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PROCEDE D'AMPLIFICATION IN VITRO OU EX VIVO DE CELLULES
SOUCHES D'ADIPOCYTES BRUNS OU BEIGES
DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé d'amplification
in vitro ou ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns
ou beiges à partir du tissu adipeux humain. Elle concerne
en outre un procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de
cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges, une matrice
extracellulaire, une composition comprenant un mélange
d'une matrice extracellulaire et d'une fraction stroma-
vasculaire, un kit comprenant cette composition, une
utilisation de la matrice extracellulaire ou de la
composition comprenant un mélange de la matrice
extracellulaire et de la fraction stroma-vasculaire, des
cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges et des
adipocytes bruns ou beiges, obtenus selon le procédé de
l'invention pour leur utilisation.
ART ANTERIEUR
La thérapie cellulaire consiste en une greffe de cellules
visant à restaurer les fonctions d'un tissu ou d'un organe
lorsqu'elles sont altérées par un accident, une
pathologie, le vieillissement et des désordres
métaboliques. Elle permet de soigner durablement un
patient grâce une injection de cellules dites
thérapeutiques . Ces cellules sont obtenues, en
particulier, à partir de cellules souches multipotentes
provenant du patient lui-même.
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On a envisagé d'améliorer la flexibilité métabolique et/ou
de stimuler la dépense énergétique d'un patient en
augmentant la masse de tissu adipeux brun/beige (TAB) chez
ce patient. Il s'agit là d'une piste innovante destinée à
lutter contre les maladies métaboliques, telles que le
diabète, les maladies cardiovasculaires et autres
dysfonctions métaboliques. En effet, le tissu adipeux brun
ou beige participe à la dissipation calorique de
l'organisme, au contrôle du métabolisme rédox et il joue
un rôle endocrine et paracrine régulateur au travers de la
sécrétion d'hormones. Restaurer la fonction dite TAB
chez ces patients représente donc une option thérapeutique
attractive.
Toutefois, les thérapies cellulaires autologues mettant en
uvre les tissus adipeux bruns ou beiges n'existent pas en
pratique, et ce, pour une raison principale qui est la
quasi absence de source d'adipocytes bruns chez le patient
adulte, plus particulièrement chez le patient obèse, pour
une amplification ex vivo. En effet, au contraire du tissu
adipeux blanc présent en abondance et surtout chez les
patients obèses, le tissu adipeux brun ou beige est
particulièrement rare chez l'homme adulte et même quasi-
inexistant chez les patients obèses, pour lesquels cette
quasi-inexistence constitue un facteur aggravant, si ce
n'est causal majeur, des dérèglements métaboliques
notamment, mais non exclusivement, liés au surpoids.
Dans ce contexte, il existe un besoin de réaliser des
cultures d'adipocytes bruns ou beiges autologues et, par
suite, de développer des méthodes d'amplification
cellulaire permettant l'obtention de quantités importantes
d'adipocytes bruns ou beiges de grade thérapeutique pour
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lutter contre les maladies métaboliques associées à
l'obésité, telles que le diabète, les maladies
cardiovasculaires et autres dysfonctions métaboliques.
La procédure standard, pour isoler et amplifier les
précurseurs d'adipocytes à partir de prélèvements de tissu
adipeux, passe par une dissociation enzymatique puis par
leur expansion en deux dimensions (2D) par attachement au
plastique de boîtes de culture. Cette procédure est
coûteuse, longue, et nécessite de nombreuses manipulations
qui augmentent les risques de contaminations. De plus,
elle entraîne une destruction de la structure
tridimensionnelle du tissu, ainsi que la perte de types
cellulaires d'intérêts comme les cellules endothéliales
qui jouent un rôle essentiel à la fois pour la
vascularisation du greffon et la physiologie de
l'adipocyte.
La dissociation non-enzymatique du tissu adipeux apparaît
comme une méthode alternative beaucoup moins coûteuse,
plus rapide et qui présente des avantages incontestables
pour la fabrication d'un produit conforme aux standards
d'une production de grade thérapeutique (exposition
réduite à des produits ou contaminants extérieurs). En
revanche, les procédés de dissociation non-enzymatique
présentés à ce jour ne sont pas satisfaisants car plusieurs
études rapportent que le nombre de précurseurs
d'adipocytes obtenu est faible comparé à la dissociation
enzymatique. De plus, les adipocytes matures, la matrice
extracellulaire ainsi que la structure tridimensionnelle
du tissu adipeux sont toujours perdues à la fin du
processus de dissociation, ainsi que les cellules
endothéliales, après culture.
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Il a été proposé différentes matrices synthétiques pour y
ensemencer les précurseurs d'adipocytes et ainsi essayer
de reconstituer au mieux la structure du tissu adipeux.
Ces matrices seraient également utilisées pour orienter in
vitro les précurseurs d'adipocytes vers un type cellulaire
non adipeux, essentiellement osseux ou cartilagineux,
avant implantation. Du tissu adipeux décellularisé a
également été proposé pour augmenter la différenciation
des précurseurs et mieux mimer la structure du tissu
adipeux. La fabrication de ces types de matrices nécessite
de nombreuses étapes faisant intervenir des réactions
enzymatiques ou de longs traitements chimiques. De plus,
le tissu décellularisé, par définition, perd ces cellules
endogènes. Le tissu adipeux non décellularisé et enrichi
en précurseurs d'adipocytes (préalablement isolés par
dissociation enzymatique) suivi d'une amplification en 2D
a été proposé récemment comme matrice pour une meilleure
reconstruction osseuse. Le temps pour générer cette
matrice biologique est long, nécessite trois semaines de
culture in vitro, et ne permet pas l'amplification des
précurseurs d'adipocytes. Seul l'intérêt pour la
réparation osseuse a été mis en avant par les auteurs.
La culture en suspension en trois dimensions (3D)
représente une méthode alternative de choix à la méthode
standard en 2D car elle permet essentiellement de conserver
la structure et les qualités intrinsèques du tissu. Cet
avantage est important car, par exemple, l'absence d'un
modèle humain pertinent, qui mime au mieux in vitro le
tissu adipeux, est une limitation majeure lors des essais
de phases précliniques, pour la découverte de nouveaux
médicaments efficaces pour lutter contre l'obésité et les
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maladies métaboliques associées comme le diabète de type
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3D est réalisable en système clos, ce qui diminue les
manipulations et les risques de contamination.
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RESUME DE L'INVENTION
Compte tenu de ce qui précède, un problème technique que
se propose de résoudre l'invention est d'obtenir in vitro
ou ex vivo une grande quantité de cellules souches
notamment d'adipocytes bruns ou beiges à partir du tissu
adipeux blanc humain, de grade thérapeutique.
La solution de l'invention à ce problème technique a pour
premier objet, un procédé d'amplification in vitro ou ex
vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du
tissu adipeux humain, comprenant les étapes suivantes :
extraction, d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire
d'un tissu adipeux humain comprenant des cellules
endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain
et des cellules souches du tissu adipeux humain et, d'autre
part, d'une matrice extracellulaire dudit tissu adipeux
humain, ladite matrice extracellulaire comprenant des
cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu
adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux
humain et du collagène, l'extraction de ladite matrice
extracellulaire comprenant une étape de dissociation
mécanique ; mélange de ladite fraction stroma-vasculaire
et de ladite matrice extracellulaire ; et culture du
mélange obtenu à l'étape précédente, en suspension, dans
un milieu de prolifération cellulaire.
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Ainsi, la culture en suspension de la fraction stroma-
vasculaire, rendue possible grâce à la présence de la
matrice extracellulaire, permet une amplification en 3D,
donnant accès à un grand nombre de cellules dans un
environnement du tissu adipeux natif et limitant ainsi les
manipulations qui augmentent les risques
de
contaminations.
Avantageusement, - l'étape de dissociation mécanique est
une étape de dissociation qui ne fait pas intervenir de
collagénase ; - l'étape de dissociation mécanique est une
étape de dissociation non-enzymatique ; - l'extraction de
la fraction stroma-vasculaire et de la matrice
= extracellulaire comprend les étapes suivantes
centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au
moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant
une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction
stroma-vasculaire mécanique ; et dissociation mécanique de
la fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire ; -
le procédé comporte en outre une étape d'élimination des
cellules sanguines présentes dans la fraction stroma-
vasculaire ; - le collagène de la matrice extracellulaire
est du collagène structuré, qui présente une organisation
fibrillaire ; - la culture du mélange de ladite fraction
stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire
comprend les étapes suivantes : transfert dudit mélange de
manière stérile dans une poche de culture en suspension
comprenant le milieu de prolifération ; amplification
dudit mélange pour l'obtention d'un mélange amplifié
comprenant des amas cellulaires ; - le mélange amplifié
comprenant les amas cellulaires fait l'objet d'une
dissociation mécanique pour l'obtention d'agrégats
cellulaires ; - le milieu de prolifération comprend un
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sérum, un facteur de croissance de fibroblastes et un
facteur de croissance ressemblant à l'insuline ; et - le
procédé comporte en outre une étape de tri-cellulaire
visant à trier les cellules souches exprimant le marqueur
de surface DPP4.
Selon un second objet, l'invention concerne un procédé
d'obtention in vitro ou ex vivo d'adipocytes bruns ou
beiges comprenant les étapes suivantes : extraction, d'une
part, d'une fraction stroma-vasculaire d'un tissu adipeux
humain comprenant, des cellules endothéliales du réseau
vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches
du tissu adipeux humain et, d'autre part, d'une matrice
extracellulaire dudit tissu adipeux humain, ladite matrice
extracellulaire comprenant des cellules endothéliales du
réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules
souches du tissu adipeux humain et du collagène,
l'extraction de ladite matrice extracellulaire comprenant
une étape de dissociation mécanique ; mélange de ladite
fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice
extracellulaire ; culture du mélange obtenu à l'étape
précédente, en suspension, dans un milieu de prolifération
cellulaire ; et induction d'une différenciation des
cellules souches du tissu adipeux pour obtenir des
adipocytes bruns ou beiges.
Avantageusement, - la différenciation des cellules souches
du tissu adipeux est induite dans un milieu de
différenciation ; - l'étape de dissociation mécanique est
une étape de dissociation qui ne fait pas intervenir de
collagénase ; - l'étape de dissociation mécanique est une
étape de dissociation non-enzymatique ; - l'extraction de
la fraction stroma-vasculaire et de la matrice
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= extracellulaire comprend les étapes suivantes
centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au
moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant
une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction
stroma-vasculaire mécanique ; et dissociation mécanique de
la fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire ; -
le procédé comporte en outre une étape d'élimination des
cellules sanguines présentes dans la fraction stroma-
vasculaire ; - le collagène de la matrice extracellulaire
est du collagène structuré, qui présente une organisation
fibrillaire ; - la culture du mélange de ladite fraction
stroma-vasculaire mécanique et de ladite matrice
extracellulaire comprend les étapes suivantes : transfert
dudit mélange de manière stérile dans une poche de culture
en suspension comprenant le milieu de prolifération ;
amplification dudit mélange pour l'obtention d'un mélange
amplifié comprenant des amas cellulaires ; - le mélange
amplifié comprenant les amas cellulaires fait l'objet
d'une dissociation mécanique pour l'obtention d'agrégats
cellulaires ; et - le milieu de prolifération comprend un
sérum, un facteur de croissance de fibroblastes et un
facteur de croissance analogue à l'insuline ; et - le
milieu de différenciation comprend de la Rosiglitazone
et/ou du SB431542 et - le procédé comporte en outre une
étape de tri-cellulaire visant à trier les cellules souches
exprimant le marqueur de surface DPP4.
