Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
~063028
~ La présente invention a pour objet l'application en
COSmétologie de certaines enzymes, ainsi que des compositions
cosmétiques contenant ces enzymes.
L'invention a plus précisément pour objet l'application
en cosmétologie des enzymes superoxyde-dismutases et en particu-
lier l'utilisation de ces enzymes dans la préparation de compo-
sitions cosmétiques pour la peau et les cheveux.
; On sait ~ue les superoxyde-dismutases sont des enzymes
capables d'induire la dismutation des ions superoxyde, suivant
la réaction:
2 2 + 2H+ - H22 + 2
On a déjà décrit des superoxyde-dismutases extraites
d'érythrocyte de boeuf tMarkovitz, J. Biol~ Chem. 234, p 40,
1959) et des superoxyde-dismutases extraites d'Escherichia coli
(Keele et Fridovich~,i J. Biol. Chem., 245, p 6176, 1970).
Dans le brevet français No. 73.13670 sont
décrites de nouvelles superoxyde-dismutases extraites
de souches bactériennes marines, ainsi que leur procédé
de préparation. La préparation de ces nouvelles en~ymes résulte
des recherches de l'inventeur désigné dans le brevet
français No. 73.13670, Monsieur Adolf Michael Michelson, et ne
constitue pas l'objet de la présente demande.
Ce procédé consiste `a disperser dans l'eau et à main-
tenir à environ 4C une culture bactérienne marine, ~ ajuster
ensuite le p~ du milieu à 6,5-~, et de préférence à 7 environ, à
porter le mélange ~ 50-60C pendant quelques minutes, à le refroi-
dir ~ environ 4C et, à cette température, ~ centrifuger, à
effectuer sur la fraction surnageante une première précipitation
fra~tionnée au moyen de sels neutres, à centri~uger à nouveau
et ~ effectuer sur la fraction surnageante une seconde précipita-
` tion franctionnée aux sels neutres et à centrifuger. En variante,
on peut compléter ce procédé par une étape de purification consis-
10630;28
tant avantageusement en une dissolution dans du tampon phosphate
à pH 7,~ du précipité recueilli dans la dernière centrifugation et
en une dialyse de la solution ainsi obtenue, contre le même tampon
; phosphate de pH 7,~. On peut également purifier l'enzyme extrai-
te de la culture bactérienne marine, après reprise du produit de
la dernière centrifugation avec du tampon phosphate pH 7,~, et
~ dialyse contre ce même tampon, par une chromatographie qui est
- de préférence une chromatographie sur colonne et en particulier
une chromatographie sur trois colonnes successives qui sont
respectivement: une premiare colonne de gel de Sephadex G 200,
une colonne de diéthylaminoéthyl Sephadex*(DEAE-Sephadex*A-50)
et une seconde colonne de gel de Sephadex* G 200. Pour ajuster
à 6,5-~ le pH de la dispersion des bacbéries dans l'eau, ce qui
constitue la première étape dudit procédé, on utilise par exem-
ple de l'ammoniaque 2N et on ajoute ensuite du chlorure de potas-
sium, de préférence du KCl 3M.
On porte ensuite le mél~nge ainsi constitué à une tem-
pérature de 50 à 60C , pendant quelques minutes seulement et de
préférence pendant 3 à 4 minutes. On refroidit alors le mélange
à L~C environ, température à laquelle on effectue toutes les
étapes suivantes du procédé selon l'invention.
Chacune des précipitations fractionnées constituant des
étapes de ce procédé est réalisée, comme indiqué plus haut au
moyen de sels neutres en solution aqueuse, et de préférence au
moyen de sulfate d'ammonium.
Dans un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé
selon l'invention, on réalise la première précipitation fraction-
née au moyen de sulfate d'ammonium ajouté en une quantité telle
que le mélange ou extrait enzymatique traité soit ainsi amené à
une concentration finale de 30 à 35% environ de la saturation
`~ à ~C. Il faut toutefois noter que l'on peut remplacer pour tout
ou partie le sulfate d'ammonium par un ou plusieurs autres sels
; * marque de commerce.
1063028
appropriés et la quantité totale desdits sels est alors une quan-
tité équivalente et appropriée pour ~u'elle amène le mélange à
une concentration finale d'environ 30 à 35 % de la saturation
à 4C.
En variante, on peut utiliser un système d'ultra~iltxa-
tion, tel que par exemple un sys-tème mettant en oeuvre un dispo-
sitif poreux tel que des tubes poreux, et en particulier un sys-
tème utilisant un premier tube poreux retenant, en les concentrant,
les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à ~0 000 et
un seoond tube poreux laissant passer les molécules d'enzyme
désirées mais retenant les bactéries res-tantes, procurant ainsi
un extrait enzymatique stérile.
De même, on réalise avantageusement la seconde préci-
; pitation fractionnée au moyen de sulfate d'ammonium (~H4)2SOq
ajouté en une quantité telle que le mélange ou extrait enzymatique
traité soit ainsi amené à une concentration finale de 70 à 75 %
environ de la saturation à 4C.
