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Anticorps anti-protéine G alpha
Domaine Technique
[0001] La présente invention concerne des nouveaux anticorps ou fragments
d'anticorps,
capable de se lier à la protéine G alpha.
Technique antérieure
[0002] Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG ou GPCR en anglais) sont
une famille
de récepteurs membranaires chez les mammifères et dans tout le règne animal.
Les
protéines G sont des protéines hétérotrimériques (3 sous unités : alpha, bêta
et gamma)
qui sont activées par les RCPG. Au travers des RCPG, les protéines G ont un
rôle de
transduction d'un signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la
cellule (i.e.
réponse cellulaire à un stimulus externe). Leur mécanisme d'action communément
décrit
est résumé ci-après :
- dans son état inactif, de repos, la sous unité alpha de la protéine G est
liée au
nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP) ;
- après activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous unité alpha de la
protéine G et
enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes
: 1) la
sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la
formation d'un
complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et 2) la fixation du GTP qui conduit
à la
formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine liée au
GTP). Dans
la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme appelée
forme
vide . Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire
puisqu'il est décrit
que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous unité alpha de la protéine
G. Par
ailleurs, les sous unités bêta/gamma de la protéine G activée se dissocient de
la sous
unité alpha ;
- la sous unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux
effecteurs pour
les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation
entraînant une
réponse cellulaire ;
- le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous unité alpha de la
protéine G et la sous
unité alpha se réassocie aux sous unité bêta/gamma pour reformer la protéine G
pleine
liée au GDP (état inactif).
[0003] Etant donné l'implication des RCPG dans de nombreuses voies de
signalisation des
outils ont été générés dans l'art antérieur pour étudier leur activité, avec
souvent pour
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objectif l'identification de nouveaux ligands de ces récepteurs ayant une
potentielle
activité thérapeutique. On peut citer à titre d'exemple de ces outils,
l'utilisation d'un
dérivé radioactif non hydrolysable ou lentement hydrolysable du GTP, notamment
le
GTP-gamma-S, qui se fixe sur la protéine G alpha lorsque le récepteur est
activé. Il
existe également des systèmes recombinants basés sur la mesure d'une activité
enzymatique telle que la luciférase dont l'expression est contrôlée par les
seconds
messagers produits par l'activation du récepteur. Des anticorps ont également
étés
synthétisés pour détecter l'activation des RCPG au niveau de la surface
cellulaire [1]. On
peut également faire référence au brevet EP2723764 B1 qui propose des nano-
anticorps
qui se lient à l'interface entre la protéine G alpha et la protéine G
bêta/gamma,
permettant de stabiliser le complexe RCPG/protéine G.
[0004] Toutefois, l'art antérieur ne décrit pas d'anticorps ou de fragments
d'anticorps
capable de générer un signal de RET lorsqu'il est marqué avec un membre d'un
couple
de partenaires de RET et utilisés avec un GTP marqué par un membre d'un couple
de
partenaires de RET.
[0005] Les inventeurs ont mis au point des anticorps ou fragments d'anticorps
pour détecter
l'activation d'un RCPG par la mise en uvre d'un procédé de RET qui utilise un
GTP
marqué par un membre d'un couple de partenaires de RET. Les inventeurs ont
également montré que ces anticorps ou fragments d'anticorps ont ces propriétés
car ils
sont capables de se lier à la protéine G alpha dans une zone très
particulière.
Résumé de l'invention
[0006] Un premier objet de la présente invention concerne un anticorps ou un
fragment
d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha, qui comprend :
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence
d'acides
aminés SEQ ID NO: 1, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et un
CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 3, et
- un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence
d'acides
aminés SEQ ID NO : 4, un CDR2 de séquence d'acides aminés DTS (soit les trois
acides
aminés Asp Thr Ser), et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5.
[0007] Un deuxième objet de la présente invention concerne un anticorps ou un
fragment
d'anticorps qui entre en compétition pour la liaison à la protéine G alpha
avec l'anticorps
ou fragment d'anticorps du premier objet de l'invention.
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[0008] Un troisième objet de la présente invention concerne une composition
comprenant
l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention.
[0009] Un quatrième objet de la présente invention concerne un kit-of-parts
(trousse de
réactifs en français) comprenant (i) l'anticorps ou le fragment d'anticorps
selon
l'invention ou la composition selon l'invention et (ii) une source de GTP
marqué avec un
membre d'un couple de partenaires de RET.
[0010] Un cinquième objet de la présente invention concerne une séquence
d'acides
nucléiques codant pour l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon
l'invention.
[0011] Un sixième objet de la présente invention concerne un vecteur
comprenant la
séquence d'acides nucléiques selon l'invention.
[0012] Un septième objet de la présente invention concerne une cellule
comprenant le
vecteur selon l'invention ou la séquence d'acides nucléiques selon
l'invention.
Description détaillée
[0013] Définitions
[0014] Les termes anticorps anti-protéine G alpha , anticorps anti-G
alpha ou
anticorps capables de se lier à la protéine G alpha (ou fragment
d'anticorps) sont
interchangeables et désignent un anticorps (ou un fragment d'anticorps) qui se
lie à la
protéine G alpha avec une affinité suffisante pour être utilisé comme agent de
détection
(ex. pour la mise en uvre d'un RET), de diagnostic et/ou thérapeutique en
ciblant la
protéine G alpha.
[0015] Le terme anticorps , également appelé immunoglobuline désigne un
hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune
(dites
les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune
(dites
les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et
intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une
région ou
domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et
en position
C-terminale, d'une région constante, constitué d'un seul domaine dit CL pour
la chaîne
légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la
chaîne
lourde. Chaque domaine variable comprend généralement 4 régions charnières
(appelées FR1, FR2, FR3, FR4) et 3 régions directement responsables de la
liaison avec
l'antigène, dites CDR (appelées CDR1, CDR2, CDR3). L'anticorps peut être,
par
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exemple, un anticorps de mammifère, tel qu'un anticorps murin, un anticorps
chimérique, un anticorps humanisé ou un anticorps humain.
[0016] Par anticorps chimérique , on entend un anticorps dont les séquences
des régions
variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une
espèce
différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et
des
chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables
des chaînes
lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les
séquences des
régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce
non-
murine. A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de
mammifères
1.0 non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier
l'homme, le singe, les
suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les
oiseaux, cette liste
n'étant pas exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon
l'invention
contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères
d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et
légères
d'origine murine.
[0017] Par anticorps humanisé , on entend un anticorps dont tout ou partie
des
séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les
régions
hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et parfois
certains acides
aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis
que les
séquences des régions constantes et des régions variables non-impliquées dans
la
reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine.
[0018] Par anticorps humain , on entend un anticorps contenant uniquement
des
séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des
chaînes
légères que pour les régions variables et constantes des chaînes lourdes.
[0019] On entend par fragment d'anticorps , toute partie d'une
immunoglobuline
obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au
moins
un pont disulfure et qui est capable de se lier à l'antigène reconnu par
l'anticorps entier,
par exemple Fab, Fab', F(ab')2, Fab'-SH. La digestion enzymatique des
immunoglobulines
par la papaïne génère deux fragments identiques, qu'on appelle les fragments
Fab
(Fragment antigen binding), et un fragment Fc (Fragment cristallisable). La
digestion
enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et
un
fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments
Fab' liés
par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des
régions
variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la
région Fab et
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d'une région charnière. Fab'-SH fait référence à un fragment Fab' dans lequel
le résidu
cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre.
[0020] Le terme affinité fait référence à la force de l'ensemble des
interactions non-
covalentes entre une molécule, par exemple un anticorps ou un fragment
d'anticorps et
5 l'antigène reconnu, par exemple un antigène tel que la protéine G alpha.
L'affinité est
généralement représentée par la constante de dissociation (Kd). La constante
de
dissociation (Kd) peut être mesurée par des méthodes bien connues, par exemple
en
FRET ou en SPR.
[0021] Au sens de la présente invention, l'identité ou l'homologie est
calculée en
comparant deux séquences alignées dans une fenêtre de comparaison.
L'alignement des
séquences permet de déterminer le nombre de positions (nucléotides ou acides
aminés)
en commun pour les deux séquences dans la fenêtre de comparaison. Le nombre de
positions en commun est donc divisé par le nombre total de positions dans la
fenêtre de
comparaison et multiplié par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité. La
détermination du pourcentage d'identité de séquence peut être effectuée
manuellement
ou grâce à des programmes informatiques bien connus.
[0022] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'identité ou
l'homologie
correspond à au moins une substitution, par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10
substitutions, d'un résidu d'acide aminé, de préférence au moins une
substitution d'un
résidu d'acide aminé réalisée de façon conservative. La substitution d'un
résidu d'acide
aminé réalisée de façon conservative consiste à remplacer un résidu d'acide
aminé par
un autre résidu d'acide aminé, ayant une chaîne latérale possédant des
propriétés
similaires. Les familles d'acides aminés possédant des chaines latérales avec
des
propriétés similaires sont bien connues, on peut citer par exemple les chaines
latérales
basiques (e.g., lysine, arginine, histidine), les chaines latérales acides
(e.g., aspartic
acid, glutamic acid), les chaînes latérales polaires et non chargées (e.g.,
glycine,
asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), les chaînes
latérales
apolaires (e.g., glycine, cysteine, alanine, valine, leucine, isoleucine,
proline,
phenylalanine, methionine, tryptophan), les chaînes latérales beta-ramifiées
(e.g.,
threonine, valine, isoleucine) et les chaînes latérales aromatiques (e.g.,
tyrosine,
phenylalanine, tryptophan, histidine).
[0023] Les anticorps ou fragments d'anticorps homologues ou variants
d'anticorps ou de
fragments d'anticorps (c'est-à-dire des anticorps ou fragments d'anticorps
ayant la
même fonction) possèdent donc certains acides aminés qui peuvent être
substitués par
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d'autres acides aminés au niveau des régions constantes et/ou des régions
variables,
sans perdre la capacité de liaison à l'antigène. Il est préférable que cette
substitution soit
réalisée au sein de la séquence d'ADN qui code pour l'anticorps ou le fragment
d'anticorps, c'est-à-dire que la substitution soit conservative en nature.
L'Homme du
métier utilise ses connaissances générales pour déterminer le nombre de
substitutions
qui peuvent être réalisés et leur localisation afin de pouvoir conserver la
fonction de
l'anticorps ou du fragment d'anticorps. Afin de déterminer la capacité d'un ou
plusieurs
variants d'anticorps ou de fragment d'anticorps à se lier spécifiquement à un
antigène,
plusieurs méthodes appropriées, bien connues de l'homme du métier et décrites
dans
l'art antérieur, peuvent être utilisées. Les anticorps ou les fragments
d'anticorps peuvent
donc être testés par les méthodes de liaison, comme par exemple la méthode
ELISA, la
méthode par chromatographie d'affinité, etc. Les variants d'anticorps ou de
fragments
d'anticorps peuvent être générés par exemple par la méthode de phage display
permettant de générer une librairie de phage. Un grand nombre de méthodes sont
connues afin de générer une librairie de phage display et cibler les
variants
d'anticorps ou de fragments d'anticorps ayant les caractéristiques
fonctionnelles
recherchées.
[0024] Par purifié et isolé , on entend, en se référant à un anticorps
ou un fragment
d'anticorps selon l'invention, que l'anticorps est présent en l'absence
substantielle
d'autres macromolécules biologiques du même type. Le terme "purifié" tel
qu'utilisé ici
signifie de préférence au moins 75% en masse, plus préférablement au moins 85%
en
masse, encore plus préférablement au moins 95% en masse, et le plus
préférablement
au moins 98% en masse d'anticorps, par rapport à l'ensemble des macromolécules
présentes.
[0025] Le terme protéine G désigne une protéine hétéro-trimérique composée
de trois
sous-unités appelées protéine G alpha, protéine G bêta et protéine G gamma.