Selon un troisième objet, l'invention concerne une matrice
extracellulaire isolée susceptible d'être obtenue selon le
procédé défini ci-dessus, comprenant des cellules
endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux
humain, des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges
du tissu adipeux humain et du collagène.
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Selon un quatrième objet, l'invention concerne une
composition comprenant un mélange de la matrice
extracellulaire telle que ci-dessus et d'une fraction
stroma-vasculaire comprenant des cellules endothéliales du
réseau vasculaire du tissu adipeux et des cellules souches
du tissu adipeux humain.
Selon un cinquième objet, l'invention concerne un kit
comprenant la composition telle que définie ci-dessus, un
milieu de prolifération cellulaire et un milieu de
différenciation.
Selon un sixième objet, l'invention concerne l'utilisation
de la matrice extracellulaire telle que définie ci-dessus
ou de la composition telle que définie ci-dessus pour le
criblage et/ou la caractérisation
d'actifs
pharmacologiques.
Selon un septième objet, l'invention concerne des
adipocytes bruns ou beiges issus d'une composition telle
que ci-dessus, pour leur utilisation en thérapie
cellulaire, ou pour le traitement de désordres
métaboliques.
Selon un huitième objet, l'invention concerne des
adipocytes bruns ou beiges issus d'une composition telle
que ci-dessus, pour le traitement de l'obésité.
Selon un neuvième objet, l'invention concerne un milieu de
différentiation pour la différentiation de cellules
souches d'adipocytes bruns ou beiges en adipocytes bruns
ou beiges, comprenant un milieu de croissance de cellules
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endothéliales supplémenté en sérum, en facteurs de
croissance, en rosiglitazone et en SB431542 et,
préférentiellement, en sérum foetal de veau, en facteurs de
croissance de fibroblastes, en facteurs de croissance
5 ressemblant à l'insuline, en facteurs de croissance de
l'endothélium vasculaire, en acide ascorbique, en
rosiglitazone, en T3, en insuline, et en SB431542.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la
description non limitative qui suit, rédigée au regard des
dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1A représente schématiquement les étapes
nécessaires et suffisantes pour l'extraction d'une matrice
extracellulaire et d'une fraction stroma-vasculaire
(étapes 1 à 3), et leur mise en coculture (étape 4), selon
l'invention ;
- la figure 1B est une représentation schématique plus
détaillée de la méthode qui permet l'extraction
séquentielle de matrices extracellulaires (Ml-M4) et de
populations de cellules (C1-C3) de fraction stroma-
vasculaire (étapes 1 à 5), et de leur mise en coculture
(étape 6), selon l'invention ;
- la figure 1C est une illustration de produits selon
l'invention, à savoir le produit dénommé ExAdEx-tissue,
qui est issu de l'amplification du mélange de la fraction
stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire, et le
produit dénommé ExAdEx-lobules, qui est issu de la
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formation d' agrégat s, conformément à une
étape
additionnelle du procédé selon l'invention ;
- la figure 1D illustre les étapes d'obtention du produit
ExAdEx-lobules à partir du produit ExAdEx-tissue selon le
procédé de l'invention ;
- les figures 2A, 2E, 20, 2D, 2E, 2F, 2G, 211, 21, 2J et 2K
sont des graphes qui comparent, respectivement, les
quantités exprimées, en PCR quantitative, des gènes
suivants listés ci-après dans les produits ExAdEx-lobules
et ExAdeX-tissue : FABP4, PLIN1, Adiponectine, 0D31, DPP4,
ICAM1, PDGFRa, Inhibine beta A, MSCA1, ILlb(macrophages
M1), MRC1(macrophages M2) ;
- les figures 3A, 3E, 30, 3D, 3E, 3F, 3G et 3H sont des
photographies, obtenues par imagerie confocale, des
produits ExAdEx-lobules, mettant en évidence, par marquage
immuno-fluorescent, dans lesdits produits, respectivement
le collagène I, le collagène IV, la fibronectine, la
laminine, l'élastine, DPP4, ICAM1 et 0D31 ;
- les figures. 4A, 4E et 40 sont des figures
représentatives de la présence, respectivement, du
marqueur d'hypoxie 0A9, dans les cellules souches
adipocytaires humaines pour cinq milieux de prolifération
différents testés selon le procédé de l'invention et PLIN1
et UCP1 dans les cellules souches différenciées, pour cinq
milieux de prolifération différents enrichis en facteurs
de différenciation testés selon le procédé de l'invention
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- les figures 5A, 5E et 50 sont des images de microscopie
optique qui montrent, respectivement, que le milieu de
différentiation permet une différentiation en adipocytes
(figure 5A), qu'il est toxique pour les cellules
endothéliales en présence de dexaméthasone et de l'IBMX
(figure 5B), mais qu'il ne l'est pas, lorsqu'on retire ces
composés dudit milieu (figure 50) ;
- les figures 6A et 6B sont des figures qui illustrent
l'expression de PLIN1 et de UCP1 dans différents milieux
de différentiation selon l'invention ;
- les figures 7A, 7E et 70 présentent des images de
microscopie à fluorescence qui permettent de visualiser
les cellules endothéliales et différentes populations de
cellules souches du tissu adipeux selon la présence du
marqueur CD31 (figure 7A), DPP4 (figure 7E) et ICAM1(figure
70) dans le tissu adipeux avant la mise en uvre du procédé
selon l'invention (photographies de gauche), après 20
jours dans le milieu de prolifération (photographies du
centre) et après 20 jours dans le milieu de prolifération
puis 20 jours dans le milieu de différenciation, sauf pour
ICAM1 (photographies de droite sauf pour ICAM1) ;
- les figures 8A et 8E présentent des images de microscopie
à fluorescence avec marquage, par des anticorps couplés à
des fluorochromes, des protéines DPP4 et ICAM1 dans les
fractions stroma-vasculaire et la matrice extracellulaire
formant la fraction dite Endostem sur ces figures,
avant mélange selon le procédé selon l'invention ;
- la figure 9A montre, par microscopie à fluorescence, que
la matrice M2 est de type riche en collagène ; collagène
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marqué au PicroSirius Red (gris clair) et marquage des
noyaux (blanc) ;
- la figure 9E montre, par microscopie à fluorescence, que
la matrice M3 est de type fibreux ; collagène marqué au
PicroSirius Red (gris clair et fibres blanches) et marquage
des noyaux (blanc) ;
- la figure 90 caractérise, en microscopie, le type fibreux
de la matrice M1 ;
- la figure 9D montre, par microscopie, que la matrice M2
est hétérogène en termes de types matricielles : type
fibreux et type riche en collagène ;
- la figure 9E est une image de microscopie illustrant le
type fibreux de la matrice M3 ;
- la figure 10A est une photographie du tissu adipeux
centrifugé de la fraction A après dissociation mécanique
contenant la matrice M4 ;
- la figure 10B met en évidence par microscopie en
fluorescence, dans la matrice M4, des adipocytes matures
par coloration Oil Red 0 (gris clair) et une matrice riche
en collagène par marquage du collagène de type I (gris
très clair) ;
- la figure 100 montre, par l'immunomarquage CD31, les
structures capillaires formées par des cellules
endothéliales 0D31+ (blanc) dans la matrice M4 ; marquage
des noyaux (gris foncé) ;
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- la figure 10D illustre la présence du réseau de cellules
souches du tissu adipeux PDGFRa+ (points gris clair) dans
la matrice M4 ; marquage des noyaux (gris foncé) ;
- la figure 11 montre, par incorporation d'Edu, 5-ethylny1-
2'-deoxyuridine, dans le noyau des cellules en
prolifération, que les cellules endogènes, dans la matrice
extracellulaire de l'invention sont maintenues en
prolifération dans le milieu EGM-rm'i en suspension ; noyaux
(gris foncé), cellules en prolifération (blanc) auto-
fluorescence de la matrice (gris clair) ;
- la figure 12 montre que des cellules souches du tissu
adipeux exogènes, mises en coculture avec la matrice
extracellulaire de l'invention, forment des structures
composées de ces cellules souches du tissu adipeux et des
cellules endogènes présentent dans la matrice ; image prise
après 3 jours de co-culture, noyaux (gris foncé), collagène
(gris clair), cellules souches exogènes du tissu adipeux
(gris clair/blanc) ;
- la figure 13A montre l'absence de prolifération de
cellules lors de la culture cellulaire des cellules souches
du tissu adipeux et des cellules endothéliales en
suspension sans matrice extracellulaire, issue de la
fraction stroma vasculaire ; image prise après 10j de co-
culture ; noyaux (gris foncé), noyaux de cellules en
prolifération (gris très clair) ;
- la figure 13E met en évidence une capacité de
prolifération des cellules de la fraction stroma-
vasculaire, en suspension, avec la matrice extracellulaire
de l'invention ; image prise après 10j de co-culture ;
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noyaux (gris foncé), matrice collagène (gris clair),
noyaux de cellules en prolifération par marquage Edu
(blanc) ;
5 - la figure 14A montre le niveau d'expression du marqueur
de cellules endothéliales CD31 dans des populations
cellulaires différenciées obtenues par culture, en
suspension, avec (droite) et sans (gauche) la matrice
extracellulaire de l'invention ;
- la figure 14B montre le niveau d'expression du marqueur
de cellules souches adipocytaires PDGFRa dans les
populations cellulaires différenciées obtenues par
culture, en suspension, avec (droite) et sans (gauche) la
matrice extracellulaire de l'invention ;
- la figure 14C montre le niveau d'expression du marqueur
d'adipocytes matures PLIN1 dans les populations
cellulaires différenciées obtenues par culture, en
suspension, avec (droite) et sans (gauche) la matrice
extracellulaire de l'invention ;
- la figure 14D montre le niveau d'expression du marqueur
d'adipocytes matures Adiponectine dans les populations
cellulaires différenciées obtenues par culture, en
suspension, avec (droite) et sans (gauche) la matrice
extracellulaire de l'invention ;
- les figures 15A et 153 sont des images qui mettent en
évidence l'activation des capacités de prolifération du
procédé selon l'invention. En figure 15A, un tissu adipeux
non dissocié ne montre pas de cellules en prolifération.
