Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
33~
~ a présente invention a trait ~ un procédé de préparation
d~albumine purifiée, notammen-t d'albumine humaine~ ainsi qu~
l'albumine obtenue selon ce procédé~
~ e procédé selon l'invention permet notamment de pré-
parer de l'albumine purifiée tant ~ partir ae mati~res premi~res
- non contaminées par l~hémoglobine, comme par exemple le plasma9
qu'à partir de matières.contaminées par l'hémoglobine comme
par exemple les placen-tas, le sang placentaire ou d'une manière
g~rale tout sang hémolysé.
Il existe déj~ un certain nombre de procédés de prépa
ration a ~ albumine puri~iée aont aucun n'a cependant permis de
produire, du moins avec un prix de revient su~fisamment écono-
mi~ue, des quantités importantes d'albumine purifiée non dé-
naturée, surtout dans le cas où la matière première est une
matiere contenant de nombreuses impuretés et nota~ment de 11hé-
moglobine.
~ a présente invention se propose donc de fournir un
procédé de préparation a ~ albumine purifiée, notamment d~albu-
mine humaine, qui soit de mise en oeuvre s~mple et économique,
et qui permette de préparer induqtriellement de grandes quanti-
t~s d'albumine trè~ puri~iée, ~ partir des sources les plus
courantes~
~'albumine purifiée obtenue, lorsqu'elle est d'origine
: humaine~ peut servir a la préparation de solutions de protéines
utilisables comme liquides de transfusion; par exemple pour le
~raitement a 'états de choc, ou dans le cas de diminution dan-
gereuse de la quantité de sang circulant~
~ette albumine purifi~e est particuli~rement bien
supportée par l'orgc~nisme receveur et ne provoque pas les
réactions qui se produisent souvent avec les préparations
d'albumine classiques.
~invention a pour obje-t un procédé de préparation~
~.
~ 3 ~ O
d~albumine purifi~e ~e~sible~ent exempte ~Ihémoglobine et de
prot~ine~ étra~g~re~ ou dénatur~e~ ~ partir alune solution
impure d'albumine do~t la plu~ grande partie de ~9hémoglobine
a d~ t~ ~limin~e~ Cette ~olution impure ~albu~ine cont~ent
lesdite~ prot~i~es ~trang~re~ ou d~natur~e~ et de3 trac~ d'h~-
moglobine et a une teneur e~ prot~ine~ i~férieure ~ 50g par
litre. 0~ e~fectue une thermocoagulatio~ de ce~ me~t~ i~
d~sirés par chauf~age de la solutio~ ~ une temp~rature comprise
entre 50 et 64C7 en pr~se~ce d?acide ¢apryliqu~ ~ un pH comprl~
entre 498 et 5,25, la quantit~ d9acide caprylique9 e~primée en
poid~ de caprylate de ~odium~ ~tant comprise entre 15% et 30~
par rapport au poids des prot~ines pr~ente~ da~s la solu~ion
purifier~ ~e p~ de la 801~tio~ impure dlalbumine est d;~autant
plu~ élevé ~ue la proportion de caprylate par rapport aux pro-
t~ines e~t plu~ élevée. ~a thermocoagulation s~effsctue de
pr~érence pendant une durée au moins égale ~ 30 minute~ ~
~aide d~une qua~tit~ en poid~ d~acide capryli~ue qui, exprimée
en poid~ de caprylate de sodium est compxise entre 15 % et 30 %
du poid~ en protéine~ de la ~olutio~, ~ un pH compris entre
4~8 et 5,25.
De ~açon avantag~u~e5 o~ utili~e de pr~f~rence une
solutio~ ~ pur~fier dan~ laquelle la teneur en prot~ines e~t
in~rieure ~ 50 gra~me~ par litra et de pr~f~rence sit~ée au
~oisinage de 20 gramme~ par litre.
