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Conjugués anticorps-médicament anti-CD56 et leur utilisation en thérapie
Domaine Technique
[0001] La présente invention concerne des nouveaux conjugués anticorps-
médicaments comprenant un anticorps dirigé contre l'antigène CD56 couplé à un
médicament cytotoxique et leur utilisation comme médicament, notamment en
thérapie anti-cancéreuse.
Technique antérieure
[0002] Un conjugué anticorps-médicament (en anglais Antibody Drug Conjugate
OU ADC ) constitue un moyen de délivrance sélective d'un médicament
cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la
spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions
effectrices
puissantes par les agents qui leur sont conjugués.
[0003] La structure générale d'un conjugué anticorps-médicament est celle de
la
formule (I). La partie liant l'anticorps et le médicament est appelée bras de
liaison
ou linker. Il peut être greffé sur l'anticorps via l'une au moins des huit
cystéines
formant les 4 ponts disulfures inter-chaînes. Le nombre de molécules de
médicaments cytotoxiques greffées sur l'anticorps détermine un ratio appelé
Drug-to-Antibody Ratio (DAR).
[0004] Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est internalisé dans
la cellule
par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des
lysosomes où le médicament cytotoxique est libéré de l'anticorps via
différents
mécanismes. Le médicament cytotoxique actif agit ensuite sur la cellule en
induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par
transport ou
diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé
comme
vecteur et apporte le médicament cytotoxique dans la cellule ciblée.
[0005] Le carcinome à cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané agressif
survenant chez le sujet âgé. Jusqu'à récemment, le traitement des patients
métastatiques inopérables reposait sur une poly-chimiothérapie à base de sels
de platine, sans bénéfice sur la survie. L'utilisation d'une immunothérapie
ciblant
le PD-L1 (avelumab) en première ligne permet d'obtenir une réponse objective
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chez environ 50% des patients avec un CCM inopérable avec une réponse
durable observée chez la moitié des patients répondeurs. Cependant, la
persistance de patients non répondeurs incite à développer de nouvelles
stratégies thérapeutiques. Dans ce contexte, le développement d'une thérapie
ciblée dans le CCM semble constituer une stratégie prometteuse.
[0006] Dans ce contexte, le CD56 a été identifié comme une cible thérapeutique
fortement exprimée par la majorité des CCM. En effet, le IMGN901 qui est un
ADC anti-CD56 couplé à la mertansine (DM1) par une technologie de première
génération, inhibe la polymérisation de la tubuline. Une tolérance acceptable
de
lo l'IMGN901 a pu être démontrée par plusieurs études de phase I chez les
patients
avec tumeurs solides exprimant le CD56 dont des cas de CCM. De plus, une
étude de phase II a été proposée avec la même molécule dans le carcinome à
petites cellules du poumon, en combinaison avec la chimiothérapie (cisplatine
étoposide). Cette étude n'a pas montré de bénéfice sur la survie du fait de la
survenue fréquente d'effets secondaires dans le groupe traité par IMGN901 et
notamment de neutropénie fébrile (infection liée à une diminution des
neutrophiles) suggérant une toxicité non spécifique du produit. Il existe donc
un
besoin de développer des conjugués anti-CD56-médicament cytotoxiques plus
homogènes, plus stables et donc plus efficaces et/ou qui génèrent moins
d'effets
secondaires. De plus, la technologie décrite dans le présent brevet permet de
délivrer spécifiquement la molécule cytotoxique aux cellules tumorales tout en
limitant son relargage non spécifique dans la circulation limitant de ce fait
les
toxicités non spécifiques induites par la drogue.
Résumé de l'invention
[0007] Un premier objet de l'invention concerne un conjugué anticorps-
médicament
de formule (I) suivanteo. :
___________________________________________________________________________ =
=
Téte em de õ, Médizzerfte nt
õõ
d'accroche heison
cytotoxique
n
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dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment
d'anticorps anti-CD56 ;
la tête d'accroche est représentée par l'une des formules suivantes :
1.,
e 1 X
N i -, H , 0 0
I k '1, ..1\14-- C1-1=
0
\
N )1.(-CE12-
I 0
OH
0
ou X
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules
suivantes :
0
H à'
...
0 ..õ---
;
0
FIN ' 1.
...4,
H ..
..
0 ' NH 2 ou 0 ..
= ,
l'espaceur est représenté par la formule
suivante :
'\,,--' 0
--:;---'--'-o '')Lye
I 1
H .
'
m est un entier allant de 1 à 10;
n est un entier allant de 1 à 4.
[0008] Un second objet de l'invention concerne une composition comprenant un
ou
plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l'invention.
[0009] Un troisième objet de l'invention concerne un conjugué anticorps-
médicament
selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour utilisation comme
médicament.
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[0010] Un quatrième objet de l'invention concerne un conjugué anticorps-
médicament selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour
utilisation dans le traitement d'un cancer CD56+.
[0011] Un cinquième objet de l'invention concerne un procédé de préparation
d'un
conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprenant les étapes
suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique en couplant une tête d'accroche de
formule :
X
X
N 0
X
0
cH27\v? XcH0 m OH
ou H
/ni OH
avec un composé de
formule
Bras de . Médicament
_______________________________ Espaceur
liaison cytotoxique
dans laquelle :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules
suivantes :
0
H
H2f:NylLye
0
HN
.! ,11
-A-mu H2N.'
0 12
OU
l'espaceur est représenté par la formule
suivante :
0
H
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X est Br, CI, I ou F;
m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6,
avantageusement égal à 4 ou 5 ; et
(ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un
anticorps anti-
5 CD56 ou un fragment d'anticorps anti-CD56.
[001210e préférence, le procédé de préparation d'un conjugué anticorps-
médicament selon l'invention comprend une étape qui consiste à faire réagir du
6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-
aminobenzoyle carbamate de MMAE ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-
yl)ami no)-6-oxohexanamide-vali ne-citru Ili ne-p-aminobenzoyle
carbamate de
MMAE avec un anticorps anti-CD56 ou un fragment d'anticorps anti-CD56.
Description détaillée
[0013] Définitions
[0014] Le terme conjugué cytotoxique désigne un conjugué qui comprend un
médicament cytotoxique. Dans le cadre de la présente invention, un conjugué
cytotoxique désigne un conjugué de formule (II) suivante :
Tête ', Bras de !Médicament
Espaceur '¨
d'accroche fiaison cytotoxique
dans laquelle :
la tête d'accroche est représentée par l'une des formules suivantes :
X X
N
H 0
X N/ r H 2 44( \ 0
X
N H
2 im
ou
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules
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suivantes :
N
ô
Hte
F0-1
0'" =Nii2
ou H
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
0
H
X est Br, Cl, I ou F;
m est un entier allant de 1 à 10.
[0015] Le terme médicament cytotoxique désigne toute molécule naturelle ou
de
synthèse, capable d'inhiber ou d'empêcher la fonction et/ou le développement
des cellules. On entend par cytotoxique , la propriété pour un agent
chimique
ou biologique, d'altérer des cellules, éventuellement jusqu'à les détruire.
[0016] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament
cytotoxique est choisi parmi tout composé ayant obtenu une AMM et qui est
utilisé en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire, toute molécule en
cours
d'évaluation clinique en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire. Le
médicament cytotoxique sera choisi par exemple parmi le paclitaxel (Taxo18) ou
le docetaxel (Taxotèree) ou l'un de ses dérivés, le topotecan, le bortezomib,
la
daunorubicine, les analogues de daunorubicine, la vincristine, la mitomycine
C,
l'acide rétinoïque, le méthotrexate, l'ilomédine, l'aspirine, un IMIDs, le
lénalidomide, le pomalidomide.
[0017] Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le
médicament
cytotoxique est sélectionné dans le groupe constitué de la duocarmycine et ses
analogues, les dolastatines, la combretastatine et ses analogues, la
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cal ichéam ici ne, la N-acétyl-y-calichéamyci ne (CMC),
un dérivé de
calichéamycine, la maytansine et ses analogues, tel qu'un dérivé de type
maytansinoïde, par exemple le DM1 et le DM4, les auristatines et leurs
dérivés,
tels que l'auristatine E, l'auristatine EB (AEB), l'auristatine EFP (AEFP), la
monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), la
tubulysine, le disorazole, les epothilones, l'echinomycine, l'estramustine, la
cemadotine, l'eleutherobine, la méthoptérine, l'actinomycine, la mitomycine A,
la
camptothécine, un dérivé de la camptothécine, le SN38, le TK1, l'amanitine,
une
pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, une
pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un intercalant de
l'ADN, un inhibiteur d'histone désacétylase, ou un inhibiteur de tyrosine
kinase.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament M
est
sélectionné parmi l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin,
la toxine diphtérique (DT) et la ricine.
[0018] Dans un mode de réalisation particulier, le médicament cytotoxique est
choisi
parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calichéamicine,
monométhyle auristatine E (MMAE), monométhyle auristatine F (MMAF),
maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazépine, dimère de
pyrrolobenzodiazépine, pyrrolopyridodiazépi ne, dimère
de
pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l'histone désacétylase, un inhibiteur
de
tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE, représentée par la formule
suivante :
t H 9
µf
0 O.
k 0
111-1
[0019] Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré de
l'invention, le
conjugué cytotoxique répond à la formule (lia) suivante :
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o
N ,==
H ete--=====.e., 0 N N =
I 0
õire
0
0 0 r,
t
ef
eipg
04k> *-le
ou à la formule (lia') suivante :
N ? *
0 H 0 0 N H 0
H t
e
,=
0 0 0
===-.
Br
H2N "4-0
[0020] Le terme anticorps , également appelé immunoglobuline désigne un
hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune
(dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa
chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts
disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position
N-
terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH
pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante,
constitué d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre
domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde.
[0021] Par anticorps chimérique , on entend un anticorps dont les séquences
des
régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à
une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes
légères et des chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des
régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement
d'origine
murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et
légères appartiennent à une espèce non-murine. A cet égard, pour les régions
constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles
d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les
bovidés, les
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équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant
pas
exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon l'invention
contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et
légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes
lourdes et légères d'origine murine.
[0022] Par anticorps humanisé , on entend un anticorps dont tout ou partie
des
séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les
régions hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et
parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont
d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des
régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont
d'origine humaine.
[0023] Par anticorps humain , on entend un anticorps contenant uniquement
des
séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des
chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes
lourdes.