En figure 15E, la composition montre des cellules en
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prolifération, les noyaux des cellules en prolifération
étant représentés en blanc sur cette figure ;
- les figures 16A, 16E, 160, 16D, 16E et 16F sont des
images dans lesquelles les cellules en prolifération, qui
sont contenues dans la matrice dite Endostem, sont
marquées, en l'absence de la fraction stroma-vasculaire
(figures 16A, 160, 16E) et avec l'ajout de cette fraction
stroma-vasculaire (figures 16E, 16D, 16F) après 20 jours
de culture dans le milieu de prolifération ;
- les figures 17A, 17B, 170, 17D, 17E et 17F illustrent
l'expression de la dipeptidyl peptidase-4 (DPP4), qui est
concentrée dans la fraction stroma vasculaire isolée, et
l'expression de ICAM1 et 0D31, qui est concentrée dans la
matrice isolée (Figs. 17A, 170, 17E), et l'expression de
DPP4, ICAM1 et CD31 dans la composition amplifiée (Figs.
17B, 17D, 17F) ;
- la figure 18 est composée de quatre photographies qui
illustrent la capacité de prolifération des cellules (EdU
positives) qui présentent le marqueur DPP4 au sein de la
matrice extracellulaire du tissu adipeux dans le procédé
selon l'invention ;
- la figure 19 est composée de photographies qui illustrent
la capacité de différentiation en adipocytes bruns ou
beiges des populations cellulaires présentent le marqueur
DPP4 (trois photographies du haut de la figure) ou qui ne
présentent pas ce marqueur DPP4 (trois photographies du
bas) ;
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- les figures 20A et 203 sont des graphes qui illustrent
la capacité de différentiation en adipocytes bruns ou
beiges des populations cellulaires, exprimant DPP4 ou pas,
obtenues en PCR quantitative, en temps réel du marqueur
PLIN1 (Figure 20A) et du marqueur UCP1 (Figure 20B) ;
- les figures 21A et 213 illustrent la présence de
macrophages de type M1 et de type M2 respectivement, dans
la composition amplifiée selon l'invention ;
- la figure 22 comprend un ensemble de photographies qui
démontrent la présence de certaines protéines dans la
matrice extracellulaire selon l'invention, et la
conservation d'un réseau capillaire ;
- la figure 23 montre l'expression relative de l'UCP1
humain, au jour JO, soit avant transplantation du produit
ExAdeX-tissue amplifié et au jour J21, dans le produit
ExAdeX-tissue, après transplantation chez la souris ;
- la figure 24 montre trois photographies de microscopie
a fluorescence, la photographie de gauche montrant
l'absence d'adipocytes bruns/beiges dans le tissu adipeux
blanc avant la mise en uvre du procédé de l'invention, la
photographie du centre montrant la présence d'adipocytes
bruns/beiges, spécifiquement marqués en gris clair par
l'expression, chez un individu en surpoids, de la protéine
UCP1, ex vivo après le procédé d'amplification et de
différenciation, et la photographie de droite montrant la
présence d'adipocytes bruns/beiges ex vivo, après la mise
en uvre de l'invention, chez un patient, avec une obésité
sévère ;
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- les figures 25A, 25E et 25C montrent la viabilité de
cellules souches du tissu adipeux après purification de la
fraction stroma-vasculaire, directement après incubation
dans un tampon de lyse 1X, nommé ACL, comprenant du
chlorure d'ammonium (figure 25A), après 24h de culture
(figure 25E) et après 5 jours en conditions de culture
adhérente (figure 250) ;
- les figure 26A, 26E, 260 et 26D présentent les résultats
graphiques de l'analyse par cytométrie en flux du nombre
de cellules viables et mortes après différents temps de
traitements dans un tampon de lyse 1X, nommé ACL,
comprenant du chlorure d'ammonium ;
- les figures 27A, 27E et 27C montrent la viabilité de
cellules endothéliales du tissu adipeux après purification
de la fraction stroma-vasculaire, directement après
incubation dans un tampon de lyse 1X, nommé ACL, comprenant
du chlorure d'ammonium (figure 27A), après 24h de culture
(figure 27E) et après 5 jours en conditions de culture
adhérente (figure 270) ;
- la figure 28 présente le profil des cellules souches du
tissu adipeux, amplifiées selon le procédé ExAdEx de
l'invention, obtenu par détermination par cytométrie en
flux des marqueurs de surface cellulaire ;
- les figures 29A et 29E présentent les profils des ASCs
du tissu adipeux ex vivo (figure 29A) et du produit
amplifié ExAdEx (figure 29E) obtenu par détermination des
marqueurs de surface cellulaire obtenu par cytométrie en
flux ;
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- les figures 30A, 30E et 30C montrent des cellules
endothéliales isolées du tissu adipeux humain qui sont
cultivées dans le milieu de prolifération décrit dans
l'invention (figure 30A), dans le milieu de
différentiation décrit dans l'invention (figure 30E) et
dans un milieu de différentiation standard non optimisé
qui comprend du DMEM et du sérum (figure 300).
- la figure 31 présente une visualisation en blanc, d'un
réseau vasculaire fonctionnel de la composition décrite
dans l'invention après transplantation chez la souris Nude
(4 semaines post greffe) ; et
- la figure 32 présente une comparaison des capacités de
viabilité et d'amplification des cellules souches
d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux selon un
procédé ne comprenant pas l'ajout de la fraction stroma-
vasculaire (A) et comprenant la purification puis l'ajout
des cellules isolés de l'infranatant, également nommé dans
l'invention fraction stroma vasculaire (B).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Le tissu adipeux est fourni pour réaliser l'invention. Il
s'agit en pratique de tissu adipeux par exemple blanc
provenant d'individus, par exemple, mais non
exclusivement, d'individus en surpoids, notamment obèses
et/ou présentant des désordres métaboliques tels que le
diabète de type 2 et des maladies cardio-vasculaires.
L'invention a pour premier objet, un procédé
d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches
d'adipocytes bruns ou beiges à partir du tissu adipeux,
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par exemple blanc, humain comprenant les étapes suivantes
: extraction, d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire
(Figure 1A, étapes 1-2 et Figure 1B, étapes 1-3 et étape
5) dite mécanique d'un tissu adipeux humain comprenant des
5 cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu
adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux
humain et, d'autre part, d'une matrice extracellulaire
dudit tissu adipeux humain(Figure 1A, étape 3 et Figure
1B, étape 4), ladite matrice extracellulaire comprenant
10 des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu
adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux
humain et du collagène, l'extraction de ladite matrice
extracellulaire comprenant une étape de dissociation
mécanique (Figure 1A, étape 3 et Figure 1B, étape 4) ;
15 mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite
matrice extracellulaire (Figure 1A, étape 4 et Figure 1B,
étape 6) ; et culture du mélange obtenu à l'étape
précédente, en suspension, dans un milieu de culture, à
savoir de prolifération cellulaire. Ce procédé est
20 également dénommé, ci-après, procédé ExAdEx (pour Ex
vivo Adipocytes Expansion).
Au sens de la présente invention, il est entendu par
fraction stroma-vasculaire les cellules présentes dans
un prélèvement de tissu adipeux humain. Cette fraction
stroma-vasculaire comprend des cellules endothéliales du
réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules
souches du tissu adipeux humain. La fraction stroma-
vasculaire selon l'invention, également
nommée
infranatant, est avantageusement issue des étapes 2 et 3
décrites sur la figure 1B, et est riche en cellules DPP4+.
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Au sens de l'invention, il est entendu par matrice
extracellulaire une matrice bioactive, c'est à dire une
matrice qui comprend différentes protéines du tissu
adipeux (Figure 22) et des cellules endogènes, comprenant
notamment des cellules endothéliales (Figure 10C), des
cellules souches du tissu adipeux (Figure 10D), des
adipocytes et des macrophages. La Figure 11 montre la
présence de cellules en prolifération dans la matrice
extracellulaire (marquage Edu en blanc). Cette matrice
extracellulaire permet l'amplification cellulaire en 3D,
c'est-à-dire la prolifération des cellules en trois
dimensions. La matrice extracellulaire de l'invention est
également notée ci-après EndoStem-Matrix ou matrice
EndoStem .
Les protéines de la matrice extracellulaire du tissu
adipeux comprennent du collagène. Ce collagène est
structuré. Il présente une organisation fibrillaire. Il
s'agit notamment de collagène de type I et de type III
(voir les figures 9A et 9B montrant des fibres de collagène
fibrillaire marqué par le PicroSirius Red et la figure 10E
qui montre le collagène de type I marqué par un anticorps
anti-collagène I et observé par microscopie confocale).
Les protéines de la matrice extracellulaire du tissu
adipeux comprennent en outre notamment de la fibronectine,
de l'élastine, de la laminine et du collagène de type IV
(Figure 22).
L'extraction de la matrice extracellulaire comprend une
étape de dissociation non-enzymatique, en particulier
l'extraction de la matrice extracellulaire comprend une
étape de dissociation mécanique. La dissociation
mécanique de l'invention permet de conserver intacte la
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structure de la matrice extracellulaire tandis qu'une
digestion enzymatique fait généralement intervenir de la
collagénase qui la digère. La dissociation mécanique
permet ainsi le maintien de la vasculature , ainsi que
cela est montré à la Figure 7A, dans laquelle apparaît le
réseau vasculaire avant dissociation dans le tissu adipeux
humain dans la photographie de gauche et le réseau
vasculaire après dissociation et amplification dans la
photographie du milieu. Cette dissociation mécanique
permet en outre le maintien de la microstructure de la
matrice extracellulaire, qui présente en conséquence une
organisation semblable à l'organisation du tissu adipeux
in vivo.
L'extraction de la fraction stroma-vasculaire et de la
matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes :
centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au
moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant
une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction
stroma-vasculaire ; et dissociation mécanique de la
fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire (Figure
1A).
L'étape de centrifugation du tissu adipeux humain permet
en outre d'éliminer de l'huile, du sang et du liquide
anesthésique contenus dans le tissu adipeux humain fourni.
Cette étape permet également d'éliminer du liquide
physiologique issu de lavages préalables du tissu adipeux
humain fourni.
Dans un mode de réalisation particulier, l'extraction de
la fraction stroma-vasculaire et de la matrice
= extracellulaire comprend les étapes suivantes
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centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au
moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant
une matrice extracellulaire centrifugée et une fraction B
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu
adipeux humain ; dissociation mécanique de la fraction A
pour obtenir une fraction A' comprenant une matrice
extracellulaire dissociée ; centrifugation de la fraction
A' pour obtenir au moins la matrice extracellulaire et une
fraction B' comprenant des cellules endothéliales du
réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules
souches du tissu adipeux humain; et mélange des fractions
B et B' pour obtenir la fraction stroma-vasculaire
mécanique (Figure 1B).
Dans ce mode de réalisation, l'étape de centrifugation du
tissu adipeux humain permet en outre d'éliminer de l'huile,
du sang et du liquide anesthésique contenus dans le tissu
adipeux humain fourni. Cette étape permet également
d'éliminer du liquide physiologique issu de lavages
préalables du tissu adipeux humain fourni. La
centrifugation de la fraction A' permet en outre d'éliminer
d'éventuels résidus d'huile et de liquide physiologique.