[0026] Le terme Protéine G alpha ou G alpha désigne la sous-unité
alpha de la
protéine G. La protéine G alpha possèdent deux domaines, le domaine GTPase, et
le
domaine hélice alpha. Il existe au moins 20 protéines G alpha différentes, qui
peuvent se
classer parmi les principales familles de protéines suivantes : G alphas
(connu pour
activer l'adénylate cyclase afin d'augmenter la synthèse de l'AMPc), G alphai
(connu pour
inhiber l'adénylate cyclase), G alphaolf (associé aux récepteurs olfactifs), G
alphat
(connu pour la transduction des signaux visuels dans la rétine en conjonction
avec la
rhodopsine), G alphaq (connu pour stimuler la phospholipase C) ou la famille G
alpha12
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/ 13 (connue pour réguler le cytosquelette, les jonctions cellulaires, et
d'autres processus
liés au mouvement de la cellule). La protéine G alpha peut être choisie parmi
la protéine
G alphai, G alphao et/ou G alphaz. La protéine G alphai peut être choisie
parmi la
protéine G alphai1, G a1phai2 et G a1phai3. La protéine G alphai peut être
d'origine
humaine ou animale.
[0027] Avantageusement, l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon
l'invention se lie à la
protéine G alphai, G alphao et/ou G alphaz, par exemple il se lie à la
protéine G alphai1,
à la protéine G a1phai2 et/ou à la protéine G a1phai3. La protéine G alphai1
d'origine
humaine porte l'identifiant UniProt P63096-1 pour l'isoforme 1 et
l'identifiant UniProt
P63096-2 pour l'isoforme 2. Le gène codant pour la protéine G alphai1
d'origine humaine
est connu sous le nom de GNAI1 (Gene ID : 2770, NCBI).
[0028] Le terme GTP désigne la guanosine triphosphate.
[0029] Le terme GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable désigne un
analogue
du GTP qui n'est pas hydrolysé ou peu hydrolysé en GDP. On peut citer par
exemple le
GTPgammaS (CAS no. 37589-80-3), le GppNHp (CAS no. 148892-91-5) ou le GppCp
(CAS no. 10470-57-2).
[0030] Les termes GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par
un
membre d'un couple de partenaire de RET ou GTP non hydrolysable ou
lentement
hydrolysable marqué sont interchangeables et désignent soit un GTP non
hydrolysable
ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaire de
RET
donneur ( GTP-donneur ), soit un GTP non hydrolysable ou lentement
hydrolysable
marqué par un membre d'un couple de partenaire de RET accepteur ( GTP-
accepteur
).
[0031] Le terme RET (de l'anglais Resonance Energy Transfer ) désigne
les
techniques de transfert d'énergie, dont le FRET et le BRET.
[0032] Le terme FRET (de l'anglais Fluorescence Resonance Energy
Transfer )
désigne le transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes. Le FRET est
défini
comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction
dipôle¨dipôle entre
un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une
compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre
d'émission du
donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de
l'accepteur. En
accord avec la théorie de Fôrster, le FRET est un processus qui dépend de la
distance
séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont
à
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proximité l'une de l'autre, un signal de FRET sera émis. Par exemple, la
constante de
dissociation (Kd) entre un anticorps et sa cible peut être mesurée par FRET,
par exemple
comme décrit dans les exemples.
[0033] Le terme BRET (de l'anglais Bioluminescence Resonance Energy
Transfer )
désigne le transfert d'énergie entre une molécule biolunninescente et une
molécule
fluorescente.
[0034] Anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention
[0035] Un premier objet de l'invention concerne un anticorps ou un fragment
d'anticorps
capable de se lier à la protéine G alpha, qui comprend :
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence
d'acides
aminés SEQ ID NO : 1, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et un
CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 3, et
- un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence
d'acides
aminés SEQ ID NO : 4, un CDR2 de séquence d'acides aminés DTS (soit les trois
acides
aminés Asp Thr Ser , c'est à dire les trois acides aminés acide aspartique,
thréonine et
sérine), et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5.
[0036] Le domaine variable de la chaîne lourde peut comprendre :
- un FR1 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%,
au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides
aminés SEQ ID NO: 6,
- un FR2 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%,
au moins 98%, au moins 99% ou même 100 /0 d'homologie avec la séquence
d'acides
aminés SEQ ID NO: 7,
- un FR3 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%,
au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides
aminés SEQ ID NO : 8, et/ou
- un FR4 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%,
au moins 98%, au moins 99% ou même 1000/0 d'homologie avec la séquence
d'acides
aminés SEQ ID NO : 9.
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[0037] Le domaine variable de la chaîne légère peut comprendre :
- un FR1 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%,
au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides
aminés SEQ ID NO: 10,
- un FR2 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%,
au moins 98%, au moins 99% ou même 1000/0 d'homologie avec la séquence
d'acides
aminés SEQ ID NO: 11,
- un FR3 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%,
au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides
aminés SEQ ID NO : 12, et/ou
- un FR4 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%,
au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides
aminés SEQ ID NO : 13.
[0038] Dans un mode de réalisation particulier de l'anticorps selon
l'invention :
= le domaine variable de la chaîne lourde comprend :
- un FR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6 (i.e. 100% d'homologie
avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6),
- un FR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7,
- un FR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8, et
- un FR4 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9; et
= le domaine variable de la chaîne légère comprend :
- un FR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10,
- un FR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 11,
- un FR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 12, et
- un FR4 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 13.
[0039] Dans un mode de réalisation particulier de l'anticorps selon
l'invention, le domaine
variable de la chaîne lourde peut présenter au moins 80% d'homologie, de
préférence
au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%,
au
moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie avec la séquence
d'acides aminés SEQ ID NO : 14, et le domaine variable de la chaîne légère
peut
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présenter d'homologie au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%,
au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie avec la séquence d'acides
aminés
SEQ ID NO : 15.
5 [0040] Ainsi, l'invention concerne un anticorps ou fragment d'anticorps
dans lequel :
- le domaine variable de la chaîne lourde présente au moins 80% d'homologie,
de
préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au
moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie
d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14;
10 - le domaine variable de la chaîne légère présente au moins 80%
d'homologie, de
préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au
moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie
d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 15; et
- le CDR1 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence
d'acides
aminés SEQ ID NO : 1, le CDR2 du domaine variable de la chaîne lourde consiste
en la
séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, le CDR3 du domaine variable de la
chaîne
lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, le CDR1 du
domaine
variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO
: 4, le
CDR2 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides
aminés
DTS, et le CDR3 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la
séquence
d'acides aminés SEQ ID NO : 5.
[0041] Avantageusement, le domaine variable de la chaîne lourde consiste en la
séquence
d'acides aminés SEQ ID NO : 14 (i.e. le domaine variable de la chaîne lourde
présente
100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14) et le
domaine
variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO :
15.
[0042] L'anticorps décrit dans les exemples sous la référence DSV36S comprend
un domaine
variable de la chaîne lourde qui consiste en la séquence d'acides aminés SEQ
ID NO : 14
et un domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d'acide
aminé
SEQ ID NO :15.
[0043] L'anticorps ou fragment d'anticorps selon le premier objet décrit ci-
dessus est appelé
anticorps ou fragment d'anticorps de référence ci-après.
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[0044] Un second objet de l'invention concerne un anticorps ou un fragment
d'anticorps qui
entre en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps ou
fragment
d'anticorps de référence, ci-après anticorps ou fragment d'anticorps
compétiteur .
[0045] La capacité d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps à entrer en
compétition avec
l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour la liaison à la protéine
G alpha
peut être testée par une méthode par compétition. Une méthode par
compétition
consiste à tester un anticorps (ou un fragment d'anticorps) pour ses capacités
à bloquer
la liaison entre un anticorps ou fragment d'anticorps de référence et un
antigène ou à
entrer en compétition avec un anticorps ou fragment d'anticorps de référence
pour la
liaison à l'antigène. En d'autres termes, un anticorps qui entre en
compétition avec
l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence se lie au même épitope que
l'anticorps
ou fragment d'anticorps de référence ou à un épitope qui est suffisamment
proches de
l'épitope reconnu par l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour
empêcher la
liaison de l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour des raisons
d'encombrements stériques.
[0046] De nombreux types de méthodes par compétition peuvent être utilisés
pour
déterminer si un anticorps ou un fragment d'anticorps entre en compétition
avec un
anticorps ou fragment d'anticorps de référence, par exemple: par un test ELISA
par
compétition, par une méthode d'immuno-fluorescente e.g. par un test FRET ou
HTRF
( Homogeneous Time Resolved Fluorescence ), par une méthode d'immuno-
luminescence, par une méthode du sandwich direct ou indirect, par dosage radio-
immunologique (RIA) direct ou indirect en phase solide, par dosage immuno-
enzymatique en phase solide directe ou indirecte (EIA), par une technologie de
résonance plasmonique de surface (ex. BIACORE), par cytométrie de flux, par
polarisation de fluorescence (par exemple entre un peptide fluorescent et
l'anticorps à
tester), etc. Par exemple, la méthode ELISA par compétition implique
l'utilisation d'un
antigène purifié lié à une surface solide ou à des cellules, l'anticorps à
tester qui se lie à
l'antigène non marqué et un anticorps ou fragment d'anticorps de référence
marqué.
Habituellement, l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence est présent
en
concentration non saturante (par rapport à sa constante de dissociation Kd
pour la
protéine Galpha) et on mesure le signal à des concentrations croissantes de
l'anticorps
ou du fragment d'anticorps à tester. Lorsqu'un anticorps est présent en excès,
il peut
bloquer ou inhiber (par exemple réduire) la liaison spécifique d'un anticorps
ou fragment
d'anticorps de référence à un antigène d'au moins 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-
60%,
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60-65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou plus. Dans certains cas, la liaison est
inhibée d'au
moins 80 à 85%, 85 à 90%, 90 à 95%, 95 à 97% ou 97% ou plus.
[0047] En particulier, les anticorps ou les fragments d'anticorps qui entrent
en compétition
pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps ou fragment d'anticorps
de
référence sont identifiés par la mise en uvre d'un test HTRF ou par la mise
en uvre
d'un test de polarisation de fluorescence, de préférence d'un test HTRF.
Lorsqu'un
anticorps ou un fragment d'anticorps entre en compétition pour la liaison à la
protéine G
alpha avec l'anticorps ou le fragment d'anticorps de référence, il est capable
d'inhiber un
signal HTRF généré par l'anticorps ou le fragment d'anticorps de référence. A
l'inverse,
1.0
un anticorps ou un fragment d'anticorps qui n'entre pas en compétition pour la
liaison à
la protéine G alpha avec l'anticorps ou le fragment d'anticorps de référence
n'est pas
capable d'inhiber un signal HTRF généré par l'anticorps ou le fragment
d'anticorps de
référence.
[0048] Les anticorps ou fragments d'anticorps compétiteurs selon l'invention
peuvent, par
exemple, être obtenus avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence
par la mise
en oeuvre du protocole décrit dans l'Exemple 1. L'anticorps DSV38S est un
anticorps
compétiteur selon l'invention.
[0049] Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps DSV38S et/ou
l'anticorps DSV36S
est/sont exclu(s) des anticorps ou fragments d'anticorps compétiteur(s) selon
l'invention.
[0050] Les anticorps ou fragments d'anticorps de référence et les anticorps ou
fragments
d'anticorps compétiteurs tels que définis ci-dessus sont appelés conjointement
anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention ci-après.
[0051] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut se lier a
la protéine G
alpha sous une forme isolée et/ou présente dans un environnement membranaire,
par
exemple il peut se lier a une protéine G alpha présente dans une préparation
de
membranes portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéines G alpha.
Il n'est
pas nécessaire que la protéine G alpha soit complexée avec le RCPG pour que
l'anticorps
selon l'invention puisse se lier à la protéine G alpha.