[0024] On entend par fragment d'anticorps , toute partie d'une
immunoglobuline
obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au
moins un pont disulfure, par exemple Fab, Fab', F(ab')2, Fab'-SH, scFv-Fc ou
Fc.
[0025] La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère
deux
fragments identiques, qu'on appelle les fragments Fab (Fragment antigen
binding), et un fragment Fc (Fragment cristallisable). La digestion
enzymatique
des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment
Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés
par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des
régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de
la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SH fait référence à un fragment
Fab'
dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol
libre.
Le scFv (single chain Fragment variable) est un fragment issu de l'ingénierie
des
protéines qui est constitué uniquement des domaines variables VH et VL. La
structure est stabilisée par un court bras peptidique flexible, appelé linker,
qui est
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placé entre les deux domaines. Le fragment scFv peut être lié à un fragment Fc
pour donner un scFv-Fc.
[0026] Le terme CD56 désigne le Cluster de Différenciation 56 , qui est
une
glycoprotéine membranaire membre de la super-famille des immunoglobulines
5 (Ig) contenant 5 domaines de type Ig et deux domaines de type 3 de la
fibronectine dans sa partie extracellulaire. Le CD56 est aussi appelé
fréquemment Neural-Cell Adhesion Molecule 1 (NCAM 1) .
[0027] Le terme cancer CD56+ ou c< cancer CD56 positif désigne un cancer
exprimant le CD56. En particulier, le terme cancer C056+ désigne tout cas
lu de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une expression
du
CD56. Une expression du CD56 est fréquemment observée dans les carcinomes
neuroendocrines, les tumeurs pédiatriques et certaines hémopathies. Elle est
également rapportée dans certains mélanomes et sarcomes de tissus mous. De
préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer CD56+ est choisi
parmi le mélanome, les tumeurs de blastème, les hémopathies, telles que les
leucémies aigues myéloïdes, les myélomes, les néoplasies à cellules
dendritiques plasmacytoïdes blastiques et les carcinomes neuroendocrines, tels
que le carcinome à petites cellules du poumon et le carcinome à cellules de
Merkel. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer CD56+ est un carcinome
choisi parmi les carcinomes neuroendocrines, tel que le carcinome à petites
cellules du poumon ou le carcinome à cellules de Merkel, de préférence le
carcinome à cellules de Merkel.
[0028] Au sens de la présente invention, l'identité ou l'homologie est
calculée
en comparant deux séquences alignées dans une fenêtre de comparaison.
L'alignement des séquences permet de déterminer le nombre de positions
(nucléotides ou acides aminés) en commun pour les deux séquences dans la
fenêtre de comparaison. Le nombre de positions en commun est donc divisé par
le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et multiplié par
100
pour obtenir le pourcentage d'identité. La détermination du pourcentage
d'identité
de séquence peut être effectuée manuellement ou grâce à des programmes
informatiques bien connus.
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[0029] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'identité ou
l'homologie
correspond à au moins une substitution, par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10
substitutions, d'un résidu d'acide aminé, de préférence au moins une
substitution
d'un résidu d'acide aminé réalisée de façon conservative. La substitution
d'un
résidu d'acide aminé réalisée de façon conservative consiste à remplacer un
résidu d'acide aminé par un autre résidu d'acide aminé, ayant une chaîne
latérale
possédant des propriétés similaires. Les familles d'acides aminés possédant
des
chaines latérales avec des propriétés similaires sont bien connues, on peut
citer
par exemple les chaines latérales basiques (ex. lysine, arginine, histidine),
les
lo chaines latérales acides (ex. acide aspartique, acide glutamique), les
chaînes
latérales polaires et non chargées (ex. glycine, asparagine, glutamine,
serine,
thréonine, tyrosine, cystéine), les chaînes latérales apolaires (ex. glycine,
cystéine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine,
méthionine,
tryptophane), les chaînes latérales beta-ramifiées (ex. thréonine, valine,
isoleucine) et les chaînes latérales aromatiques (ex. tyrosine, phénylalanine,
tryptophane, histidine).
[0030] Les anticorps ou fragments d'anticorps homologues ou variants
d'anticorps
ou de fragments d'anticorps (c'est-à-dire des anticorps ou fragments
d'anticorps ayant la même fonction) possèdent donc certains acides aminés qui
peuvent être substitués par d'autres acides aminés au niveau des régions
constantes et/ou des régions variables, sans perdre la capacité de liaison à
l'antigène. Il est préférable que cette substitution soit réalisée au sein de
la
séquence d'ADN qui code pour l'anticorps ou le fragment d'anticorps, c'est-à-
dire
que la substitution soit conservative en nature. L'Homme du métier utilise ses
connaissances générales pour déterminer le nombre de substitutions qui peuvent
être réalisés et leur localisation afin de pouvoir conserver la fonction de
l'anticorps ou du fragment d'anticorps. Afin de déterminer la capacité d'un ou
plusieurs variants d'anticorps ou de fragment d'anticorps à se lier
spécifiquement
à un antigène, plusieurs méthodes appropriées, bien connues de l'homme du
métier et décrites dans l'art antérieur, peuvent être utilisées. Les anticorps
ou les
fragments d'anticorps peuvent donc être testés par les méthodes de liaison,
comme par exemple la méthode ELISA, la méthode par chromatographie
d'affinité, etc. Les variants d'anticorps ou de fragments d'anticorps peuvent
être
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générés par exemple par la méthode de phage display permettant de générer
une librairie de phage. Un grand nombre de méthodes sont connues afin de
générer une librairie de phage display et cibler les variants d'anticorps
ou de
fragments d'anticorps ayant les caractéristiques fonctionnelles recherchées.
[0031] Par purifié et isolé , on entend, en se référant à un anticorps
selon
l'invention, que l'anticorps est présent en l'absence substantielle d'autres
macromolécules biologiques du même type. Le terme "purifié" tel qu'utilisé ici
signifie de préférence au moins 75% en niasse, plus préférablement au moins
85% en masse, encore plus préférablement au moins 95% en niasse, et le plus
préférablement au moins 98% en masse d'anticorps, par rapport à l'ensemble
des macromolécules présentes.
[0032] Le terme pharmaceutiquement acceptable signifie approuvé par une
agence réglementaire fédérale ou d'État ou énuméré dans la pharmacopée
américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement
reconnue, destiné à être utilisé chez les animaux et chez l'homme. Une
composition pharmaceutique désigne une composition comprenant un
véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, un véhicule
pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient
ou un véhicule avec lequel l'agent thérapeutique est administré. Ces véhicules
peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris
ceux
d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile
d'arachide,
l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc. L'eau est un
véhicule
préféré lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie
intraveineuse. Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et
de
glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en
particulier
pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiquement acceptables
comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de
sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait
écrémé
en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires.
Lorsque la
composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les
comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec
des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par
exemple de l'amidon de maïs prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de
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l'hydroxypropyl méthylcellulose); des charges (par exemple du lactose, de la
cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des
lubrifiants
(par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par
exemple
l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents
mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent
être
enrobés par des procédés bien connus dans l'état de la technique. Les
préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par
exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées
sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule
approprié avant utilisation. De telles préparations liquides peuvent être
préparées
par des moyens classiques avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables
tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des
dérivés
de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents
émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux
(par
exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales
fractionnées); et des conservateurs (par exemple des p-hydroxybenzoates de
méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique). Les compositions
pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des
aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas. La composition
selon l'invention est de préférence une composition pharmaceutique.
[0033] Le terme traiter ou traitement englobe tout effet bénéfique ou
souhaitable sur une pathologie ou un état pathologique, et peut même inclure
une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie
ou de l'état pathologique. Le traitement peut par exemple impliquer soit la
réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état
pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état
pathologique. Le terme traitement ne signifie pas nécessairement
l'éradication complète ou la guérison de la pathologie, ni des symptômes
associés.
[0034] On entend par spectrométrie de masse native une analyse de
spectrométrie de masse réalisée dans des conditions ne dénaturant pas les
protéines, permettant ainsi de conserver les liaisons non-covalentes. Des
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procédés de spectrométrie de niasse native sont largement décrits dans la
littérature, par exemple dans la référence [4].
[0035] Conjugué anticorps-médicament
[0036] L'invention concerne un conjugué anticorps-médicament de formule (I)
suivante :
ee--
,
- -5 ly: eàT:fte, , ..Eõ,1 fi:::: tie ,õ,
0
= e. he = on
__________________________________________________ ... ______________________
:
espaceur õ,, 'Médicament i
cytotoxique
n
dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment
d'anticorps anti-CD56 ;
la tête d'accroche est représenté par l'une des formules suivantes :
,. ---
1
AI 0
H i s,
l(e, _--=-: , . L ..,. N 2-; I CH2\ 0
\ CH 1.0 0 et H /m>
-
,
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules
suivantes :
--.õ...,..,-
0
T
S' N "..-
H
.,,
O
0
) H
HN
ou
H
0 .
,
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
CA 03166699 2022- 8- 1
WO 2021/170961 PCT/FR2021/050332
0
sx, )
N
H
m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6,
avantageusement égal à 4 ou 5 ;
n est un entier allant de 1 à 4.
5
[0037] L'anticorps ou le fragment d'anticorps anti-CD56 selon l'invention peut
être
d'origine mammifère (ex. humain ou de souris), humanisé ou chimérique. Il
s'agit
de préférence d'un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par
des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement décrites
dans l'art antérieur.
1.0
[0038] Lorsque A est un anticorps anti-CD56, il s'agit de préférence d'une
IgG, par
exemple IgG1, lgG2, IgG3 ou IgG4.
[0039] Dans un mode de réalisation particulier, A est un anticorps ou un
fragment
d'anticorps anti-CD56 qui comprend :
- un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence
15
d'acides aminés SEQ ID NO: 1, un CDR2 de séquence en acides aminés SEQ
ID NO: 2, et un CDR3 de séquence en acides aminés SEQ ID NO: 3; et
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence
d'acides aminés SEQ ID NO: 4, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID
NO: 5, et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 6.
[0040] Dans ce mode de réalisation particulier, le domaine variable de chaine
légère
présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie,
par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au
moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence
d'acides aminés SEQ ID NO: 15; et le domaine variable de chaine lourde
présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la
séquence d'acides aminés SEQ ID NO :16.
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16
[0041] Ainsi, A peut être un anticorps ou un fragment d'anticorps de séquence
en
acides aminés SEQ ID NO : 15 pour le domaine variable de la chaine légère et
de séquence en acides aminés SEQ ID NO: 16 pour le domaine variable de la
chaine lourde.