~ es superoxydes-dismutases obtenues à partir de diffé-
rentes souches baotériennes marines par le procédé décrit oi-
dessus sont toutes des superoxyde-dismutases comprenant du fer
non hématinique, alors que les enzymes présentant une activité
` de superoxyde-dismutaseq qui sont décrites dans la littérature
mentionnée précédemment, c'est-à-dire l'érythrocupréine et
l'enzyme extraite d'Escherichia coli, comportent des cations
divalents qui sont respectivement le cuivre et le zinc pour la
première, et le manganèse pour la seconde.
~ a recherche de la présence d'un métal dans les
superoxyde-dismutases considérées peut être réalisée par une
~ analyse au spectrographe d'absorption atomique.
1 30 On peut également effectuer un test colorimétrique
qui, dans le cas présent, consiste à colorer un gel de migration
électrophorétique d'une préparation de l'enzyme au moyen d'un
-- 3 --
10630Z8
colorant spécifique du fe:r ~erreux Fe2~, la bathophénanthroline,
eventuellement en présence d'un réducteur tel que l'hydrazine.
Pour ce test, on coupe le gel en deux dans le sens de la lon-
gueur et on place une des deux parties dans du bleu de coomassie,
et ltautre partie dans de la bathophénanthroline. ~e test est
positif si l'on obtient un anneau rose dans le dernier cas, au
niveau de la bande protéique. Or, comme il est connu, une telle
apparition d'un anneau rosé peut être considérée com~e l'indica-
tion de la présence de fer ferxeux, ici dans la protéine
~0 superoxyde-dismutase.
On peut aussi utiliser du fer radioactif pour marquer
la protéine et en déterminer la stoechiométrie en ce qui concerne
le cation métallique divalent présent.
Les superoxyde-dismutases extraites de cellules bac-
tériennes marines contiennent du fer non hématinique, elles ont
un poids moléculaire de 40 000 ~ 2500 environ, et un point
isoélectrique dç 4 à 7 environ; elles présentent un maximum -
d'activité enzymatique pour un pH de 8,5 à 10 environ, avec un
optimum à pH 9,5 environ.
On peut maintenir l'enzyme active sur une longue pé-
riode de temps en la conservant dans une solution à 70-80 % de
sulfate neutre d'ammonlum à 4~.
Pour mesurer l'activité des superoxyde-dismutases
~ produites selon l'invention, pn peut évaluer l'inhibition par
ces dernières de la réaction de chimioluminescence provoquée par
le système enzy~atique oxygène/hypoxanthine/xanthineoxydase/lu-
- minol ainsi qu'on le montrera plus loin. Ce système enzymatique
réagissant provoque la libération dlions 2 qui sont aptes à don-
ner une réaction de chimioluminescence avec le luminol. L'addi-
tion de superoxyde-di-smutases à ce système capte en effet des
ions 2 et provoque ainsi une diminution de l'intensite de la
lumière émlse dans cette réaction.
- 4 -
~ - ' 1063028
~ es superoxyde-dismutas~s catalysent en effet la réac-
tion
2 2 + 2 H ~ H202 ~ 2
Si l'on utilise alors comme substrats dans ce-tte réac-
tion les ions superoxyde produits par la réaction enzymatique
mettant en jeu xantine-oxydase et xanthine ou hypoxan1;hine, les
ions superoxyde ainsi produits son-t très instables et émettent
spontanément de la lumière. Cette dernière est cependant trop
faible et les mesures ne pourraient avoir une reproductibilité
suffisante.
C'est pourquoi on complète en pratique le dispositif
analytique en utilisant, pour mettre en évidence la quantité
~ d'ions superoxyde formés, une substance chimioluminescente, le
; luminol ou 5-amino-2,3-dihydro~ -phtalazinedione.
Luminol + O ~ émission de lumière + produit
2 d'oxydation
Selon une technique décrite dans le brevet
français No. 73.13670, on mesure l'activité des superoxyde-
dismutases à l'aide de systèmes producteurs d'ions superoxyde,
systèmes catalytique~ ~usceptibles de promouvoir l'oxydation du
luminol constitués d'ions ~e2+, ~i2+,ou Co2 dans des solutions
aqueuses d'oxygène moléculaire en présence de certains ligan~s.
~a superoxyde-dismutase introduite dans le système
diminue la quantité d'ions 2 et par conséquént la production de
lumière.
On effectue le dosage comme suit:
On utilise le mélange réactionnel ci-après:
Luminol 1o-3M 0,3 ml
Tampon phosphate 10 3M pH 7;8 0,3 ml
EDTA - 1o-3M 0,3 ml
Eau qsp 2 ml
+ 50 ~1 de xanthine-oxydase (1,05 ml d'une solution à
-- 5 --
. .
c ~;
~ 1063028
1 mg/rnl cle xanthine-oxydase).
On place ce mélange dans une cuve argentée, devant un
photomultiplicateur On initie la réaction en injectant dans la
cuve le substrat: 1 ml d'une solution contenant 0,3 ~ mole d'hypo-
xanthine.
Il se pxoduit alors une émission d'un flux de photons,
qui donne naissance, sous l'action du photomul-tiplicateur, à un
courant dont l'intensité est mesurée par un picoampèremètre et
enregi~trée. Si l'on introduit dans le mélange réactionnel 5 ~1
de la superoxyde-dismutase à évaluer, avant l'initiation de la
réaction, on réalise une inhibition de cette émission de lumière.