[0052] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut se lier à
la protéine G
alpha avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure ou
égale à 20
nM. Une constante de dissociation inférieure à 20 nM est préférable pour la
bonne mise
en uvre d'un RET. Avantageusement, l'anticorps ou le fragment d'anticorps
selon
l'invention peut se lier à la protéine G alpha avec une constante de
dissociation (Kd)
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mesurée en FRET inférieure ou égale à 20 nM, par exemple une constante
d'affinité
inférieure ou égale à 10 nM ou encore inférieure ou égale à 5 nM, par exemple
allant de
0 à 20 nM (0 étant exclu), allant de 0 à 10 nM (0 étant exclu), allant de 0 à
5 nM (0
étant exclu). Un procédé pour mesurer le Kd d'un anticorps ou d'un fragment
d'anticorps
selon l'invention en FRET est décrit à l'Exemple 2.
[0053] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut être
utilisé dans un
procédé de RET avec un GTP marqué par un membre d'un couple de partenaires de
RET.
[0054] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention est
particulièrement
avantageux dans la mise en oeuvre d'un RET, en particulier d'un FRET,
notamment pour
détecter l'activation d'une protéine G alpha. Ainsi, l'anticorps ou le
fragment d'anticorps
selon l'invention peut être couplé à une molécule permettant sa détection.
Avantageusement, l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut
être
marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET.
[0055] Par exemple, des anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention
peuvent être
obtenus par la mise en oeuvre du protocole décrit dans l'Exemple 1.
[0056] Les inventeurs ont également montrés que les anticorps ou fragments
d'anticorps
selon l'invention se lient au domaine SwitchII de la protéine G alpha, et plus
particulièrement au peptide 215-294 de la protéine G alpha.
[0057] Marquage de l'anticorps ou du fragment d'anticorps selon l'invention
[0058] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut être
marqué de manière
directe ou indirecte selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, par
exemple comme décrit ci-après, mais de manière préférée, l'anticorps est
marqué de
manière directe, par liaison covalente avec un membre d'un couple de
partenaires de
RET.
[0059] Le terme couple de partenaires de RET désigne un couple constitué
d'un
composé donneur d'énergie (ci-après composé donneur ) et d'un composé
accepteur
d'énergie (ci-après composé accepteur ); lorsqu'ils sont à proximité l'un
de l'autre et
lorsqu'ils sont excités à la longueur d'onde d'excitation du composé donneur,
ces
composés émettent un signal de RET. Il est connu que pour que deux composés
soient
partenaires de RET, le spectre d'émission du composé donneur doit recouvrir
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partiellement le spectre d'excitation du composé accepteur. Par exemple, on
parle de
couples de partenaires de FRET lorsqu'on utilise un composé fluorescent
donneur et
un composé accepteur ou de couple de partenaires de BRET lorsqu'on utilise
un
composé bioluminescent donneur et un composé accepteur.
[0060] Le marquage direct de l'anticorps ou du fragment d'anticorps par un
membre d'un
couple de partenaires de RET, par exemple un composé fluorescent quand on met
en
uvre un FRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de
l'homme du
métier, reposant sur la présence de groupes réactifs sur l'anticorps ou le
fragment
d'anticorps. Par exemple, les groupes réactifs suivants peuvent être utilisés
: le groupe
amino terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique,
les
groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes
thiols des
cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des
tryptophanes, les
groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines.
[0061] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un
groupe réactif
porté par l'anticorps ou le fragment d'anticorps. Les groupes réactifs
appropriés, portés
par l'anticorps ou le fragment d'anticorps, sont bien connus de l'homme du
métier, par
exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un
groupe
maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les
groupes
thiols portés par les cystéines portées par l'anticorps ou le fragment
d'anticorps. De
même, un composé donneur / accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide
sera
capable de se fixer de manière covalente à une amine présente sur l'anticorps
ou le
fragment d'anticorps.
[0062] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut également
être marqué
par un composé fluorescent ou bioluminescent de manière indirecte, par exemple
en
introduisant dans le milieu de mesure un anticorps ou un fragment d'anticorps,
lui-même
lié de manière covalente à un composé accepteur / donneur, ce deuxième
anticorps ou
fragment d'anticorps reconnaissant de manière spécifique l'anticorps ou le
fragment
d'anticorps selon l'invention.
[0063] Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de
la biotine sur
l'anticorps ou le fragment d'anticorps à marquer, puis d'incuber cet anticorps
ou
fragment d'anticorps biotinylé en présence de streptavidine marquée par un
composé
accepteur / donneur. Des anticorps ou fragment d'anticorps biotinylés
appropriés
peuvent être préparés par des techniques bien connues de l'homme du métier ;
la
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société Cisbio Bioassays commercialise par exemple de la streptavidine marquée
avec un
fluorophore dont la dénomination commerciale est d2 (réf. 610SADLA).
[0064] Dans le cadre de l'invention, l'anticorps ou le fragment d'anticorps
est marqué par (i)
un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur, ou (ii) un composé
5 fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent
(quencher). De
préférence, l'anticorps ou le fragment d'anticorps est marqué par un composé
fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher).
[0065] Selon un mode de réalisation de l'invention, l'anticorps ou le fragment
d'anticorps est
marqué par un composé fluorescent accepteur, par exemple choisi parmi les
10 allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les
coumarines, les
proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-
dipyrrométhène, le
nitrobenzoxadiazole et un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi
GFP10,
GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP
citrine, YFP
venus et YPet, le mOrange et le DsRed.
15 [0066] Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps ou
le fragment
d'anticorps est marqué par un composé fluorescent donneur, par exemple choisi
parmi
un cryptate d'europium, un chélate d'europium, un chélate de terbium, un
cryptate de
terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les
rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les
acridines,
les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le
nitrobenzoxadiazole, de
préférence choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un
chélate de
terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dot
; les
chélates et les cryptates d'europium et de terbium étant particulièrement
préférés.
[0067] Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps ou le
fragment
d'anticorps est marqué par un composé luminescent donneur, par exemple choisi
parmi
la Luciférase (luc), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla
Luciférase (Rluc8) et
la Firefly Luciférase.
[0068] Les méthodes de marquage et les marqueurs qui peuvent être utilisés
dans le cadre
de la présente invention sont décrits dans la demande de brevet français
déposée le
30/01/2019 sous le numéro FR1900880, incorporée ici par référence.
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[0069] Composition d'anticorps ou de fragment d'anticorps
[0070] Un troisième objet de l'invention concerne une composition comprenant
l'anticorps
ou le fragment d'anticorps décrit ci-dessus. La composition selon l'invention
peut
comprendre en outre une source de GTP marqué avec un membre d'un couple de
partenaires de RET.
[0071] Le GTP marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET est
décrit ci-
après dans la partie kit-of-parts .
[0072] Trousse de réactifs (Kit-of-parts)
[0073] Un quatrième objet de l'invention concerne une trousse de réactifs (kit-
of-parts)
comprenant (i) l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention (de
référence ou
compétiteur tels que définis ci-dessus) et (ii) une source de GTP marqué avec
un
membre d'un couple de partenaires de RET (ci-après GTP marqué ).
[0074] Le GTP peut être un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable, tel
que le
GTPgammaS (GTPyS ou GTPgS), le GppNHp et le GppCp.
[0075] Le GTP peut être marqué de manière directe ou indirecte. De préférence,
le GTP est
marqué de manière directe. Le marquage direct du GTP par un membre d'un couple
de
partenaires de RET, par exemple un composé fluorescent quand on met en oeuvre
un
FRET, peut être effectué par les méthodes reposant sur la présence de groupes
réactifs
sur le GTP.
[0076] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un
groupe réactif
porté par un membre d'un couple de partenaires de RET. Les groupes réactifs
appropriés, portés par le membre d'un couple de partenaires de RET, sont bien
connus
de l'homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur
fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de
manière
covalente avec les groupes thiols. De même, un composé donneur / accepteur
portant
un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente
à une
amine.
[0077] Dans le cadre de l'invention, le GTP est marqué par (i) un composé
fluorescent
donneur, ou (ii) un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non
fluorescent (quencher). De préférence, le GTP est marqué par un composé
fluorescent
donneur.
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[0078] Dans un mode de réalisation particulier, le GTP marqué est un GTP non-
hydrolysable
ou lentement hydrolysable marqué par un composé fluorescent donneur choisi
parmi
GTPgN-C2 (GTP-gamma-N-C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl-C2 (GTP-
gamma-N-octyl-C2), GTPgN-octyl-C11 (GTP-gamma-N-octyl-C11), GTPgN-octyl-C3
(GTP-
gamma-N-octyl-C3), GTPg0-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPg0-hexyl-C3 (GTP-
gamma-0-hexyl-C3) ou GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-
thiosuccinimidyl-C2), de préférence GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2.
[0079] Selon l'invention, le GTP marqué est un GTP non-hydrolysable ou
lentement
hydrolysable marqué par un composé fluorescent accepteur choisi parmi GTPgN-
octyl-
lo
Cy5, GTPgN-octyl-AF488, GTPgN-L15-Fluorescein, GTPg0-Linker-Cy5(P) ou GTPgS-
Linker-Cy5(R). Le GTP peut également être marqué par un composé accepteur non
fluorescent (quencher).
[0080] Le GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 est représenté ci-dessous.
H
0 0 0
µ1.'>.e=;Ãe" .µ..eik4
0, H
OH
sl
0>
NO = = f"- 'N'y' Geeeletee o*.= 44:teeettearelrelye
[0081] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le GTP est
marqué par un
composé fluorescent donneur et l'anticorps ou le fragment d'anticorps est
marqué par un
composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent
(quencher).
Dans un autre mode de réalisation particulier, le GTP est marqué par un
composé
fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher) et
l'anticorps ou le fragment d'anticorps est marqué par un composé fluorescent
donneur
ou luminescent donneur.
[0082] Les autres GTP marqués susmentionnés et leur mode de préparation sont
décrits
dans la demande de brevet français déposée le 30/01/2019 sous le numéro
FR1900856,
incorporée ici par référence.
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[0083] Avantageusement, (i) est un anticorps qui comprend un domaine variable
de la
chaîne lourde qui consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 et un
domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d'acide aminé
SEQ ID
NO : 15 et (ii) est le GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2.
[0084] Autres objets
[0085] Un cinquième objet de la présente invention concerne une séquence
d'acides
nucléiques codant pour l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon
l'invention (de
référence ou compétiteur).
[0086] Un sixième objet de la présente invention concerne un vecteur
comprenant une
séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Tout type de vecteur adapté à
la
production d'anticorps peut être utilisé dans le cadre de l'invention. En
particulier, le
vecteur est un vecteur recombinant. Le vecteur comprendra les séquences
nucléiques
nécessaires pour produire l'anticorps selon l'invention, par exemple des
séquences
promotrices, des séquences régulatrices, etc. La préparation d'un vecteur
approprié est
largement décrite dans la littérature.
[0087] Un septième objet de l'invention concerne une cellule comprenant un
vecteur selon
l'invention ou une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. La cellule
selon
l'invention peut être obtenue par des méthodes largement décrites dans la
littérature,
par exemple en transfectant un clone cellulaire avec un vecteur selon
l'invention ou une
séquence d'acides nucléiques. L'invention n'est pas limitée à un type
cellulaire particulier.
Toute cellule capable de produire des anticorps peut être utilisée dans le
cadre de
l'invention. Il peut s'agir de cellules eucaryotes, telles que les cellules de
mammifères,
par exemple les cellules humaines ou de souris ou de cellules procaryotes, par
exemple
les bactéries ou encore les levures.
[0088] L'invention sera davantage illustrée par les figures et exemples
suivants. Cependant,
ces exemples et ces figures ne doivent en aucun cas être interprétés comme
limitant la
portée de l'invention.
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Brève description des figures
[0090] La Figure 1 représente le schéma réactionnel d'un FRET permettant de
mesurer le
Kd d'un anticorps anti-protéine G alphai1.