[0042] Dans un mode de réalisation particulier, A est un anticorps de séquence
en
acides aminés SEQ ID NO: 7 pour la chaine légère et de séquence en acides
aminés SEQ ID NO: 8 pour la chaine lourde. La chaîne lourde de séquence en
acides aminés SEQ ID NO : 8 peut également présenter une lysine additionnelle
en position C terminal.
[0043] Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, A est l'anticorps
décrit
sous la référence m906 dans la demande US 2018/0214568 Al et dans
référence [1]. L'anticorps m906 est un anticorps anti-CD56 chimérique de type
IgG1 de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 pour la chaine légère et de
séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 pour la chaine lourde.
[0044] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-
médicament de
l'invention a l'une des formules suivantes .
.,
\
e. , ,,,,, (11.,, = u
1 ...-..... i.,:?,,e/ \
i 1
' . q 1 ()..\-Nj µ)' )4µ = - Y "t' , '''' gi' \
õ ...,L .
) 0 r om
CV Mie
\ I
OU
\
/
\
9
7 = y
, ,
, ,
=
õ .. ,
, ,
i H I H Ji fõ 1 1 g .j:,
'
: -...,, ,,. 11-. ri --" Isr " ' C.'
e . H :: H
0 ;
0 --NH
0HI
'
=
/ I '(..- t
.;
A 1-=µ; ei. His.e '
/ . ..,:s
0' SH,
_
.
/ n
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque A est m906, le conjugué
anticorps-médicament de l'invention a la formule (la) suivante :
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m906
cri Xrr
t\rIty I o o
o
H É H
NH
0INH2
ou a la formule (la') suivante=
:
0 riXm,))
tr- .
s o H E H
NH
m906 11 ox.
Hr=IJ
)
0-NH2 dle
[0045] Le conjugué anticorps-médicament identifié dans les exemples sous la
référence MF-m906-MMAE correspond à un conjugué anticorps-médicament
de formule (la). m906 correspond à l'anticorps m906, c'est-à-dire un
anticorps anti-CD56 humain de type IgG1 de séquence en acides aminés SEQ
ID NO : 7 pour la chaine légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8
1.0 pour la chaine lourde.
[0046] Avantageusement, le conjugué anticorps-médicament selon l'invention est
purifié (ou isolé) en mettant en uvre des techniques de purification connues,
telle que la purification sur colonne de chromatographie et / ou d'affinité.
[0047] Lorsque n est égal à 1, le conjugué anticorps-médicament est
communément
appelé DAR1 . Lorsque n est égal à 2, le conjugué anticorps-médicament est
communément appelé DAR2 . Lorsque n est égal à 3, le conjugué anticorps-
médicament est communément appelé DAR3 Lorsque n est égal à 4, le
conjugué anticorps-médicament est communément appelé DAR4 .
[0048] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-
médicament
présente une ou plusieurs fonctions effectrices médiées par la partie Fc
atténuée.
De préférence, la ou les fonctions effectrices médiées par la partie Fc
est/sont
choisies parmi l'ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) et la
CDC
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(Complement-dependent cytotoxicity). L'Homme du métier n'aura aucune
difficulté à atténuer une ou plusieurs fonctions effectrices médiées par la
partie
Fc au regard de l'enseignement de l'art antérieur, par exemple en mutant la
partie Fc. De nombreuses mutations sont connues pour diminuer les fonctions
effectrices médiées par la partie Fc. Il peut s'agir par exemple d'une
mutation
visant à déglycosyler de la partie Fc, notamment à supprimer la glycosylation
au
niveau de l'asparagine 297.
[0049] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-
médicament
est déglycosylé au niveau de la partie Fc, par exemple le conjugué anticorps-
médicament ne porte plus de glycosylation au niveau de l'asparagine 297.
[0050] Composition
[0051] L'invention concerne également une composition comprenant un ou
plusieurs
conjugué(s) anticorps-médicament de formule (I), par exemple de formule (la)
ou
de formule (la'), tel que défini ci-dessus. Il peut s'agir d'une composition
pharmaceutique comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament
de formule (I) tel que défini ci-dessus, par exemple de formule (la) ou de
formule
(la'), et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
[0052] La composition selon l'invention a la caractéristique d'être
particulièrement
homogène, ce qui peut se traduire par une meilleure stabilité, une meilleure
efficacité et/ou une diminution des effets secondaires de la composition, par
rapport à une composition qui n'est pas homogène.
[0053] Avantageusement, lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la
composition selon l'invention se caractérise par les caractéristiques
suivantes :
a) au moins 50%, de préférence au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%,
par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au
moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au
moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal
à 4 ;
b) le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3 et 4,5, de
préférence compris entre 3,5 et 4, entre 3,7 et 4, entre 3,8 et 4, par exemple
égal
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à 3,9 0,1, par exemple égal à 3,89. Le DAR moyen est généralement déterminé
par la méthode HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) ou par
spectrométrie de masse native. La méthode HIC et la méthode de spectrométrie
de masse native sont largement décrites dans la littérature. Il peut être cité
par
exemple la référence [3] pour la méthode HIC et la référence [4] pour la
méthode
de spectrométrie de masse native ;
C) au moins 95%, de préférence au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%,
au moins 99% des conjugués anticorps-médicament sont présents sous forme de
monomère. Le pourcentage de monomère est généralement déterminé par la
lo
méthode SEC (Size Exclusion Chromatography). La méthode SEC est largement
décrite dans la littérature, par exemple dans la référence [2] ;
d) un ou plusieurs des ratios de n définis ci-après ; ou
e) une combinaison de deux, trois ou quatre caractéristiques choisies parmi
a), b,
c) et d).
[0054] Lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition selon
l'invention peut se caractériser par des ratios de n
ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins
de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,2%, moins de 0,1%, par
exemple environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont
un n égal à 1,
- moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins
de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% des conjugués
anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 25%, moins de 20%, moins de 18%, moins de 17% des conjugués
anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 56%, au moins 57%, au moins 58%,
au moins 59%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins 71%, au
moins 72%, au moins 73%, au moins 74% des conjugués anticorps-médicament
de la composition ont un n égal à 4.
[0055] Lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition selon
l'invention peut également se caractériser par des ratios de n ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 70, entre 0% et 0,75%, entre
0%
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et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1% des conjugués anticorps-
médicament de la composition ont un n égal à 1,
- entre 0% et 10%, entre 0% et 7%, entre 0% et 6%, entre 3% et 6%, entre 5% et
6%, entre 0% et 5%, entre 0% et 4%, entre 0% et 3%, entre 0% et 2%, entre 0%
5 et 1% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal
à 2,
- entre 0% et 25%, entre 5% et 20%, entre 10% et 20%, entre 15% et 17% des
conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 85%, entre 50% et 80%, entre 50% et 75%, entre 70% et 85%, entre
70% et 80%, entre 70% et 75%, entre 50% et 60%, entre 55% et 60%, des
10 conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0056] Les ratios de n peuvent être déterminés par la méthode HIC (Hydrophobic
Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0057] Dans un premier mode de réalisation particulier, lorsque A est un
anticorps,
par exemple m906, la composition selon l'invention peut se caractériser par
des
15 ratios de n déterminés par la méthode HIC (Hydrophobic Interaction
Chromatography) ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins
de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,2%, moins de 0,1% des
conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1,
20 - moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, par
exemple environ 5,5% des conjugués anticorps-médicament de la composition
ont un n égal à 2,
- moins de 25%, moins de 20%, moins de 18%, moins de 17%, par exemple
environ 16% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n
égal à3, et/ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 56%, au moins 57%, au moins 58%,
au moins 59%, par exemple environ 60% des conjugués anticorps-médicament
de la composition ont un n égal à 4.
[0058] Ainsi, lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition
selon
l'invention peut également se caractériser par des ratios de n déterminés par
la
méthode HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography)
ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 /o, entre 0% et 0,75%, entre
0%
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et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1% des conjugués anticorps-
médicament de la composition ont un n égal à 1,
- entre 0% et 10%, entre 0% et 7%, entre 0% et 6%, entre 3% et 6%, entre 5% et
6% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 25%, entre 5% et 20%, entre 10% et 20%, entre 15% et 17% des
conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 75%, entre 50% et 60%, entre 55% et 60%, des conjugués
anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0059] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, lorsque A est un
anticorps,
par exemple m906, la composition selon l'invention peut se caractériser par
des
ratios de n déterminés par spectrométrie de masse native ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins
de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,2%, moins de 0,1%, par
exemple environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont
un n égal à 1,
- moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins
de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, par exemple
environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal
à 2,
- moins de 25%, moins de 20%, moins de 18%, moins de 17% des conjugués
anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 56%, au moins 57%, au moins 58%,
au moins 59%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins 71%, au
moins 72%, au moins 73%, au moins 74% des conjugués anticorps-médicament
de la composition ont un n égal à 4.
[0060] Ainsi, lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition
selon
l'invention peut également se caractériser par des ratios de n déterminés par
spectrométrie de masse native ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1%, entre 0% et 0,75%, entre 0%
et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1% des conjugués anticorps-
médicament de la composition ont un n égal à 1,
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- entre 0% et 10%, entre 0% et 7%, entre 0% et 6%, entre 0% et 5%, entre 0% et
4%, entre 0% et 3%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1% des conjugués anticorps-
médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 25%, entre 5% et 20%, entre 10% et 20%, entre 15% et 17% des
conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 85%, entre 50% et 80%, entre 50% et 75%, entre 70% et 85%, entre
70% et 80%, entre 70% et 75% des conjugués anticorps-médicament de la
composition ont un n égal à 4.Lorsque A est un anticorps, la composition selon
l'invention peut également comprendre des DARO, c'est-à-dire des anticorps
1.0 sans conjugué cytotoxique. De préférence, moins de 10%, moins de 9%,
moins
de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%,
moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,5%, moins de 0,4%, moins de 0,2%,
moins de 0,1% de DARO, par exemple environ 0% de DARO. Le pourcentage de
DARO peut être déterminé par la méthode HIC (Hydrophobic Interaction
Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0061] La composition selon l'invention peut également comprendre des DAR5,
c'est-à-dire des conjugués anticorps-médicament ayant 5 conjugués
cytotoxiques. De préférence, moins de 25%, moins de 20%, moins de 15%,
moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins
de 5% de DAR5. La présence de DAR5 dans des compositions de conjugués
anticorps-médicament est largement décrite dans la littérature, néanmoins la
structure exacte des DAR5 est peu étudiée. Ainsi, le DAR moyen est calculé en
tenant compte de l'ensemble des DARs présents dans la composition, c'est-à-
dire les DARO, les DAR1 (i.e. n=1), les DAR2 (i.e. n=2), les DAR3 (i.e. n=3),
les
DAR4 (i.e. n=4), les DAR5, etc. De préférence, lorsque A est un anticorps, la
composition selon l'invention ne comprend pas de DAR supérieur à DAR5, par
exemple DAR6, DAR7, etc. Les pourcentages de DAR5 et plus peuvent être
déterminés par la méthode HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) ou
par spectrométrie de masse native. Dans un mode de réalisation très
particulier,
la composition selon l'invention présente le profil HIC de la Figure 1 ou le
profil
de spectrométrie de masse native de la Figure 3.