On définit alors arbitrairement l'unité d'enzyme
superoxyde-dismu-tase comme étant la quantité de cette enzyme
qui provoque une inhibition de 50 % de l'émission de lumière.
Cette unité est dont indépendante de la souroe d'enzyme et de
l'enzyme superoxyde-dismutase utilisée.
On notera cependant que l'on peut égalemen-t évaluer
l'activité des superoxyde-dismutases selon l'invention en p~o-
voquant l'inhibition de la même réaction que celle mentionnée
ZO plus haut, directement en injectant 1 ml d'une solution d'ions
2 ~ préparée par réduction électrochimique (J.M. Cord, I. ~ri-
dovitch, J.B.C. vol. 244, 25 (1969), pp. 6049-6055), dans 2 ml
d'une solution contenant 0,5 ~ mole de luminol et 0,17 millimole
de tampon phosphate pH 7,8.
Dans certains cas, il peut être avantageux, pour appré-
cier sur une période raisonnable de temps l'efficacité des supe-
roxyde-dismutases dans l'application considérée, d'activer l'oxy-
dation des matières. Pour ce faire, on opère en pratique soit à
l'aide de flavines réduites par irradiation à 365 m~, soit au
moyen d'un système enzymatique, par exemple le système xanthine-
oxydase/hypoxanthine/oxygène.
~orsque l'on accélère l'oxydation par les flavines
-- 6 --
. -- 1063028
reduites, on irradie une solution de flavine mononucléotide
(FMN) 10 4 M d'ED~A 10 3M et de tampon phosphate 10 2M pH 7,0
dans une cuve en quartz placée dans un spec-trofluorimètre Zeiss,
équipé d'un filtre M 365; on suit la photoréduction, qui se
produit rapidement, en suivant la diminution de l'intensité de
fluorescence émise à 530 m~.
En fin de réduction, on reprend les solutions pour
les agiter vigoureusement en présence d'air, obtenant ainsi leur
reoxydation complete, ce qui produit des ions superoxude 2-
1~ Il est à noter que ce cycle de réduction-réoxydation des flavi-
nes peut être répé-té plusieurs fois, sans que la structure du
flavine mononucléotide soit altérée. ~n variante,on peut procé-
der aux irradiations à 365 m~, à l'aide d'une lampe ~ 100 A four-
nie par Ultraviolet Products Inc. sur des solutions telles que
décrites ci-dessus agitées en continu.
~orsque l'on désire accélérer l'oxydation par le sys-
tème enzymatique hypoxanthine/xanthine-oxydase/oxygène, il est
avantageux d'utiliser une solution contenant 0,3 ml d'hypoxan-
thine 10 3M, 0,3 ml de tampon phosphate 1 M pH 7,8, 0,3 ml
d'~DTA 10 3M, 2,1 ml d'eau et 0,05 ml d'une solution de xanthine
oxydase à 1 mg/ml.
On a maintenant découvert que les superoxyde-dismutases
présentent des propriétés de protection de la peau et du cheveu
qui permettent de les utiliser en cosmétologie.
~es superoxyde-dismutases permettent notamment de pro-
teger la peau et les cheveux en main-tenant l'intcgritc de la
structure kératinique naturelle. Il est possible que cette pro-
tection soit due à l'inhibition de phénomènes d'oxydation de la
kéra-tine. ~es superoxyde-dismutases améliorent la respira-tion
cellulaire cutanée e-t maintiennent ou améliorent les qualités
de la peau: douceur au toucher, souplesse e-t élasticitc. ~eur
prcsence dans des cor~po itions pour cheveux permet aussi le
* marque de commerce.
-- 7 --
- - 1063028
maintien ou ]'a~élioration ~e l'état du cuir chevelu, tout en pro-
tégeant également la peau des mains de la personne qui applique
ces compositions.
En outre, on a découvert que les superoxyde-dismutases
protègent la peau contre les phénomènes d~inflam~ation causés par
les rayonnèments ultra-violets.
Grace à ces différentes propriétés, les superoxyde-
dismutases sont utilisables dans des compositions co~métiques pour
la peau ou pour les cheveux.
~n raison de leurs proprietés particulières d'oxydo-
réduction, les supero~yde-dismutases jouent en outre dans les
compositions cosmétiques un rôle de protection et de stabilisa-
tion, car elles empêchent les phénomènes d'oxydation ou d'auto-
oxydation qui entra~nent la dégradation de certains constituants
des compositions cosmétiques. Par exemple elles emp~chent le
ranoissement des corps gras présents dans de nombreuses formula-
tions cosmétiques; et plus généralement elles inhibent la dégra-
dation de tous les corps oxydables ou auto-oxydables présents
dans la composition.
On a découvert notamment que les superoxyde-dismutases
peuvent inhiber l'oxydation de certains composés, fortement oxy-
dables, avant leur utilisation, en particulier:
a) certains composés de coloration ou précurseurs de
colorants utilisés dar~s les teintures d~oxydation développées soit
par un agent oxydant habituellemen~ utilisé (eau oxygéné, persul-
- fate, peroxyde d'urée, sels métalliques, et les autres) soit par
l'oxygène de l~air.