[0091] La Figure 2 représente des courbes qui illustrent l'affinité des
anticorps SC13533,
DSV36S et DSV38S marqués au d2 pour la protéine Gai1 humaine. En présence de
la
protéine Gait un signal HTRF très significatif est obtenu avec tous les
anticorps en
présence et en absence de nucléotide (GTPgS ou GDP). Les résultats indiquent
que les
anticorps DSV36S, DSV38S et SC13533 sont capables de lier la protéine Gait Les
courbes permettent de calculer l'affinité (Kd) de ces différents anticorps
pour la protéine
Gai1 (Tableau 1).
[0092] La Figure 3 est une courbe qui illustre la capacité des anticorps non
marqués
DSV36S, DSV38S et SC 13533 à inhiber la liaison de l'anticorps SC13533-d2 sur
la
protéine Gi1 humaine. De manière logique, l'anticorps SC 13533 non marqué a
inhibé
complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps SC 13533-d2. A
l'inverse, les
anticorps DSV36S et DV38S n'ont pas été capables d'inhiber le signal généré
par le SC
13533-d2. Ceci démontre que ces 2 anticorps ne se lient pas sur la même région
de la
protéine Gai1 que l'anticorps SC 13533. En conclusion les anticorps DSV36S et
DSV38S
reconnaissent des épitopes différents de l'anticorps SC 13533.
[0093] La Figure 4 représente la capacité des anticorps commerciaux sc-13533,
sc-56536
et AM05302PU-N à inhiber la liaison de l'anticorps DSV SC13533-d2 sur la
protéine Gi1
humaine. De manière logique, l'anticorps DSV SC13533 non marqué a inhibé
complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps 5C13533-d2. Egalement,
les
anticorps sc-56536 et AM05302PU-N ont inhibé complètement le signal HTRF
obtenu
avec de l'anticorps SC13533-d2. En conclusion, les anticorps commerciaux sc-
13533, sc-
56536 et AM05302PU-N sont tous des anticorps non-compétiteurs de l'anticorps
DSV
36S. Tous ces anticorps reconnaissent donc un épitope différent de l'anticorps
DSV 36S.
[0094] La Figure 5 représente la capacité des anticorps commerciaux sc-13533,
sc-56536
et AM05302PU-N à inhiber la liaison de l'anticorps DSV 3S-d2 (généré au
laboratoire) sur
la protéine Gi1 humaine. De manière logique, l'anticorps DSV 3S non marqué a
inhibé
complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV 3S-d2. Egalement,
les
anticorps sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N ont inhibé complètement le signal
HTRF
obtenu avec de l'anticorps DSV 3S-d2. En conclusion, ces résultats démontrent
que les
anticorps commerciaux sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N sont tous des
anticorps
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non-compétiteurs de l'anticorps DSV 36S. Il en est donc de même pour
l'anticorps DSV
3S fait au laboratoire. Tous ces anticorps reconnaissent donc un épitope
différent de
l'anticorps DSV 36S.
[0095] La Figure 6 est une courbe qui illustre la capacité des anticorps non
marqués
5 DSV36S et DSV38S à inhiber la liaison de l'anticorps DSV36S-d2 sur la
protéine Gai1. De
manière logique, l'anticorps DSV36S non marqué a inhibé complétement le signal
HTRF
obtenu avec l'anticorps DSV36S-d2. L'anticorps DSV38S a aussi inhibé
complètement le
signal généré par le DSV36S-d2. Ceci démontre que ces 2 anticorps se lient sur
la même
région de la protéine G ail. En conclusion l'anticorps DSV38S entre en
compétition pour
10 la liaison à la protéine G alphai avec l'anticorps DSV36S.
[0096] La Figure 7 représente la capacité des anticorps commerciaux DSV 36S,
DSV 26S,
DSV 3S et DSV 39S à inhiber la liaison de l'anticorps DSV36S-d2 sur la
protéine Gil
humaine. De manière logique, l'anticorps DSV36S non marqué a inhibé
complètement le
signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV36S-d2. A l'inverse, les anticorps
DSV 26S,
15 DSV 3S et DSV 395 n'ont pas été capables d'inhiber le signal généré par
le DSV 36S-d2.
Ceci démontre que ces trois anticorps ne se lient pas sur la même région de la
protéine
Gai1 humaine que l'anticorps DSV 36S. En conclusion ces anticorps
reconnaissent des
épitopes différents de l'anticorps DSV 36S.
[0097] Les Figures 8A et 8B représentent le schéma réactionnel d'un FRET
permettant de
20 mesurer la sélectivité des anticorps DSV36S, DSV38S et SC13533 pour
différents types
de protéines Ga.
[0098] La Figure 9 est un diagramme qui représente le signal FRET pour
différents types
de protéines Ga obtenu avec une paire d'anticorps Anti-Tvvin-Strep-tag-Lumi4
Tb / Anti-
FLAG-d2, ce qui permet de vérifier que toutes les protéines Ga encodées par
les
plasmides étaient bien sur-exprimées dans les HEK293. En effet, le signal HTRF
obtenu
avec chacune d'entre elles était très supérieur au signal HTRF obtenu avec la
condition
négative ( MOCK ) qui correspond à des HEK293 transfectées avec un plasmide
contrôle ne codant pour aucun protéine taggée FLAG+ Tvvin-Strep-tag.
[0099] La Figure 10 est un diagramme qui illustre la sélectivité des anticorps
DSV36S,
DSV38S et SC13533 pour les différents types de protéines Ga. Les anticorps
DSV36S et
DSV38S ont donné un signal HTRF positif lorsque les protéines Gail, Gai2,
Gai3, Gao et
Gaz étaient surexprimées mais n'ont pas donné de signal HTRF lorsque les
protéines
Gas, Gag, Ga12 et Ga13 étaient surexprimées. L'anticorps SC13533 a donné un
signal
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HTRF positif lorsque les protéines Gai1 et Gai3, étaient surexprimées mais n'a
pas donné
de signal HTRF lorsque les protéines Gai2, Gao, Gaz, Gas, Gag, Ga12 et Ga13
étaient
surexprimées. Ces résultats confirment que les anticorps DSV36S et DSV38S
reconnaissent le même épitope sur les protéines Ga (ils ont le même profil de
sélectivité
et sont compétitifs). Cet épitope est différent de celui reconnu par
l'anticorps SC13533
qui reconnait un plus petit nombre de protéines Ga.
[0100] La Figure 11 est un diagramme qui illustre la capacité des anticorps
DSV36S,
DSV38S et SC13533 à générer un signal de TR-FRET lorsqu'ils sont associés à un
analogue fluorescent du GTP (GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium) sur des
lo
préparations membranaires sur-exprimant un GPCR. La condition GTPgS
représente
le signal non spécifique de l'essai (NS) dans lequel l'excès de GTPgS non
marqué
(100pM) a inhibé la liaison du GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium sur les
protéines Ga
et a donc empêché l'apparition d'un signal de FRET. La condition tampon a
montré
qu'il était possible d'obtenir un signal de FRET modéré mais significatif
entre le GTPgN-
octyl-C2-Cryptate d'europium et les anticorps DSV36S et DSV 38S marqués au d2.
Lors
de l'ajout du SNC162 qui a provoqué l'activation des récepteurs DOR sur-
exprimés dans
les membranes, on a observé une augmentation de ce signal de FRET liée à une
augmentation de la liaison de l'analogue GTP fluorescent sur tout ou partie
des protéines
Gai1, Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par les anticorps DSV36S et DSV38S. A
l'inverse,
malgré sa capacité à lier les protéines Gailet Gai3 qui sont exprimées de
manière
endogène dans les cellules HEK293 [2], l'anticorps SC 13533 n'a donné aucun
signal de
FRET lorsqu'il a été associé avec le GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium que ce
soit en
absence ou en présence de SNC162. Ces résultats confirment que seuls les
anticorps
selon l'invention ont été capables de générer un signal de FRET.
[0101] La Figure 12 représente la capacité des anticorps DSV 36S, DSV 26S, DSV
3S et
DSV 39S à générer un signal de TR-FRET lorsqu'ils sont associés à un analogue
fluorescent du GTP (GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium) sur des préparations
membranaires non activées sur-exprimant un GPCR. La condition Non specific
signal a
montré qu'un faible signal de FRET basal entre l'analogue fluorescent de GTP
et les
anticorps marqués au d2 était détecté. La condition Negative control
représente le
signal non spécifique de l'essai dans lequel l'excès de GTPgS non marqué
(100pM) a
inhibé la liaison de l'analogue fluorescent de GTP sur les protéines Ga et a
donc
empêché l'apparition d'un signal de FRET. L'inhibition mesurée a été totale
puisque le
niveau de signal HTRF mesuré pour les conditions Non specific signal et
Negative
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control est quasiment identique. Lors de l'ajout de l'analogue fluorescent
de GTP et
des anticorps, une augmentation du signal de FRET liée à une augmentation de
la liaison
des analogues fluorescents de GTP sur tout ou partie des protéines Gai1, Gai2,
Gai3,
Gao et Gaz reconnues par l'anticorps DSV36S a été mesurée. A l'inverse, malgré
leur
capacité à lier les protéines Gai dans les cellules HEK293, les anticorps DSV
26S, DSV 3S
et DSV 39S n'ont donné aucun signal de FRET lorsqu'ils ont été associés avec
le GTPgN-
octyl-C2-Cryptate d'europium. En conclusion, ces résultats confirment que
seuls les
anticorps décrits selon l'invention ont été capables de générer un signal de
FRET.
[0102] La Figure 13 représente la capacité de l'anticorps DSV 36S et sc-13533
à générer
1.0 un signal de TR-FRET lorsqu'il est associé à un analogue fluorescent du
GTP (GTPg0-
Linker-Cy5(P)) sur des préparations membranaires non activées sur-exprimant un
GPCR.
La condition Non specific signal a montré qu'un faible signal de FRET basal
entre
l'analogue fluorescent de GTP et les anticorps marqués au cryptate de Terbium
était
détecté. La condition Negative control représente le signal non spécifique
de l'essai
dans lequel l'excès de GTPgS non marqué (100pM) a inhibé la liaison de
l'analogue
fluorescent de GTP sur les protéines Ga et a donc empêché l'apparition d'un
signal de
FRET. L'inhibition mesurée a été totale puisque le niveau de signal HTRF
mesuré pour
les conditions Non specific signal et Negative control est quasiment
identique.
Lors de l'ajout de l'analogue fluorescent de GTP et des anticorps, une
augmentation du
signal de FRET liée à une augmentation de la liaison de l'analogue fluorescent
de GTP
sur tout ou partie des protéines Gai1, Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par
l'anticorps
DSV36S a été mesurée. A l'inverse, malgré sa capacité à lier les protéines
Gailet Gai3
qui sont exprimées de manière endogène dans les cellules HEK293, l'anticorps
sc-13533
n'a donné aucun signal de FRET lorsqu'il a été associé avec le GTPg0-Linker-
Cy5(P). En
conclusion, seuls les anticorps décrits selon l'invention ont été capables de
générer un
signal de FRET.
[0103] Les Figures 14A et 14B illustrent 2 formats de FRET qui peuvent être
mis en
uvre avec les anticorps selon l'invention (Formats 2A et 2B).
[0104] Les Figures 15A et 15B illustrent un test d'activation selon le format
2A sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0105] Les Figures 16A et 16B illustrent un test d'activation selon le format
2A sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
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[0106] Les Figures 17A et 17B illustrent un test d'activation selon le format
2A sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV38S-d2.
[0107] [Les Figures 18A et 186 illustrent un test d'activation selon le format
2A sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
[0108] Les Figures 19A et 196 illustrent un test d'activation selon le format
2A sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPg0-hexyl-C2 + DSV36S-d2.