Cette étape de centrifugation de la fraction A' est
optionnelle.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon
l'invention comporte en outre une étape d'élimination des
cellules sanguines. Il s'agit d'une élimination des
cellules sanguines de type érythrocytes, présentes dans le
tissu adipeux et dans les différents culots cellulaires,
nommées SVF mécanique, obtenus lors des étapes précitées
du procédé de dissociation mécanique dit ExAdEx. Cette
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étape d'élimination est réalisée lors d'une incubation du
tissu adipeux et/ou des culots cellulaires dans un tampon
de lyse 1X comprenant du chlorure d'ammonium ( Ammonium
chlorure lysing solution , Becton Dickinson n' - nommé ACL)
dilué dans de l'eau stérilisée, dans un rapport tampon :
échantillon, variant de 1:1 à 1:10, à une température
comprise entre 4 et 37 C et durant un temps d'incubation
variant de 5 minutes à 30 minutes. Cette étape permet la
lyse des érythrocytes. Les figures 25A, 25B et 250 ainsi
que les figures 26A, 26E, 260 et 26D présentent l'effet,
sur les cellules souches du tissu adipeux, du traitement
ACL. Il en résulte qu'une incubation dans l'ACL, sur une
période de temps supérieure à 5 minutes, endommage la
viabilité et les capacités de prolifération des cellules
souches contenues dans l'infranatant. Par ailleurs, les
figures 27A, 27B et 270 illustrent l'absence d'effet de
l'incubation dans l'ACL sur la viabilité et les capacités
de prolifération des cellules endothéliales du tissu
adipeux contenues dans l'infranatant.
La culture du mélange de la fraction stroma-vasculaire et
de ladite matrice extracellulaire comprend les étapes
suivantes : transfert dudit mélange de manière stérile
dans une poche de culture en suspension comprenant du
milieu de prolifération ; et amplification dudit mélange
formant des amas cellulaires.
Le transfert de manière stérile , au sens de
l'invention, est un transfert, de préférence, réalisé en
système clos. Ce transfert de manière stérile permet de
d'éviter la présence de contaminants lors de la culture
cellulaire. La dissociation mécanique des amas cellulaires
formés au cours de l'amplification ne nécessite pas
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d'ouverture du système, évitant ainsi l'exposition des
produits cellulaires à une contamination de la culture par
les éléments de l'environnement.
5 Dans un mode de réalisation, le milieu de prolifération,
dans la poche de culture en suspension, est un milieu
EGM+11". Ce milieu de prolifération comprend le milieu de
base pour la prolifération des cellules endothéliales
(EGM) enrichi en Epidermal Growth Factor (EGF), Basic
10 Growth Factor (FGF2), Insulin-like Growth Factor, Vascular
Endothelial Growth Factor 165, acide ascorbique, héparine
et hydrocortisone (EGM+). Le milieu EGM+ permet également
l'amplification des cellules souches adipocytaires sans
altérer leur capacité de différenciation en adipocytes.
Le procédé de l'invention permet une amplification du
nombre de cellules souches du tissu adipeux avec un facteur
d'amplification supérieur à 10, avantageusement supérieur
à 20, en particulier supérieur à 30, de préférence
supérieur à 35. Le facteur d'amplification est le rapport
entre le nombre de cellules obtenues après culture de la
SVF isolée en présence de ladite matrice extracellulaire
et le nombre de cellules avant l'invention. Dans un mode
de réalisation particulier décrit dans l'exemple 2, le
procédé de l'invention présente un facteur d'amplification
de 36 en 8 jours.
Selon un second objet, l'invention concerne un procédé
d'amplification in vitro ou ex vivo des cellules souches
d'adipocytes bruns ou beiges comprenant les étapes
suivantes : amplification in vitro ou ex vivo de cellules
souches du tissu adipeux humain telle que définie ci-dessus
; et induction d'une différenciation des cellules souches
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du tissu adipeux pour obtenir des adipocytes bruns ou
beiges. Autrement dit, selon un second objet, l'invention
concerne un procédé d'obtention in vitro ou ex vivo
d'adipocytes bruns ou beiges comprenant les étapes
suivantes : amplification in vitro ou ex vivo de cellules
souches du tissu adipeux humain telle que définie ci-dessus
; et induction d'une différenciation des cellules souches
du tissu adipeux pour obtenir des adipocytes bruns ou
beiges.
Plus précisément, le procédé d'amplification in vitro ou
ex vivo des adipocytes bruns ou beiges comprend donc les
étapes suivantes : extraction, d'une part, d'une fraction
stroma-vasculaire d'un tissu adipeux humain comprenant,
des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu
adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux
humain et, d'autre part, d'une matrice extracellulaire
dudit tissu adipeux humain, ladite matrice extracellulaire
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu
adipeux humain et du collagène ; mélange de ladite fraction
stroma-vasculaire mécanique et de ladite matrice
extracellulaire ; culture du mélange obtenu à l'étape
précédente, en suspension, dans un milieu de prolifération
cellulaire ; et induction d'une différenciation des
cellules souches du tissu adipeux pour obtenir des
adipocytes bruns ou beiges. Autrement dit, le procédé
d'obtention in vitro ou ex vivo des adipocytes bruns ou
beiges comprend donc les étapes suivantes : extraction,
d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire d'un tissu
adipeux humain comprenant, des cellules endothéliales du
réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules
souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux
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humain et, d'autre part, d'une matrice extracellulaire
dudit tissu adipeux humain, ladite matrice extracellulaire
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain, des cellules souches d'adipocytes
bruns ou beiges du tissu adipeux humain et du collagène ;
mélange de ladite fraction stroma-vasculaire mécanique et
de ladite matrice extracellulaire ; culture du mélange
obtenu à l'étape précédente, en suspension, dans un milieu
de prolifération cellulaire
et induction d'une
différenciation des cellules souches d'adipocytes bruns ou
beiges du tissu adipeux pour obtenir des adipocytes bruns
ou beiges.
Le procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules
différenciées comprenant les étapes liées
à
l'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du
tissu adipeux, les précisions données ci-dessus pour le
procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules
souches du tissu adipeux s'appliquent également pour le
procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules
différenciées. Autrement dit, le procédé d'obtention in
vitro ou ex vivo d'adipocytes bruns ou beiges comprenant
les étapes liées à l'amplification in vitro ou ex vivo de
cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu
adipeux, les précisions données ci-dessus pour le procédé
d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches
d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux s'appliquent
également pour le procédé d'obtention in vitro ou ex vivo
d'adipocytes bruns ou beiges.
En particulier, l'extraction de la matrice extracellulaire
comprend une étape de dissociation non-enzymatique, en
particulier l'extraction de la matrice extracellulaire
comprend une étape de dissociation mécanique.
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Dans un mode de réalisation, l'extraction de la fraction
stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire
comprend les étapes suivantes : centrifugation du tissu
adipeux humain pour obtenir au moins deux fractions
distinctes, une fraction A comprenant une matrice
extracellulaire centrifugée, et la fraction stroma-
vasculaire ; et dissociation mécanique de la fraction A
pour obtenir la matrice extracellulaire.
Dans un autre mode de réalisation, l'extraction de la
fraction stroma-vasculaire et de la
matrice
= extracellulaire comprend les étapes suivantes
centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au
moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant
une matrice extracellulaire centrifugée et une fraction B
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu
adipeux humain ; dissociation mécanique de la fraction A
pour obtenir une fraction A' comprenant une matrice
extracellulaire dissociée ; centrifugation de la fraction
A' pour obtenir au moins la matrice extracellulaire et une
fraction B' comprenant des cellules endothéliales du
réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules
souches du tissu adipeux humain ; et mélange des fractions
B et B' pour obtenir la fraction stroma-vasculaire.
Le collagène de la matrice extracellulaire comprend du
collagène de type I et du collagène de type III révélé par
coloration au Picrosirius Red (voir Figure 9A et Figure
9B).
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Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon
l'invention, ledit procédé comporte en outre une étape de
tri-cellulaire visant à trier les cellules souches
exprimant le marqueur de surface DPP4, aussi appelé CD26.
Une variante possible consiste à sélectionner/trier les
cellules exprimant CD26/DPP4, principalement avant le
procédé dit ExAdEx, après mélange de la fraction stroma-
vasculaire et de la matrice extracellulaire, mais avant
culture dudit mélange, en suspension, dans le milieu de
prolifération cellulaire. Les objectifs sont notamment
d'enrichir le produit utilisé en cellules précurseurs
d'adipocytes bruns ou beiges et, d'autre part,
d'homogénéiser et de standardiser la composition du
produit cellulaire à amplifier.
En effet, un tri des cellules souches du tissu adipeux
humain trié selon la présence du marqueur de surface CD26
a mis en évidence que les cellules exprimant le marqueur
de surface 0D26 ont la capacité de se différencier
préférentiellement en adipocytes bruns/beiges. La Figure
20A montre que les populations DPP4+ et DPP4- ont toutes
la capacité de se différencier en adipocytes selon
l'expression du marqueur PLIN1 (Figure 20A). En revanche,
seule la population DPP4+ se différencie en adipocytes
exprimant le marqueur d'adipocyte brun/beige UCP1 (Figure
20B). Une illustration en Figure 19 montre par imagerie
par fluorescence de la protéine UCP1 que la protéine UCP1
n'est exprimée que dans les cellules souches du tissu
adipeux exprimant DPP4+ et différenciées dans un milieu
adipogénique. L'utilisation du produit, qui est obtenu
après culture des cellules triées, concerne principalement
les applications de thérapie cellulaire de l'obésité et
des maladies métaboliques, toutefois des applications in
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vitro de ce type de produit à composition contrôlée sont
également possibles. Les modalités méthodologiques du tri
cellulaire reposent sur la fixation d'anticorps
spécifiques de DPP4 pour identifier les cellules exprimant
5 cette protéine. Une première technique de séparation
consiste à utiliser des anticorps couplés à des
fluorochromes, le tri s'opère sur une plateforme de tri
cellulaire automatisée (type Aria III, BD) qui est un
cytomètre/trieur de cellules à haut débit capable de
10 séparer au moins quatre populations cellulaires
différentes. L'autre méthode concerne le tri cellulaire
immuno-magnétique, basée sur l'utilisation d'anticorps
couplés à des billes magnétiques qui permettent la
rétention des cellules d'intérêt dans un champs magnétique
15 (technologie type cliniMACsm, Miltenyi Biotecm). Ces deux
techniques permettent d'atteindre des degrés élevés
d'homogénéité du produit cellulaire d'intérêt dans le
produit final (>95%). Ces techniques sont toutes
compatibles avec des tris réalisés en condition GMP pour
20 des applications de thérapie cellulaire sous réserve de
disposer des plateformes adaptés (Automate CliniMacsm pour
le tri magnétique, Cytomètre trieur GMP).
