. Les bactéries Christensenella minuta permettent donc de restaurer
la résistance
de la membrane épithéliale.
[0149] 5. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries
christensenella in vivo
[0150] L'objectif de cette étude est de démontrer l'effet anti-inflammatoire
in vivo sur souris,
de bactéries selon l'invention. La démonstration a été réalisée sur des
marqueurs majeurs de
l'inflammation, deux cytokines : IL6 (interleukine 6) et TNF-a (facteur de
nécrose tumorale-
alpha). L'étude a été réalisée en aveugle : les expérimentateurs ne
connaissaient pas les
.. traitements afin que leurs connaissances antérieures n'influencent en aucun
cas le résultat
de l'étude.
[0151] Le protocole opératoire est décrit en suivant.
- Des souris mâles C57BL/6 âgées de quatre semaines ont été achetées auprès
de Charles
River (St Germain sur l'Arbresle, France).
- Les souris ont eu une période d'acclimatation d'une semaine sur le régime à
base d'une
alimentation standard ( chow diet (SafeA04) ) avant de commencer l'étude.
- Le premier jour (DO), les animaux ont été soumis à un régime riche en
graisses ( Research
Diet D12451 45% kcal) et répartis aléatoirement en 2 groupes (n = 5 par
groupe), chacun
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recevant soit une solution de 150 u.L de Christensenella minuta (109 UFC/mL),
soit une
solution de contrôle constituée du milieu de culture utilisé pour la
croissance des bactéries
pendant 12 semaines. Les animaux ont eu à disposition de la nourriture et de
l'eau à volonté
pendant toute la durée de l'étude et ont été maintenus dans une pièce à
température (22,0
__ 2,0 C) et humidité (40-50%) contrôlés et sur un cycle de 12h de lumière
(8h-20h)/ 12h
d'obscurité.
- A la fin de l'expérimentation (D85), des derniers échantillons de sang ont
été prélevés sur
les animaux anesthésiés (par un mélange de kétamine/xylazine 80/10 mg / kg).
Les
échantillons de sang ont été recueillis dans des tubes à centrifuger
préremplis avec du sulfate
__ d'héparine (200 Ul / mL de sang). Le plasma a été séparé par centrifugation
(3500 tr/ min, 15
min, 4 C), collecté puis conservé à -80 C jusqu'à l'analyse.
- Les taux plasmatiques de cytokines IL6 et TNFa ont été déterminés à l'aide
du kit de dosage
ELISA Invitrogen Luminex Cytokine Mouse Magnetic 10-Plex et conformément
aux
instructions du fabricant. Les mesures ont été effectuées par VEBIO (Arcueil,
France).
__ [0152] Les résultats (présentés dans le Tableau 4) de dosage des cytokines
pro-
inflammatoires TNFa et IL6 après 85 jours de régime riche en graisse à 45%
(cal) montrent
qu'une bactérie de la famille des Christensenellacées limite fortement
l'inflammation.
[Tableau 4]
Moyenne Moyenne IL6 +/-
TNFa IL-6
TNFa +/- SEM
(pg/mL) (pg/mL)
Régime Souris SEM
C9- SM 62,48 44.61 +/-
11.40
HFD45% + C9- OG 17,00
C. minuta C15-SM 52,17
C15- OG 72,73
C15- OD 18,68
C12- SM 2,93 3.53 +/- 89,71 117,25 +/-
28.57
HFD45% + C12- OG 0.36 144,76
contrôle C12- OD 4,19 39,96
C14- SM 3,49 101,85
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C14- OG 1,87 209,96
[0153] 6. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries
christensenella in vivo
[0154] Dès leur arrivée, les animaux sont mis en cage (n=5 par cage) et
démarre une période
d'acclimatation afin de permettre aux souris de se remettre du transport et en
diminuant le
stress en s'habituant à ce nouvel environnement. Après une semaine, les
gavages de tous les
groupes (excepté le groupe contrôle 5-ASA, contrôle pharmacologique anti-
inflammatoire)
commencent, ainsi que le suivi du poids. Les souris contrôles (ctlr-vehicle et
DNBS-vehicle)
sont gavées avec 1501.iL de PBS/16%de glycérol. Les souris DNBS-
Christensenella minuta (C.
minuta) sont gavées avec 1501.iL de C. minuta DSM 22607 à 10' CFU/mL
resuspendues dans
du PBS/16% glycérol. Après deux semaines, l'inflammation est induite via un
produit
chimique, appelé le DNBS (dinitrobenzensulfate). Ce dernier est injecté
directement dans le
côlon de la souris par une sonde introduite au niveau du rectum. Le DNBS est
dissout dans de
l'éthanol à 30%, permettant de fragiliser la barrière intestinale pour
faciliter l'entrée du DNBS
dans le tissu, déclenchant ainsi le système immunitaire et donc
l'inflammation. Les gavages
continuent durant cette période, et ceux du groupe 5-ASA commencent le jour de
cette
injection à 150 L (solution de 5-ASA préparée tous les matins, à 2mg/souris
resuspendue dans
du PBS). L'euthanasie a lieu 3 jours après l'injection. La période dite de
recovery est donc
courte, mais nécessaire pour pouvoir observer des différences avec le groupe
contrôle DNBS.
[0155] La Figure 4 représente les différents paramètres évalués lors d'un
essai sur un modèle
inflammatoire induit par le DNBS.
[0156] En Figure 4A, le suivi de la perte de poids a été observé à partir du
jour de l'injection,
et donc la période de récupération (J1, J2 et J3) qui suit. Les inventeurs ont
ainsi observé un
effet sur la récupération qui semble être plus rapide après l'administration
du traitement.