[0109] Les Figures 20A et 2013 illustrent un test d'activation selon le format
2A sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
[0110] Les Figures 21A, 216 illustrent un test d'activation selon le format 2A
sur RCPG
Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0111] Les Figures 22A et 22B illustrent un test d'activation selon le format
2A sur RCPG
Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0112] Les Figures 23A et 236 illustrent un test d'activation selon le format
2A sur RCPG
Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0113] Les Figures 24A et 246 illustrent un test d'activation selon le format
2B sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-Cy5 + DSV36S-Lumi4Tb.
[0114] Les Figures 25A et 256 illustrent un test d'activation selon le format
2B sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-AF488 + DSV36S-
Lumi4Tb.
[0115] Les Figures 26A et 266 illustrent un test d'activation selon le format
2A sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 +
DSV36S-
d2.
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Exemples
[0116] Matériel
[0117] Les préparations membranaires de cellules exprimant le récepteur Delta
Opidid
(DOR) ont été achetées chez Euroscreen via une prestation de service.
[0118] Les anticorps DSV36S, D5V385, DSV 26S, DSV 3S et DSV 395 ont été
générés par
Cisbio Bioassays et sont disponibles auprès de Cisbio Bioassays sur demande
(sous les
références respectives DSV36S, DSV38S, DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S).
L'anticorps
DSV36S comprend un domaine variable de la chaîne lourde qui consiste en la
séquence
d'acides aminés SEQ ID NO : 14 et un domaine variable de la chaîne légère qui
consiste
en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO : 15. Les anticorps ont été marqués
avec les
sondes fluorescentes compatibles pour une détection TR-FRET (accepteur rouge ¨
d2 ou
donneur Lumi4Tb).
[0119] Les anticorps SC13533 et SC56536 ont été achetés chez Santa Cruz
Biotechnology
(ref SC13533 et ref SC56536). L'anticorps AM05302PU-N a été acheté chez Acris
Antibodies GmbH (ref AM05302PU-N).
[0120] L'anticorps anti Twin-Strep-tag a été acheté chez IBA Lifesciences (ref
2-1517-001)
et marqué avec une sonde fluorescente compatible avec une détection TR-FRET
(donneur Lumi4Tb).
[0121] L'anticorps anti-FLAG-d2 est disponible auprès de Cisbio Bioassays (Ref
61FG2DLF)
[0122] Les nucléotides GDP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich
(références
catalogues respectives G7127 et G8634).
[0123] L'agoniste des RCPG Delta Opioïde (SNC162) a été acheté chez Tocris
Biosciences
(référence 1529).
[0124] Les plaques 384 puits Lovv volume, blanches à fond blanc et des plaques
96 puits
noires (à fond noir) adaptées à la culture cellulaire ont été achetées chez
Greiner Bio
One (références Catalogue 784075 et 665086 respectivement).
[0125] L'analogue de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable (GTPgN-
octyl-C2)
marqué avec un fluorophore donneur (cryptate d'europium) a été synthétisé par
Cisbio
Bioassays. L'analogue de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable (GTPg0-
Linker-
Cy5(P)) marqué avec un fluorophore accepteur (Cy5) a été acheté chez Jena
Bioscience
(ref NU-834-Cy5).
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[0126] La protéine G alphai1 humaine recombinante fusionnée en N-terminal à un
Tag
Twin-Strep-tag a été produite et purifiée par Cisbio Bioassays
[0127] Les plasmides codant pour les différentes protéines G humaines, Gai1,
Gai2, Gai3,
Gao, Gaz, Gas, Gaq, Ga12 et Ga13 fusionnées dans leur partie N-terminale aux
tags
5 Twin-Strep-tag et FLAG ont été synthétisés et amplifiés par la société
Genecust
(prestation de service).
[0128] Les cellules HEK293 ont été achetées à l'ATCC.
[0129] Les réactifs et milieux utilisés dans les expériences cellulaires,
milieu Opti-MEM,
Lipofectamine 2000 et poly-ornithine ont été achetés respectivement chez
Thernno Fisher
10 Scientific (réf. 51985-026 et 11668-019) et Sigma Aldrich (réf. P4957).
[0130] Méthode
[0131] Lecture du signal FRET (Technologie HTRF)
[0132] Le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG Labtech) avec
la
configuration suivante :
15 = Module : HTRF (Excitation 337nm, Emission 665nm et 620nm)
= Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs
= Fenêtre de lecture : délais : 60p5 ¨ Intégration : 400p5.
[0133] Traitement du signal HTRF
[0134] A partir des signaux bruts à 665nm et 620nm, le Ratio HTRF a été
calculé selon la
20 formule suivante :
Ratio HTRF = Signal à 665nm / Signal à 620nm * 10,000.
[0135] Exemple 1: Protocole pour obtenir des anticorps anti-protéine G alphail
selon l'invention
25 [0136] Immunisation de souris
[0137] La protéine TST-G alphai1 recombinantes (protéine G alphai1 de séquence
UniProt
P63096-1 tagguée en N-terminal avec le tag TvvinStreptag (TST) (IBA) via un
linker TEV)
a été produite dans des cellules d'insectes Sf9 (infection avec un baculovirus
codant
ladite protéine) puis purifiée sur une colonne d'affinité via le tag
TwinStreptag (TST)
(Strep-Tactin Superflow high capacity resin (IBA, Catalogue : 2-1208-002)).
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[0138] Des souris BALB/c ont été immunisées par injection de la protéine TST-G
alphai1
préalablement diluée dans du tampon contenant du GTPgS (HEPES 20mM pH8, NaC1
100mM, MgCl2 3mM, CHAPS 11mM, GTPgS 100pM). La primo-injection a été suivie de
trois rappels à intervalle d'un mois.
[0139] Quinze jours après chaque injection, des ponctions sanguines sur les
souris ont
permis de vérifier la présence d'une réponse immunitaire.
[0140] Pour cela, un test de type ELISA a été mis en place. La protéine TST-G
alphai1
préalablement diluée à 20pg/mL dans du tampon contenant du GTPgS (Tris HCI
20mM
pH8.5, NaC1 140mM, EDTA 2mM, MgCl2 10mM, BSA 0.1%, GTPgS 1pM) a été adsorbée
via le tag TwinStreptag sur des plaques 96 puits contenant de la Strep-
TactinC)XT (IBA,
Catalogue : 2-4101-001). Pour cela, 100p1 de protéine ont été ajoutés dans
chaque puits
puis incubées pendant 2h à 37 C suivi de trois lavages en tampon PBS 1X, 0.05%
Tween20.
[0141] Les dilutions sérielles d'un facteur 10 à 100 millions des ponctions
sanguines ont
ensuite été ajoutées à hauteur de 100pL / puits et incubées pendant 2h à 37 C.
Les
anticorps non fixés à la protéine ont été éliminés par trois étapes de lavages
en tampon
PBS 1X, 0.05% Tween20 puis la détection des anticorps fixés a été réalisée à
l'aide d'un
anticorps secondaire anti-Fc de souris lié à la HRP (horseradish peroxidase)
(Sigma
#A0168 dilué au 1/10 000 dans du PBS, BSA 0.1%). Après 1h d'incubation à 37 C
puis
trois lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20, la révélation de la HRP a été
réalisé
par dosage colorimétrique à 450nm suite à l'incubation de son substrat TMB
(3,31,5,5T-
Tétraméthylbenzidine, Sigma #T0440) pendant 20min à température ambiante sous
agitation.
[0142] Afin de s'assurer que les anticorps détectés par le test ELISA étaient
bien dirigés
contre la protéine G alphai1 et non contre le tag TwinStrepTag, les mêmes
ponctions ont
été testés sur le test ELISA après pré-incubation avec un excès d'une autre
protéine
orthogonale tagguée avec le TwinStrepTag (SNAPTag-TwinStrepTag). Ainsi, les
anticorps
anti tag se fixent sur la protéine orthogonale taguée et donc pas sur la
protéine G
alphai1 attachée au fond des puits ; auquel cas aucun signal HRP ou une
diminution du
signal HRP est détecté.
[0143] Les souris présentant les meilleurs titres d'anticorps et le moins de
baisse de signal
dans le cas contrôle anti tag ont été sélectionnées pour l'étape suivante
d'hybridation
lymphocytaire, aussi appelée fusion. La rate des souris a été récupérée et un
mélange
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des lymphocytes et plasmocystes issus de cette rate a été fusionné in vitro
avec une
lignée cellulaire de myélome en présence d'un catalyseur de la fusion
cellulaire du type
polyéthylène glycol. Une lignée cellulaire de myélome mutante, manquant
l'enzyme
HGPRT (Hypoxanthine Guanosin Phosphoribosyl Transferase) a été utilisée pour
permettre une sélection des cellules hybrides, appelées hybridomes. Ces
cellules ont été
cultivées dans un milieu contenant de l'hypoxanthine, de l'aminopterine
(methotrexate)
et de la thyamine (milieu HAT) pour permettre l'élimination des cellules de
myélome non
fusionnées et ainsi sélectionner les hybridomes d'intérêt. Les cellules de
rate non
fusionnées quant à elle meurent puisqu'elles sont incapables de proliférer in
vitro. Ainsi,
seuls les hybridomes ont survécu.
[0144] Ces hybridomes ont alors été cultivés dans des plaques de culture. Les
surnageants
de ces hybridomes ont ensuite été testés pour évaluer leur capacité à produire
des
anticorps anti protéine G alphai1. Pour cela, un test ELISA comme décrit ci-
dessus a été
réalisé.
[0145] Afin d'évaluer la sélectivité des anticorps entre les différentes
formes de la protéine
Galpahil (forme pleine liée au GDP vs forme pleine liée au GTPgS vs forme
vide), le test
a été réalisé en parallèle sur des conditions de protéine TST-G alphai1 pré-
incubée dans
le tampon contenant soit du GDP à 1pM, soit du GTPgS à 1pM soit sans
nucléotide. Les
meilleurs hybridomes ont ensuite été clonés avec une étape de dilution limite
afin
d'obtenir des clones d'hybridome.
[0146] Les clones d'hybridomes d'intérêt ont ensuite été injectés dans des
souris (injection
intra péritonéale) afin de permettre la production des anticorps en grande
quantité dans
le liquide d'ascite.
[0147] Les anticorps ont ensuite été purifiés par chromatographie d'affinité
sur des colonnes
avec des résines présentant de la protéine A.
[0148] Capacité des anticorps purifiés ci-dessus à entrer en compétition pour
la liaison à la
protéine G alpha avec l'anticorps DSV36S
[0149] Tous les réactifs sont dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCl2
10mM,
BSA 0,1%, NaCI 10mM. La protéine Gal est préparée 2X pour obtenir une
concentration
finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS est préparé 2X pour
obtenir une
concentration finale dans les puits de lOpM. Ces 2 réactifs sont préparés dans
une
même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant d'être
distribués dans les puits. Les anticorps purifiés ci-dessus sont préparés 4X
pour viser des
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concentrations finales dans les puits comprises entre 0.01 et 1pM. L'anticorps
DSV36S-
d2 est préparé 4X pour viser une concentration finale de lOnM.L'anticorps anti
Twin-
Strep-tag-Lumi4 Tb est préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans
les puits
de 0.5nM.
[0150] Les réactifs sont distribués dans les plaques 384 puits de la manière
suivante :
1. 10p1 du mélange pré-incubé de protéine G ail + GTPgS sont placés dans
chaque puit,
2. 5p1 de l'anticorps purifié sont rajoutés dans chaque puit
3. Les plaques sont incubées pendant 30 minutes à température ambiante
4. 5p1 du mélange anticorps anti Tvvin-Strep-tag- Lumi4 Tb et anticorps DSV36S-
d2 sont
lo rajoutés dans chaque puit.
[0151] Les plaques sont incubées 1H à température ambiante avant de lire le
signal HTRF.
[0152] Les anticorps selon l'invention sont capables d'inhiber le signal HTRF
obtenu avec de
l'anticorps DSV36S-d2. A l'inverse, les anticorps qui ne sont pas selon
l'invention ne sont
pas capables d'inhiber le signal généré par le DSV36S-d2.