Dan~ un mode de ml~e e~ oeuvre pr~fér~g l~acide ~apry-
li~u~ e~t introdult sou~ forme de caprylate de ~odium~ mai~ il
e~t ~galeme~t po3~1ble de l~introdulre ~OU8 daautre~ fo~me~, par
~xemple ~ou~ la forme de l'acide lui-mame e~ no~ pa3 ~ou~ forme
a~ ~n ~el. Dan~ c~ ca~, la t~eur e~ acide capxylique 3era d~-
3Q termi~ée par un 8imple oalcul ~ partir de~ ~aleurs pr~cédente~
qui corresponde~t au cas o~ l~acide capryligue est introduit
~ou~ forme de caprylate de ~odiumO
2 _
3Za~
Dlune façon gén~ral09 le pH e~t choi~i d~aut~t plus
gra~d que la proportion de caprylate par rappor-t au~ prot~e~
est plu~ importante .
Ain~ titre d~e:~emple~ lor~que la tenelLr e~ capr~-
late est égal~ ~ 15 % de la teneur en protéin~, le pH sera de
pré~ére~ce de l:'ordre de 4,~5 ~ 4~,95~ ta~di~ g~e pour u~e teneur
en ~aprylate égale ~ 20 % de la teneur en protéi~e~,~ le ?H le
plu~ faYorable sera ¢oml?ri~ entre 4995 et 5705~ Pour
-~ 2 ~ 3 ~
une tenellr en capr~late de 25 ~ le pH sera de pr~ére~lce au
voisinage de 5,17 tandis que pour une teneur de 30 ~o en
caprylate, le p~ sera avantageu~ement de 1'ordre de 5 9 15O
~a thermocoagulation ainsi effectuée perme~ d'éliminer
une grande partie de l'hémoglobine et de précipiter l'albumine
dénaturée ainsi que les protéines étrangères.
Dans le cas o~ la solution ~ purifier a été obtenue
~ partir d'une origine plaqmati~ue~ le procédé précité permet
d'obtenir directement une albumine purifiée directement utili-
sable
Dans le cas o~ la solution à purifier ~rovient-d'une
~ource davantage contaminée par des corps étrangers9 par exemple
du placenta, au sang plaeentaire QU du sang hémolys~, on peut
faire a~antageusement précéder la thermocoagulation par l'une
au moins des ~tapes consistant ~ éliminer la ma~eure partie de
l'hémog3obine, à éliminer les enzymes tels que les phosphatases
alc~lines par précipitation des protéines ~ l'aide d'un acide
tel que l'acide trichloracétique ou les acides polyphospho-
rique~, et ~ éliminer les substances de groupe.
L'éliminatlon de l'hémoglobine peut avantageusement
etre e~fectuée en présence d'une concentration d'éthanol infé-
rieure ~ 60 %, avec adjonction d'un hydrocarbure halogéné tel
que le chloroforme~ Elle peut cependant aussi être effectuée
par ad~onction d'un hydrocarbure halogéné sans alcool ou par
d'autres procédés en soi connus.
limination des en~ymes tels que les phosphat~ses
que l'on e~fectue de préférence après l'~tape d'~limination de
l'hémoglobine, est de préférence effectuée en présence d'une
concentration d'éthanol inférieure ~ 60 %, avec adjonction
d'acide trichloracétique. ~a concentration de 19acide peut 8tre
comprise entre 3 et 10.10-2 ~/litre et est de préférence ae
l'ordre de 4,2.10 2 M/litre, l'acide étant ajouté à la solution
1~2~
protéi~ue ~ une tempéra-ture inferieure ~ 0C et de préf~rence
comprîse entre -5 et -10C, jusqu'~ précipitation totale des
pxotéines.
~ n dehors de l'élimination des enzymes9 oette étape
permet également de concentrer notablement la quantité dlalbu-
mine en solution du fait que l'albumine précipite.
Dans cextain~ cas, il est possible de remplacer la
précipitation avec l'acide trichloracétique par une précipitation
aveo un acide polyphosphorique.
~ tape d'élimination de substances ~e groupe s'e~-
fectue de préférence aYec une concentration en éthanol supérieuxe
à 55 ~, par exemple de l'ordre de 75 ~o, a~ec une concentration
en protéines de préférence inférieure ou égale à 10g/litre et
en ajoutant de l'acide trichloracéti~ue à la solution ~ une
temp~rature inférieure ~ 0, comprise par exemple entre -5 et
-10C. ~a quantité d'acide trichloracé~ique peut avantageu-
sement e~re de l'ordre de 8.10 2 M/litre. ~e préclpité obtenu
est rejetéO A ce stade, les substancea de groupe sont éliminées.
aette étape permet égaleme~t d'éliminer les phospha-
ta~es alcalines, de sorte que l'~tape précédente d'éliminationdes phosphatases peut éventuellement etre supprim~e. ~lle est
aloxs de pr~férence remplacée par une simple concentration des
prot,élnes.
