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UTILISATION D'HÉMOGLOBINE D'ANNÉLIDES IN VITRO
La présente invention concerne l'utilisation d'une molécule choisie parmi une
globine
d'Annélides, un protomère de globine d'Annélides et une hémoglobine
extracellulaire
d'Annélides, pour son usage in vitro. En particulier, la présente invention se
rapporte à un
procédé d'analyse d'un échantillon de cellules d'un patient ou d'échantillon
bactérien ou
d'un organoïde, comprenant :
une première étape de mélange de l'échantillon de cellules du patient, de
l'échantillon
bactérien ou de l'organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une
globine
d'Annélides, un protomère de globine d'Annélides et une hémoglobine
extracellulaire
d'Annélides,
optionnellement, une seconde étape de préparation du mélange obtenu à la
première
étape, et
une troisième étape d'analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde
étape.
Les examens de biologie médicale sont réalisés pour le dépistage et le suivi
des
maladies. Un examen biologique commence par le prélèvement d'un échantillon
biologique chez un patient. Cet échantillon est ensuite analysé pour
déterminer la valeur
normale ou le déséquilibre d'un paramètre biologique, et ainsi identifier la
nature, la cause
ou le pronostic d'une maladie.
Parmi les différents échantillons biologiques utilisables, les échantillons
comprenant des
cellules d'un patient sont particulièrement délicats. En effet, le maintien en
bon état et/ou
la survie des cellules prélevées sont cruciaux pour la pertinence et la
sensibilité des
résultats qui en découlent.
Les cellules constituent un matériel biologique sensible ; des conditions de
culture ou de
stockage inadaptées peuvent induire leur mort, ce qui peut avoir pour
conséquence de
fausser les résultats des analyses, voire même de rendre leurs analyses
impossibles.
Pourtant, les techniques actuelles de biologie médicale ne sont pas
nécessairement
appropriées pour maintenir une suivie optimale des cellules.
Il est d'une part important d'obtenir des échantillons biologiques de bonne
qualité,
prélevés et préparés selon des standards de qualité (voir la publication Ziv
et al, The
Importance of Biopsy in the Era of Molecular Medicine, Cancer J, 2016 ; 22(6)
:418-422).
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D'autre part, l'utilisation de certains solvants, en particulier les solvants
organiques
volatils, pose des problèmes de santé et de sécurité : par exemple, le
formaldéhyde (ou
formol) est un composé cancérigène et fortement volatil. Lors de la
préparation d'un
échantillon biologique en vue de son analyse, ce solvant est à manipuler avec
précaution.
Ainsi, il existe un besoin pour une méthode permettant de maintenir les
cellules prélevées
d'un patient vivantes, le plus longtemps possible. Cela permettrait
d'effectuer des
analyses de façon fiable, reproductible et sensible. En outre, cela
permettrait de lire et/ou
interpréter les résultats avec précision et dans des conditions optimales, car
proches du
contexte in vivo. Enfin, il existe un besoin pour une méthode qui limite ou
n'utilise pas de
solvant organique volatil, et/ou qui substitue ce dernier, afin d'obtenir un
environnement
d'expérimentation plus sûr.
Par ailleurs, dans le domaine des tests in vitro, il est très courant
d'utiliser des organoïdes
comme matériel biologique mimant l'anatomie d'un organe. De telles structures
ont des
durées de vie limitées, et les mesures ne sont pas forcément effectuées dans
de bonnes
conditions.
Il existe donc un besoin pour une méthode permettant de préserver ce type de
matériel
biologique, afin d'assurer des mesures fiables et reproductibles.
Enfin, dans le cas des bactéries, il est très courant d'utiliser des cultures
sur gélose pour
étudier ces micro-organismes, par exemple pour déterminer le niveau
d'efficacité de
nouveaux antibiotiques, ou bien encore pour identifier une souche bactérienne.
De telles
cultures sur gélose sont effectuées typiquement en présence de sang, par
exemple de
sang de mouton (gélose au sang ou Columbia au sang), en quantité relativement
importante (de l'ordre de 50 mL de sang par litre de gélose). En outre, du
fait de la
présence de sang, de telles cultures ne peuvent pas subir d'étape de
congélation.
Il existe donc un besoin pour une méthode d'étude des bactéries, qui soit plus
économe
en matières premières, et qui permette une congélation des échantillons.
La présente invention permet de répondre à ces attentes.
Elle a en effet pour objet un procédé d'analyse d'un échantillon de cellules
d'un patient,
de préférence humain, d'un échantillon bactérien ou d'un organoïde, comprenant
:
une première étape de mélange de l'échantillon de cellules du patient, de
l'échantillon
bactérien ou de l'organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une
globine
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d'Annélides, un protomère de globine d'Annélides et une hémoglobine
extracellulaire
d'Annélides,
optionnellennent, une seconde étape de préparation du mélange obtenu à la
première
étape, et
une troisième étape d'analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde
étape.
Un tel procédé permet, grâce à la présence d'au moins une molécule choisie
parmi une
globine d'Annélides, un protomère de globine d'Annélides et une hémoglobine
extracellulaire d'Annélides, de maintenir l'échantillon de cellules ou
bactérien ou
l'organoïde en vie dans de bonnes conditions.
-na En outre, l'échantillon présente une durée de vie significativement
améliorée. Cette durée
de vie est bien entendu dépendante de la taille de l'échantillon, et du volume
dans lequel
il est immergé.
En ce qui concerne l'organoïde, sa durée de vie est également améliorée, et
permet des
mesures fiables et reproductibles.