[0153] Exemple 2: Détermination de l'affinité des anticorps SC13533, DSV36S,
DSV38S marqués au d2 pour la protéine Gail
[0154] Protocole expérimental
[0155] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4,
MgCl2 10mM,
BSA 0,1%, NaCI 10mM. La protéine Gail a été préparée 2X pour obtenir une
concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS a été
préparé 2X pour
obtenir une concentration finale dans les puits de 100pM. Ces 2 réactifs ont
été préparés
dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant
d'être
distribués dans les puits. Les anticorps DSV36S-d2, D5V385-d2 et 5C13533-d2
ont été
préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits comprises
entre 0.01 et
lOnM selon les anticorps. L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb a été
préparé 4X
pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.25nM.
[0156] Les réactifs ont été distribués dans les plaques 384 puits de la
manière suivante :
1) 10p1 du mélange pré-incubé de protéine Gail + tampon seul ou GTPgS ou GDP
ont
été placés dans chaque puit,
2) 5p1 de l'anticorps DSV36S ou DSV38S ou 5C13533 marqué au d2 ont été
rajoutés
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dans chaque puit,
3) 5p1 de l'anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb ont été rajoutés dans
chaque puit.
[0157] Les plaques ont été incubées 24H à température ambiante avant de lire
le signal
HTRF.
[0158] Le schéma réactionnel est illustré à la Figure 1.
[0159] Résultats
[0160] La Figure 2 montre les résultats obtenus avec les anticorps DSV36S,
DSV38S et
SC13533 marqués au d2. En présence de la protéine Gail, un signal HTRF très
significatif est obtenu avec tous ces anticorps en présence et en absence de
nucléotide
(GTPgS ou GDP). Ces résultats indiquent que les anticorps DSV36S, DSV38S et
SC13533
sont capables de lier la protéine Gan.
[0161] De plus les courbes de titration en anticorps réalisées permettent de
calculer l'affinité
(Kd) de ces différents anticorps pour la protéine Gait Ceci a été effectué au
travers du
logiciel GraphPad Prism en appliquant un modèle one site specific binding
aux
données HTRF. Les valeurs de Kd obtenues sont présentées dans le Tableau 1.
Tableau 1:
Kd de l'anticorps Kd de l'anticorps Kd de
l'anticorps
Condition
DSV36S (nM) DSV38S (nM) 5C13533
(nM
Tampon seul 0,82 0,65 0,16
GDP 10pM 0,48 0,29 0,22
GTP 10pM 0,31 0,14 0,26
[0162] Les valeurs de Kd montrent que les 3 anticorps ont une excellente
affinité pour la
protéine Gai1, les valeurs de Kd étant comprises entre 0.1 et 1nM quel que
soit l'état de
la protéine.
[0163] On peut toutefois noter que les anticorps DSV36S et DSV38S présentaient
un signal
et une affinité plus élevés lorsque la protéine Gai1 était liée à un
nucléotide (notamment
GTPgS). A l'inverse, l'anticorps SC13533 présentait un signal et une affinité
similaires
quel que soit l'état de la protéine Gai1. Ceci suggère que l'anticorps SC13533
ne se lie
pas de la même manière que les anticorps DSV36S et DSV38S sur la protéine
Gai1.
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[0164] Exemple 3; Capacité des anticorps non marqués DSV36S, DSV38S, SC
13533, SC56536 et AM05302PU-N à inhiber la liaison de l'anticorps SC13533-
d2 sur la protéine Gi1
[0165] Protocole expérimental
5 [0166] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH
7,4, MgCl2 10mM,
BSA 0,1%, NaCI 10mM. La protéine Gai1 a été préparée 2X pour obtenir une
concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS a été
préparé 2X pour
obtenir une concentration finale dans les puits de 10pM. Ces 2 réactifs ont
été préparés
dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant
d'être
10 distribués dans les puits. Les anticorps froids DSV36S, DSV38S et
SC13533 ont été
préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits comprises
entre 0.01 et
100nM. L'anticorps SC 13533-d2 a été préparé 4X pour viser une concentration
finale de
10nM.L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb a été préparé 4X pour obtenir
une
concentration finale dans les puits de 0.5nM.
15 [0167] Les réactifs ont été distribués dans les plaques 384 puits de la
manière suivante :
1) 10p1 du mélange pré-incubé de protéine Gai1 + GTPgS ont été placés dans
chaque
puit,
2) 5p1 de l'anticorps DSV36S ou DSV38S ou ou SC56536 ou AM05302PU-N ou SC13533
non-marqué ont été rajoutés dans chaque puits,
20 3) Les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température
ambiante,
4) 5p1 de l'anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb et de l'anticorps SC13533-
d2 ont été
rajoutés dans chaque puits.
[0168] Les plaques ont été incubées 1H à température ambiante avant de lire le
signal
HTRF.
25 [0169] Résultats
[0170] La Figure 3 montre les résultats obtenus avec les anticorps DSV 36S,
DSV 38S et SC
13533. De manière logique, l'anticorps SC 13533 non marqué a inhibé
complétement le
signal HTRF obtenu avec de l'anticorps SC 13533-d2. A l'inverse, les anticorps
DSV36S et
DV38S n'ont pas été capables d'inhiber le signal généré par le SC 13533-d2.
Ceci
30 démontre que ces 2 anticorps ne se lient pas sur la même région de la
protéine Gai1 que
l'anticorps SC 13533. En conclusion les anticorps DSV36S et DSV38S
reconnaissent des
épitopes différents de l'anticorps SC 13533.
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[0171] La Figure 4 montre les résultats obtenus avec les anticorps SC13533,
SC56536 et
AM05302PU-N. De manière logique, l'anticorps DSV 5C13533 non marqué a inhibé
complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps 5C13533-d2. [gaiement,
les
anticorps sc-56536 et AM05302PU-N ont inhibé complètement le signal HTRF
obtenu
avec de l'anticorps SC13533-d2. L'anticorps SC 13533 n'entrant pas en
compétition avec
les anticorps DSV36S et DSV38S, et les anticorps SC56536 et AM05302PU-N étant
capable d'inhiber le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps SC13533-d2, les
anticorps sc-
56536 et AM05302PU-N sont donc également des anticorps non-compétiteurs de
l'anticorps DSV 36S.
lo [0172] En conclusion, les résultats présentés en Figures 3 et 4
démontrent que les anticorps
commerciaux sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N sont tous des anticorps non-
compétiteurs de l'anticorps DSV 36S. Tous ces anticorps reconnaissent donc un
épitope
différent de l'anticorps DSV 36S.
[0173] Exemple 4: Capacité des anticorps non marqués DSV3S, SC56536,
AM05302PU-N et SC 13533 à inhiber la liaison de l'anticorps DSV3S-d2 sur la
protéine Gil
[0174] Protocole expérimental
[0175] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4,
MgCl2 10mM,
BSA 0,1%, NaC1 10mM. La protéine Gai1 a été préparée 2X pour obtenir une
concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS a été
préparé 2X pour
obtenir une concentration finale dans les puits de 10pM. Ces 2 réactifs ont
été préparés
dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant
d'être
distribués dans les puits. Les anticorps froids DSV3S, SC56536, AM05302PU-N et
SC
13533_ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits
comprises
entre 0.03 et 300nM. L'anticorps DSV3S-d2 a été préparé 4X pour viser une
concentration finale de 10nM.L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb a été
préparé 4X
pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.25nM.
[0176] Les réactifs ont été distribués dans les plaques 384 puits de la
manière suivante :
1) 10p1 du mélange pré-incubé de protéine Gai1 + GTPgS ont été placés dans
chaque
puit,
2) 5p1 de l'anticorps DSV 3S ou SC56536 ou SC13533 ou AM05302PU-N non-marqués
ont été rajoutés dans chaque puits,
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3) Les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante,
4) 5p1 de l'anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb et de l'anticorps DSV 35-
d2 ont été
rajoutés dans chaque puits.
[0177] Les plaques ont été incubées 1H à température ambiante avant de lire le
signal
HTRF.
[0178] Résultats
[0179] La Figure 5 montre les résultats obtenus. De manière logique,
l'anticorps DSV 3S non
marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV 3S-
d2.
Egalement, les anticorps sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N ont inhibé
complètement
lo le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV 3S-d2. En conclusion, ces
résultats
associés à ceux présentés dans l'exemple 3, démontrent que les anticorps
commerciaux
sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N sont tous des anticorps non-compétiteurs de
l'anticorps DSV 36S. Il en est donc de même pour l'anticorps DSV 3S fait au
laboratoire.
Tous ces anticorps reconnaissent donc un épitope différent de l'anticorps DSV
36S.
[0180] Exemple 5 : Capacité des anticorps non marqués DSV36S, DSV38S, DSV3S,
DSV26S et DSV39S à inhiber la liaison de l'anticorps DSV36S-d2 sur la
protéine Gail
[0181] Protocole expérimental
[0182] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4,
MgCl2 10mM,
BSA 0,1%, NaCI 10mM. La protéine Gai1 a été préparée 2X pour obtenir une
concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS a été
préparé 2X pour
obtenir une concentration finale dans les puits de 100pM. Ces 2 réactifs ont
été préparés
dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant
d'être
distribués dans les puits. Les anticorps froids DSV36S, DSV38S, DSV26S, DSV3S,
et
DSV395 ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les
puits
comprises entre 0.001 et 1pM. L'anticorps DSV36S-d2 a été préparé 4X pour
viser une
concentration finale de 10nM.L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb a été
préparé 4X
pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.25nM.
[0183] Les réactifs ont été distribués dans les plaques 384 puits de la
manière suivante :
1) 10p1 du mélange pré-incubé de protéine Gai1 + GTPgS ont été placés dans
chaque
puit,
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2) 5p1 de l'anticorps DSV36S, DSV38S, DSV26S, DSV3S, et DSV39S non-marqués ont
été
rajoutés dans chaque puit,
3) Les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante,
4) 5p1 de l'anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb et de l'anticorps DSV36S-
d2 ont été
rajoutés dans chaque puit.
[0184] Les plaques ont été incubées 1H à température ambiante avant de lire le
signal
HTRF.
[0185] Résultats
[0186] La Figure 6 montre les résultats obtenus avec les anticorps DSV36S et
DSV38S. De
manière logique, l'anticorps DSV36S non marqué a inhibé complétement le signal
HTRF
obtenu avec l'anticorps DSV36S-d2. L'anticorps DSV38S a aussi inhibé
complètement le
signal généré par le DSV36S-d2. Ceci démontre que ces 2 anticorps se lient sur
la même
région de la protéine Gai1. La Figure 7 montre les résultats obtenus avec les
anticorps
DSV36S, DSV26S, DSV3S et DSV39S. De manière logique, l'anticorps DSV36S non
marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps D5V365-
d2. A
l'inverse, les anticorps DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S n'ont pas été capables
d'inhiber le
signal généré par le DSV 36S-d2. Ceci démontre que ces 3 anticorps ne se lient
pas sur
la même région de la protéine Gai1 humaine que l'anticorps DSV 36S.
[0187] En conclusion seul l'anticorps DSV38S entre en compétition pour la
liaison à la
protéine G alphai avec l'anticorps DSV36S et partage donc le même épitope.
[0188] Exemple 6: Sélectivité des anticorps DSV36S, DSV38S et SC13533 pour les
différents types de protéines Ga lorsque celles-ci sont sur-exprimées dans des
cellules HEK293
[0189] Jour 1 : transfection des cellules HEK293 par des plasmides codant pour
les
différentes protéines Gai1, Gai2, Gai3, Gao, Gaz, Gas, Gaq, Ga12 et Ga13
humaines
[0190] Une solution contenant 1 million de cellules HEK/ml a été préparée en
milieu
OptiMEM. Des mélanges plasmides / Lipofectamine contenant 15Ong/puits de
plasmides
et 0.375p1 de lipofectamine ont été préparés dans du milieu OptiMEM 30 minutes
avant
leur ajout dans la plaque 96 puits à fond noir.