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[0062] Utilisation thérapeutique
[0063] L'invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de
formule (I) selon l'invention ou une composition comprenant un conjugué
anticorps-médicament de formule (I) selon l'invention pour utilisation comme
médicament, par exemple pour utilisation dans le traitement d'un cancer CD56-
E,
tel que le mélanome, les tumeurs de blastème, les hémopathies, telles que les
leucémies aigues myéloïdes, les myélomes, les néoplasies à cellules
dendritiques plasmacytoïdes blastiques et les carcinomes neuroendocrines.
Avantageusement, le cancer CD56+ est choisi parmi les carcinomes
neuroendocrines, tel que le carcinome à petites cellules du poumon ou le
carcinome à cellules de Merkel, de préférence le carcinome à cellules de
Merkel.
[0064] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l'invention
est de
préférence formulé pour une administration parentérale, par exemple une
administration intravasculaire (intraveineuse ou intra-artérielle),
intrapéritonéale
ou intramusculaire. Le terme administré par voie parentérale , tel
qu'utilisé ici,
désigne des modes d'administration autres que l'administration entérale et
topique, généralement par injection, et comprend, sans limitation,
l'administration
intravasculaire, intraveineuse, intramusculaire, intra-artérielle,
intrathapsale,
intracapsulaire, intraorbitaire, intratumorale, intracardiaque, intradermique,
intra-
péritonéale, par injection, perfusion transtrachéale, sous-cutanée, intra-
articulaire, sous-capsulaire, sous-arachnoïdienne, intraspinale et
intrasternale.
L'administration par voie intraveineuse est préférée dans le cadre de la
présente
invention, par exemple par perfusion intraveineuse.
[0065] La dose de conjugué anticorps-médicament administrée à un sujet qui en
a
besoin variera en fonction de plusieurs facteurs, y compris, sans limitation,
la
voie d'administration, le type et la gravité de la pathologie traitée, l'état
du patient,
la corpulence du patient, l'âge du patient, etc. L'Homme du métier peut
facilement déterminer, sur la base de ses connaissances dans ce domaine, la
plage posologique requise en fonction de ces facteurs et d'autres. La dose
appropriée peut également être déterminée avec des modèles animaux ou avec
des essais cliniques. Par exemple, les doses typiques de conjugué anticorps-
médicament selon l'invention peuvent être de 5 mg/m2 à 250 mg/m2, par exemple
de 30 mg/m2à 150 mg/m2, de 5 mg/m2 à 75 mg/m2, de 75 mg/m2à 120 mg/m2, par
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exemple égale à 100 mg/m2, 75 mg/m2, 60 mg/m2. L'administration peut se faire
en une seule fois ou, plus généralement, en plusieurs fois. Le schéma
d'administration peut comprendre une dose de charge initiale puis des doses
d'entretien, par exemple hebdomadaires, toutes les 2 semaines, toutes les
trois
semaines, tous les mois, ou plus. La durée de traitement peut varier selon la
pathologie traitée et le sujet.
[0066] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l'invention
peut
être utilisé en monothérapie ou en association avec des médicaments dont
l'intérêt thérapeutique est reconnu dans la pathologie considérée. Il peut
s'agir
par exemple du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du
cyclophosphamide, du lenalidomide, de la dexamethasone, du carboplatine, de
l'etoposide, ou d'un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel
qu'un
anti-PD1 ou anti-PD-L1.
[0067] La description concerne également une méthode de traitement d'un cancer
CD56 chez un sujet comprenant l'administration au sujet d'une quantité
thérapeutique efficace d'un conjugué anticorps-médicament de formule (I) selon
l'invention ou d'une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament
de formule (I) selon l'invention.
[0068] Procédé de préparation
La description concerne également un procédé de préparation d'un anticorps-
médicament de formule (I) tel que défini ci-dessus, dans lequel on fait réagir
un
conjugué cytotoxique de formule (II) suivante :
______________________________________________________ =
Tête Bras de L. Médicament
Espaceur
d'accroche liaison cytotoxique
tel que défini ci-dessus, avec un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-
CD56
tel que défini ci-dessus.
[0069] L'invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué anticorps-
médicament selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique en couplant une tête d'accroche de
formule :
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X X
N N 0
H 0
X N ,J=C H2µ_fe
X \CH2X
0 OH ou H 4., OH
avec un composé de formule
Bras de Médicament
_______________________________ Espaceur ¨
liaison cytotoxique
dans laquelle :
5 le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les
formules
suivantes :
0
H yLio,
1-12i\X[r
0
H N H
N
0 NH2 112.N Ir
OU 0 =
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
0
N
H
10 X est Br, Cl, I ou F;
m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6,
avantageusement égal à 4 ou 5 ; et
(ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un
anticorps anti-
CD56 ou un fragment d'anticorps anti-CD56.La tête d'accroche est décrite plus
15 en détail dans la définition de conjugué cytotoxique et dans la
partie
conjugué anticorps-médicament ci-dessus, à la différence que la tête
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d'accroche mise en oeuvre dans le procédé comprend une fonction acide
carboxylique terminale.
[0070] Le bras de liaison est décrit plus en détail dans la définition de
conjugué
cytotoxique et dans la partie conjugué anticorps-médicament ci-dessus, à
la
différence que le bras de liaison mise en uvre dans le procédé comprend une
fonction amine terminale.
[0071] L'espaceur est décrit plus en détail dans la définition de conjugué
cytotoxique et dans la partie conjugué anticorps-médicament ci-dessus.
[0072] Le médicament cytotoxique est décrit plus en détail dans la définition
de
conjugué cytotoxique et dans la partie conjugué anticorps-médicament ci-
dessus.
[0073] L'anticorps anti-CD56 est décrit plus en détail dans la définition de
conjugué
cytotoxique et la partie conjugué anticorps-médicament ci-dessus.
[0074] Lorsque le médicament cytotoxique est MMAE, l'étape (i) permet
d'obtenir un
conjugué cytotoxique de formule (11a) ou (11a').
[0075] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un
conjugué cytotoxique selon l'étape (i) comprend une étape qui consiste à
coupler
de l'acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoIque ou de l'acide 6-
((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoïque avec le
valine-
citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE ou un sel de ce composé. Dans
ce mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un conjugué
cytotoxique selon l'invention permet d'obtenir du 6-(2,6-
bis(bromométhyl)pyridin-
4-yl)amido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate
de
MMAE ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanamide-
valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE, respectivement.
[0076] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un
conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprend une étape qui
consiste à faire réagir du 6-(2,6-bis(bromométhyppyridin-4-yl)amido-N-
hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE ou du 6-
((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-
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aminobenzoyle carbamate de MMAE avec un anticorps anti-CD56 ou un
fragment d'anticorps anti-CD56.
Brève description des figures
[0077] [Fig. 1] représente le profil HIC (Hydrophobic Interaction
Chromatography)
d'une composition de conjugué anticorps-médicament selon l'invention. La
figure
montre que la composition est enrichie en DAR4, avec plus de 50% de DAR4.
[0078] [Fig. 2] représente une analyse SEC (Size Exclusion Chromatography)
d'une
composition de conjugué anticorps-médicament selon l'invention. La figure
montre que la composition est extrêmement homogène, avec plus de 99% de
monomère.
[0079] [Fig. 3] représente une analyse spectrométrique de masse native sur un
spectromètre de masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H-
Class de Waters (Wilmslow, UK) d'une composition de conjugué anticorps-
médicament selon l'invention. Cette méthode permet d'identifier avec certitude
chaque espèce de DAR. La figure montre que la composition est enrichie en
DAR4, avec près de 75% de DAR4.
[0080] [Fig. 4] représente l'expression du CD56 sur différentes lignées
cellulaires (4
de CCM et une lignée contrôle de cancer du sein) par cytométrie en flux après
incubation avec l'anticorps anti-CD56 marqué avec le fluorophore FITC
(Fluorescein IsoThioCyanate).
[0081] [Fig. 5A], [Fig 513], [Fig 50], [Fig 50], [Fig 5E] représentent
l'évaluation des
performances de l'ADC MF-m906-MMAE, comparées aux contrôles m906
(anticorps non couplé), MF-TTZ-MMAE (ADC Trastuzumab couplé à MMAE) et
MMAE (toxine seule) sur les lignées cellulaires de CCM (Figure 5A: WaGa,
Figure 5B : PeTa, Figure 5C: MS-1 et Figure 5D : MKL-2) et de cancer du sein
(Figure 5E : SK-BR3). Les expériences ont été réalisées de façon indépendante
deux fois (6 réplicats biologiques/expérience). Les résultats sont exprimés en
moyenne (+/-SEM) du pourcentage obtenu.
[0082] [Fig. 6A-6C] représente l'évaluation de la spécificité de MF-m906-MMAE
dans
les lignées WaGa après knock-down du 0D56. Les cellules WaGa ont été
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transduites indépendamment avec des vecteurs lentiviraux contenant deux
shRNA distincts inductibles par doxycycline (Dox) (A, B et C) et ciblant les
séquences du CD56. Après sélection antibiotique (puromycine), les cellules ont
été exposées à la doxycycline pendant 7 jours avant évaluation. (A-B-C) :
Confirmation du knock-down du CD56 par RT- qPCR en temps réel (A) (*:
p<0.05, les cellules contrôles sans doxycycline sont utilisées en tant que
référence), par Western blot (masse attenue du CD56 = 140 KDa) (B). (C)
Évaluation de l'effet cytotoxique de MF-m906-MMAE sur les cellules exprimant
le
CD56 (-Dox) ou non (+Dox) en utilisant trois shRNA différents (Sh RNA A, Sh
1.0 RNA B et Sh RNA C). Les expériences ont été réalisées de façon
indépendante
deux fois (6 réplicats biologiques/expérience). Les résultats sont exprimés en
moyenne (+/-SEM) du pourcentage obtenu.