~ 'invention a également pour objet l'albumine ainsi
préparée~ laquelle se caractérise par des propriétés pratique-
ment identiques ~ celles de l'albumine organique originelle~
cette albumine pouvant ainsi 8tre utilisée pour le traitement
d'a~ect~ons notamment humaines~
~ autres avantages et caract~ristiques de l'invention
appara~tront ~ la lecture de la de,scription suiv~nte faite à
titre d'exemple non limitatif, et du dessin annexé dans lequel:
la figure 1 repr~sente les courbes de taux d'hémoglo-
~ 3 ~
bine e-t de rendemen-t en prot~ines en ~onction du p~I po~r un
pxemier lot d'albumineg
la figure 2 représente les courbes pour u~ autre lot~
la .~igure 3 repr~sente les courbes de rendement en
albumin.e e-t de taux ~'hémoglobine en ~onction de la teneur en
caprylate pour une m&me valeur du pH. ~
On se réfère aux figures~
Sur la ~igure 1 on a représenté, en ~vnction du pH9
porté en abscisse 9 les cour~es R de renderaent en protéines et
H de taux d'hemoglobine apr~s traitement au capryla-te~ ~e lot
d'albumine humaine placentaire contenait initlalemen-t 20 g de
protéines, principalement d'albumine9 par litre et un peu moins
de 0,2 en taux d'hémoglobine (densité op-tique dlune solution à
1 yO)~ ~a courbe R représente ainsi le poids en grammes par litre
de protéines, essentiellement d'albumine qui reste en solution
après thermocoagulation au caprylate~ ~a coloration H de l'al-
bumine est évaluée photométriquement par simple lecture au
spectrophotomètre ~eckmann, ~ 403 m~ apres avoir ajusté la
solution a 10 g de protéines par li.tre.
aomme on le voit sur la figure, pour une quant~té de
caprylate égale ~ 2g par litre, c'est-à-dire ~ 10 % du poids
i~itial en prot~inesy les courbes R10 et E10~ qui correspo-ndent
cette teneur en caprylate, sont sensiblement horizon~ales.
~eci veut dire qulil n'y a pratiquement pas de protéines qui
pr~cipi-tent et que le taux d'hémoglobine reste pratiquement
constantO Pour une teneur égale ~ lO~o en caprylate, il nYest
donc pas possible d'e~ectuer la thermocoagulation selon 1'in-
~ention.
Si l'on utilise maintenant 15 ~ de poids en caprylate
par rapport au poids de protéines~ c'es-t-à-dire 3g d~ caprylate
par li~re~ les r~sultats sont portés sur les courbes R15 et H15.
On voit que le rendement en prot~ines est d'autant plus élevé
~ 2 ~ 3 ~ ~
que le pH es-t plus grand mais le taux en hémoglobine évolue de
la même façon. Néanmoins9 pour un pH voisin de 4,8~ il est
po~sible de faire diminuer de plus de moitié le taux d'hémo-
globine~ ~ condition de consentir une perte de 1'ordre de 4 g
par litre en proteinesO A ce sujet9 il convient de remarquer
que la pureté de llalbumine obtenue par le procédé selon l'in-
vention est relativement indépendante du rendement en prot~ines,
ca~ les protéines étrang~re~ et la fraction dénaturée de l~al-
bumine précipitent e~ premier. Il suf~it donc a ~ avoir un pré-
cipité ~ranc pour e-tre certain d'a~oir éliminé la quasi-totalité
des protéines indésirablesO ~a poursuite de la précipita$ion
élimine une partie de l'albumine pure et ~ait donc baisser le
rendement.
~orsque la teneur en caprylate est égale a 2Q % de la
teneur initiale en protéines, c'est-~-dire à 4 g par litreg les
résulta-ts sont reportés sur les courbes R20 et H20. On voit ~ue
pour un pH voisln de 4,95 à 5? on conserve encore une quantité
notable d'al~umine puriPiée, tout en réduisant nettement la
teneur en hémoglobine.