Le procédé selon l'invention présente l'avantage de pouvoir être mis en oeuvre
depuis le
bloc opératoire où l'échantillon d'un patient, de préférence une biopsie, est
prélevé,
jusqu'au laboratoire d'analyses : en effet, dès le prélèvement, l'échantillon
du patient est
mélangé avec au moins une molécule choisie parmi une globine d'Annélides, un
protomère de globine d'Annélides et une hémoglobine extracellulaire
d'Annélides, puis il
subit les étapes subséquentes du procédé de manière inhérente (par exemple
hotte
aspirante dans le cas d'utilisation de solvant organique volatil).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une molécule
choisie parmi
une globine d'Annélides, un protomère de globine d'Annélides et une
hémoglobine
extracellulaire d'Annélides, pour la conservation d'au moins un échantillon de
cellules d'un
patient, de préférence humain, d'un échantillon bactérien ou d'un organoïde.
La molécule selon l'invention est choisie parmi une globine d'Annélides, un
protomère de
globine d'Annélides et une hémoglobine extracellulaire d'Annélides.
Cette molécule est un transporteur d'oxygène. Par transporteur d'oxygène ,
on entend
une molécule capable de transporter l'oxygène, de façon réversible, depuis
l'environnement jusqu'aux cellules, tissus ou organes cibles.
L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est présente chez les trois classes
d'Annélides:
les Polychètes, les Oligochètes et les Achètes. On parle d'hémoglobine
extracellulaire car
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elle est naturellement non contenue dans une cellule, et peut donc circuler
librement dans
le système sanguin sans modification chimique pour la stabiliser ou la rendre
fonctionnelle.
L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est un biopolymère géant de poids
moléculaire
compris entre 2000 et 4000 kDa, constitué d'environ 200 chaînes
polypeptidiques
comprises entre 4 et 12 types différents que l'on regroupe généralement en
deux
catégories.
La première catégorie, comptant 144 à 192 éléments, regroupe les chaînes
polypeptidiques dites "fonctionnelles" qui portent un site actif de type hème,
et sont
capables de lier réversiblement l'oxygène ; ce sont des chaînes de type
globine (huit
types au total pour l'hémoglobine d'Arenicola marina : ai, a2, bl , b2, b3, c,
dl et d2), dont
les masses sont comprises entre 15 et 18 kDa. Elles sont très similaires aux
chaînes de
type a et g de vertébrés.
La deuxième catégorie, comptant 36 à 42 éléments, regroupe les chaînes
polypeptidiques
dites de structure ou linkers possédant peu ou pas de site actif mais
permettant
l'assemblage des sous-unités appelées douzièmes ou protomères. On compte deux
types
de linkers, Li et L2.
Chaque molécule d'hémoglobine est constituée de deux hexagones superposés que
l'on
a nommés bicouche hexagonale (hexagonal bilayer) et chaque hexagone est lui-
même
formé par l'assemblage de six sous-unités (dodécannère ou protonnère) en forme
de
goutte d'eau. La molécule native est formée de douze de ces sous-unités
(dodécamère ou
protomère). Chaque sous-unité a une masse moléculaire d'environ 250 kDa, et
constitue
l'unité fonctionnelle de la molécule native.
De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi les
hémoglobines extracellulaires d'Annélides Polychètes et les hémoglobines
extracellulaires
d'Annélides Oligochètes. De préférence, l'hémoglobine extracellulaire
d'Annélides est
choisie parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille des Lumbricidae,
les
hémoglobines extracellulaires de la famille des Arenicolidae et les
hémoglobines
extracellulaires de la famille des Nereididae. Encore plus préférentiellement,
l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi l'hémoglobine
extracellulaire
de Lumbricus terrestris, l'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola sp et
l'hémoglobine
extracellulaire de Nereis sp, plus préférentiellement l'hémoglobine
extracellulaire
d'Arenicoia marina ou de Nereis virens. L'arénicole Arenicola marina est un
ver annélide
polychète vivant essentiellement dans le sable.
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Selon l'invention, le protomère de globine de l'hémoglobine extracellulaire
d'Annélides
constitue l'unité fonctionnelle de l'hémoglobine native, comme indiqué ci-
dessus.
Enfin, la chaîne de globine de l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides peut
notamment
être choisie parmi les chaînes de globine de type Ax et/ou Bx d'hémoglobine
5 extracellulaire d'Annélides.
L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protomères de globine et/ou ses
globines
ne nécessitent pas de cofacteur pour fonctionner, contrairement à
l'hémoglobine de
mammifère, notamment humaine. Enfin, l'hémoglobine extracellulaire
d'Annélides, ses
protonnères de globine et/ou ses globines ne possédant pas de typage sanguin,
ils
permettent d'éviter tout problème de réaction immunologique ou allergique.
L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protonnères de globine et/ou
ses globines
présentent une activité superoxide dismutase (SOD) intrinsèque. Par
conséquent, cette
activité anti-oxydante intrinsèque ne nécessite aucun antioxydant pour
fonctionner,
contrairement à l'utilisation d'une hémoglobine de mammifères pour laquelle
les
molécules antioxydantes sont contenues à l'intérieur du globule rouge et ne
sont pas liées
à l'hémoglobine.
L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protonnères de globine et/ou
ses globines
peuvent être natifs ou recombinants.
De préférence, l'hémoglobine extracellulaire est celle d'Arenicola marina.