[0083] [Fig. 7] illustre l'évaluation des performances du conjugué MF-m906-
MMAE et
des contrôles (PBS et MF-TTZ-MMAE un ADC Trastuzumab couplé à MMAE) en
modèle xénogreffes de CCM. La Figure 7 représente les courbes de volume
tumoral relatif (moyenne +/-SEM) durant l'étude. Les volumes tumoraux relatifs
(VTR) sont calculés en utilisant comme référence le volume tumoral de début
d'étude (Volume à j0 =100%). Chaque point représente la moyenne de VTRs
pour les groupes traités par le MF-m906-MMAE, le MF-TTZ-MMAE et le PBS, les
flèches grises indiquent les temps d'injections.
[0084] [Fig. 8] illustre l'évaluation des performances du conjugué MF-m906-
MMAE et
des contrôles (PBS et MF-TTZ-MMAE un ADC Trastuzumab couplé à MMAE) en
modèle xénogreffes de CCM. La figure 8 représente le poids des tumeurs en fin
d'étude dans le groupe expérimental et les groupes contrôles (*: p <0.05). Les
lignes horizontales sont les moyennes, les quartiles et les limites.
[0085] [Fig. 9] représente l'évaluation des performances de l'ADC MF-m906-
MMAE,
comparée aux contrôles m906 (anticorps non couplé), MF-TTZ-MMAE (ADC
Trastuzumab couplé à MMAE) et MMAE (toxine seule) sur la lignée cellulaire de
carcinomes à petites cellules du poumon H69. Les expériences ont été réalisées
de façon indépendante trois fois (6 réplicats biologiques/expérience). Les
résultats sont exprimés en moyenne (+/-SEM) du pourcentage obtenu.
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Exemples
[0087]Exemple 1 : synthèse d'un coniuqué cytotoxique selon l'invention
Schéma réactionnel général
H0
, .0g
0i , .0g
1
.... ,,..7" ., , __ irl e. e õ * f µ,
ciii 6'4 014 OH ir 1
3 ft' 7z, Me, s
a 1
1: N i',<n; 2 -4.= Fi, .< fi, .4 ' =-=4**, Fe .< ti, 7
J f in
H I .. H e ..T. g
e, , . , , õ:4,;) ..õ
,.H,,,.3.1, ,
' ri Li' tf' I % n.
L. 7 f37 fse, iir àf =
f.>_
7 6
(a) BnON, SOCl2, DOM, 18h, 7500; (b) APS, Me0H, H20, H2SO4, 1h, 5000; (c) H2,
Pd/C, Me0H, 2h, TA; (d) HATU, 2,6-lutidine, DMF, H2N-(CH2)5-COOMe, 15h, 0
C, puis TA; (e) PBr3, MeCN, 2h, 45 C; (f) Li0H, THF, H20, 8,5h, TA; (g) EEDQ,
DIPEA, DMF, MeCN, H2N-VCPABC-MMAE, 2h20, 25 C.
[0088] Schéma réactionnel détaillé
lo [0089]Préparation de l'isonicotinate de benzyle (2)
9 sel0 0 8
3
2 =,,,,..6 4 7 " 12
I
=c?1 e 5
[0090] m ¨ (2)
[0091] L'acide isonicotinique (1) (5,00 g ; 40,614 mmol ; 1,0 eq) a été
solubilisé
dans le chlorure de thionyle (15 mL ; 206,77 mmol ; 5,1 eq) et chauffé à
reflux
pendant la nuit. Après retour à température ambiante, l'excès de chlorure de
thionyle a été éliminé par évaporation sous pression réduite, puis le résidu
obtenu a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (55 mL). L'alcool
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benzylique a été additionné (4,2 mL ; 40,614 mmol ; 1,0 eq) et le mélange a
été
agité à reflux pendant 10 h. Après retour à température ambiante, le milieu
réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de
sodium et extrait avec du dichlorométhane (3x100 mL). Les phases organiques
5 ont été rassemblées, lavées avec une solution saturée de chlorure de
sodium,
séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le
produit obtenu a été purifié par chromatographie flash (SiO2,
cyclohexane/acétate d'éthyle 50:50) pour donner (2) (6,97 g ; 80%) sous la
forme
d'une huile incolore.
lo [0092] RMN 1H (300 MHz, DMSO) 58,80 (dd ; J= 6,1 ; 1,6 Hz ; 2H1,5), 7,86
(dd ; J=
6,1 ; 1,6 Hz, 2H2,4), 7,56 - 7,29 (m ; 5H9_13), 5,39 (s ; 2H7).
[0093] RMN 130 (75 MHz, DMSO) 5165,0 (106) ; 151,3 (201,5) ; 137,2 (103) ;
136,1
(1C8) ; 129,0 (2010,12) ; 128,8 (1Cii) ; 128,6 (209,13) ; 123,0 (202,4) ; 67,4
(1C7).
[0094] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C13H11NO2 [M] : 213,0790 ;
15 observée 213,0796.
[0095]Préparation de 2,6-bis(hydroxymethypisonicotinate de benzyle (3)
9 11
0 0 8 12
6 13
3
2 4
15 HO =======' OH 17
rsi
[0096] 14i (3)
[0097]Lisonicotinate de benzyle (2) (2,48 g ; 11,630 mmol ; 1,0 eq) a été
20 solubilisé dans le méthanol (43 mL), agité à 50 00 et de l'acide
sulfurique
concentré (320 I_ ; 6,016 mmol ; 0,52 eq) a été ajouté. Une solution de
persulfate d'ammonium (26,500 g ; 116,000 mmol ; 10,0 eq) dans l'eau (43 mL) a
été ajoutée en deux étapes : un premier ajout rapide de 30 gouttes, une
suspension blanche se forme, puis en goutte à goutte rapide pendant 5 min. La
25 réaction s'emballe jusqu'à 75 C, puis la solution jaune obtenue a été
agitée à
50 C pendant 1 h supplémentaire. Après retour à température ambiante, le
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méthanol a été évaporé sous pression réduite. 50 mL d'acétate d'éthyle ont été
ajoutés et le milieu a été neutralisé par ajout d'une solution saturée
d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase aqueuse a été extraite avec de
l'acétate d'éthyle (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été
lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de
magnésium, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par
chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/méthanol, 95:5) pour donner (3)
(1,56 g ; 49%) sous la forme d'un solide beige.
[0098] RMN 1H (300 MHz, DMSO) O 7,81 (s; 2H2,4) ; 7,55- 7,32 (ni ; 5H9-13) ;
5,60 (t
io ; J= 5,9 Hz ; 21-115,17) ; 5,40 (s ; 2H7) ; 4,59 (d ; J. 5,9 Hz ; 41-
114,10-
[0099] RMN 13C (75 MHz, DMSO) 5 165,0 (106) ; 162,8 (2C1,5) ; 138,0 (1C3) ;
135,7 (1C8) ; 128,6 (2C10,12) ; 128,4 (1C11) ; 128,3 (209,13) ; 117,0 (2C2,4)
;
66,9 (1C7) ; 63,9 (2C14,16).
[0100] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C15H15N04 [M] : 273,1001 ;
observée 273,1001.
[0101] Préparation de l'acide
2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinique (4)
,A0 OH 7
6
2 4
Ho 5 OH il
1 N
8 10 (4)
[0102] Le 2,6-bis(hydroxyméthyl)lsonicotinate de benzyle (3) (1,33 g ; 4,867
mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le méthanol (50 mL) et la solution a été
dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Du palladium sur charbon 10% wt (133
mg) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante
sous
atmosphère d'hydrogène pendant 2 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur
dicalite
(rinçage méthanol). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour
donner
(4) (849 mg ; 95%) sous la forme d'un solide beige.
[0103] RMN11-1 (300 MHz, DMSO) 67,78 (s ; 2H2,4) ; 5,54 (s large ; 2H9,11) ;
4,59 (s;
4H8,10)=
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[0104] RMN 13C (75 MHz, DMSO) O 166,7 (1G6); 162,5 (2C1,6) ; 139,4 (1C3) ;
117,3
(2C2,4) ; 64,0 (2C8,10).
[0105] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C81-19N04 [M] : 183,0532 ;
observée
183,0526.
[0106]Préparation du 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate
de méthyle (5)
7 0
0
3 8 IO 12
2 4
5
15OH
OH
[0107] 16 (5)
[0108] L'acide 2,6-bis(hydroxyméthyl)lsonicotinique (4) (50 mg; 0,273 mmol;
1 eq) a été dissous dans le N,N-diméthylformamide anhydre (3,0 mL), la
solution
a été refroidie à 0 C, puis le HATU (156 mg; 0,410 mmol ; 1,5 eq) et la 2,6-
lutidine (147,0 .1_ ; 1,260 mmol ; 4,7 eq) ont été ajoutés. La solution
d'activation a
été agitée à 0 C pendant 15 min puis le 6-aminohexanoate de méthyle (59 mg;
0,322 mmol; 1,2 eq) a été ajouté. Les parois du ballon ont été rincées avec 2
mL
de N,N-climéthylformamide anhydre et le milieu réactionnel a été agité à
température ambiante pendant 15 h. Le mélange réactionnel a été dilué dans
l'acétate d'éthyle, lavé à trois reprises avec une solution saturée de
chlorure de
sodium, séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré sous pression
réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash
(dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (5) (76 mg ; 91%) sous la forme
d'un solide blanc cassé.
[0109] RMN 1H (300 MHz, DMSO) O 8,79 (t; J. 5,6 Hz; 1H7) ; 7,71 (s ; 2H2,4) ;
5,50
(t ; J= 5,8 Hz; 2H16,18) ; 4,57 (d ; J= 5,8 Hz ; 4H15,17) ; 3,57 (s; 3H14) ;
3,25 (m ;
2H8) ; 2,30 (t; J= 7,4 Hz ; 2H12) ; 1,62 - 1,45 (m ;4H911) ; 1,37 - 1,21 (m ;
2H10).
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[0110] RMN 13C (75 MHz, DMSO) O 173,3 (1C13) ; 165,1 (1G6); 161,8 (21,5) ;
142,9
(103) ; 115,8 (2024 ; 64,1 (2015,17) ; 51,2 (1C14) ; 38,5 sous le DMSO (1C8) ;
33,2
(1G12); 28,6 (1C9) ; 25,9 (1G11); 24,2 (1C10)-
[0111] SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C15H22N205 [M] : 310,1529 ;
observée 310,1526.