On ~e réfère à la figure 2.
Un second lot d'albumine placentaire a été traité, et
les courbes R' et H' representent respectivement la teneur en
protéine~ et le taux d'hémoglobine après thermocoagulation.
Pour une teneur en capryla$e égale à 20 ~ du poids
initial, de 20 g par litre, en pro-téines de la solution à
thermocoaguler, on obtient une courbe R'20 de rendement en
pro~éines, qui correspond sensiblement à la oourbe R20. ~a
oo~rbe H'20 suit une allure qui est également ~oisine de la
courbe H20 et l~ encore la zone la plus favorable est située
aux alentours d'un pH égal à 5.
Si l'on augmente la teneur en caprylate, en se repor-
tant aux courbes R'25 et H'25 qui correspondent ~ une teneur en
_ 6 --
~ 3 ~ ~
caprylate de 25 qO9 on consta-te ~u'une zone ~avorable est présente
pour un pH voisin de 5 91 ~
En~in9 pour une teneur en caprylat0 de 30 ~7 les
r~sultats re~résentés sur les courbes R30 et H~o montrent que
le pH optimum se trouve situé aux alentours de 5~15. C'est en
effet dans cette zone ~e pH que 1'on obtie~t un abaissement
important du taux d'hémoglobine pour un rendement en albumine
encore convenable.
En se ré~rant ~ la figure 3, on ~oit le comportement
pour un lot d'albumine thermocoagulé en ~onction du pourcentage
en caprylate9 a un m~me pH égal à 5~ ~a température est de 60,
la thermocoagulation s'effectue en prenant ~ heure. On constate
que le rendement en protéines, de m8me que le taux d'hémoglobine
slabaisse lorsque la teneur en caprylate augmente mais qu'un
optimum est atteint pour une teneur en caprylate de 20~. ~n
e~fet, pour cette valeur, le rendement est égal à 90%, ce qui
~eut dire que seuls 10~ des protéines ont précipité, tandis que
le taux d'hémoglo~ine est passé d'environ 0~20 ~ une v~leur
oompri~e entre 0,1 et 0,05.
ZO On ~a maintenant a~crire un,exemple de mise en oeuvre
dëtaill~e du procédé selon l'invention.
A partir de sept tonnes environ de placenta~ on prépare
d'une fa~on en æoi connue~ le surnageant des globulines par
précip.itation des globulines ~ l'éthanol.
1. ~limination de l'hémoglobine:
On ajoute au surnageant alcoolique ~ 25 % dléthc~ol
et renfermant environ 58 g de protéines par kg de placenta9 du
chloro.forme de ~açon ~ue le volume total d'environ 17 000 litres
contienne 0~6% de chloroforme~ 0~ ajuste le pH ~ une q~leur
comprise entre 6,0 et 6,1
~e surnageant ét~lt dans ces conditions maintenu
une tempéra-ture de l'ordre de 2~C, il se forme un précipité
3~6~
que l'~n separe et re~etteO
~e volume de surnageant se trouve de ce f'ait r~duit
~ environ 16 000 litres. A ce moment~ ].e rendement protéique
e5-t de l'ordre de 8g/kilo et la plus grande partie de l'hémo
globine a ~té éliminée a
2o Elimination des enz~mes:
On ajoute au surnageant de 16 000 litres obtenu pré-
cédemment contenant environ 25 % d'éthanol~ après abaissement
de la température à -8C9 de l~ac de trichloracétique pour obte
nir une concentration de 4,2. 10 M/litre.
~a quantité de protéines est de l'ordre de 4g/litre~
On obtient de cette ~agon, un pr~cipité d'environ
1000 kg tandis que le surnageant, d'un volume d'er.~iron 15 000
litres, est rejeté. Dans ce but, on utilise de préférence des
centrifugeuses hermétiques à éjection en continu du précipité.
'De cette façon~ les phosphatases alcalines et d'autres
en~ymes tels que les transaminases se trouvent ~liminés ou
dénaturés.