[0157] Sur la figure 4B, les scores macroscopiques nous indiquent le niveau de
sévérité de la
maladie, indiquent que suite aux traitements avec DSM 22607, une diminution
significative
du score a été observée, de même qu'avec l'agent pharmacologique anti-
inflammatoire, le 5-
ASA (Acide 5-aminosalicylique utilisé comme comparatif contrôle positif).
[0158] Les figures 4C et 4D nous montrent le potentiel immunomodulateur de DSM
22607,
notamment en diminuant la présence de neutrophiles dans le côlon, évalué en
suivant
l'activité de la myélopéroxydase. De plus, l'augmentation de l'interleukine-10
dans la rate
(figure 4D) nous montre les effets anti-inflammatoires associés à
Christensenella minuta.
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[0159] 7. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries
christensenella in vivo
[0160] Trois jours après l'injection, les animaux sont euthanasiés. La
variation de poids des
souris est mesurée en prenant le poids des souris tous les jours. Lors du
sacrifice, le côlon est
ouvert et nettoyé afin réaliser le score macroscopique. Ce dernier est basé
sur la présence de
sang dans le tissu (hyperhémie), la présence d'ulcère, le transit intestinal
(par exemple si la
souris était constipée) et l'épaississement du côlon induit par le DNBS.
[0161] Un morceau de côlon est également récupéré afin de doser l'activité de
la
myélopéroxydase (MPO). Cette enzyme est présente dans les neutrophiles,
marqueurs de
l'inflammation. Elle participe également à la production d'espèces réactives
de l'oxygène
(ROS). Lors de ce test, après avoir pesé le côlon pour normaliser les
résultats en fonction de
la taille de l'échantillon, une réaction colorimétrique a lieu permettant de
doser l'activité de
cette enzyme.
[0162] La rate est également récupérée lors du sacrifice (organe lymphoïde
périphérique) et
les cellules de la réponse immunitaire innée et adaptatives sont stimulées
afin de doser les
cytokines sécrétées telles que l'IL-10, cytokines anti-inflammatoires.
[0163] La figure 5 représente les effets d'autres souches de Christensenella
minuta lors d'une
répétition de l'expérience présentée en Figure 4. Le design expérimental et
les méthodes
restent similaires. Cette expérience nous apprend que toutes les souches de
Christensenella
minuta testées ont la même efficacité quant à la réduction des scores
macroscopiques suite
à l'injection intra-rectale de DNBS. De même, toutes les souches testées
montrent un
effet anti-inflammatoire qui se traduit par une réduction de l'activité de la
MPO.
[0164] 8. Démonstration de l'effet anti-prolifératif de bactéries
christensenella
[0165] Les cellules HT-29 ont été ensemencées à une densité de 10000 cellules/
puits dans
un volume total de 100 pl en plaque 96-puits. Après 24h d'incubation, le
milieu de culture a
été retiré des cellules adhérentes et du nouveau milieu supplémenté avec 10%
de surnageant
en phase stationnaire de Christensenella minuta a été ajouté (DSMZ, C. minuta
1 et C. minuta
2 et en contrôle GAM (milieu de culture bactérien)). Chaque condition a été
faite en 4
réplicats. Les cellules ont été incubées pendant 48h ou 72h supplémentaires.
[0166] La prolifération cellulaire a été déterminée par l'utilisation du kit
CellTiter-Glo 2.0
assay (Promega). Les mesures ont été réalisées selon les instructions du
fabricant.
Brièvement, les plaques ont été retirées de l'incubateur et laissées
s'équilibrer à température
ambiante pendant 30 min et un volume égal de réactif CellTiter-Glo 2.0 a été
ajouté
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directement aux puits (100 u.1). Les plaques ont été mises sous agitation à
300 tr / min pendant
2 min en utilisant un agitateur rotatif, puis incubées à température ambiante
pendant 10 min.
Le mélange réactionnel a ensuite été transféré dans une plaque à 96 puits à
paroi blanche et
le signal luminescent a été mesuré à l'aide d'un lecteur de microplaques
(FLUOstar Omega,
5 BMG Labtech).
[0167] La Figure 6 représente l'influence de souches de Christensenella minuta
sur la
prolifération de cellules tumorales.
[0168] Les inventeurs ont observé l'influence de souches de Christensenella
minuta sur la
prolifération de cellules tumorales, nous avons analysé l'effet de ces
surnageants par
10 traitement d'une lignée cellulaire humaine d'adénocarcinome du côlon, la
lignée HT-29.
L'effet des surnageants de Christensenella minuta sur la prolifération des
cellules HT-29 a été
évalué après 48 et 72h. Les surnageants des souches DSM22607 (DSMZ), C. minuta
1 et C.
minuta 2 réduisent significativement la prolifération des cellules traitées
pendant 48h et 72h,
par rapport au contrôle "GAM", correspondant aux cellules traitées avec le
milieu de
15 culture bactérien (Test statistique = Dunnett où le groupe contrôle est
le GAM; ****GAM vs
DSMZ p<0.0001, *GAM vs C. minuta 1 p=0.0140, **GAM vs C. minuta 2 p = 0.0027 à
48h and
****p<0.0001 à 72h). L'inhibiteur VIII d'Akt est utilisé comme contrôle du
blocage de la
prolifération cellulaire.
[0169] Cette expérience permet de conclure que les surnageants des différentes
souches de
20 Christensenella minuta testés induisent une diminution de la
prolifération de la lignée
tumorale HT-29, et donc un rôle de ces souches dans l'inhibition du
développement tumoral.