[0112]Préparation du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de
méthyle (6)
7 0
0 14
316 13 0
8 10 12
2 4
l 5
Ne.' 16
[0113] Br Br (6)
[0114] Le 6((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (5)
1.0 (55 mg ; 0,177 mmol ; 1 eq) a été mis en suspension dans l'acétonitrile
anhydre
(10,5 mL) puis le tribromure de phosphore (50 pl_ ; 0,532 mmol ; 3,0 eq) a été
ajouté goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à 45 C pendant 2 h.
La
solution a été refroidie à 0 C, neutralisée avec de l'eau (10 mL) et extraite
à
l'acétate d'éthyle (3x15 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées
15 avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de
magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par
chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/acétate d'éthyle 60:40) pour donner
(6) (57 mg ; 74%) sous la forme d'un solide blanc.
[0115] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) 58,83 (t, J= 5,6 Hz ;1H7) ; 7,84 (s ; 2H2,4) ;
4,74
(s ; 4H15,16) ; 3,57 (s, 3H14) ; 3,31 - 3,20 (m ; 2118) ; 2,31 (t; J = 7,4 Hz
; 2H12) ;
1,64 - 1,45 (m ; 41-19,11) ; 1,39 - 1,22 (m, 2H10).
[0116] RMN 13C (75 MHz, DMSO) 5 173,3 (1013) ; 163,8 (106) ; 157,5 (201,5) ;
144,2
(1C3) ; 120,8 (202,4) ; 51,2 (1C14) ; 38,9 sous le DMSO (105) ; 34,1 (2015,16)
; 33,2
(1012) ; 28,5 (1C9) ; 25,9 (1011) ; 24,2 (1 C10)=
[0117] SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C15H20Br2N203 [M] : 433,9841 ;
observée 433,9832.
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[0118]Préparation de l'acide 6-(2,6-
bis(bromométhyl)pyridin-4-
yl)amidohexanoïque (7)
7 0
0 11
14,
3 6 e IO 12 13 H
2
15 r\r 16
[0119] Br Br (7)
[0120] Le 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (6)
5 (57 mg ; 0,131 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane (4
mL) et
une solution d'hydroxyde de lithium hydraté (8 mg ; 0,327 mmol ; 2,5 eq) dans
l'eau (4 mL) a été ajoutée doucement. Le milieu réactionnel a été agité à
température ambiante pendant 8,5 h. Le tétrahydrofurane a été évaporé sous
pression réduite et le résidu aqueux a été traité avec une solution aqueuse
1.0 d'acide chlorhydrique 1N et extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x10
mL). Les
phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de
chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous
pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash
(dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (7) (44 mg ; 80%) sous la forme
d'un solide blanc.
[0121] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) 5 12,00 (s ; 1H14) ; 8,83 (t ; J= 5,5 Hz ; 1H7)
;
7,84 (s ; 2H2,4) ; 4,74 (s ; 4H15,17) ; 3,31 - 3,21 (m ; 2H8) ; 2,21 (t ; J =
7,3 Hz ;
2H12) ; 1,60 - 1,46 (m ; 4H9,11) ; 1,39- 1,25 (m ; 2H10).
[0122] RMN 130 (75 MHz ; DMSO) 5 174,4 (1013) ; 163,8 (106) ; 157,5 (201,6) ;
144,1
(1C3) ; 120,8 (202,4) ; 39,0 sous le DMSO (1C8) ; 34 ,1 (2C15,18) ; 33,6
(1C12) ;
28,6 (109) ; 26,0 (1011) ; 24,2 (1C10).
[0123] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C14H1913r2N203[M+H] : 420,9757 ;
observée
420,9752.
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Préparation de 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-N-hexanamide-
valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
(8)
ï eit 0
=-=
O NH
4.? efj
erINTireeµ'/
0 , 0
(8)
[0124] Sous atmosphère inerte, dans l'obscurité et en conditions anhydres,
l'acide 6-
5 (2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque (7) (13,2 mg; 0,0313
mmol ; 2,28 eq) a été dissous dans l'acétonitrile anhydre (1,2 mL) puis la N-
éthoxycarbony1-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ) (21,2 mg; 0,0857 mmol;
6,25 eq) a été ajouté. Le milieu d'activation a été agité à 25 C pendant 1 h
20.
Une solution de sel d'acide trifluoroacétique de valine-citrulline- p-
aminobenzoyle
1.0 carbamate de MMAE (17,0 mg ; 0,0137 mmol ; 1,0 eq), solubilisé dans du
N,N-
dinnéthylfornnannide anhydre (300 L) en présence de N,N-
diisopropyléthylannine
(9,4 I_ ; 0,0537 mmol ; 3,92 eq), a été ajoutée au milieu d'activation. Le
milieu
réactionnel obtenu a été agité à 25 C pendant 1 h. Le mélange a été dilué par
2
avec du N,N-diméthylformamide et purifié par chromatographie liquide haute
15 pression semi-préparative (tR = 22,1 min ; sur le système Gilson PLC
2050
[ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254
nm à 25 C; colonne Waters XBridgeTM C-18; 5 lm (250 mm x 19,00 mm) ;
élution réalisée avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique (en volume) dans l'eau
(solvant A), et de l'acétonitrile (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32
min
20 puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mUmin) pour donner (8) (18,2 mg ; 87%)
sous
la forme d'un solide blanc.
[0125] RMN 1H (300 MHz, DMSO) (ppm) 10,04 - 9,95 (m ; 1H) ; 8,94 - 8,79 (m ;
1H) ; 8,20 -8,06 (rn ; 2H) ; 7,98 -7,87 (m ; 1H) ; 7,84 (s; 2H) ; 7,81 (s; 1H)
;
7,70 - 7,61 (m ; 1H); 7,58 (d ; J= 8,2 Hz ; 2H) ; 7,38- 7,11 (m ; 6H) ; 6,07-
5,92
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(rrl ; 1H) ; 5,47 - 5,37 (m ; 1H) ; 5,15 - 4,96 (m ; 1H) ; 4,73 (s ; 4H) ;
4,54 - 4,29
(m ; 2H) ; 4,32 - 4,12 (m ; 1H) ; 4,05 - 3,92 (lm ; 1 H) ; 3,30 - 3,08 (m ;
9H) ; 3,06
- 2,93 (m ; 2H) ; 2,91 - 2,77 (ni ; 2H) ; 2,24 - 2,05 (m ; 2H) ; 2,21 - 2,11
(m ; 3H)
; 2,02 - 1,88 (m ; 1H) ; 1,60 - 1,44 (m ; 5H) ; 1,36 - 1,13 (m ; 4H) ; 1,08 -
0,93
; 6H) ; 0,93 - 0,67 (m ; 28H).
[0126] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C72H111Br2N12014 [M+H]' : 1525,6704 ;
observée 1525,6700.
[0127] Exemple 2: synthèse d'un coniuqué anticorps-médicament selon
l'invention
[0128]Code du produit synthétisé : MF-m906-MMAE (correspondant à la formule
(la), également appelé ci-après conjugué anticorps-médicament selon
l'invention ou de manière générale ADC ).
[0129] Anticorps utilisé pour produire le conjugué anticorps-médicament selon
l'invention : m906.
[0130] Préparation des solutions
[0131] Tampon de bioconjugaison : Tampon salin 1X, par exemple phosphate,
borate, acétate, glycine, tris(hydroxymethyl)aminométhane, acide 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineéthanesulfonique dans une plage de pH comprise
entre 6 et 9, avec une concentration finale en NaCI comprise entre 50 et 300
mM
et une concentration finale en EDTA comprise entre 0,1 et 10 mM.
[0132] m906 à une concentration comprise entre 1 et 10 mg/mL dans le tampon de
bioconjugaison.
[0133] Réducteur : Solution d'un réducteur choisi parmi le dithiotréitol, le
13-
mercaptoéthanol, l'hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine, la
tris(hydroxypropryl)phosphine à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM
dans le tampon de bioconjugaison.
[0134] Solution de linker : composé 8 à une concentration comprise entre 0,1
et 10
mM dans un mélange de solvants organiques choisis parmi le diméthylsulfoxide,
le N,N-diméthylformamide, le méthanol, le tétrahydrofurane, l'acétonitrile, le
N,N-
diméthylacétamide, le dioxane.
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[0135] Réaction de bioconjuqaison
[0136] Sous atmosphère inerte, au m906 dans le tampon bioconjugaison (1 mg ; 1
éq) a été ajouté le réducteur (4 à 100 éq) puis le tout a été incubé entre 15
et 40
C pendant 0,25 à 3 h puis la solution de composé 8 (4 à 100 éq) a été ajoutée
sous atmosphère inerte et le milieu réactionnel a été agité entre 15 et 40 C
pendant 0,5 à 15 h. Cette réaction a été dupliquée, en parallèle, autant de
fois
que nécessaire pour obtenir la quantité d'ADC final souhaitée, i.e. 18 fois.
[0137] Purification de l'ADC
[0138] Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du
tampon PBS Gibco pH 7,4 le nombre de fois nécessaire pour éliminer les
réactifs
chimiques résiduels, i.e. purifié 3 fois.
[0139] Résultat
[0140] Les étapes décrites ci-dessus ont permis d'obtenir 12,87 mg de MF-m906-
MMAE (71%).
[0141]Exemple 3: analyses du coniuciué anticorps-médicament (MF-m906-
MMAE)
[0142] Analyse HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography)
[0143] Matériel et méthode
[0144] L'ADC MF-m906-MMAE a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant
d'être filtré sur 0,22 im. 50 lig de produits ont été injectés sur une colonne
MAbPac HIC-Butyl, 5 lm, 4,6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une
chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une
détection à 280 nm. L'ADC MF-m906-MMAE a été élué à un débit de 1 mL/min
par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM
phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu'à 20%
de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v),
pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu'à 85% de tampon B dans le tampon A en 30
minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 1 min. La température a été
maintenue à 25 C tout au long de la séparation.
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[0145] Les résultats obtenus pour MF-m906-MMAE sont présentés en Figure 1, et
dans le Tableau 1 ci-dessous.
[0146] [Table 1]
MF-m906-MMAE DAR 0 DAR 1 DAR 2 DAR 3 DAR 4 DAR 5
Temps de
8,65 10,87 12,39 18,36 21,47
25,9
rétention (min)
Aire ( /(:)) 0,39 0,09 5,45 16,20 59,69
18,17
DAR moyen 3,89
[0147] Analyse SEC (Size Exclusion Chromatography)
[0148] Matériel et méthode
[0149] L'ADC MF-m906-MMAE a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant
d'être filtré sur 0,22 11.m. 50 lig de produits ont été injectés sur une
colonne
AdvanceBio SEC 2.7 11m, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une
io chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (2998) réglé pour
une
détection à 280 nm. L'ADC MF-m906-MMAE été élué à un débit de 1 mL/min par
un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM
de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM
d'azoture de sodium, pH 7,0) en 24 minutes. La température a été maintenue à
25 C tout au long de la séparation.
[0150] Les résultats sont présentés à la Figure 2 et dans le Tableau 2 ci-
dessous.