~e précipité est ensuite redissous dans de la soude
diluée jusqu'à un pH neutre et le volume est ajusté ~ 1300 litres
par de l'eau~
3. Clari~ication:
Ce pr~cipité redissous reçoit une adjonction de poudre
~' de silice (aérosil) pour obtenir une concentration d'aérosil
d'environ 0,2 %. Il se forme ainsi un précipité d'envi~on 50 kg
qui est rejeté par centri~ugation. ~a solution surnageante
' clari~iée correspond ~ un rendement protéique d'environ 6,5 g
'par kilo.
4. Elimination aes substances de groupe:
On rappelle que les substances de groupe sont princi-
palement constituées de pol~saccharides de parois d'hématies qui
se son~ dissous lors de l'hémol~se et ~ui doivent ~tre ~limines.
3 ~ ~
~ a solution clariliée est diluée dans u.n mé~ ge d' étha-
nol et d'aci~e trichloracé~i~ue, le -taux ~inal d'a~cool étan-
~d'envirorl 75 % et le taux a 'aciae trichloracétique d'environ
8~10 2 M/litre~ ~a ^teneur en proteines est de l'ordre de
10g/litreO ~a température étant maintenue à environ -7C, il
se forme un précipité d'environ 10 kg qui est rejeté et les
substances de groupe se trouvent éliminéesO Cette étape complète
ég~lernent l'élimination des éventuels en~ymes r~siduels.
~ e surnageant qui contient environ 8 g de protéines
par litre es-t ~iltré. On ajuste le pH a une valeur comprise
entre 6,5 et 79 la température étant toujours maintenue en-tre
-5 et -10C. A ce moment~ il se forme un précipité d'albumine
qu.i est centri~ugé,
On obtient ainsi 140 ~g environ de précipité et l'on
re~ette le surnageant.
5. ~urification de l'albumine:
~ e précipit~ est redissous dans de l'eau pour ~ormer
un volume d'environ 280 litres, le rendement protéique étant à
ce moment de 5g/kilo.
~0 ~pr~s une dialyse contre eau distillée pour éliminer
l'alcool~ on a~uste le taux de protéines ~ 20g/litre, on ajoute
la solu-tion du caprylate de sodium à une concentration de
2,41.10 M/litre (4 g/litre) et l'on a~uste, par exemple aveG
un tampon acétique, le pH ~ une valeur comprise entre 5~0 et
5,05.
Cette solution est maintenue a 60C pendant environ
1 heure~
~ es protéines restantes sau~ l'albumine se trouvent
alnsi coagulées et elles sont rejetées en un précipité a~ec les
dernières traces d'~émoglob.ixe ainsi que la ~raction déna-turée
de l'albumine. Seule reste cn solution l'c~lbuminc pratiquement
pure~
~ e surnageant ~nené ~ environ 1750 litres est ensuite
filtré. La solu-tion diluée d'albumine est alors concsntr~e en
aaustant 40 ~0 d'éthanol à ~n pH compris entre 4,8 et 4,9~ ~ une
-températuxe de l'ordre de -8Co Il se forme alors un précipité
~ui est recueilli puis redissous~ cette nou~elle solution étant
alors dialysée puis traitée sur gel d'alumine. On effectue
ensuite une concentration sous vide puis une fil-tration stéri- -
li~ante aboutissant à environ 95 litres de solution concentxée
prati~uement pure a~ albumine ~ 200 g/litre~ A ce stade final~
le rendement protéique est de l'ordre de 2,7 g/kilo. ~a colo-
ration de la solution est comparable a celle de la plupart des
bonnes solutions d'origine plasmatique~
~ 'invention décrite à l~aide de cet exemple est bien
entendu susceptible de faire l'objet de nombreuses variantes.
Ainsi~ certaines des étapes préliminaires peuvent être omises
ou encore remplacées par des étapes similaires en soi déjà
eonnues. En outre, l'ordre dans lequel ces étapes préliminaires
sont menées peut être modi~ié.
~ 'albumine humaine ainsi préparée est dépourvue de
substances de groupe et de phosphatases alcalines placentaires,
et n'entra~ne pas d'effet hypotenseur chez le chien perfuséO Son
~aible taux d'h~moglobine la rend comparable et meme supérieure
à la plupart des albumines d'origine plasmatique.
aette albumine peut être utilisée ~ des fins thérapeu-
ti~ues chez l'homme sans les inconv~nients et répond à tous les
critères établis pour le oontrôle de l'albumine.
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