Le procédé selon l'invention comprend une première étape de mélange de
l'échantillon de
cellules du patient, de préférence humain, de l'échantillon bactérien ou de
l'organoïde
avec au moins une molécule choisie parmi une globine d'Annélides, un
protornère de
globine d'Annélides et une hémoglobine extracellulaire d'Annélides.
L'échantillon de cellules du patient est tout échantillon biologique dudit
patient
comprenant des cellules. L'échantillon de cellules peut être un ensemble de
cellules
isolées, un fragment de tissu biologique, ou bien encore un organe ou un
fragment
d'organe. Les cellules peuvent être eucaryotes ou procaryotes, de préférence
eucaryotes,
de préférence de mammifère, de préférence humaines.
Cet échantillon est de préférence un ensemble de cellules isolées (tel que par
exemple un
échantillon sanguin), un fragment de tissu biologique, ou bien encore un
fragment
d'organe.
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Cet échantillon est de préférence un échantillon sanguin, une biopsie, un
frottis ou une
résection d'organe.
Un échantillon sanguin est de préférence un échantillon comprenant au moins
des
hématies.
Une biopsie est un prélèvement d'un fragment d'un organe ou d'un tissu,
généralement
effectué au moyen d'une aiguille ou d'un trocart.
Un frottis est un prélèvement effectué par grattage, généralement au moyen
d'un
écouvillon, d'une petite brosse ou d'une petite spatule.
Une résection d'organe, appelée également ablation, est un retrait par
chirurgie d'une
partie d'organe ou d'un tissu, généralement pathologique.
Le patient peut être tout animal vertébré ou invertébré ; de préférence il
s'agit d'un
mammifère, de préférence d'un humain.
De préférence, l'échantillon de cellules d'un patient, de préférence humain,
est un
échantillon d'une partie d'organe ou de tissu pathologique, notamment affecté
par un
cancer. Ainsi, de préférence, l'échantillon de cellules d'un patient est un
échantillon d'une
partie d'organe ou de tissu tumoral_
L'échantillon bactérien est tout échantillon de bactéries, comprenant une
seule souche
bactérienne ou un mélange de souches. Les bactéries peuvent être connues ou
non. De
préférence, il s'agit de bactéries Gram+, de préférence de bactéries de la
classe Bacilli,
de préférence du genre Streptococcus ou Staphylococcus.
Selon une alternative, le procédé selon l'invention peut également comprendre
une
première étape de mélange de l'organoïde avec au moins une molécule choisie
parmi une
globine d'Annélides, un protomère de globine d'Annélides et une hémoglobine
extracellulaire d'Annélides.
Par organoïde , on entend une structure tridimensionnelle qui reproduit in
vitro la
micro-anatomie d'un organe. Un organoïde correspond donc à un modèle d'organe
; il est
préparé hors de tout organisme vivant. Il est généralement obtenu par culture
en
laboratoire d'une ou plusieurs cellules précurseurs d'un tissu, telles que des
cellules
souches (type cellules souches embryonnaires ou pluripotentes induites). Ces
cellules
peuvent s'auto-organiser en trois dimensions, dans un milieu nutritif adéquat
comprenant
des fadeurs de croissance et de différentiation, pour former le mini-organe.
De
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préférence, les cellules s'auto-organisent dans un environnement
tridimensionnel adapté,
tel qu'un hydrogel ou une matrice poreuse.
L'organoïde utilisé dans la présente invention peut être n'importe quel
organoïde utilisé en
test in vitro, par exemple une peau reconstruite, un organoïde cérébral, un
organoïde
tumoral, un organoïde intestinal ou un organoïde rénal.
Un organoïde est donc distinct des cellules classiques en culture (par exemple
en boîtes
de Pétri) ; tandis que l'organoïde est forcément en trois dimensions (3D), les
cellules en
culture ne sont qu'en 20.
Typiquement, les organoïdes peuvent être utilisés pour tester la toxicité ou
l'efficacité de
potentiels médicaments, ou bien pour tester l'innocuité de compositions
cosmétiques.
Selon l'invention, de préférence, la globine, le protomère de globine ou
l'hémoglobine
extracellulaire d'Annélides utilisé dans la première étape peut être formulée
dans une
solution tampon, un milieu de culture cellulaire ou une solution de
préservation d'organe
ou de greffon.
La solution tampon créée un environnement salin adéquat pour l'hémoglobine,
ses
protornères et ses globines, et permet ainsi le maintien de la structure
quaternaire, et
donc de la fonctionnalité de cette molécule. Grâce à la solution tampon,
l'hémoglobine,
ses protonnères et ses globines sont capables d'assurer leur fonction
d'oxygénation.
La solution tampon selon l'invention est de préférence une solution aqueuse
comprenant
des sels, de préférence des ions chlorure, sodium, calcium, magnésium et
potassium, et
confère à la composition selon l'invention un pH compris entre 5 et 9, de
préférence entre
5.5 et 8.5, de préférence entre 6.5 et 7.6 ; sa formulation est similaire à
celle d'un liquide
physiologiquement injectable. Dans ces conditions, l'hémoglobine
extracellulaire
d'Annélides, ses protomères de globine et ses globines restent fonctionnels.
Dans la présente description, le pH s'entend à température ambiante (25 C),
sauf
mention contraire. De préférence, la solution tampon est une solution aqueuse
comprenant du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, du chlorure de
magnésium,
du chlorure de potassium, ainsi que du sodium gluconate et du sodium acétate,
et a un
pH compris entre 6.5 et 7.6, de préférence égal à 7,1 0,5, de préférence
d'environ 7.35.