Dans un mode de réalisation de l'invention, la culture du
25 mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite
matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes :
transfert dudit mélange de manière stérile dans une poche
de culture en suspension comprenant du milieu de culture
amplification dudit mélange formant des amas
30 cellulaires ;
Le produit issu de l'amplification du mélange de la
fraction SVF mécanique et de la fraction matrice peut être
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dénommé ExAdEx-tissue . Le produit issu de la formation
d'agrégats dans une étape supplémentaire en fin de procédé,
peut être dénommé ExAdEx-lobules . Ces produits sont
schématisés en Figure 1C. Le produit EXADEX-lobules est un
produit qui peut être obtenu dans une étape additionnelle
du procédé selon l'invention. A l'issue de l'étape de mise
en co-culture, le produit est mis en amplification dans le
milieu de prolifération EGM+ dans des flasques de culture,
comme décrit précédemment. Il constitue alors le produit
amplifié ExAdEx-tissue. Ainsi que cela est illustré à la
Figure 1D, on transfère ce produit amplifié dans des
plaques de cultures ULA (Ultra-Low Attachment
Attachement Ultra-Faible), non-adhérentes, de 6 puits, 12
puits ou 24 puits dans le milieu de prolifération,
notamment EGM+, avec ou sans agitation. Une formation
d'agrégats est alors observée. Ceux-ci comportent
l'ensemble des caractéristiques décrites dans le produit
ExAdEx-tissue, après 3 à 10 jours, dans les conditions
décrites. Ces caractéristiques sont définies par la
présence de cellules souches du tissu adipeux humain, les
cellules endothéliales et les composants de la matrice
extracellulaire. Ce produit est également caractérisé par
la présence de cellules adipocytes matures et de
macrophages. Parmi les marqueurs moléculaires, et ainsi
que cela est montré aux Figures. 2A à 2K, on retrouve les
marqueurs CD31, DPP4, ICAM1, PDGFRA, PLN1, ADIPONECTIN,
FABP4, IL1B et MRC1. Ces figures montrent une comparaison
de l'expression des marqueurs précédemment cités, retrouvé
dans le produit ExAdEx-tissue et ExAdEx-lobules de façon
comparable. Seul l'expression de MSCA1 est différente
entre les deux produits et constitue la signature
moléculaire des ExAdEx-lobules en comparaison au produit
ExAdEx-tissue. Une caractérisation des protéines présentes
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dans les ExAdEx-lobules a également été faite par
microscopie confocale à fluorescence et montre la présence
des principales protéines de la matrice extracellulaire du
tissu adipeux, notamment le collagène de type I (Figure
3A) et du collagène de type IV (Figure 3B), mais également
de la fibronectine (Figure 3C), de la laminine (Figure
3D), de l'élastine (Figure 3E) et des marqueurs de cellules
souches du tissu adipeux DPP4 (Figure 3f), ICAM1 (Figure
3G), ainsi que des cellules endothéliales 0D31 (Figure
3H). Les unités produites sont de tailles plus homogènes
que le produit ExAdEx-tissue et sont adaptées aux standards
utilisés par les industries pharmaceutiques dans le cadre
de criblage de molécules. Le produit ExAdEx-lobules est
aussi mieux adapté à l'injection à la seringue dans le
cadre d'une thérapie cellulaire. Ces unités ExAdEx-lobules
peuvent être produites à partir du produit ExAdEx-tissue
à différents temps d'amplification, par exemple à partir
de 10 jours d'amplification et jusqu'à 40 jours. Ces
agrégats, une fois formés, ne possèdent plus de capacités
d'amplification mais possèdent une viabilité en culture
supérieure à 10 jours. Les unités de ExAdEx-lobules peuvent
être maintenues dans la gamme de produit en adipocytes
blancs ou induit en différenciation ou différenciés en
adipocytes bruns/beiges.
En définitive, le procédé selon l'invention a pour objet
d'amplifier les cellules souches adipocytaires (hASCs)
brunes ou beiges, maintenues dans une matrice
extracellulaire active, en 3D et, puis de les différencier
en adipocytes bruns ou beiges tout en permettant de
maintenir viables des cellules du microenvironnement du
tissu adipeux à savoir les cellules endothéliales (hECs)
et des macrophages M1 et M2 (Figs. 21A, 21B). A cet effet,
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des milieux de culture ont été développés, car le milieu
de culture utilisé classiquement pour la prolifération et
la différenciation des hASCs est toxique pour les hECs et
le milieu de culture utilisé classiquement pour la
prolifération des hECs est inhibiteur de la
différenciation des hASCs. Deux milieux de culture ont
donc été établis : un milieu de prolifération, qui permet
la prolifération des hASCs et un milieu de différentiation,
qui permet la différenciation des hASCs amplifiées en
adipocytes exprimant le marqueur UCP1. L'originalité de
ces deux milieux de culture est qu'ils sont également
compatibles avec le maintien des cellules endothéliales du
tissu adipeux humain.
Le milieu référencé DMEM (Dulbecco m Modified Eagle
Medium), comprenant 10% FCS (Fetal Bovine Serum - Sérum
Foetal de Veau) est le milieu de référence pour la
prolifération des hASCs. Toutefois, ce milieu ne permet
pas de maintenir viables les cellules endothéliales. Pour
la détermination du milieu de prolifération, cinq milieux,
qui sont généralement commercialisés pour la prolifération
des cellules endothéliales humaines, ont été testés. Il
s'agit des milieux suivants :
N 1: Endo-BM EPC : Commercialisé par la société PrepoTechnv,
(référence produit : Cat: GS-EPC)
N 2: Endo-BM MacroV Commercialisé par la société
PrepoTechn4 (référence produit : Cat: GS-MacroV)
N 3: Endo-BM MicroV Commercialisé par la société
PrepoTechn4 (référence produit : Cat: GS-MicroV)
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N'4: EGM+ Commercialisé par la société Promocelln'
(référence produit : Cat: CC-22011 plus C-39216)
N 5 MV2 Commercialisé par la société PromocelIm (référence
produit : Cat: CC-39226 plus C-22022B)
En culture en 2D, ces cinq milieux permettent la
prolifération des cellules souches du tissu adipeux humain
avec la même efficacité que le milieu de référence.
Cependant, le milieu de prolifération N'4, à savoir EGM+,
a été choisi, car, notamment, contrairement aux autres
milieux testés, l'EGM+ n'induit pas d'hypoxie cellulaire,
suivie par le marqueur d'hypoxie CA9, lorsque les hASCs
sont en suspension en 3D, ainsi que cela est montré à la
Figure 4A.
La composition du milieu de prolifération EGM+ est la
suivante : Endothelium Cell Growth Medium (milieu de
croissance de cellules endothéliales) supplémenté par: 2%
FCS ; 5 ng/ml Epidermal Growth Factor (EGF - Facteur de
croissance épidermique) ; long/m1 Fibroblast Growth factor
(FGF2 - Facteur de croissance des fibroblastes 2) ; 20ng/m1
long R3 Insulin_like Growth Factor-1 (IGF-1 - Facteur de
croissance 1 ressemblant ou analogue à l'insuline) ; 0,5
ng/ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF - Facteur
de Croissance de l'Endothélium Vasculaire) 165 ; 1 pg/ml
Acide Ascorbique; 22,5 dg/m1 Héparine ; 0,2 pg/ml
Hydrocortisone_
Pour la détermination du milieu de différenciation
différents milieux ont été testés. Ces milieux ont été
enrichis en facteurs adipogéniques puis testés pour la
différenciation des hASCs. Les résultats indiquent que :
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contrairement aux milieux N'1 à 3, l'EGM+, complementé en
facteurs adipogéniques, permet une différenciation
adipocytaire, déterminée par l'expression du marqueur
adipocytaire PLIN1, ainsi que cela est montré à la Figure
5 4E. Cependant, l'expression du marqueur UCP1 spécifique
des adipocytes brun/beige est très faible, ainsi que cela
est montré à la Figure 40. Ce premier milieu 4 EGM+ de
différenciation est donc non optimisé. A noter également
que le milieu n 5 est une option à l'EGM+ qui n'a pas été
10 poursuivie plus avant.
La composition du milieu de prolifération non optimisé est
donc avantageusement celle décrite ci-dessus, supplémentée
en facteurs de différenciation adipocytaire à savoir : EGM
15 supplémenté en : 2% FCS ; 5 ng/ml EGF ; l0ng/m1 FGF2 ; 20
ng/ml long R3 IGF ; 0.5 ng/ml VEGF factor 165 ; 1 pg/ml
acide ascorbique ; 22,5 pg/ml Héparine ; 0,2 pg/ml
Hydrocortisone ; 2 pM Rosiglitazone ; 1 nM T3 ; 2,5 pg/ml
Insuline ; 0,25 pM Dexaméthasone ; 500 pM IBMX, un
20 inhibiteur non spécifique des phosphodiestérases.
Le milieu de différentiation précité, non optimisé, est
avantageusement optimisé de la manière suivante. Tout
d'abord, avec le retrait de l'EGF et de l'hydrocortisone
25 pour augmenter la différenciation des hASCs : les deux
composés sont décrits dans la littérature comme pouvant
inhiber l'expression de UCP1. Ensuite, avec le retrait de
la Dexaméthasone et de l'IBMX pour maintenir la viabilité
des hECs : comme le montre la Figure 5A, le milieu de
30 différenciation permet une différenciation en adipocyte
mais est toxique pour les hECs (Cellules Endothéliales -
Figure 5B). En revanche, le retrait de la Dexaméthasone et
de l'IBMX du cocktail de différenciation après les trois
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premiers jours permet de maintenir la viabilité des hECs
(Figure 5C). Ensuite encore, avec l'ajout du composé
SB431542 pour compenser le retrait de la Dexaméthasone et
de l'IBMX pour la différenciation en adipocytes : l'impact
du retrait de la dexaméthasone et de l'IBMX du cocktail de
différenciation après les trois premiers jours est une
diminution de la différentiation en adipocytes (PLIN1).
L'ajout de l'inhibiteur de la voie TGFb, le SB431542,
permet de rétablir la différenciation comme le montre la
Figure 6A. Le SB431542 est sans conséquence sur la
viabilité des hECs. Finalement, l'ajout de SB431542 et le
maintien de la Rosiglitazone permet l'expression de UCP1,
ainsi que cela est montré à la Figure 6B. De plus, la
présence de la Rosiglitazone est particulièrement
avantageuse car l'expression est très faible si la
Rosiglitazone n'est présente que les trois premiers jours.