Ces composés de coloration sont des bases, des cou-
pleurs ou des leucodérivés, et notamment:
- certains dérivés de l'orthoaminophénol tels que dé-
crits dans le brevet français No. 1.374.983 et son addition
No. 84.324.
.1063028
- certains dérivés du dihydroxy-5~6 indole et composés
aminés apparentes, par exemple cevx décrits dans les brevets
français Nos. 1.1 ~3.594, 1.166.172 et 1,264.707;
- certains leucodérivés tels que décrits dans les
brevets français 2.056.799, 2.174.473.
- certaines bases qui ont été décrites dans les bre- -
vets français 1.473.843, 2.017.995, 2.016.123.
b) certains composés réduc-teurs utilisés pour la défor-
mation permanente des cheveux, par exemple sulfite~ alcalin~,
mercaptans et dérivés, notamment ceux revendiqués dans les bre-
~ets français 1.175.560 et 2.005.648.
En l'absence de superoxyde-dismutase, l'oxydation du
sulfite conduit, dans ce cas, à l'anion radical superoxyde,
selon la réaction suivante:
3 2 ~ 2 2 ~ ~ S03.
~ 'irradiation des bases organiques, notamment les ami-
nes tertiaires telles que la triéthanolamine, utiliséeæ pour la
neutralisation des compositions cosmétiques contenant des résines
acide~ (par exemple des résines carboxyvinyliques du type Carbo-
pol marque de commerce ou du type acétate de vinyle - acide cro-
tonique, ou des résines contenant des motifs anhydride maléique
du type Gantrez marque de commerce), favorise en présence d'oxy-
gène, la formation d'ions superoxyde. ~'addition de superox~Tde-
dismutases permet la destruction de ces ions, et on évite ai~si
les réactions d'oxydation provoquées par ces ions.
~ 'oxyde de titane ou l'oxyde de zinc, qui sont utilisés
dans de nombreuses compositions cosmétiques, initient des réac-
tions d'oxydation en formant des ions superoxydes par irradiation.
` ~a présence de superoxyde-dismutases permet d'éviter
ces oxydations.
~ a présente invention a pour objet l'application en
cosmétologie des enzymes superoxydes-dismu-tases.
_ g _
-` 10630Z8
Cette application est principalement caractérisée par
le fait que l'on realise des compositions hygi~niques ou cosmé-
tiques, pour la peau ou pour les cheveux, contenant lesdites
enzymes.
Dans l'application de l'invention, les enY,ymes super-
oxydes-dismutases peuvent jouer no-tamment le r81e de protecteurs
des substances kérati.niques vivantes ~ue constituent la peau et
le~ cheveux. Ce rôle pro-tecteur consiste d'une part ~ maintenir
l'intégrité de la structure kératinique naturelle de la peau du
cuir chevelu ou de3 cheveux, soit à titre préventif, soit pour
en arrêter la dégradation, d'autre part à maintenir ou améliorer
les qualités de la peau ou du cuir chevelu (douceur, souplesse,
élasticité), et aussi à protéger la peau contre les effets no-
cifs (notamment les effets inflammatoires) à l'origine de cer-
taines réactions des rayonnements ultra-violets.
Dans l'application selon l'invention, les superoxyde-
dismutases peuvent également jouer le rôle de protecteurs de
substances oxydables ou auto-oxydables présentes dan.~ les com-
positions cosmétiques.
C'est ainsi que les superoxyde-dismutases peuvent être
incorporées dans des formules con-tenant des composés for-tement
auto-oxydables pour protéger contre l'oxydation lesdites for~ules:
- soit pendant leur conservation,
- soit pendant leur mise en oeuvre au con-tact des
fibres kératiniques et/ou de la peau, même si une étape ulté-
rieure d'o2ydation est nécessaire.
On peut citer, en particulier, la conservation et la
répartition sur cheveux des compositions tinctoriales (composi-
tions de teinture ou shampooing colorant) à base de composés de
la p.phénylène diamine et de ses dérivés, d'ortho-aminophénols
(eventuellement en présence de colorants directs) afin d'éviter
l'auto-oxydation prcma-turee conduisant à une mauvaise péné-tra-tion
_ 10 --
~--.~
i 10630;~8
des pigments dan~ la fibre~
Il s'agit dans ce dernier cas d'empêcher temporaire-
ment, et donc de retarder, ce phénomène d'auto-oxydation pendant
l'utilisation de la composition.
De façon analogue, l'application des superoxyde-dismu-
tases, selon l'invention, permet la protection de composé du
type leucodérivés et dihydroxy indoles avant le développement
ultime de la coloration. Elle permet également la protection
des dérivés réducteurs sulfhydrylés - (lors de leur conservation
et de leur mise en oeuvre) - utilisés dans la première étape
de la déformation permanente des fibres kératiniques.
~'invention a également pour objet des compositions
hygiéniques ou cosmétiques pour la peau ou pour les cheveux
caractérisées par le fait qu'elles renferment au moins une
enzyme superoxyde-dismutase, dans un excipient approprié.