Plus préférentiellement, la solution tampon est une solution aqueuse
comprenant 90 mM
de NaCI, 23 Mm de Na-gluconate, 2,5 mM de CaCl2, 27 mM de Na-acétate, 1,5 mM
de
MgCl2, 5 nriM de KC1, et a un pH de 7,1 0,5, pouvant contenir entre 0 et 100
mM
d'antioxydant de type acide ascorbique et/ou glutathion réduit.
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De préférence, la globine, le protomère de globine ou l'hémoglobine
extracellulaire
d'Annélides utilisée dans la première étape peut également être formulée dans
une
solution de préservation d'organe ou de greffon, ou un milieu de culture
cellulaire.
Par exemple, la solution de conservation d'organes peut être une solution
aqueuse ayant
un pH compris entre 6.5 et 7.5, comprenant des sels, de préférence des ions
chlorure,
sulfate, sodium, calcium, magnésium et potassium ; des sucres, de préférence
le
mannitol, le raffinose, le saccharose, le glucose, le fructose, le
lactobionate (qui est un
imperméant), ou le gluconate ; des antioxydants, de préférence le glutathion ;
des agents
actifs, de préférence des inhibiteurs de xanthine oxydase tel que
l'allopurinol, des
lactates, des acides aminés tel que l'histidine, l'acide glutamique (ou
glutamate), le
tryptophane ; et éventuellement des colloïdes tels que de l'hydroxyéthyl
amidon, du
polyéthylène glycol ou du dextran.
Les milieux de culture cellulaire sont disponibles commercialement et très
variés. Par
exemple, des milieux disponibles chez Invitrogen, sans être limités à ceux-ci
sont les
milieux suivants : D-MEM, D-MEM/F-12, MEM, RPMI 1640, milieu 199 ou tout
milieu
analogue.
Typiquement, l'hémoglobine, ses protonnères ou ses globines est utilisée dans
une
concentration allant de 0,03 g/L à 40 g/L, de préférence de 0,05 g/L à 35 g/L,
de
préférence de 0,1 g/L à 30 g/L, de préférence de 0,5 g/L à 25 g/L, de
préférence de 1 g/L
à 20 g/L. Elle peut être utilisée dans une concentration allant de 1,5 g/L à
20 g/L.
De préférence, l'hémoglobine, ses protomères ou ses globines est utilisée dans
une
concentration allant de 0,03 g/L à 10 g/L, de préférence de 0,08 g/L à 10 g/L,
de
préférence de 0,1 g/L à 5 g/L.
La température de mise en oeuvre du procédé peut être comprise entre 0 C et 40
C, de
préférence entre 2 C et 39 C. De préférence, cette température est d'environ 4
C;
alternativement de préférence, cette température est d'environ 37 C.
De préférence, la première étape du procédé selon l'invention est effectuée
dans un
récipient comprenant de la gélose. La gélose est une substance nutritive
favorisant ou
inhibant (selon sa composition) la prolifération et le développement des
bactéries.
Typiquement, la gélose comprend au moins un mélange de peptones, de l'agar-
agar et du
chlorure de sodium. De préférence, la gélose comprend de 5 à 35 g/L, de
préférence de 7
à 30 g/L de peptones. De préférence, la gélose comprend de 5 à 30 g/L, de
préférence de
7 à 25 g/L, de préférence de 10 à 20g/L d'agar-agar. L'agar-agar permet
d'obtenir une
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composition solide (gel solide). De préférence, la gélose comprend de 3 à 20
g/L, de
préférence de 4 à 10 g/L de chlorure de sodium.
Selon les indications, la gélose peut comprendre d'autres ingrédients, par
exemple des
sels, de l'amidon, ou tout autre ingrédient classique.
De préférence, la gélose comprend au moins une molécule choisie parmi une
globine
d'Annélides, un protomère de globine d'Annélides et une hémoglobine
extracellulaire
d'Annélides.
Classiquement, on utilise une gélose au sang, qui comprend environ 10g/L
d'hémoglobine
de mammifère, par exemple d'hémoglobine de mouton.
Dans la présente invention, de préférence, lorsque la gélose comprend au moins
une
molécule choisie parmi une globine d'Annélides, un protomère de globine
d'Annélides et
une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ladite hémoglobine, ses
protomères ou ses
globines est utilisée dans une concentration allant de 0,03 g/L à 5 g/L, de
préférence de
0,08 g/L à 3 g/L, de préférence de 0,1 g/L à 2 g/L.
De préférence, la première étape comprend le dépôt de l'échantillon de
cellules du patient
humain, de l'échantillon bactérien ou de l'organoïde dans un récipient
comprenant de la
gélose et au moins une molécule choisie parmi une globine d'Annélides, un
protomère de
globine d'Annélides et une hémoglobine extracellulaire d'Annélides.
Ainsi, selon cette première étape, l'échantillon ou l'organoïde est déposé
dans le récipient
de gélose comprenant au moins une molécule choisie parmi une globine
d'Annélides, un
protomère de globine d'Annélides et une hémoglobine extracellulaire
d'Annélides. Le
récipient obtenu peut être congelé en attendant de subir des autres étapes du
procédé,
sans entacher la fiabilité des résultats obtenus.
A la fin de la première étape du procédé, on obtient ainsi un mélange
d'hémoglobine, de
ses protomères ou de ses globines et d'échantillon de cellules, d'échantillon
bactérien ou
d'organoïde.