La composition finale du milieu de différentiation
optimisé est ainsi avantageusement la suivante : EGM
supplémenté en : 0,1% à 5%, de préférence 2% FCS ; 2 ng/ml
à 20 ng/ml, de préférence 10 ng/ml FGF2 ; 10 ng/ml à 30
ng/ml, de préférence 20ng/m1 long R3 IGF-1 ; 0,1 ng/ml à
1 ng/ml, de préférence 0,5 ng/ml VEGF 165 ; 0,5 pg/ml à 2
pg/ml, de préférence 1 pg/ml acide ascorbique ; 0,5 pM à
4 pM de préférence 2 pM Rosiglitazone ; 0,5 nM à 10 nM, de
préférence 1 nM T3 ; 0,5 pg/ml à 10 pg/ml de préférence
2,5 pg/ml Insuline ; 0,1 pM à 0,500 pM, de préférence 0,25
pM Dexaméthasone ; 100 pM à 800 pM, de préférence 500 pM
de 3-isobuty1-1-methylxanthine (IBMX) ; 1 1JM à 10 pM, de
préférence 5 pM de SB431542.
Ce milieu de différentiation est un premier milieu de
différentiation, qui comporte de la dexaméthasone et de
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l'IBMX. Ces composés sont cependant présents uniquement
les 3 premiers jours environ de la différentiation. On
utilise ensuite un second milieu de différentiation dont
la composition est conforme à celle précitée du premier
milieu de différentiation, mais qui ne comporte pas de
dexaméthasone et d'IBMX.
La composition finale de ce second milieu de
différentiation est donc par exemple la suivante : 0,1% à
5%, de préférence 2% FCS ; 2 ng/ml à 20 ng/ml, de préférence
10 ng/ml FGF2 ; 10 ng/ml à 30 ng/ml, de préférence 20ng/m1
long R3 IGF-1 ; 0,1 ng/ml à 1 ng/ml, de préférence 0,5
ng/ml VEGF 165 ; 0,5 pg/ml à 2 pg/ml, de préférence 1 pg/ml
acide ascorbique ; 0.5 pM à 4 pM de préférence 2 pM
Rosiglitazone ; 0,5 nM à 10 nM, de préférence 1 nM T3 ;
0.5 pg/ml à 10 gg/ml de préférence 2,5 pg/ml Insuline ; 1
pM à 10 gM, de préférence 5 gM de SB431542.
Par ailleurs, éventuellement, les premier et/ou second
milieux de différentiation comprennent 5 gg/ml à 50 pg/ml,
par exemple 22,5 pg/ml d'héparine et 1 pM à 20 pM, par
exemple 10 pM de Y27632.
Comme le montre la Figure 7A, les hECs sont toujours
détectables après 20 jours dans la composition du milieu
de prolifération puis 20 jours de plus dans la composition
du milieu de différenciation. A cette Figure, les ECs sont
visualisées par expression du marqueur CD31. La photo de
gauche est une photo du tissu adipeux avant la mise en
uvre du procédé selon l'invention. La photo du centre est
une photo de ce tissu après 20 jours dans le milieu de
prolifération. La photo de droite est une photo de ce tissu
après 20 jours dans le milieu de prolifération puis 20
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jours dans le milieu de différentiation. La Figure 7B
montre également que les cellules DPP4 sont toujours
détectables après 20 jours dans la composition du milieu
de prolifération puis 20 jours de plus dans la composition
du milieu de différenciation. Ceci est également valable
pour les précurseurs d'adipocytes ICAM1 toujours
détectables dans le tissu amplifié après 20 jours de co-
culture (Figure 70).
Les facteurs qui dans le milieu de différenciation peuvent
ne pas être nécessaires ou utilisés dans d'autres
conditions : - le Y27632 est rapporté comme augmentant la
viabilité de cellules en suspension ; - l'héparine ; et -
les facteurs adipogéniques peuvent être utilisés à
d'autres concentrations.
Selon un exemple de réalisation de l'invention, la
différenciation des cellules souches d'adipocytes bruns ou
beiges du tissu adipeux en adipocytes bruns ou beiges est
induite in vivo. L'exemple 4 ci-dessous démontre en effet
que le produit amplifié selon le procédé de l'invention
permet une différenciation des cellules souches
d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux en adipocytes
bruns ou beiges, après transplantation chez la souris Nude.
Selon un troisième objet, l'invention concerne une matrice
extracellulaire isolée susceptible d'être obtenue selon le
procédé défini ci-dessus, comprenant des cellules
endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux
humain, des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges
du tissu adipeux humain et du collagène. Autrement dit, la
matrice extracellulaire est extraite lors de l'étape
d'extraction du procédé de l'invention, et comprend donc
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toutes les caractéristiques de la matrice extracellulaire
décrite ci-dessus.
Le collagène est du collagène structuré, de type I et du
collagène de type III (Figure 9A et Figure 9B). La matrice
extracellulaire comprend en outre notamment de la
fibronectine (Figure 22).
Selon un quatrième objet, l'invention concerne une
composition comprenant le mélange de la matrice
extracellulaire et de la fraction stroma-vasculaire tel
que défini ci-dessus, la matrice extracellulaire
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu
adipeux, et du collagène, et la fraction stroma-vasculaire
comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire
du tissu adipeux et des cellules souches du tissu adipeux
brun ou beige.
Autrement dit, la composition comprend la matrice
extracellulaire qui est extraite lors de l'étape
d'extraction du procédé de l'invention, ainsi que la
fraction stroma-vasculaire qui est extraite lors de cette
même étape d'extraction du procédé de l'invention. La
matrice extracellulaire de la composition comprend donc
toutes les caractéristiques de la matrice extracellulaire
décrite ci-dessus. Et la fraction stroma-vasculaire de la
composition comprend donc toutes les caractéristiques de
la fraction stroma-vasculaire décrite ci-dessus.
Le collagène est du collagène de type I et du collagène de
type III. La matrice extracellulaire comprend en outre de
la fibronectine (Figure 22).
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Cette composition, obtenue selon le procédé de
l'invention, avant amplification du mélange de la fraction
stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire, est
5 une composition tissulaire. Cette composition comprend en
outre des adipocytes matures.
Selon un cinquième objet, l'invention concerne un kit
comprenant la composition telle que définie précédemment,
10 le milieu de prolifération et le milieu de différentiation.
Selon un sixième objet, l'invention concerne l'utilisation
in vitro de la matrice extracellulaire telle que définie
ci-dessus ou l'utilisation in vitro de la composition telle
15 que définie ci-dessus pour le criblage et/ou la
caractérisation d'actifs pharmacologiques, notamment
contre l'obésité et/ou les maladies métaboliques associées
comme le diabète de type 2 et les maladies cardio-
vasculaires.
L'invention concerne en outre des adipocytes bruns ou
beiges obtenus selon le procédé défini ci-dessus, ou issus
d'une composition telle que définie précédemment, et
destinés à une utilisation, ou pour leur utilisation, en
thérapie cellulaire, ou pour le traitement des désordres
métaboliques. Le terme issu doit être compris comme
signifiant que les adipocytes proviennent de la
composition, par différentiation de cellules souches
d'adipocytes bruns ou beiges.
L'invention concerne ainsi une composition, obtenue selon
les procédés de l'invention, comprenant des adipocytes
bruns ou beiges ou les précurseurs de tels adipocytes, et
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destinés à une utilisation, ou pour leur utilisation, en
thérapie cellulaire, ou pour le traitement des désordres
métaboliques. Cette composition est une composition
tissulaire du tissu adipeux humain et comprend l'ensemble
du produit obtenu par les procédés de l'invention, c'est-
à-dire le mélange de la fraction stroma-vasculaire et de
la matrice extracellulaire, après prolifération, voire
après différentiation.
Les adipocytes bruns ou beiges ou les précurseurs de tels
adipocytes, peuvent être utilisés pour le traitement de
l'obésité chez des individus en surpoids ou obèses. A cet
effet, et dans un exemple, on réalise un prélèvement d'un
tissu adipeux blanc chez un individu. Ce tissu prélevé est
ensuite traité selon le procédé de l'invention, afin
d'obtenir, toujours dans cet exemple, des produits ExAdEx-
tissue voire ExAdEx-lobules tels que décrits précédemment.
Ces produits, dans lesquels les cellules souches
précurseurs d'adipocytes bruns ou beiges ont subi une
amplification, font alors avantageusement l'objet d'une
différenciation en adipocytes bruns ou beiges. Puis, les
produits comportant ces adipocytes bruns ou beiges sont
transplantés, par exemple, dans un tissu adipeux blanc ou
à proximité d'un tel tissu de l'individu. Il est à noter
que les produits comportant les adipocytes bruns ou beiges
sont une composition tissulaire telle que définie au
paragraphe précédent. Dans un autre mode de réalisation,
on transplante non pas des adipocytes bruns ou beiges mais
des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges, ayant
subi l'amplification selon le procédé de l'invention,
autrement dit une composition tissulaire telle que définie
ci-dessus, comprenant le mélange de la fraction stroma-
vasculaire et de la matrice extracellulaire après
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prolifération, et la différentiation en adipocytes blancs
ou beiges mature s'effectue dans le corps de l'individu
transplanté.
EXEMPLES
EXEMPLE 1. EXTRACTION MECANIQUE
a) Procédé d'extraction mécanique en vue de la
caractérisation des populations cellulaires et
matricielles au cours du processus
L'extraction mécanique de la fraction stroma-vasculaires
et de la matrice extracellulaire, à partir d'un prélèvement
de tissu adipeux chez un donneur humain, peut être réalisée
selon les étapes suivantes (Figs. 1A et 1B) :
1. Prélèvement de tissu adipeux par aspiration dans une
seringue stérile de lOcc équipée d'une canule de Coleman
2mm en dépression -20kPa.
2. Afin de séparer les différentes phases, la seringue est
centrifugée à 1600 rcf (force centrifuge relative), 3 min
dans le tube de collecte. La fraction huile ainsi que la
fraction sang et liquide anesthésique sont éliminées. La
fraction culotée, nommée Cl, est conservée.
3. Une unité de sérum physiologique est injectée dans la
seringue, suivie d'une incubation de 30 min à 37 C en
agitation. La seringue est centrifugée à 1600 rcf, 3 min
dans le tube de collecte. La fraction de liquide
physiologique et la fraction huile sont éliminées. La
fraction culotée, nommée C2, est conservée.
4. La seringue est connectée à une autre seringue de type
Luer-Lock mâle reliée par un connecteur de type Tulip0
afin de procéder à la dissociation du tissu par une
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émulsification. Trois types de connecteur Tulipe, 2,4 mm,
1,4 mm puis 1,2 mm, sont successivement utilisés, sur 30
passages.
5. Une unité de sérum physiologique est injectée dans la
seringue, suivie d'une incubation de 30 min à 37 C en
agitation. La seringue est centrifugée à 1600 rcf 3 min
dans le tube de collecte. La fraction de liquide
physiologique et la fraction huile sont éliminées. La
fraction culotée, nommée 03, est conservée.
6. Le contenu de la seringue ainsi que les contenus Cl, 02
et C3 des tubes de collecte préalablement débarrassés des
cellules sanguines sont transférés par une connexion
stérile dans une poche de culture contenant le milieu de
culture EGM+ à 37 C pour la phase d'expansion.
Lors de l'étape 4 ci-dessus de dissociation du tissu, un
connecteur d'une autre marque que la marque Tulipe peut
être employé. Le nombre de connecteur employé est compris
entre 1 et 5. Le nombre de passages à travers ces
connecteurs est compris entre 10 et 50.