[0151] [Table 2]
MF-m906-MMAE Agrégats Monomères
Temps de rétention (min) 4,862 8,253
Aire (%) 0,64 99,36
[0152] Analyse MS native (native Mass Spectrornetry)
[0153] Matériel et méthode
[0154] L'analyse spectrométrique de masse a été réalisée sur un spectromètre
de
masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H-Class de Waters
(Wilmslow, UK). Avant l'analyse MS, les échantillons (20 ug) ont été dessalés
sur
une colonne de dessalage BEH SEC 2,1 x 150 mm 300 A par un gradient
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isocratique (50 mM d'acétate d'ammonium, pH 6,5) à 40 lL/min. Une vanne de
dérivation a été programmée pour permettre au solvant d'entrer dans le
spectromètre entre 6,5 et 9,5 min seulement. Les données MS ont été acquises
en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 500 à 8000 à 1 Hz
et analysées en utilisant le logiciel UNIFI 1.9 et l'algorithme MaxEnt pour la
déconvolution.
[0155] Les résultats sont présentés à la Figure 3 et dans le Tableau 3 ci-
dessous.
[0156] [Table 3]
MF-m906-MMAE DAR 0 DAR 1 DAR 2 DAR 3 DAR 4 DAR 5
MW (Da)1 n.o.2 n.o.2 152572 153945 155315
156686
Aire (%) 0 0 0,7 17,0 74,5
7,7
DAR moyen 3,89
1 : glycosylation GOF/GOF
2 : n.o. = non observé
GOFIGOF
*IP
r*
[0157] Exemple 4: évaluation in vitro du coniuoué anticorps-médicament MF-
m906-MMAE
[0158]4.1. Reconnaissance des cellules tumorales par le m906 : carcinome à
cellules de Merkel
[0159]Immunohistochimie sur tumeurs de patients
[0160] Matériel et méthode
[0161] Le marquage immunohistochimique avec un anticorps commercial anti-CD56
(123C3, Ventana, Prediluted) a été réalisé sur une cohorte de 90 tumeurs CCM
incluses dans un tissue micro array en utilisant une plate-forme benchMark XT
en suivant les instructions du fournisseur. L'expression du CD56 a été évaluée
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par un homme du métier en utilisant le score semi-quantitatif suivant : 0 :
absence d'expression, 1 : positivité faible et/ou hétérogène ; 2 : positivité
intense
et diffuse.
[0162] Résultats : De manière générale, 66% des cas étaient positifs (n = 59)
avec
5 une expression intense et diffuse (score 2) détectée dans 37% des cas (n
= 33).
[0163]Cytométrie en flux et Immunohistochimie sur les lignées de CCM
[0164] Matériel et méthode
[0165] Pour évaluer l'expression du CD56 par les lignées cellulaires, les
cellules
tumorales ont été incubées en présence d'un anticorps anti-0D56 couplé au
1.0 FITC (BioLegend , clone : HCD56) ou de l'isotype contrôle selon les
indications
fournies par le fabricant. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois en
PBS +
16"/0 de sérum de veau foetal puis analysées.
[0166] Pour l'évaluation de la fixation du m906 et du trastuzumab (anticorps
anti-
HER2 contrôle) sur les cellules tumorales, des marquages immunocytochimiques
15 ont été effectués avec l'anticorps m906 utilisé à 650 ng/ml, ou
l'anticorps
trastuzunnab (Herceptin 150 mg Roche) à 40 ng/nnl puis révélés à l'aide d'un
anticorps secondaire couplé à la péroxidase.
[0167] Lignées cellulaires testées
[0168] WaGa (RRID:CVCL E998).
20 [0169] MS-1 (RRID:CVCL_E995).
[0170] PeTa (RRID:CVCL LC73).
[0171] MKL-2 (RRID:CVCL_D027).
[0172] Résultats :
[0173] Les cellules WaGa, MS-1, PeTa et MKL-2 sont des lignées cellulaires de
25 carcinome à cellules de Merkel (ci-après CCM). Toutes les lignées ci-
dessus sont
0D56-positives (Figure 4).
[0174] SK-BR-3 (RRID :CVCL_0033) : lignée de cancer du sein HER2-positive,
choisie comme contrôle car n'exprime pas le CD56.
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[0175] Les fixations du m906 et du trastuzumab (TTZ), inclus comme contrôle,
ont
été testées sur les lignées par étude immunohistochimique. Cette analyse
montrait une fixation du m906 sur l'ensemble des lignées de CCM alors qu'il
n'était pas observé de fixation avec le TTZ (Tableau 4 : confirmation de la
fixation
du m906 sur les lignées de CCM).
[0176] [Table 4]
Lignée
cellulaire WaGa MS-1 PeTa MKL-2 SKBR3
Fixation du
m906
Fixation du
Trastuzumab
: présence d'une fixation de l'anticorps à la cellule cible révélée par la
péroxidase, - absence de fixation
[0177]Cytométrie de flux d'imagerie - m906 et coloration de compartiment
intracellulaire et acquisition d'image
[0178] Matériel et méthode
[0179] Pour confirmer son internalisation dans les cellules tumorales,
l'anticorps
m906 a été conjugué avec l'Alexa Fluor 750 en utilisant le kit "SAIVI Rapid
Antibody Labeling Kit" (Thermoscientific) selon les instructions données par
le
fabricant. Les cellules WaGa (500 000 cellules) ont été incubées pendant 30
min
à température ambiante avec le conjugué m906-Alexa Fluor 750 dans une
solution tampon (PBS 1X, 2% sérum de veau fétal, 0,1% d'azide de sodium). Les
cellules ont ensuite été fixées à l'aide du BD Cytofix/Cytoperm (BD
Biosciences)
et perméabilisées avec du Permwash (BD Biosciences, dilué à 1/10e) selon les
instructions du fabricant. Les compartiments nucléaire et lysosomal ont été
marqués par le Hoechst 33342 (BD Pharmigen, 1/10000) et un anticorps anti-
LAM P1 couplé à la phycoerythrin-Cyanine 5 (BD Pharmigen, H4A3),
respectivement. L'analyse des cellules marquées a été réalisée à l'aide d'un
cytomètre imageur en flux Amnis lmageStream X Mark II (Amnis Corp., une
partie d'EMD Millipore, Seattle, WA) équipé de 4 lasers (375 nm, 488 nm, 642
nm
et 785 nm (SSC)). Les images des WaGa ont été capturées avec le logiciel de
cytométrie de flux d'imagerie InspireTM au grossissement 60X et avec une
profondeur de champ étendue (EDF).
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[0180] Des compensations ont été réalisées avant chaque analyse. Les cellules
d'intérêt ont été identifiées en utilisant l'outil Gradient RMS de l'image
Bright
Field (BF : lumière blanche). Les débris et les doublets cellulaires ont été
exclus
de l'analyse en fonction du rapport d'aspect par rapport à la parcelle de zone
de
l'image BF. La surface et l'intensité moyenne de fluorescence intracellulaire
(IMF)
du m906 conjugué à l'Alexa Fluor 750 (canal 12) a été évaluée pour deux temps
d'incubation différents (5 et 30 min) à l'aide des outils surface mask et
cytoplasm mask avec le logiciel IDEAS v6.2. Le score d'internalisation du
m906 conjugué à l'Alexa Fluor 750 (canal 12) a été déterminé en utilisant la
fonction d'internalisation permettant de définir le rapport de l'intensité de
fluorescence intracellulaire sur l'intensité des cellules entières. Les
cellules avec
anticorps internalisés ont des scores positifs. L'assistant de co-localisation
utilisant la fonction de similitude de détail lumineux (BDS) a été employé
pour
quantifier le niveau de colocalisation entre l'anticorps anti-LAMP1 conjugué à
la
phycoerythrine-Cyanine 5 (canal 5) et le m906 conjugué à l'Alexa Fluor 750
(canal 12). Le score positif de BDS (n. 1) indique la localisation lysosomale
du
m906.
[0181] Résultats
[0182] Le m906 anticorps anti-CD56 est internalisé dans le lysosome dans les
cellules WaGa exprimant le CD56 (Tableau 5). C'est une étape cruciale pour la
libération de drogues par un ADC, ce qui fait du m906 un bon candidat
anticorps
pour le développement d'un ADC.
[0183] [Table 5]
Nombre
Fluorescence
Durée de Surface de Score
Intracellulaire Score
BDS*2
d'incubation cellules fluorescence d'internalisation (minutes)
dans le m906 (MFI*1) du m906
du m906
(LAMP1/m906)
(MF*1)
focus I
5 8617 930 50046 7.08 1.4
5223 580 50464 7.96 1.4
*1Mean Fluorescence Intensity
25 *2 Bright Detail Similarity
[0184] 4.2. Cvtotoxicité de MF-m906-MMAE sur les lignées in vitro
[0185]Evaluation de la viabilité (test de prolifération)
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[0186] Matériel et méthode
[0187] Pour évaluer la viabilité cellulaire, un test de cytotoxicité par le
XTT a été
réalisé. Les cellules ont été déposées en 7 réplicas dans une plaque 96 puits
(50
000 cellules/puits). Les ADCs MF-m906-MMAE et MF-TTZ-MMAE (ADC
contrôle) ont été ajoutés en concentrations incrémentielles. Le milieu de
culture a
servi de contrôle négatif. Après 4 jours d'exposition à la drogue, 25 I de
réactif
XTT ont été ajoutés par puits et l'absorption a été mesurée à 450 nm après 4
heures d'incubation à 37 C. L'absorption à 620 nm a été utilisée comme
référence.
[0188] Résultats
[0189] L'évaluation de la cytotoxicité sur lignées cellulaires a montré que
l'ADC MF-
m906-MMAE est aussi cytotoxique que la MMAE libre (IC50 entre 1-10 nM) pour
toutes les lignées de CCM. Par ailleurs, ni l'anticorps m906 (i.e. non couplé
à
MMAE), ni l'ADC MF-TTZ-MMAE (ADC contrôle) n'ont d'effet cytotoxique sur ces
mêmes lignées aux plus faibles concentrations efficaces testées démontrant
l'absence de toxicité intrinsèque de la construction Figure 5).