~'invention a en outre pour objet un procédé de trai-
tement oosmétique caractérisé par le fait que l'on applique sur
; les cheveux ou sur la peau au moins une enzyme superoxyde-dis-
mutase.
~es enzymes superoxyde-dismutases utilisables selon
l'invention peu~ent être d'origine quelconque, animale, bacté-
rienne ou végétale.
Parmi les superoxyde-dismutases utilisables selon
l'invention, on citera notamment, sans que cette énu~ération
soit limitative, celles extraites de bactéries, celles extraites
de champignons ou celles extraites du sang.
Parmi les exemples de superoxyde-dismutases extraites
de bactéries on citera en particulier celles extraites d'Esche-
richia coli; parmi les superoxyde-dismutases extraites de cham-
pi~nons on citera en particulier celles extraites de Pleurotus
olearius; parmi les superoxyde-dismutases extraites du sang,
on citera en particulier les érythrocupréines.
_ 11 -
. ~063028
On peut citer égalemen- les superoxyde-dismutases
extraites de souches bactériennes marines, telles que par exemple
des souches de Photobacterium phosphoreum, Photobacterium
leiognathi ou Photobactérium sepia.
Parmi les diverses souches utilisables, on peut citer
les souches de Photobactérium phosphoreum No. ATCC 11040, de
Photobactérium leiognathi ~o. ATCC 25521, de Photobactérium
sepia No. A~CC 15709, d'Escherichia coli No. A~ac 15224 et de
Yleurotus olearius Gillet (~aboratoire de Cryp~ogamie de Paris).
~es superoxyde-dismu~ases extraites de souches bacté-
riennes marines peuvent être pré:arées selon le procédé décrit
dans le brevet francais No. 73.13670. Ce procédé a ~té
rappelé ci-dessus.
Les compositions pour la peau de l'invention sont
notamment des solutions du type lotions; des émulsions de con-
sistance liquide ou semi-liquide du type laits, obtenues par
dispersion d~ne phase grasse dans une phase aqueuse ou inverse-
ment; ou des suspensions ou émulsions de consistance molle du
type crèmes ou gels.
Ces compositions sont preparées selon les methodes
usuelles. Elles constituent notamment des crèmes de nettoyage,
de protection ou de soins pour le visage, pour les mains ou pour
le corps, (par exemple crèmes de jour, crèmes de nuit, crèmes
démaquillantes, crèmes fond de teint, crèmes anti-solaires),
des fonds de teint fluides, des laits de démaquillage, des laits
corporels de protection ou de soins, des laits anti-solaires;
des lotions de nettoyage, des lotions anti-solaires, des lotions
de bronzage artificiel, des compositions pour bain ou des compo-
si-tions désodorisantes contenant un agent bactéricide.
~es compositions pour la peau selon l'invention peuvent
~galement consister en des préparations solides constituant
des savons ou des pains de nettoyage.
~063028
~ es com~ositions pou~ la peau qui sont de nature ~luide
peuvent etre présentées sous forme de bombe aérosol contenant
également un propulseur sous pression.
~ es compositions pour la peau ~elon l'invention
contiennent, outre les superoxyde-dismutases, des ingrédients
actifs ou excipien~s utilisés de façon usuelle dans les formula-
tions mentionnées ci-dessus, tels que des tensio-actifs, des
colorants, des parfums, des agents conservateur35 des émulsion-
nantst de~ véhicules liquides tels que l'eau, des corps gras
tels que huiles naturelles ou synthétiques destinées à constituer
la phase grasse des laits ou des cxèmes, des résines du type
carboxyvinylique ou anhydride maléique neutralisés par des amines
tertiaires et notamment par des aminoalcools tels que la triétha-
nolamine et les autres. ~es composés destinés à constituer une
phase grasse sont par exemple, l'huile d'amande douce, l'huile
d~avocat, l'huile d~olive des esters d'acides gras comme la
- stéarine, le monostéarate de glycérine ou l~huile de Purcellin,
les palmitates d~éthyle ou d'isopropyle, les myristates d'alkyle
tels que les myristates de propyle, de butyle ou de cétyle. G~
peut en outre ajouter des alcools gras comme l'alcool cétylique,
des alcools gras polyoxyéthylénés, ou des cires telles que par
exemple la cire d'abeille, des ciressynthétiques, ou les autres.
~ es compositions pour cheveux selon l'invention peuvent
8tre présentées sous forme de solutions aqueuses, alcooliques ou
; hydroalcooliques, ou sous forme de crèmes, de gels, d'émulsions,
ou encore sous forme de bombes aérosols contenant également
agent propulseur sous pression.
Elles renferment les superoxyde-dismutases soit à titre
d'ingrédient actif principal, soit à titre de protecteur contre
l'oxydation des autres ingrédients.
Outxe les ingrédients actifs classiques, elles peuvent
renfermer divers adjuvants habituellement présents dans ces compo-
1063~28
sitions pour cheveux par exemple des véhicules liquides ou sous~orme de gels, des parfums, des colorants, des agents conserva-
teurs, des agents séquestrants, des agents épaississants, et les
autres.