[0191] Distribution des réactifs dans chaque puits de la microplaque noire
adaptée à la
culture cellulaire :
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34
1) 50p1 par puits de poly-ornithine ont été incubés 30 minutes à température
ambiante
puis la solution a été retirée de chaque puits par aspiration.
2) 50p1 de la préparation de HEK293 (densité cellulaire de 50000 cellules par
puits) ont
été rajoutés dans chaque puit
3) 50p1 du mélange plasmides codant pour une protéine G + lipofectamine ont
été
rajoutés dans chaque puit.
[0192] Les microplaques ont été incubées 24H à 37 C et 5 /00O2 (étuve
régulée).
[0193] Jour 2 : test HTRF de mesure de la sélectivité des anticorps DSV36S,
DSV38S et SC
13533
[0194] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4,
MgCl2 10mM,
BSA 0,1%, Triton X100 0.02%. Les anticorps DSV36S-d2, DSV38S-d2 et SC13533-d2
ont
été préparés 4X pour viser une concentration finale dans les puits de 10nM.
L'anticorps
anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb a été préparé 4X pour obtenir une concentration
finale
dans les puits de 0.5nM. Les nucléotides GDP et GTPgS ont été préparés 4X pour
obtenir
une concentration finale dans les puits de 10pM.
[0195] Les réactifs ont été distribués sur les plaques 384 puits de la manière
suivante :
1) Le milieu de culture OptiMEM a été aspiré,
2) 25p1 de tampon ou GDP ou GTP ont été rajoutés dans chaque puit,
3) 25p1 de tampon ont été rajoutés à chaque puit,
4) 25p1 d'anticorps DSV36S-d2 ou DSV38S-d2 ou SC13533-d2 ou anti-FLAG-d2 ont
été
rajoutés dans chaque puit,
5) 25p1 d'anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb ont été rajoutés dans chaque
puit.
[0196] Les microplaques ont été incubées 20H à température ambiante avant de
lire le
signal HTRF.
[0197] Le schéma réactionnel est illustré aux Figures 8A et 8B.
[0198] Résultats
[0199] Les Figures 9 et 10 montrent les résultats obtenus lors de cette
expérience.
[0200] L'utilisation d'une paire d'anticorps Anti-Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb /
Anti-FLAG-d2
permet de vérifier que toutes les protéines Ga encodées par les plasmides
étaient bien
sur-exprimées dans les HEK293. En effet, le signal HTRF obtenu avec chacune
d'entre
elles était très supérieur au signal HTRF obtenu avec la condition négative (
MOCK )
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qui correspond à des HEK293 transfectées avec un plasmide contrôle ne codant
pour
aucun protéine taggée FLAG+ Twin-Strep-tag.
[0201] La surexpression de toutes les protéines Ga étant validée on a pu alors
déterminer le
profil de sélectivité des anticorps DSV36S, DSV38S et SC 13533 en mesurant un
éventuel
5
FRET entre ces anticorps marqués au d2 et l'anticorps Anti-Twin-Strep-tag-
Lumi4 Tb. Les
anticorps DSV36S et DSV38S ont donné un signal HTRF positif lorsque les
protéines
Gai1, Gai2, Gai3, Gao et Gaz étaient surexprimées mais n'ont pas donné de
signal HTRF
lorsque les protéines Gas, Gaq, Ga12 et Ga13 étaient surexprimées. L'anticorps
SC13533
a donné un signal HTRF positif lorsque les protéines Gai1 et Gai3, étaient
surexprimées
10
mais n'a pas donné de signal HTRF lorsque les protéines Gai2, Gao, Gaz, Gas,
Gag,
Ga12 et Ga13 étaient surexprimées. Ces résultats confirment que les anticorps
DSV36S
et DSV38S reconnaissent le même épitope sur les protéines Ga (ils ont le même
profil de
sélectivité et sont compétitifs). Cet épitope est différent de celui reconnu
par l'anticorps
SC13533 qui reconnait un plus petit nombre de protéines Ga.
[0202] Exemple 7: Capacité des anticorps DSV36S, DSV38S, DSV 26S, DSV 39S,
DSV 3S et SC13533 à générer un signal de TR-FRET lorsqu'ils sont associés à
un analogue fluorescent du GTP sur des préparations membranaires sur-
exprimant un GPCR
[0203] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4,
MgCl2 10mM,
BSA 0,1%, NaCI 300nre et 0.5pM GDP. Des membranes HEK293 exprimant le
récepteur
DOR ont été préparés 4X pour viser une quantité finale dans les puits de 10pg.
Les
anticorps DSV36S-d2, DSV38S-d2, SC13533-d2 et anti-FL_AG-d2 ont été préparés
4X
pour viser une concentration finale dans les puits de 10nM. Le GTPgN-octyl-C2
marqué
par un cryptate d'europium a été préparé 4X pour obtenir une concentration
finale dans
les puits de 6nM. Le GTPg0-linker-Cy5 a été préparé 4X pour obtenir une
concentration
finale dans les puits de 50nM. Les nucléotides GTPgS et GDP ont été préparé 4X
pour
obtenir une concentration finale dans les puits de 100pM. Le SNC 162 a été
préparé 4X
pour obtenir une concentration finale dans les puits de 10pM.
[0204] Les réactifs ont été distribués dans les plaques 384 puits de la
manière suivante :
1) 5p1 de membranes DOR ont été placé dans chaque puit,
2) 5p1 de GTPgN-octyl-C2 marqué au cryptate d'europium ou de GTPg0-linker-Cy5
ont
été rajoutés dans chaque puit,
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3) 5p1 d'anticorps DSV36S ou DSV38S ou SC13533 ou DSV 26S ou DSV3S ou DSV 39S
marqués au d2 ou DSV 365 ou 5C13533 marqués au cryptate de terbium ont été
rajoutés dans chaque puits,
4) 5p1 de tampon ou SNC 162 ou GTPgS ont été rajoutés dans chaque puits.
[0205] Les plaques ont été incubées 20H à température ambiante avant de lire
le signal
HTRF.
[0206] Le schéma réactionnel est illustré à la Figure 8A.
[0207] Résultats
[0208] La Figure 11 montre les résultats obtenus lorsque l'on associe
l'analogue GTPgN-
d'europium avec les anticorps DSV36S-d2, DSV38S-d2 et SC13533-d2.
La condition GTPgS représente le signal non spécifique de l'essai (NS)
dans lequel
l'excès de GTPgS non marqué (1001JM) a inhibé la liaison du GTPgN-octyl-C2-
Cryptate
d'europium sur les protéines Ga et a donc empêché l'apparition d'un signal de
FRET. La
condition tampon a montré qu'il était possible d'obtenir un signal de FRET
modéré
mais significatif entre le GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium et les anticorps
DSV36S et
DSV 385 marqués au d2. Lors de l'ajout du SNC162 qui a provoqué l'activation
des
récepteurs DOR sur-exprimés dans les membranes, on a observé une augmentation
de
ce signal de FRET liée à une augmentation de la liaison de l'analogue GTP
fluorescent
sur tout ou partie des protéines Gai1, Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par
les
anticorps DSV36S et DSV38S. A l'inverse, malgré sa capacité à lier les
protéines G:flet
Gai3 qui sont exprimées de manière endogène dans les cellules HEK293 [2],
l'anticorps
SC 13533 n'a donné aucun signal de FRET lorsqu'il a été associé avec le GTPgN-
octyl-C2-
Cryptate d'europium que ce soit en absence ou en présence de SNC162.
[0209] De la même manière, la Figure 12 montre les résultats obtenus lorsque
l'on associe
l'analogue GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium avec les anticorps DSV36S-d2,
DSV26S-
d2, DSV39S-d2 et DSV3S-d2 sur des préparations membranaires non activées sur-
exprimant un GPCR. La condition Non specific signal a montré qu'un faible
signal de
FRET basal entre l'analogue fluorescent de GTP et les anticorps marqués au d2
était
détecté. La condition Negative control représente le signal non spécifique
de l'essai
dans lequel l'excès de GTPgS non marqué (100pM) a inhibé la liaison de
l'analogue
fluorescent de GTP sur les protéines Ga et a donc empêché l'apparition d'un
signal de
FRET. L'inhibition mesurée a été totale puisque le niveau de signal HTRF
mesuré pour
les conditions Non specific signal et Negative control est quasiment
identique.
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Lors de l'ajout de l'analogue fluorescent de GTP et des anticorps, une
augmentation du
signal de FRET liée à une augmentation de la liaison des analogues
fluorescents de GTP
sur tout ou partie des protéines Gai1, Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par
l'anticorps
DSV36S a été mesurée. A l'inverse, malgré leur capacité à lier les protéines
Gai dans les
cellules HEK293 [2], les anticorps DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S n'ont donné
aucun signal
de FRET lorsqu'ils ont été associés avec le GTPgN-octyl-C2-Cryptate
d'europium.
[0210] La Figure 13 montre les résultats obtenus lorsque l'on associe
l'analogue GTPg0-
linker-Cy5 avec les anticorps DSV36S-Tb et SC13533-Tb sur des préparations
membranaires non activées sur-exprimant un GPCR. La condition Non specific
signal a
montré qu'un faible signal de FRET basal entre les analogues fluorescents de
GTP et les
anticorps marqués au cryptate de Terbium était détecté. La condition
Negative control
représente le signal non spécifique de l'essai dans lequel l'excès de GTPgS
non marqué
(100pM) a inhibé la liaison de l'analogue fluorescent de GTP sur les protéines
Ga et a
donc empêché l'apparition d'un signal de FRET. L'inhibition mesurée a été
totale puisque
le niveau de signal HTRF mesuré pour les conditions Non specific signal et
Negative control est quasiment identique. Lors de l'ajout de l'analogue
fluorescent
de GTP et des anticorps, une augmentation du signal de FRET liée à une
augmentation
de la liaison de l'analogue fluorescent de GTP sur tout ou partie des
protéines Gai1,
Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par l'anticorps DSV36S a été mesurée. A
l'inverse,
malgré sa capacité à lier les protéines Gailet Gai3 qui sont exprimées de
manière
endogène dans les cellules HEK293 [2], l'anticorps sc-13533 n'a donné aucun
signal de
FRET lorsqu'il a été associé avec le GTPg0-Linker-Cy5(P).
[0211] L'ensemble de ces résultats confirme que seuls les anticorps selon
l'invention ont été
capables de générer un signal de FRET.
[0212] Exemple 8: mesure de l'activation d'un GPCR par la mise en oeuvre d'un
FRET avec un anticorps selon l'invention marqué.
[0213] Matériel
[0214] Les préparations membranaires de cellules exprimant les récepteurs
étudiés et la
protéine G alphai ont été achetées chez Perkin Elmer ou Euroscreen. Le tableau
ci-
dessous liste les fonds cellulaires et références des différents échantillons
utilisés :
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[0215] Tableau 2 :
Fond cellulaire Fournisseur Référence
Delta Opioïde HEK293 Perkin Elmer
6110549400UA
Delta Opioïde CHO-K1 Euroscreen Service
Dopamine D2S CHO-K1 Euroscreen Service
[0216] L'anticorps DSV36S a été marqué avec les sondes fluorescentes
compatibles pour
une détection TR-FRET (accepteur rouge ¨ d2 ou donneur Lumi4Tb).
[0217] les nucléotides GTP, GDP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich
(références
catalogues respectives G8877, G7127 et G8634).
[0218] les agonistes des RCPG Delta Opioïde (SNC162) et Dopamine D2S (PPHT) et
l'antagoniste du RCPG Delta Opioïde (Naltrindole) ont été achetés chez Tocris
(références catalogues respectives 1529 et 0740).
[0219] les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été
achetées chez
Greiner Bio One (référence Catalogue 784075).