De façon optionnelle, une seconde étape est présente dans le procédé : cette
seconde
étape comprend la préparation du mélange obtenu à la première étape.
De préférence, cette seconde étape comprend au moins la coloration et/ou
l'amincissement et/ou l'inclusion dans la paraffine ou une résine époxy, d'au
moins
certaines cellules et/ou d'au moins certains organites cellulaires de
l'échantillon.
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Par organite cellulaire , on entend un compartiment différencié contenu
dans les
cellules eucaryotes qui a une fonction donnée. De préférence, l'organite
cellulaire est
choisi parmi le noyau, les lysosomes, les peroxysomes et les mitochondries.
5 Selon une première alternative, la seconde étape comprend directement
au moins la
coloration et/ou l'amincissement et/ou l'inclusion dans la paraffine ou une
résine époxy,
d'au moins certaines cellules de l'échantillon de patient ou bactérien.
Selon une seconde alternative, la seconde étape comprend l'isolation d'au
moins certains
organites cellulaires de l'échantillon de patient, puis leur coloration et/ou
leur
10 amincissement et/ou leur inclusion dans la paraffine ou une résine
époxy. Par exemple, la
seconde étape peut comprendre l'isolation des mitochondries de l'échantillon
de cellules
du patient, puis leur coloration.
Les tissus biologiques présentent en eux-mêmes très peu de contraste en
imagerie.
Typiquement, la coloration est utilisée aussi bien pour augmenter le contraste
que pour
mettre en valeur une structure particulière.
La coloration peut être réalisée à l'aide d'un colorant classique, notamment
un colorant
acide ou basique. Un tel colorant peut être choisi parmi le carmin,
l'hématoxyline, l'éosine,
l'acide picrique, la fuschine acide, la fuschine basique, l'orange G,
l'érythrosine, la
safranine, la coloration PAS (Periodic Acid Schiff), le bleu de méthylène et
la thionine.
Le colorant peut également être la Rhodamine 123. Ce colorant est notamment
utilisé
pour la coloration des mitochondries.
L'amincissement de l'échantillon peut être effectué par tranchage, notamment à
l'aide
d'un microtome, pour réaliser des coupes adaptées.
Cet amincissement est notamment effectué après inclusion d'au moins certaines
cellules
de l'échantillon dans la paraffine ou une résine époxy.
Typiquement, le mélange obtenu à la première étape est mélangé avec de la
paraffine à
l'état liquide, ou avec une résine époxy, puis le mélange résultant est séché.
La paraffine
présente l'avantage d'être liquide à une température supérieure à 56 oc et de
se solidifier
lorsque la température passe en dessous de cette limite. On obtient finalement
des blocs
de paraffine solide, ou de résine époxy polymérisée, contenant les cellules de
l'échantillon. Ces blocs peuvent alors être débités à l'aide d'un microtome,
pour obtenir
des coupes fines d'échantillon de quelques micromètres d'épaisseur. Ces coupes
peuvent
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subir ensuite une coloration, de façon à identifier certains éléments de façon
plus ou
moins spécifique, avant d'être placées sur une lame de microscope pour
analyse.
De préférence, l'échantillon de cellules du patient obtenu à la première ou la
seconde
étape est conservé pendant une durée de quelques heures, par exemple au moins
24
heures, de préférence au moins 50 heures, de préférence au moins 100 heures à
une
température comprise entre 0 C et 10 C, par exemple 4 C; ou bien à une
température
comprise entre 15 C et 25 C, telle que la température ambiante.
Lorsqu'on utilise un organoïde, la seconde étape du procédé selon l'invention,
optionnelle,
comprend la préparation du mélange obtenu à la première étape. Cette
préparation peut
alors comprendre la mise en contact d'un composé avec le mélange obtenu à la
première
étape.
Le composé peut être toute molécule potentiellement active, ou bien une
composition
cosmétique. La molécule peut être chimique ou biologique.
Le procédé vise alors à déterminer les effets éventuels du composé sur
l'organoïde.
La seconde étape peut comprendre au moins la coloration d'au moins certaines
cellules
de l'organoïde.
Enfin, le procédé selon l'invention comprend une troisième étape d'analyse du
mélange
obtenu à la première ou à la seconde étape.
Notamment, la troisième étape comprend l'analyse par histologie, par
microscopie, par
détection immunologique ou par biologie moléculaire.
L'histologie est une technique d'analyse biologique comprenant
l'identification d'un
ensemble de cellules données par des moyens chimiques, enzymatiques, par
radiographie ou par immunologie.
De préférence, l'histologie est choisie parmi l'histochimie, l'histochimie
enzymatique,
l'historadiographie et l'immunohistochimie.
On parle d'histochimie quand au moins certaines cellules ou organites de
l'échantillon ou
de l'organoïde sont colorées grâce à des réactions chimiques connues entre des
réactifs
de laboratoire et des composants des cellules étudiées (de type cytoplasme,
noyau, ou
présence de glucides).
Ainsi, l'analyse par histochimie est effectuée lorsque la seconde étape
comprend au
moins la coloration de l'échantillon ou de l'organoïde.
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L'histochimie enzymatique est une méthode histologique qui permet la
détermination de
l'activité d'une ou plusieurs enzymes dans un tissu donné. La technique
histoenzymologique ne révèle pas les enzymes en tant que telles, mais leur
présence par
le produit obtenu au cours de leur action sur un substrat spécifique de
l'enzyme en
question.
L'historadiographie consiste à faire des coupes minces du tissu à observer et
à leur
inclusion dans de la paraffine (i.e. seconde étape d'amincissement et
d'inclusion de
l'échantillon), puis à les observer en utilisant des radiations.