Elles constituent par exemple des shampooings, des
lotions de mise en plis, des lotions traitantes, des crèmes ou des
gels coi~fants, des compositions de teintures (notamment teintures
d'oxydation) éventuellement sous forme de shampooings colorants,
des lotions restruoturantes, de8 composi~io~s de per~anente
(notamment des compositions pour le premier temps d'une perma-
nente), et les autres.
~es compositions de l'invention sont par exemple:
- des shampooings contenant, outre une superoxyde
dismutase, un détergent cationique, anionique ou non ionique;
- des compositions de teinture y compris des shampooings
colorants, qui contiennent des colorants ou des précurseurs de
oolorants tels que ceux déjà mentionnés précédemment par exemple
sul~ate de m-diaminoanisol, o-,m- ou p-aminophénol, nitropara-
phénylènediamine, paraphénylène-dia~ine, p-toluè~ediamine,
5,6-dihydroxy indole, et les autres;
- des compositions pour le premier temps (temps de
réduction) d'une déformation permanente aes cheveux, contenant
des dérivés réducteurs tels que mercaptane, sulfites, et les
~ autres.
; Il convient de remarquer que les compositions cosméti-
ques selon l'invention sont aussi bien des compositions pretes
à l'emploi que des concentrés devant être dilués avant l'utili-
sation. ~es compositions pouvant être présentées sous forme de
concentrés sont par exemple des shampooings ou des compositions
pour bains. ~es compositions de l'invention ne sont pas limitées
à un domaine particulier de concentration en superoxyde-dismutases.
On peut cependant indiquer que généralement les compo-
- 14 -
1063028
sitions prêtes à l'emploi renferme~t de 0 01 ~ à 5 % en poids, et
notamment de 0,05 à 1 % en poids, de superoxyde dismutase.
Dans le cas où l'ingrédient oxy~able à protéger æubit
~e décomposition accélérée en présence de fibres kératiniques
et/ou de la peau, la superoxyde-dismutase peu-t être conservée
seule, en solution aqueuse diluée ou concentrée, ou sous forme
de complexe ou de lyophilisat, et être ajoutée aux autres ingré-
~lients de la composition au moment de l'emploi.
De même, lorsque la superoxyde-di~mutase est utilisée
dans le but de maintenir ou d'améliorer les qualités de la peau
ou des cheveux, elle peut n'être ajoutée à la composition qu'au
moment de l'emploi.
~es compositions de l'invention peuvent donc être pré-
sentées sous la forme d'un conditionnement en plusieurs parties
contenant d'une part la superoxyde-dismutase, et d'autre part les
autres ingrédients de la composition. Comme indiqué ci-dessus, la
~i ,superoxy~3e-dismutase peut être conservée par exemple sous forme de
solution aqueuse, de complexe ou de lyophilisat.
~e procédé de traitement cosmétique de l'invention peut
être mis en oeuvre par application des compositions hygiéniques ou
cosmétiques telles que définies ci-dessus, selon la technique
d'utilisation habituelle de ces compositions. Par exemple: appli-
cation de crèmes, de laits de démaquillage ou de compositions
anti-solaires sur la peau, application d'une lotion pour cheveux
sur cheveux mouillés, shampooings et tous les autres.
-~ ~e procéde de traitement cosmétique de l'invention est
mis en oeuvre de façon à appliquer une quantité efficace de su-
peroxyde-dismutase, c'est-à-dire une quantité suffisante pour
obtenir l'effet de protection recherché. -
Ce procédé de traitement cosmétique est destiné soit à
maintenir la structure kératinique de la peau ou des cheveux, soit
à main-tenir ou améliorer les qualités de la peau (douceur, souples-
- 15 -
- i063028
se, élasticité), soit à protéger la peau contre les effets nocifs
des rayons ultra-violets.
~ es exemples suivants illustren-t l'invention sans tou-
tefois la limiter. Les exemples 1 et 3 ont simplement pour but
d'illus-trer le procédé de préparation de superoxyde-dismutases
extraites de bactéries d'origine marine, procédé qui est décrit
dans le brevet français No. 73.13670.
EXEMPI,E 1
On a cultivé des bactéries de Photobactérium leio-
gna-thi de souche No. ATCC 25 521 sur un milieu synthétique Gonte-
nant en grammes par litre:
NaCl 30g/l
N 2 4' 2 18,7
KH2Po4 2
MgS 4~ 7 2 0,2
(NH4)2HP04 ,5
Glucose 1,5
Glycérol 1,5
lrypticase 5
Extrait de levure 5
On a amené ce milieu au pH de 7,2 avec de la soude et
on l'a stérilisé pendant 1 heure à 100 C.
On s'est servi d'une préculture de 1 litre, poussée
pendant la nuit et répartie entre 4 Erlenmeyer contenant 250 ml
` de milieu chacun, pour ensemencer un fermenteur de 12 litres de
milieu.
On a poursuivi la culture pendant 12 heures à 20 C
- avec forte aération et on a ainsi ob1;enu 100 g de bactéries
exprimés en poids de produit mouillé.