La Figure lA montre un procédé permettant de rassembler
dans l'étape 2 les populations Cl et 02 ainsi que les
matrices M1 et M2. Dans l'étape 3 sont regroupées la
population C3 et les matrices M3 et M4.
b) Caractérisation des populations cellulaires obtenues
Le procédé décrit ci-dessus permet d'extraire
séquentiellement la fraction stroma-vasculaire et une
matrice extracellulaire. Les populations cellulaires sont
caractérisées en particulier par microscopie à
fluorescence, par une caractérisation moléculaire par PCR
quantitative et par cytométrie en flux.
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- La fraction stroma vasculaire obtenu est caractérisé par
une majorité de cellules de type DPP4+ (Figure 17A) au
niveau de l'expression génique du marqueur DPP4 et par
observation de la protéine DPP4 par microscopie (Figure
8A). En comparaison, la protéine ICAM1 est peu présente
(Figure 17C et Figure 8B).
- La matrice extracellulaire obtenu est caractérisé par
une majorité de cellules de type ICAM1+ (Figure 170) et
CD31+ (Figure 17E) au niveau de l'expression génique. Ce
résultat est confirmé par la présence de cellules exprimant
la protéine ICAM1 observé par microscopie (Figure 8E)
- le produit amplifié ExAdEx obtenu est caractérisé en
particulier par la présence de cellules de type CD26+
(figure 28). En particulier, des profils des cellules
souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux ex
vivo et du produit amplifié ExAdEx, sont obtenus par
détermination, par cytométrie en flux, des marqueurs de
surface cellulaire. Il est ainsi démontré que le procédé
de l'invention permet une augmentation de la population de
cellules exprimant le marqueur 0D26 de 4% à 51% (figure
29A). Les cellules exprimant le marqueur 0D54 sont
présentes mais pas amplifiées par le procédé de l'invention
(figure 29E).
c) Caractérisation des matrices M1 à M4 obtenues lors des
différentes étapes du procédé
- La matrice obtenue lors de l'étape 2, nommée ici Ni est
de type fibreux (Figure 90).
- La matrice obtenue lors de l'étape 3, nommée ici M2 est
de type fibreux et riche en collagène (Figure 9D). Le
collagène est révélé par le PicroSirius Red (Figure 9A)
qui permet, de plus, de visualiser une structure du
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collagène en bâtonnets. Cette matrice contient des
cellules endogènes.
- La matrice obtenue lors de l'étape 5 et isolé dans le
tube de collecte, nommée ici M3, est de type fibreux
5 (Figure 9E et Figure 9B). Cette matrice contient également
des cellules endogènes. Le collagène de la matrice isolée
est révélé, à la Figure 9E, par le PicroSirius Red qui
colore les fibres de collagène de type I et de type III.
La coloration rouge (en nuance de gris à la Figure 9B)
10 obtenue indique que le collagène reste organisé, à savoir
que le collagène présent présente toujours une structure
secondaire en hélice cx et une structure quaternaire en
triple hélice. Il n'est pas dégradé. En effet, le collagène
désorganisé se colore en vert par le PicroSirius Red.
15 - La matrice obtenue lors de l'étape 5 et contenue dans la
seringue, nommée ici M4, est composée d'une majorité
d'adipocytes matures et d'une trame de collagène de type
I (Figure 10B). La matrice M4 est également composée de
structures capillaires formées par des cellules
20 endothéliales 0D31+ (Figure 10C) et par un réseau de
cellules souches du tissu adipeux PDGFRa+ (Figure 10D).
d) Purification de l'infranatant 01/02
25 Les populations Cl et C2 sont préalablement débarrassées
des cellules sanguines par une incubation des culots
cellulaires dans un tampon de lyse 1X comprenant du
chlorure d'ammonium, nommé ACL, dilué dans de l'eau
stérilisée, dans un rapport tampon : échantillon, variant
30 de 1:1 à 1:10, à une température comprise entre 4 et 37 C
et durant un temps d'incubation variant de 5 minutes à 30
minutes. Afin de déterminer l'effet de ce traitement ACL
sui les cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du
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tissu adipeux, une analyse en cytométrie en flux a été
réalisée. Ainsi, un total de 1.105 cellules souches du
tissu adipeux humain ont été incubées, dans une solution
saline comme contrôle, ou à différents temps, dans 10
volumes de la solution de lyse des cellules sanguines. La
figure 25A illustre la viabilité directe en termes de
nombres de cellules viables après incubation dans les
différentes compositions. La figure 25B illustre la
viabilité après 24h de culture et la figure 250 présente
la capacité de prolifération après 5 jours en conditions
de culture adhérente (Test Post hoc de Tuckey * < 0,05 ;
** < 0,01 ; *** < 0,001 pour n= 5). Un résultat graphique
de cette analyse par cytométrie en flux est présenté sur
les figures 26A, 26E, 260 et 26D et permet de visualiser
le nombre de cellules viables et mortes après différents
temps de traitements dans l'ACL. Une solution saline est
prise comme référence. Sur ces figures apparaissent, dans
l'encadré gris à gauche, les cellules viables et dans
l'encadré à droite, les cellules mortes, identifiées par
le marquage à l'Iodure de Propidium. Ce marquage a la
propriété de ne pénétrer que les cellules dont la membrane
cellulaire est endommagée. Une autre analyse par
cytométrie en flux a également été réalisée afin de
déterminer l'influence de la purification de l'infranatant
sur les cellules endothéliales du tissu adipeux. Ainsi, un
total de 1.105 cellules endothéliales du tissu adipeux
humain ont été incubées dans une solution saline comme
contrôle, ou à différent temps, dans 10 volumes de la
solution de lyse des cellules sanguines. La figure 27A
illustre la viabilité directe en termes de nombres de
cellules viables après incubation dans les différentes
compositions. La figure 27B illustre la viabilité après
24h de culture et la figure 270 présente la capacité de
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prolifération après 5 jours en conditions de culture
adhérente. Il résulte de ces analyses qu'une période
d'incubation dans l'ACL supérieure à 5 minutes endommage
la viabilité et les capacités de prolifération des cellules
souches du tissu adipeux contenues dans l'infranatant.
L'incubation dans l'ACL n'a, par ailleurs, pas d'effets
sur la viabilité ou les capacités de prolifération des
cellules endothéliales du tissu adipeux humain.
EXEMPLE 2. EXPANSION CELLULAIRE ET DIFFERENCIATION
Une méthode d'expansion ex vivo de cellules souches
d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux et de
différenciation dans un environnement mimant le tissu
adipeux comprend les étapes suivantes :
1. Le produit final obtenu à l'exemple 1 contenant les
populations C1-03 ainsi que les matrices dites EndoStem-
Matrix M1-M4 sont misent en culture en suspension dans des
poches et maintenues dans le milieu de prolifération EGM+
avec une agitation pendant 24h à 37 C 5% 002, puis
maintenues dans les mêmes conditions, de préférence, avec
agitation.
2. Le milieu de prolifération EGM+ est changé à 50% tous
les deux jours.
3. Une dissociation mécanique en système clos, par passage
à travers 2 seringues ou deux poches de culture montées en
tulipe, est effectuée au jour 5 et jour 10.
4. Au jour 14, le milieu de prolifération EGM+ est remplacé
par le cocktail de différenciation I composé de EGM+
enrichi en 250 pM Dexaméthasone ; 500 pM IBMX ; 1 pM
Rosiglitazone ; 2 pM T3 et 2,5 pg/ml insuline.
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5. Au jour 17, le milieu de différenciation I est remplacé
par le milieu de différenciation II composé de EGM+ enrichi
en 1 pM Rosiglitazone ; 2 pM T3 et 2,5 ugiml insuline.
EXEMPLE 3. CARACTERISATION DE LA CAPACITE D'AMPLIFICATION
DE LA MATRICE
Les matrices extracellulaires dites EndoStem-Matrix de
l'invention ont été caractérisées, notamment, par
microscopie à fluorescence, en présence de différents
marqueurs spécifiques. Des cellules en prolifération ont
ainsi été détectées par incorporation, lors de la phase de
réplication de l'ADN, de Edu (5-ethylny1-2'-deoxyuridine)
fluorescent dans les matrices EndoStem-Matrix de
l'invention, comme illustré sur la Figure 11, prouvant que
celles-ci sont bioactives. En effet, la Figure 11 montre
que les cellules endogènes aux matrices sont maintenues en
prolifération pendant la phase d'amplification.
Par ailleurs, la Figure 12 met en évidence la présence de
cellules souches exogènes du tissu adipeux mises en co-
culture après trois jours de co-culture avec la matrice
extracellulaire de l'invention. La matrice extracellulaire
permet donc de fournir un support pour la prolifération de
la fraction stroma-vasculaire : les cellules souches du
tissu adipeux ajoutées peuvent s'attacher à la matrice
EndoStem-Matrix, en suspension. Ceci montre que des
cellules exogènes ont la capacité de s'attacher à la
matrice extracellulaire selon l'invention, et démontre que
la matrice peut être utilisée en tant que telle et seule
pour des applications cliniques ou in vitro et, notamment,
pour le criblage et/ou la caractérisation d'actifs
pharmacologiques. Les cellules souches exogènes peuvent
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être génétiquement modifiées, par exemple, pour exprimer
une protéine d'intérêt. Les cellules souches exogènes
peuvent par ailleurs être des cellules souches non-
adipocytaires ou spécifiquement adipocytaires. Il peut
s'agir, par exemple, de cellules souches de la peau,
notamment des cellules souches épithéliales de la peau ou
de cellules souches pluripotentes induites.
En référence à la figure 13B, la fraction stroma-vasculaire
est amplifiée par sa culture sur l'EndoStem Matrix de
l'invention. A l'inverse, en référence à la figure 13A,
lorsque la fraction stroma-vasculaire est mise en culture
en suspension sans la matrice extracellulaire, des
agrégats cellulaires sans prolifération sont observés. La
matrice extracellulaire de l'invention a donc la capacité
d'amplifier les cellules souches du tissu adipeux
ajoutées.
De plus, la figure 16 permet de mettre en évidence la
nécessité de la co-culture de la fraction stroma-
vasculaire et de la matrice pour obtenir une amplification
des cellules souches du tissu adipeux. Les figures 16A,
16C et 16E montrent une proportion faible de cellules en
prolifération dans la matrice Endostem cultivée sans
l'ajout de la fraction stroma-vasculaire. En comparaison,
les Figures 16B, 16D et 16F montrent que la co-culture de
la fraction stroma-vasculaire et de la matrice
extracellulaire permet d'obtenir une prolifération
supérieure des cellules souches du tissu adipeux. De la
même manière, afin de comparer la viabilité et les
capacités d'amplification des cellules souches du tissu
adipeux, des cellules contenues dans une composition sans
ajout de la fraction stroma-vasculaire (figure 32A) ou une
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composition comprenant un mélange de la matrice
extracellulaire et des cellules isolées de l'infranatant
(figure 32B) sont isolées par digestion mécanique, mises
en culture en conditions adhérentes 48h, puis fixées et
5 colorées au cristal violet, permettant ainsi d'observer la
densité cellulaire. Les cellules contenues dans le puits
cellulaire apparaissent en noir sur la figure 32. La figure
32A montre ainsi une faible amplification de la population
cellulaire en absence de l'ajout de la fraction stroma-
10 vasculaire. A l'inverse, la figure 32E montre une
amplification des populations cellulaires de la fraction
stroma-vasculaire après mise en culture.