Enfin, l'immunohistochimie consiste à utiliser des anticorps pour se fixer à
une molécule
présente dans au moins certaines cellules de l'échantillon ou de l'organoïde.
Ces
anticorps sont spécifiques de la molécule à identifier et donc de l'analyse à
effectuer. Les
complexes anticorps-antigènes (présents dans l'échantillon) sont ensuite
révélés en
utilisant un composé chimique.
De préférence, on utilise des anticorps ciblant des antigènes tumoraux.
La microscopie peut être une microscopie optique ou une microscopie
électronique à
balayage.
La détection immunologique repose sur le même principe que
l'immunohistochimie, et
utilise des anticorps pour se fixer à une molécule présente dans au moins
certaines
cellules de l'échantillon ou de l'organoïde.
De préférence, la détection immunologique comprend l'utilisation d'au moins un
anticorps
dirigé contre un antigène cancéreux ou un antigène inflammatoire.
L'analyse par biologie moléculaire peut comprendre notamment l'utilisation de
PCR, ou
encore la détection d'un ratio d'acides nucléiques tel que le ratio ADN/ARN,
notamment
par spectrophotométrie. Un ratio ADN/ARN élevé indique une quantité d'ARN
faible, donc
une vie des cellules faible. Le mélange de l'échantillon de cellules du
patient ou de
l'organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d'Annélides,
un
protomère de globine d'Annélides et une hémoglobine extracellulaire
d'Annélides selon
l'invention, permet notamment de protéger les ARN cellulaires, et d'obtenir
ainsi des
résultats plus fiables et reproductibles.
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Lorsqu'on utilise un organoïde, la troisième étape du procédé selon
l'invention peut
comprendre l'analyse par histologie, par détection immunologique ou par
biologie
moléculaire, notamment comme indiqué ci-avant.
La présente invention a également pour objet un récipient comprenant de la
gélose et au
moins une molécule choisie parmi une globine d'Annélides, un protomère de
globine
d'Annélides et une hémoglobine extracellulaire d'Annélides.
La gélose comprend de préférence au moins un mélange de peptones, de l'agar-
agar et
du chlorure de sodium. De préférence, la gélose comprend de 5 à 35 g/L, de
préférence
de 7 à 30 g/L de peptones. De préférence, la gélose comprend de 5 à 30 g/L, de
préférence de 7 à 25 g/L, de préférence de 10 à 20g/L d'agar-agar. De
préférence, la
gélose comprend de 3 à 20 g/L, de préférence de 4 à 10 g/L de chlorure de
sodium.
La gélose peut également comprendre d'autres ingrédients, par exemple des
sels, de
l'amidon, ou tout autre ingrédient classique.
De préférence, l'hémoglobine, ses protomères ou ses globines est utilisée dans
une
concentration allant de 0,03 g/L à 5 g/L, de préférence de 0,08 g/L à 3 g/L,
de préférence
de 0,1 g/L à 2 g/L.
Ce récipient peut être utilisé pour tout test in vitro utilisant un
échantillon biologique, par
exemple un échantillon de patient ou un échantillon bactérien. Il peut être
congelé sans
impacter la fiabilité des résultats obtenus.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants, nullement
limitatifs.
Exemple 1: Etude de préservation de différents organes de rat par analyse des
mitochondries
Le but de l'étude est d'identifier une condition optimale de conservation des
organes pour
le foie, le coeur et le cerveau de rat.
3o Les organes ont été conservés à 4 C dans une solution d'HEMO2Lifen avec
modulation
de la période de conservation et de la concentration en HEMO2Lifee.
L'efficacité de la
conservation a été évaluée par la caractérisation de l'intégrité et de la
fonctionnalité
mitochondriales.
Le principal challenge de celle étude est d'éviter les préparations
extemporanées de
mitochondries en optimisant la conservation des échantillons pendant le
transport.
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HEMO2Lifee est une composition comprenant l'hémoglobine extracellulaire d'
Arenicola
marina, avec différents excipients.
Matériels et Méthodes
Organes
Les organes utilisés sont le foie, le coeur et le cerveau de rats Wistar mâles
de 250 g
(référence: WI (Han), Charles River).
Conditions de conservation
Durée:
Chaque organe est mélangé avec HEMO2Lifee (première étape du procédé selon
l'invention).
Une période de conservation de 24 heures a été définie comme point de
référence_ Selon
les résultats obtenus à ce temps, des points temporels plus longs ou plus
courts ont été
évalués avec une modulation de la concentration en HEMO2Lifea En cas de bonne
conservation à 24 heures (foie), un délai plus long a été testé. En cas de
mauvaise
conservation à 24 heures (coeur et cerveau), une période plus courte a été
testée_
Solution HEMO2Lifee:
HEMO2Life0 (solution-mère à 49 g/L) a été diluée dans du tampon de
stabilisation à 20
g/L. La solution a été diluée dans du tampon de stabilisation pour obtenir une
concentration finale de 15, 10 ou 5 g/L dans 8 mL (volume final).
Récipient:
Les récipients sont des tubes à fond plat de 20 ml (récipient PP, Dominique
Dutscher). Le
volume de HEMO2Life représente 40% du volume total du tube (8 mL).
Agitation:
Les récipients ont été placés sur un appareil d'agitation (IKA HS 260 basic,
VWR) à la
vitesse de 90 allers-retours/minute.
Température:
Les échantillons ont été conservés dans une chambre froide à 4 C.