On a dispersé 135 g en poids mouillé de bactéries de
Photobactérium leiognathi, provenant de plusieurs cultures dans
650 ml d'eau et on a laissé reposer à 4C pendant une nuit. On
- 16 -
~,
1063028
a ajouté de l'ammoniaque 2N, jusqu'à amener le pH du milieu à
7,5 et on a ensuite ajouté 18 ml de KCl 3M.
On a porté le méla~ge à 58C et on l'a maintenu à cette
température pendant 4 minutes, après quoi on l'a rafra~chi
jusqu'à 4C et centrifugé pendant 10 minutes à la vitesse de
10 000 tours/minutes. ~oujours en opérant à 4C, on a ajusté
le surnageant à 35 ~ de saturation avec du sulfate d'ammonium
solide à pH 8; on a centrifugé et on a amené le surnageant à
75 % de saturation en sulfate d'ammonium et on a laissé reposer
pendant une nuit à 4C. On a récolté par centrifugation la
protéine précipitée et on l'a conservée dans une solution de
sulfate d'ammonium à 75 %.
~ 'activité d'une solution de 9 mg de protéine par
millilitre (~iuret) était de 40 unités/mg, alors qulelle était
à titre comparatif, de O unité/mg pour de la catalase en solution
de 9 mg de protéine/ml.
Après une nouvelle précipitation fractionnée au moyen
de sulfate d'ammonium avec un gradient de concentration de 35
~ 75 % de la saturation, on à obtenu une superoxyde-dismutase
qui, en solution à 14,8 mg de protéine/ml (~iùret) présentait
une activité de 134 unités/mg à 500 unités/mg.
On a dissous le précipité protéique dans du tampon
phosphate pH 7,8 et on a dialysé pendant 48 heures à 4C. On
a conservé l'enzyme superoxyde-dismutase à - 20C.
Pour déterminer l'activité de cette dernière, on a
utilisé une cuve placée devant un photomultiplicateur et renfer-
mant le mélange réactionnel ci-après:
~uminol 1o-3M 0,3 ml
lampon phosphate 10 3~5 pH 7,8 0,3 ml
ED~A 1o-3M 0,3 ml
Eau 1,0 ml
Xan-thine oxydase (1mg/ml) 0,050 ml
- 17 -
- 1063028
On a ini-tie la réaction en injectant dans la cuve 1 ml
d'hypoxanthine 3X10 4M.
Un flux de photons était alors émis, qui a donné nais-
sance, sous l'action du photomultiplicateur, à un courant dont
on a mesuré l'intensité au picoampèremètre et on a également
enregistré les variations de cette intensité.
~ n introduisant dans le mélange réactionnel, avant
; initiation de la réaction, 5 lul d'une solution de la superoxyde-
dismutase préparée comme indiqué plus haut, on a obtcnu une
inhibition de l'émission de lumière et on a considéré arbitrai-
rement que l'unité d'enzyme superoxyde-dismutase serait la quan-
tité d'enzyme qui provoque une inhibition de 50 ~ de l'émission
. de lumière.
~ n spectroscopie UV, la superoxyde-dismutase extraite
a donné le spectre classique des protéines non hématiniques,
; a~ec l'épaulement du tryptophane à 160 m~u.
; Pour en déterminer le poids moléculaire, on a utilisé
deux techniques connues, l'une consistant à déterminer un gra-
dient de centrifugation au saocharose et l'autre mettant en
oeuvre un gel ~ Sephadex G 200.
On a pour ce faire utilisé les marqueurs suivants,
- dont on connaissait le poids moléculaire (P.M.):
P.M.
ADH de ~evure 150 000
Albumine bovine 66 000
Peroxydase 40 200
On a conclu à un poids moléculaire de 40 000 + 2500.
- . Pour déterminer les sous-unités de la structure pro-
téique de l'enzyme, on a réalisé une électrophorèse en gel de
polyacrylamide additionné de dodécyl sulfate de sodium à 10 %.
On a observé un seul type de sous-unité, de poids
moléculaire dlenviron 21 000. ~e poids moléculaire de la super-
oxyde-dismutase obtenue peut donc être estimé ~ 21 000 x 2,
- 18 -
1063028
soit 42000.
Toujours sur le gel de polyacrylamide, on a obtenu
une bande rouge en présence de bathophénanthroline et d'hydra
zine, au niveau précisément de la bande de superoxyde-dismutase
révélée par le bleu de coomassie.
On a effectué un dosage colorimétrique d'une solution
de protéine et on a obtenu pour le fer une valeur qui, en esti-
mant le poids moléculaire de l'enzyme à 42 000, donnait environ
2 atomes de fer par molécule.
Une spectrométrie d'absorption atomique d'une solution
de protéine à 0,2 mg/ml a confirmé ce chlffre.
On peut donc raisonnablement estimer à 2 le no~bre
d'ato~es de fer par molécule de cette superoxyde-dismutase.
Par ailleurs, l'enzyme extraite selon cet exemple ne
subit pas de perte appréciable d'activité après 5 minute~ à la
température de 70C.
Une électrofocalisation de la superoxyde-dismutase
a permis d'évaluer à 4,4 le pHi ou point isoélectrique de cette
enzyme.