[0220] Les analogues de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable marqués
avec des
fluorophores donneurs ou accepteurs (GTPgN-C2 ; GTPgN-C3 ; GTPgN-octyl-C2 ;
GTPgN-octyl-C11 ; GTPgN-octyl-C3 ; GTPg0-hexyl-C2 ; GTPg0-hexyl-C3 ; GTP-gN-
octyl-
thiosuccinimidyl-C2 ; GTPgN-octyl-Cy5 ; GTPgN-octyl-AF488) ont été synthétisés
par
Cisbio Bioassays.
[0221] Les analogues de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable marqués
avec des
fluorophores accepteurs GTP9O-Linker-Cy5(P) et GTPgS-Linker-Cy5(R) ont été
achetés
chez Jena Bioscience sous les références respectives NU-834-CY5 et NU-1610-
CY5.
[0222] Méthode
[0223] Préparation des réactifs
[0224] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4,
MgCl2 10mM,
BSA 0,1%, NaCI 10mM ou 100mM ou 300mM ou 500mM (concentration spécifiée dans
la
légende de chaque figure), 0 ou 0.5 ou 1pM GDP (concentration spécifiée dans
la
légende de chaque figure). Les membranes ont été préparées 4X pour distribuer
1 ou
10pg/puits (quantité spécifiée dans la légende de chaque figure). Le
nucléotide GTPgS
(condition signal non spécifique) a été préparé 6.67X pour obtenir une
concentration
finale dans les puits de 100pM. Les composés à tester (agonistes ou
antagonistes) ont
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39
été préparés 10X pour obtenir les concentrations finales dans les puits
mentionnées dans
les graphiques. Les anticorps anti-G alphai utilisés pour la détection ont été
préparés 4X
pour viser les concentrations finales dans les puits suivantes : anticorps
DSV36S-d2
(10nM) ; anticorps DSV36S-Lumi4Tb (0.5 ou 1nM) ; anticorps DSV38S-d2 (10nM).
Les
analogues GTP non hydrolisables / lentement hydrolisables marqués avec des
sondes
fluorescentes donneur ou accepteur ont été préparés 4X pour viser les
concentrations
finales dans les puits mentionnées dans les légendes de chaque figure.
[0225] Distribution des réactifs dans les plaques 384 puits :
= Membranes exprimant le RCPG et la protéine G alphai : 5pL
1.0 = Tampon ou nucléotide GTPgS (pour la condition signal non spécifique)
: 3pL
= Analogue GTP non hydrolisables / lentement hydrolisables ¨ donneur ou
accepteur :
5pL
= Anticorps anti G alphai-donneur ou accepteur : 5pL
= Tampon ou Composés à tester (agonistes et / ou antagonistes) : 2pL.
[0226] Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré
avec des puits
contenant un excès de GTPgS (100pM).
[0227] Lecture du signal HTRF
[0228] Les plaques ont été incubées à 21 C pendant 20h (hormis si autrement
spécifié dans
les figures) puis le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG
Labtech)
avec la configuration suivante :
= Module : HTRF (Excitation 337nm, Emission 665nm et 620nm)
= Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs
= Fenêtre de lecture : délais : 60ps ¨ Intégration : 400ps.
[0229] Traitement du signal
[0230] A partir des signaux bruts à 665nm (pour accepteur rouge - Cy5) ou
520nm (pour
accepteurs verts ¨ AF488 ou Fluorescéine) et 620nm, le Ratio HTRF a été
calculé selon
la formule suivante :
Ratio HTRF = Signal à 665nm ou Signal à 520nm / Signal à 620nm * 10,000.
[0231] Formats d'essais
[0232] La Figure 14A illustre le principe d'essai utilisant un analogue non
hydrolysable /
lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET donneur et un
anticorps anti protéine G alpha marqué avec un partenaire de RET accepteur
dans lequel
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l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une augmentation de la
liaison de
l'analogue GTP-donneur à la protéine G et donc une augmentation du signal de
RET
(format 2A).
[0233] La Figure 14B illustre le principe d'essai utilisant un analogue non
hydrolysable /
5
lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET accepteur et un
anticorps anti protéine G alpha marqué avec un partenaire de RET donneur dans
lequel
l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une augmentation de la
liaison de
l'analogue GTP-accepteur à la protéine G et donc une augmentation du signal de
RET
(format 2B).
10
[0234] Test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde (DOR) :
augmentation
du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine G alphai-
accepteur sous
stimulation d'un agoniste.
[0235] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps
anti-G
alphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la
protéine G a
15
été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules
CHO-K1
exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine G alphai. Les conditions
expérimentales
suivantes ont été utilisées :
- Figure 15A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM
final
dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50m1"l
pH7,4 ;
20 MgCl2 10mM ; NaCI 500mM ; BSA 0,1%.
- Figure 16A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM
final
dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4
;
MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.51JM ; BSA 0,1%.
- Figure 17A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV38S-d2 (10nM
final
25
dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4
;
MgCl2 10mM ; NaCI 300m1'vl ; GDP 0.51M; BSA 0,1%.
- Figure 18A : GTPgN-octyl-C11 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM
final
dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4
;
MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5pM ; BSA 0,r/o.
30
- Figure 19A : GTPg0-hexyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM
final
dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4
;
MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.51JM ; BSA 0,1%.
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- Figure 20A : GTPgN-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans
le
puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2
10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5pM ; BSA 0,1%.
[0236] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort
excès de
GTPgS (100pM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces
deux
conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2, GTPgN-octyl-C11, GTPg0-
hexyl-
C2, GTPgN-C2 sont capables de se lier à la protéine G alphai et générer un
signal TR-
FRET avec l'anticorps anti G alphai-accepteur (Figures 16A à 20A).
[0237] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la
proportion
de protéine G alpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes
et
conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. L'augmentation du signal TR-
FRET
(Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la
proportion de
forme protéine G alpha liée au GTP-donneur augmente (i.e. que la forme de la
protéine
G alpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste
entraine la
liaison du GTP-donneur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur
et
entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur
les
Figures 15B, 16B, 17B, 18B, 19B et 20B. Par ailleurs, la Figure 16B montre une
deuxième condition où l'activation par une concentration fixe d'agoniste du
RCPG
SNC162 (200nM) a été inhibée par une concentration croissante d'antagoniste du
RCPG
(Naltrindole). Cette inhibition d'activation est observée par la diminution du
signal TR-
FRET (Ratio HTRF).
[0238] Test d'activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S (D2S) :
augmentation
du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine G alphai-
accepteur sous
stimulation d'un agoniste.
[0239] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps
anti-G
alphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la
protéine G a
été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules
CHO-K1
exprimant le RCPG Dopamine D2S et la protéine G alphai. Les conditions
expérimentales
suivantes ont été utilisées :
- Figure 21A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM
final
dans le puits) ; 10pg membranes CHO-D2S / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4
;
MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; GDP 1pM ; BSA 0,1%.
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- Figure 22A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM
final
dans le puits) ; 10pg membranes CHO-D2S / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4
;
MgCl2 10mM ; NaCI 100mM ; BSA 0,1%.
- Figure 23A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM
final
dans le puits) ; 10pg membranes CHO-D2S / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4
;
MgCl2 10mM ; NaCI 100mM ; GDP 1pM ; BSA 0,1%.
[0240] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort
excès de
GTPgS (100pM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces
deux
conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la
protéine G
1.0 alphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti G alphai-
accepteur (Figures
21A à 23A).
[0241] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la
proportion
de protéine G alpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes
et
conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. L'augmentation du signal TR-
FRET
(Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la
proportion de
forme protéine G alpha liée au GTP-donneur augmente (i.e. que la forme de la
protéine
G alpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste
entraine la
liaison du GTP-donneur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur
et
entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur
les
Figures 21B, 22B et 23B.
[0242] Test d'activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde (DOR) :
augmentation
du signal TR-FRET entre GTP-accepteur et Anticorps anti-protéine G alphai-
donneur sous
stimulation d'un agoniste.
[0243] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-accepteur /
Anticorps anti-G
alphai donneur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la
protéine G a été
mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1
exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine G alphai. Les conditions
expérimentales
suivantes ont été utilisées :
- Figure 24A: GTPgN-octyl-Cy5 (50nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb
(1nM
final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM
pH7,4
; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5pM ; BSA 0,1%. Lecture après 3h
d'incubation à
21 C.
- Figure 25A : GTPgN-octyl-AF488 (50nM final dans le puits) ; DSV36S-
Lumi4Tb (1nM
final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM
pH7,4
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; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5pM ; BSA 0,1%. Lecture après 3h
d'incubation à
21 C.
[0244] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort
excès de
GTPgS (100pM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces
deux
conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-Cy5 et GTPgN-octyl-AF488 sont
capables de se lier à la protéine G alphai et générer un signal TR-FRET avec
l'anticorps
anti G alphai-donneur (Figures 24A à 25A).
[0245] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la
proportion
de protéine G alpha liée au GTP-accepteur a été testée avec les mêmes
membranes et
conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. L'augmentation du signal TR-
FRET
(Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la
proportion de
forme protéine G alpha liée au GTP-accepteur augmente (i.e. que la forme de la
protéine
G alpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste
entraine la
liaison du GTP-accepteur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-
accepteur et
entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur
les
Figures 24B et 25B.
[0246] Test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde (DOR) :
augmentation
du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine G alphai-
accepteur sous
stimulation d'un agoniste.
Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-G
alphai
accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G
a été
mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1
exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine G alphai. Les conditions
expérimentales
suivantes ont été utilisées :
- Figure 26A : GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (7.5nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon
:
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 60mM ; NaCI 150mM ; BSA 0,1%.
[0247] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort
excès de
GTPgS (100pM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces
deux
conditions montre que l'analogue GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 est capable
de se lier
à la protéine G alphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti G
alphai-
accepteur (Figure 26A).
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[0248] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la
proportion
de protéine G alpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes
et
conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. L'augmentation du signal TR-
FRET
(Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la
proportion de
forme protéine G alpha liée au GTP-donneur augmente (i.e. que la forme de la
protéine
G alpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste
entraine la
liaison du GTP-donneur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur
et
entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur
la Figure
26B.
1.0
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Listage de séquences
[0250] Tableau 3
Numéro de séquence Type de séquences Séquence en acides
aminés
SEQ ID NO: 1 VH - CDR1 GFNIKDYY
SEQ ID NO: 2 VH - CDR2 IDPENGNT
SEQ ID NO : 3 VH - CDR3 TRGGGYYSDWYFDV
SEQ ID NO : 4 VL - CDR1 SSVSY
SEQ ID NO: 5 VL - CDR3 QQWSSNPPIT
SEQ ID NO : 6 VH - FR1
EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKAS
SEQ ID NO : 7 VH - FR2 MHWVKQRPEQGLEWIGW
SEQ ID NO : 8 VH - FR3
IYDPKFQGKASITADTSSNTAYLQLSSLT
SEDTAVYYC
SEQ ID NO : 9 VH - FR4 WGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 10 VL - FR1
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSAS
SEQ ID NO : 11 VL- FR2 MHWYQQKSGTSPKRWIY
SEQ ID NO: 12 VL - FR3
KLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEA
EDAATYYC
SEQ ID NO: 13 VL - FR4 FGAGTKLELK
SEQ ID NO : 14 VH
EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFN
IKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPE
NGNTIYDPKFQGKASITADTSSNTAYL
QLSSLTSE DTAVYYCTRGGGYYSDWYF
DVVVGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 15 VL QIV LTQS PAI M SAS PG E
KVTMTCSASSS
VSYM H WYQQ KSGTS PKRWIY DTSKLA
SGVPARFSGSGSGTSYSLTISSM EAE DA
ATYYCQQWSSN PPITFGAGTKLE LK
5 Références citées
[1] Damien Maurel, Oligomérisation des récepteurs couplés aux protéines G:
deux ou plus?
Application des technologies de FRET en temps résolu au cas du récepteur
GABAB. Biologie
cellulaire. Université Montpellier I, 2006.
[2] Atwood et al., BMC Genomics, 2011, 12:14
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