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Les mitochondries ont été isolées des organes par congélation, broyage, puis
centrifugation en gradient de densité (seconde étape du procédé selon
l'invention), puis
incubées à 37 C pendant 45 minutes. L'intégrité des mitochondries est évaluée
par
absence de gonflement spontané et par le potentiel transmembranaire, et leur
5 fonctionnalité est évaluée par l'indice de contrôle respiratoire après
incubation.
Paramètres
Gonflement et potentiel transmembranaire:
Les mitochondries ont été incubées à 37 C avec de la Rhodamine 123 dans des
plaques
10 96 puits dans 200 'IL (volume final) (seconde étape du procédé selon
l'invention, étape de
coloration).
L'absorbance à 545 nm (gonflement) et la fluorescence de la Rhodamine 123
(perte de
AWm; AExcitation 485 nm; AEmission 535 nm) ont été enregistrées en temps réel
pendant
45 minutes à l'aide d'un spectrofluorimètre (Tecan Infinite 200). Des
traitements de CaCl2
15 (50 1..tM) et mCICCP (carbonyi cyanide m-chlorophenylhydrazone) (50 M)
ont été utilisés
comme contrôle positif du gonflement et de la perte de A'-Pm, respectivement.
Respiration:
Les mitochondries isolées ont été incubées dans une cellule de 1,5 mL sous
agitation
magnétique avec une électrode à oxygène de type Clark (Hansatech Instruments
Ltd,
Norfolk, Royaume-Uni), thermostatées à 37 C, dans 500 kil_ d'un milieu
constitué de 0,3M
de mannitol, du tampon phosphate 10 mM (pH 7,3), KCI 10 mM, MgC12 5 mM et 1
mg/m1
de BSA (sérum albumine bovine). L'addition d'ADP (1,65 mM) provoque une
augmentation soudaine de l'absorption d'oxygène lorsque l'ADP est converti en
ATP,
caractérisée par un état de respiration active. L'inhibiteur Oligomycine A (1
FtM), qui
bloque la respiration dans les mitochondries couplées et l'agent de découplage
mCICCP
ont été ajoutés pour rétablir l'activité.
Calculs
Gonflement
Le gonflement est calculé comme suit (troisième étape du procédé selon
l'invention) :
[Math 1]
(DOcontrôle négatif T3Omin
% de gonflement spontané = 100¨ [100 x
_________________________________________________________________________ )1
DOcontrôle négatifT0 min
Potentiel transmembranaire:
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Le potentiel transmembranaire est calculé comme suit (troisième étape du
procédé selon
l'invention) :
[Math 2]
(RFUcontrôle négatif T3Omin)]
% de perte de alPm = [100 x
_____________________________________________________________________________
100
RFUcontrôle négatifT0 min
Indice de contrôle respiratoire (RCI):
L'indice de contrôle respiratoire est calculé comme suit :
[Math 3]
PenteCICCP
RCI =
Pente(oligornycine)
Cet indice indique l'étanchéité de la phosphorylation oxydative, se référant
ainsi à la
fonctionnalité de la chaîne respiratoire et à la qualité de la préparation
mitochondriale.
Critères d'acceptation
Une condition de préservation a été validée pour le foie et le c ur si:
Gonflement spontané <20%
Perte de Allim spontanée <20%
RCI 3 (le RCI chez les mitochondries isolées à partir de foie et de coeur
frais était de
6,34 et 4,85 respectivement).
Une condition de préservation a été validée pour le cerveau si:
Gonflement spontané <20%
Perte de atPrn spontanée <20%
RCI 2 (le RCI des mitochondries isolées à partir de cerveau frais était de
3,23).
Résultats
Les résultats sont résumés ci-dessous.
Le foie est l'organe présentant la plus longue période (30 h) de conservation
à 4 C dans
HEMO2Lifee. Au-delà, la membrane mitochondriale commence à se rompre et
l'activité
respiratoire diminue fortement Pour le foie frais, l'indice de contrôle
respiratoire (RCI) est
de 6,34, le gonflement spontané est de 5,40% et la perte de Atlim spontanée
est de
1,89%. Après 24 h, la valeur de RCI est restée supérieure à 5, et le
gonflement spontané
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et la perte de AYm spontanée sont inférieurs à 10%, ce qui suggère que la
fonctionnalité
des mitochondries est fortement conservée. HEMO2Life à 10 et 15 g/L maintient
la
fonctionnalité mitochondriale pendant 30 h d'incubation à 4 C. Il est
intéressant de noter
que la concentration de 10 g/L semble mieux préserver l'activité respiratoire
(RCI = 4,55
pour 10 g/L et 3,59 pour 15 g/L), tandis que la concentration de 15 g/L semble
mieux
conserver l'intégrité de la membrane (gonflement spontané = 17,86 pour 10 g/L
et 9,25
pour 15 g/L). En revanche, HEMO2Life à 5 g/L semble trop faible pour assurer
l'intégrité
mitochondriale après 30 h à 4 C, comme le montre un gonflement spontané élevé
(
20%) révélant une perméabilisation de la membrane mitochondriale. Une plus
forte
concentration (20 g/L) de HEMO2Life semble être délétère pour la fonction
mitochondriale, perturbant l'activité de la chaîne respiratoire.
Quelle que soit la concentration de HEMO2Life , la fonctionnalité
mitochondriale n'est
pas préservée au-delà d'une incubation de 30 h à 4 C.