[0190] L'évaluation de la cytotoxicité sur la lignée H69 (RRID:CVCL_1579), une
lignée cellulaire de carcinome à petites cellules du poumon, a montré que
l'ADC
MF-m906-MMAE est aussi cytotoxique que la MMAE libre (IC50 entre 1-2 nM).
Par ailleurs, ni l'anticorps m906 (Le. non couplé à MMAE), ni l'ADC MF-TTZ-
MMAE (ADC contrôle) n'ont d'effet cytotoxique sur cette lignée aux plus
faibles
concentrations efficaces testées démontrant l'absence de toxicité intrinsèque
de
la construction Figure 9).
[0191] 4.3. Confirmation de la spécificité du m906 : L'effet cytotoxique
observé est
dépendant de CD56 (Figure 6)
[0192] Plasmides et transduction lentivirale
[0193] Matériel et méthode
[0194] Trois shRNA ciblant la séquence du 0D56 ont été générés (séquences
obtenues à partir du Consortium RNAi (A : TR0N0000373085 (SEQ ID NO 9-10)
/ B: TRCN0000373034 (SEQ ID NO 11-12) / C : TRCN0000073460 (SEQ ID
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NO 13-14)) et clonés dans un vecteur lentiviral FH1tUTG comme décrit
précédemment [5]. A noter, dans cette construction, l'activité du promoteur
contrôlant la transcription des séquences de shRNA est inductible par la
doxycycline. Les surnageants lentiviraux ont été produits dans les cellules
HEK293T (RRID:CVCL_0063) comme précédemment décrit [6-7]. Le surnageant
récolté a été stérilisé par filtration (0,45 m) et du polybrène a été ajouté
(1 g/m1)
avant l'infection. Après 14-20 h d'incubation avec les surnageants contenant
les
lentivirus, les cellules cibles ont été lavées puis soumises à une sélection
antibiotique (puromycine). Pour l'invalidation de l'expression du CD56 dans
les
1.0 lignées tumorales (knock-down), les cellules ont été exposées à la
doxycycline
pendant 7 jours avant analyse.
[0195] Résultats
[0196] La cytotoxicité induite par MF-m906-MMAE a été largement réduite lors
du
knock-down du 0D56 et ce pour les trois shRNAs (Figure 6) confirmant que la
reconnaissance du 0D56 par le m906 est essentielle pour induire une
cytotoxicité de MF-m906-MMAE.
[0197] Exemple 5: évaluation in vivo du coniuqué anticorps-médicament (MF-
m906-MMAE)
[0198] Performances thérapeutiques du m906 dans un modèle de xénogreffe de
lignées cellulaires de CCM sur souris NOD/SCID
[0199] Matériel et méthode
[0200] Modèle de souris
[0201] Vingt souris femelles NOD/SCID (Janvier Labs) de 7 semaines ont été
maintenues dans des conditions aseptiques. Toutes les procédures relatives aux
animaux ont été approuvées par le comité d'éthique local (Apafis-10076-
2017053015488124 v4). La lignée cellulaire de CCM CD56-positive WaGa [8]
a été utilisée pour l'induction tumorale. Les souris anesthésiées par
l'isoflurane
ont reçu une injection sous-cutanée de 107 cellules dans du Matrigel (site
d'injection : dos). La taille de la tumeur déterminée en mesurant la largeur,
la
longueur et la hauteur avec un pied à coulisse et l'état général de l'animal
ont été
surveillés tous les 2 jours pendant toute la durée de la procédure. Le volume
de
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tumeur a été déterminé avec la formule suivante largeur x longueur x hauteur x
7/6. Quand le volume de la tumeur a atteint 50 mm3, les souris ont été
incluses
dans l'étude et aléatoirement assignées aux groupes expérimentaux ou contrôle.
[0202] Procédure expérimentale
5
[0203] Après inclusion, les animaux ont reçu une injection intraveineuse d'ADC
(soit
MF-m906-MMAE, soit MF-TTZ-MMAE, 10 mg/kg) ou l'injection en volume
équivalent de PBS pour les souris contrôles. Une nouvelle injection a été
exécutée en cas de doublement du volume de la tumeur dans le groupe
expérimental. Les souris ont été sacrifiées 30 jours après l'inclusion ou en
cas
d'atteinte d'un point critique (ulcération tumorale, perte de poids de 20 `)/0
ou
prostration). Une autopsie des animaux a été réalisée et l'ensemble des
organes
a été examiné macroscopiquement par un pathologiste. Le poids et le volume
des tumeurs ont été évalués après dissection. L'examen microscopique des
tumeurs, des poumons et du foie a été réalisé pour détecter une potentielle
15 progression métastatique.
[0204]Analyse statistique
[0205] Des données continues sont décrites en moyennes et limites. Les données
catégorielles sont décrites en nombre et pourcentage de cas interprétables.
Les
associations ont été évaluées par le test exact de Fisher pour les données
20
catégorielles ou par les tests Mann-Whitney ou Kruskall Wallis pour les
données
continues. Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le
logiciel
XLStat (Addinsoft, Paris, France). p<0,05 a été considéré comme
statistiquement
significatif.
[0206] Résultats
25
[0207] MF-m906-MMAE a réduit la croissance tumorale dans un modèle murin de
xénogreffe de lignées cellulaires de MCC.
[0208] Les résultats de l'administration d'une triple dose de 10 mg/kg de MF-
m906-
MMAE, MF-TTZ-MMAE ou PBS sont présentés en Figure 7 (volumes tumoraux
relatifs) et Figure8 (masse tumorale en fin d'étude). Dans les deux derniers
30
groupes, utilisés comme contrôles, une croissance tumorale similaire a été
observée, avec un coefficient moyen de pente de la courbe de croissance de 105
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% du volume tumoral initial par jour (limites 35-166) et 108 cY.D du volume
tumoral
initial par jour (limites 33-318) pour le groupe PBS et MF-TTZ-MMAE,
respectivement). Pour le groupe expérimental, traité avec MF-m906-MMAE, la
croissance tumorale a été significativement retardée (coefficient moyen de
pente
de la courbe de croissance de 18 % du volume tumoral initial par jour (limites
1-
53); Test de Kruskal Wallis : p= 0,01). En conséquence, le poids médian final
des
tumeurs a été réduit dans le groupe traité par MF-m906-MMAE comparé aux
animaux témoins (Figure 8) (poids moyen 0,7g (bornes : 0,4-1.3) contre 2,03g
(bornes : 1,3-3,7) et 1,78g (bornes : 1-2,7), test de Kruskal Wallis : p-
0.02). Après
le sacrifice, aucune métastase n'a été observée dans le groupe expérimental ni
dans les groupes contrôles. Aucun signe de toxicité de MF-m906-MMAE n'a été
observé sur les tissus non tumoraux prélevés lors de l'autopsie.
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Listage de séquences
[Table 6]
Numéro de séquence Type de séquences Séquence en acides aminés
SEQ ID NO: 1 CDR1 de la chaîne QSLLHSNGYN
légère du m906
SEQ ID NO : 2 CDR2 de la chaîne YI-G
légère du m906
SEQ ID NO : 3 CDR3 de la chaîne CMQSLQTPWT
légère du m906
SEQ ID NO : 4 CDR1 de la chaîne GGTFTGYYMHW
lourde du m906
SEQ ID NO : 5 CDR2 de la chaîne NSGGTNYAQ
lourde du m906
SEQ ID NO : 6 CDR3 de la chaîne LSSGYSGYFDYVVGQG
lourde du m906
SEQ ID NO : 7 Chaine légère du DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQ
m906 SLLHSNGYNFLDVVYLQKPGQSPOLLIY
LGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS
RVEADDVGVYYCMQSLQTPWTFGHGT
KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA
SVVCLLNNFYPREAKVQVVKVDNALQS
GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN
RGEC
SEQ ID NO : 8 Chaine lourde du EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG
m906 GTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWI
NPNSGGTNYAOKFOGRVTMTRDTSIST
AYMELSRLRSDDTAVYYCARDLSSGYS
GYFDYVVGQGTLVTVSSASTKGPSVFP
LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV
TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSHEDPEVKFNVVYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNG
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KEYKCKVSNKALPAP I EKTISKAKGQPR
EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG
FYPSD I AVEW ESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFS
CSVM H EALHNHYTQKSLSLSPG K
SEQ ID NO : 9 RNAi
TCCCAGCGTTGGAGAGTCCAAATTCT
TRCN0000373085 CGAGAATTTGGACTCTCCAACGCTTT
TTTCGGG
Forward
SEQ ID NO: 10 RNAi
AAAAAAG CGTTGGAG AG TC CAAATTC
TRCN0000373085 TCGAGAATTTGGACTCTCCAACGCT
Reverse
SEQ ID NO: 11 RNAi
TCCCCGTTCCCTGAAACCGTTAAACT
TRCN0000373034 CGAGTTTAACG GTTTCAGGGAACGTT
TTT
Forward
SEQ ID NO: 12 RNAi
CGGGAAAAACGTTCCCTGAAACCGTT
TRCN0000373034 AAACTCGAGTTTAACG GTTTCAGG GA
ACG
Reverse
SEQ ID NO: 13 RNAi
TCCCCATGTACCTTGAAGTGCAATCT
TRCN0000073460 CGAGATTGCACTTCAAGGTACATGTT
TTT
Forward
SEQ ID NO: 14 RNAi
CGGGAAAAACATGTACCTTGAAGTGC
TRCN0000073460 AATCTCGAGATTGCACTTCAAGGTAC
ATG
Reverse
SEQ ID NO: 15 Domaine variable DVVMTQSPLSLPVTPG E PAS ISC
RSSQ
de la chaîne légère SLLHSNGYN FLDVVYLOKPGOSPOLLIY
LGSN RASGVPD R FSGSGSGTDFTLKIS
du m906
RVEA D DVGVYYC MQSLQTPWTFGHGT
KVE I KR
SEQ ID NO: 16 Domaine variable EVOLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG
de la chaîne lourde GTFTGYYMHVVVRQAPGQG LEW MGW I
NPNSG GTNYAQKFQG RVTMTRDTSIST
du m906
AYM ELSRLRS D DTAVYYCAR DLSSGYS
GYF DYW G QGTLVTVS
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[0209] Références citées sous le format [numéro de référence] :
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3. Fekete, S. et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 130, 3-18, 2016
4. Barran, P. et al., EuPA Open Proteomics, 11, 23-27, 2016
5. Houben, R.. et al.,1ntemational journal of Cancer, 130, 847-856, 2012
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'o
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