La capacité d'amplification cellulaire des différentes
15 matrices M1 à M4 obtenues au cours des étapes de l'exemple
1 a été vérifiée. Ainsi, environ 104 cellules souches du
tissu adipeux ont été maintenues en suspension en présence
des différentes matrices M1 à M4 en puits Ultra Low
Attachment (ULA). Huit jours après, les cellules sont
20 détachées de la matrice par de la trypsine/EDTA puis
comptées. Les valeurs obtenues sont montrées dans le
tableau 1 suivant :
[Table 1]
Facteur
Conditions Nombre de cellules
d'amplification
Cellules souches du
tissu adipeux sans 2-104 1
matrice
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51
Cellules souches du
tissu adipeux avec 5-104 2,5
matrice M1
Cellules souches du
tissu adipeux avec 53-104 26,5
matrice M2
Cellules souches du
tissu adipeux avec 7,4-104 3,7
matrice M3
Cellules souches du
tissu adipeux avec 72-10 36
matrice M4
Matrice M4 sans ajout
de cellules souches du 5-104
tissu adipeux
Dans le tableau ci-dessus, pour le cas particulier des
matrices individuelle M1 à M4, le facteur d'amplification
est le rapport entre le nombre de cellules obtenues après
culture en présence de la matrice extracellulaire et le
nombre de cellules obtenu en absence de la matrice
extracellulaire.
Les matrices M2 et M4 ont un fort pouvoir d'amplification
des cellules souches du tissu adipeux. Le volume de matrice
M2 obtenu est très faible comparé au volume de la M4
(Figure 10A). La matrice M4 illustre une matrice
extracellulaire telle que définie dans l'invention.
Le niveau d'expression de différents marqueurs cellulaires
(marqueur de cellules souches du tissu adipeux et de
cellules endothéliales CD31) a été analysé après culture
en suspension de la fraction stroma-vasculaire sur la
matrice extracellulaire dc l'invention dans le milieu de
prolifération. Cette étude révèle une amplification des
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cellules souches du tissu adipeux brun/beige DPP4 (Figure
17B), une conservation des cellules souches précurseurs
d'adipocytes du tissu adipeux humain ICAM1 (Figure 17D) et
la conservation d'une population de cellules endothéliales
(Figure 17F).
Le niveau d'expression de différents marqueurs cellulaires
(marqueur de cellules endothéliales CD31, marqueur de
cellules souches adipocytaires PDGFRa, et deux marqueurs
d'adipocytes matures PLN1 et Adiponectine) a été analysé
après culture en suspension de la fraction stroma-
vasculaire sur la matrice extracellulaire de l'invention
après l'étape d'amplification et de différenciation du
produit ExAdEx-tissue. La Figure 14 montre une comparaison
de ces niveaux d'expression avec ceux issus d'une culture
en suspension de la fraction stroma-vasculaire sans la
matrice extracellulaire de l'invention. Cette étude révèle
une amplification des cellules endothéliales du réseau
vasculaire du tissu adipeux (Figure 14A) et des cellules
souches du tissu adipeux (Figure 14B). Cette étude permet
également de mettre en évidence la meilleure capacité de
différenciation induite par la matrice extracellulaire de
l'invention (Figures. 140 et 14D). Ainsi, les cellules
souches du tissu adipeux amplifiées en 3D sur la matrice
extracellulaire de l'invention gardent leur capacité à se
différencier en adipocytes.
Le procédé ExAdEx de l'invention permet, en outre, de
conserver le réseau vasculaire natif, lors de
l'amplification et de la différentiation cellulaire. Les
figures 30A, 30E et 300 illustrent les cellules
endothéliales isolées du tissu adipeux humain après
culture dans différents milieux. La figure 30A montre les
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cellules endothéliales du tissu adipeux après culture dans
le milieu de prolifération de l'invention. La figure 30B
montre les cellules endothéliales du tissu adipeux après
culture dans le milieu de différentiation de l'invention.
Et la figure 30C montre les cellules endothéliales du tissu
adipeux après culture dans un milieu de différentiation
standard, non optimisé, qui comprend du DMEM et du sérum.
Il en résulte que seuls les milieux décrits dans
l'invention permettent une conservation des cellules
endothéliales lors des étapes de prolifération et de
différentiation en tissu adipeux brun/beige. La
conservation des cellules endothéliales est d'intérêt, en
particulier, pour des applications de transplantation du
tissu adipeux brun/beige, permettant une vascularisation
post-greffe et donc une viabilité du produit de
transplantation. A cet égard, il est également démontré
ici que le réseau vasculaire natif, présent dans la
composition amplifiée, et éventuellement différentiée,
obtenue par le procédé de l'invention, présente des
capacités de revascularisation post-greffe chez la souris
Nude. En effet, tel que cela apparait en blanc sur la
figure 31, 4 semaines après transplantation chez la souris
Nude, la composition de l'invention présente un réseau
vasculaire fonctionnel.
On notera qu'un tissu adipeux non dissocié, qui peut être
assimilé à un explant, reste viable peu de temps ex vivo.
Ainsi que cela est montré notamment à la Figure 15, la
matrice isolée par dissociation contient des cellules en
prolifération (Figure 15B), au contraire d'un tissu non
dissocié (Figure 15A). Les Figures. 15A et 15E permettent
de comparer la prolifération cellulaire dans le tissu non
dissocié (Figure 15A) et dans la matrice isolée (Figure
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15B). En Figure 15A, le tissu adipeux non dissocié ne
montre pas de cellules en prolifération. En Figure 15B, la
composition montre des cellules en prolifération. En
effet, cette figure fait apparaître, en blanc, les noyaux
des cellules en prolifération.
On notera que les cellules isolées selon l'invention, par
centrifugation du liquide des lavages, sont caractérisées
moléculairement par le marqueur DPP4. DPP4 est un marqueur
les cellules précurseurs des pré-adipocytes ICAM1, qui ont
une grande capacité de prolifération et qui sont localisées
dans le réticulum interstitiel du tissu adipeux. Ce sont
des cellules qui ont la capacité de prolifération dans la
composition selon l'invention. Il est important de noter
que ces cellules sont éliminées à la suite des lavages
réalisés selon les procédés de l'art antérieur. Ainsi que
cela est montré à la Figure 17A, l'expression de DPP4 est
concentrée dans la fraction stroma-vasculaire isolée. La
matrice en exprime peu. En revanche, et ainsi que cela est
montré à la Figure 170, l'expression de ICAM1, est
concentrée dans la matrice isolée, ainsi que les cellules
de type 0D31 à la Figure 17E. Les cellules qui portent
l'amplification dans la composition sont les cellules
exprimant DPP4 ajoutées.
En effet, la Figure 18 montre que dans le produit de co-
culture, les cellules exprimant le marqueur de
prolifération Edu sont les cellules exprimant également le
marqueur DPP4. Ainsi, les cellules souches, qui portent le
pouvoir d'amplification, sont préférentiellement les
cellules de type DPP4 ou 0D26+.
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Par ailleurs, on notera que le tissu adipeux in vivo
contient des macrophages et que la composition amplifiée
selon l'invention maintient la présence de macrophages de
type Ml, ainsi que cela est montré à la Figure 21A et de
5 type M2 ainsi que cela est montré à la Figure 21B. A la
Figure 21A, les macrophages de type M1 sont révélés par le
marqueur IL-lb et, à la Figure 21E, les macrophages de
type M2 sont révélés par le marqueur MRC1.
10 Enfin, et ainsi que cela est montré à la Figure 22, la
matrice isolée selon l'invention comprend des protéines de
la matrice extracellulaire, à savoir notamment, le
collagène de type I, le collagène de type IV, l'élastine,
la fibronectine, la laminine. Le marquage des cellules
15 endothéliales CD31 montre qu'un réseau capillaire est
conservé.
EXEMPLE 4 - AMPLIFICATION/DIFFERENTIATION EN ADIPOCYTES
BRUNS/BEIGES
La Figure 19 montre que ce sont les cellules DPP4 positives
qui sont préférentiellement les précurseurs d'adipocytes
bruns/beiges. En effet, une population isolée de cellules
souches du tissu adipeux humain exprimant DPP4+ et mise en
différenciation selon le milieu décrit dans l'invention
(Figure 19 ligne du haut), montre une expression du
marqueur UCP1 en microscopie confocale. En revanche, une
population de cellules souches du tissu adipeux humain
n'exprimant pas le marqueur de surface DPP4, ne montre pas
d'expression du marqueur UCP1 après différenciation. Des
analyses moléculaires confirment ces observations et
montrent que le marqueur de différenciation adipocytaire
PLIN1 est comparable pour les populations DPP4 positives
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et négatives (Figure20A), en revanche, le marqueur de
différenciation du tissu adipeux brun/beige est observable
uniquement dans la population différenciée à partir de
cellules souches exprimant le marqueur DPP4 (Figure 20E).
Le produit ExAdEx-tissue amplifié - mais non différencié
- a été injecté au niveau interscapulaire, à proximité du
tissu adipeux brun de la souris immunodéficience dite
Nude . Vingt et un jours après injection (J21) le produit
ExAdEx-tissue a été prélevé. Les ARN ont été extraits des
cellules constitutives du tissu prélevé. Le niveau
d'expression du marqueur d'adipocytes bruns/beiges UCP1 a
été comparé à celui du produit avant injection (JO). Les
niveaux d'expression de UCP1 à JO et à J21, ont été
déterminés par PCR quantitative en temps réel puis ont été
normalisés en les rapportant à un gène de référence dont
l'expression ne varie pas dans les 2 conditions, à savoir
le gène : GUSB humain (beta glucuronidase). Ainsi que cela
est montré à la Figure 23, il apparaît que le tissu
amplifié transplanté a fait l'objet d'une différentiation
cellulaire in vivo en adipocytes bruns/beiges après
transplantation. En pratique, et ainsi que cela est montré
à la Figure 24, il n'y a pas d'adipocytes bruns/beiges
dans le tissu adipeux sous-cutané blanc avant la mise en
uvre du procédé de l'invention (Figure 24, photographie
de gauche). La présence d'adipocytes bruns/beiges
(spécifiquement marqués par expression de la protéine
UCP1) ex vivo après l'invention à partir de tissu adipeux
de personne en surpoids (Figure 24, photographie du
milieu). La présence d'adipocytes bruns/beiges ex vivo
après l'invention à partir de tissu adipeux d'un patient
avec une obésité sévère (Figure 24, photographie de
droite).
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