La fonctionnalité des mitochondries cardiaques a été préservée avec une
incubation de
24 h à 4 C avec 15 g/L de HEMO2Life .
En effet, avec un coeur frais, la valeur de RCI est de 4,85, le gonflement
spontané est de
6,94% et la perte de AtPm spontanée est de 7,81%. Au bout de 16 h
d'incubation, 5 g/L
d'HEMO2LifeeD ne sont pas suffisants pour préserver l'activité respiratoire
(RCI = 2,71).
Cependant, les concentrations de 10 g/L (RCI = 3,78) et 15 g/L (RCI = 3,44)
permettent le
maintien de la fonctionnalité mitochondriale à ce moment précis. A 24 heures
d'incubation, seulement 15 g/L de HEMO2Life permettent de préserver la
fonctionnalité
mitochondriale (RCI 3). En revanche, HEMO2Life à 10 g/L n'est pas suffisant
(RCI =
2,63) et la concentration de 20 g/L semble trop élevée pour assurer une bonne
conservation (RCI = 2,83). Au-delà de 24 h, la fonctionnalité mitochondriale
et l'intégrité
du coeur ne sont pas préservées.
Les mitochondries isolées à partir de cerveau frais sont moins fonctionnelles
que les
mitochondries du foie et du coeur, comme indiqué par la valeur de RCI (RCI =
3,23),
tandis que l'intégrité de ces mitochondries est similaire (gonflement spontané
= 5,12% et
perte spontanée en AtPm = 5,39%). La fonctionnalité et l'intégrité
mitochondriales du
cerveau pourraient être préservées avec 12h à 4 C et 15 g/L de HEMO2Life (RCI
k 2,
gonflement <12% et perte spontanée en A4-'m <10%), tandis qu'une dose de 10
g/L n'est
pas suffisante (RCI = 1,79). Au-delà de cette période, la fonctionnalité et
l'intégrité
mitochondriales ne sont pas conservées. Ensuite, parmi les conditions testées
pour le
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cerveau, HEMO2Lifee à 15 giL pendant 12 h est la condition la plus appropriée
sans
dommage sur la membrane mitochondriale mais un RCI limite.
Pour conclure, le foie est l'organe présentant la plus longue période de
conservation dans
HEMO2Lifee (30 h), suivi du coeur (24 h) puis du cerveau (12 h). Pour ces
périodes, la
concentration requise en HEMO2Life(ID est de 15 g/L pour le coeur et le
cerveau, et de 10
g/L pour le foie. La concentration de 10 g/L est protectrice pendant 16 h pour
le coeur,
alors qu'elle ne préserve pas le cerveau pendant 12 h.
Une augmentation de la concentration d'HEMO2Lifee jusqu'à 20 g/L n'est pas
protectrice,
-Io quel que soit l'organe évalué.
Le procédé d'analyse selon l'invention permet de définir les conditions
optimales pour le
transport des organes notamment de rat, tels que foie, coeur et cerveau, sans
aucune
altération des mitochondries.
Exemple 2: Etude de la croissance bactérienne sur un substrat de aélose
Protocole:
Autoclavage de la gélose reconstituée en équivalent 1250 L (5x 250mL en
flacons schott
500mL)
Refroidissement post autoclavage en étuve à 52 C
Flacon 1 (témoin négatif): ajout de 5mL d'une solution de dilution ("solution
de
stabilisation", i.e. tampon salin de l'hémoglobine d'Arenicola marina) dans
250mL, puis
coulage de 12 boites;
Flacon 2 (témoin positif): ajout d'hémoglobine de mouton à une concentration
de 50mL de
sang par litre de gélose, puis coulage de 12 boites;
Flacon 3 (invention): ajout de 5mL d'hémoglobine d'Arenicola marina (M101)
diluée dans
"solution de stabilisation" (soit 0.5mL à 50g/L dans 4.5mL de "solution de
stabilisation"):
M101 final à 0.1g/L, puis coulage de 12 boites;
Flacon 4 (invention): ajout de 5mL de M101 diluée dans "solution de
stabilisation" (soit
2.5mL à 50g/L dans 2.5mL de "solution de stabilisation"): M101 final à 0.5g/L,
puis
coulage de 12 boites; et
Flacon 5 (invention): ajout de 5mL de M101 à 50g/L (non diluée pour avoir
1g/L): M101
final à 1g/L, puis coulage de 12 boites.
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Sur les 12 boites, 10 sont inoculées au râteau par ajout d'un inoculum de
Ssureus dilué si
nécessaire et homogénéisé, contenu dans 500 1_ de "solution de stabilisation"
(première
étape du procédé de l'invention).
La concentration d'inoculum visée est de 50 cfu/boite, soit 100 cfu/mL.
2 boites servent de témoin négatif.
On incube à 35 C-37 C.
Puis on lit le nombre de colonies par boite sur les 10 boites à 24h, 48h, 72h
et 96h
(troisième étape du procédé de l'invention).
On vérifie les témoins de chaque condition aux mêmes temps, qui doivent être
négatifs.
Résultats:
Aucune différence de temps de croissance n'a été observée à 12h, 24h et 48h.
Conclusion :
L'utilisation d'hémoglobine d'Arenicola marina à des concentrations de 0.1,
0.5 et 1g/L
permet de faire pousser des Staphylococcus aureus comme sur une gélose type
Columbia à base de sang frais.
Cette hémoglobine d'Arenicola marina peut être utilisée à des concentrations
bien
inférieures à celle du sang. Par ailleurs, elle peut être congelée, ce qui
n'est pas possible
pour le sang.
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