~'enzyme présentait un maximum d'activité pour un pH
d'environ 9,5.
On a obtenu une enzyme identique avec des caractéris-
tiques semblables à partir d'une souche bactérienne de Photo-
bactérium leio~nathi No. A~CC 25 587.
l~EMPI~ ?
On a soumis une culture de bactéries de Photobactérium
de souche No. ATCC 15 709 à une lyse en l'agitant dans de
l'eau froide, à raison de 1 g de poids mouillé de bactéries pour
4 ml d'eau. On a ensuite centrifugé à 16 000 tours/minute pen-
dant 20 minutes à 4~. On a ajouté au surnageant jaune clair
du RC1 3 M jusqu'à une concentration finale de 0,1 M.
On a chauffé la solution pendant 3 à 4 minutes dans
. .
- 19 -
10630Z8
un bain d'eau porte à 60C. On l'a ensuite refroidie à 4C et
on l'a clarifice par centrifugation.
On a soumis le surnageant à une précipitation fractionnée
par addition de sulfate d'ammonium solide. ~a fraction active
a précipité entre 45 et 75 % de saturation en sulfate d'ammonium
e-t on l'a ~éparée par centri~ugation; on l'a redissoute dans le
volume minimal de K2HP04 5 x 10 3M, pH 7,8, et on a dialysé
pendant une nuit contre le même tampon phosphate. ~e produit
de cette dialyse a en~uite été dirige sur une colonne de gel de
"Sephadex"G100 ou G 200, é~uilibrée avec du tampon phosphate
5 x 10 3M,pH 7,8. On a concentré la fraction active éluée à
l'aide d'une membrane d'ultracentrifugation Diaflo PM-10, et on
a ensuite dialysé pendant une nuit contre du K2HP04 5 x 10 3M,
pH 7,8.
On a absorbé l'enzyme superoxyde-disrnutase sur une
colonne de DEAE-Sephadex''A-50 tamponnée avec du K2HP04 5 x 10 3M,
pH 7,8. On a élué la protéine de la colonne avec un gradient
linéaire de K2HP04, pH 7,8 (de 5 x 10 3M à 3 x 10 1M). La supe-
roxyde-dismutase etait ainsi éluée à une concentration en
phosphate de 1,4 x 10 M et on l'a ensuite concentrée. On a
effectué une nouvelle filtration dans les mêmes conditions que
la précédente sur une colonne de DEAE''Sephadex'A-50. On a ainsi
éluée l'enzyme à une concentration en phosphate de 1,6 x 10 1M
et on a concentré.
~a protéine ainsi extraite et puri~iée a donné une
bande unique à l'électrophorèse en gel d'acrylamide (100 ~ug de
protéine pour un gel).
Ainsi, on a obtenu 3 mg de superoxyde-dismutase pure
à partir de 20 g de cellules congelées de Photobactérium sepia
(avec une activité de superoxyde-dismutase de 250 à 5000 unités~
mg).
On a maintenu l'enzy.ne active sur une longue période de
* marque de commerce.
- 20 -
, ~
` --` 1063028
temps en la conservant dans une solu-tion à 70 à 80 7~ de (NH4)2S04
à 4C
- On a déterminé le poids moléculaire de l'enzyme puri-
fiée au moyen d'une ultracentrifugation à 45 000 tours/minute
et pendant 16 heures, à 4C. On a mesuré la vitesse de sédimen-
tation par la méthode de Martin et Ames, avec un gradient linéaire
en sucrose de 5 à 20 (en poids/volume) et en utilisant un appa-
reillage Beckman Spinco modèle ~2-65B, avec un rotor SW 65K. On
a trouvé un coefficient de sédimentation de 3,2 pour cette
O dismutase, contre un coefficient de 4,82 et 7,~ respectivement
pour des alcools déshydrogénases de foie de cheval et de levure.
partir de cette constante de sédimentation, on a donc calculé
le poids moléculaire de la superoxyde-dismutase extraite comme
étant de 42 500 environ.
On a d'autre part établi que la molécule de cette
protéine contenait 2 atomes de fer.
~ 'électrophorèse en gels d'acrylamide a donné pour
la dismutase une bande unique correspondant à un poids molécu-
laire de 20 000 à 20 500, montrant ainsi que la molécule pro-
téinique était composée de deux sous-unités identiques.
La superoxyde-di-smutase s'est en ou-tre révélée être
très résistante à l'action protéolytique de la trypsine, puis-
qu'un traitement pendant 60 minutes de 150 ~g de cette super-
oxyde-dismutase avec 10 lug de trypsine à 20C n'a en-traîné aucun
changement dans l'activité enzymacique, non plus d'ailleurs que
dans la mobilité électrophorétique de la protéine non dissociée.
~ 'enzyme obtenue etait très stable vis-à-vis de la
chaleur: aucune perte d'activité enzymatique n'es-t apparue après
~0 minutes à 20C, 30C et même 40C; après 15 minutes à 50C,
3 une diminution de l'activité de 28 a~o est apparue; après 30
minutes à 50C, la perte d'activité nlétait toujours que de 50 ~0
c-t elle n'était que de 10 ~0 et 50 ~0 après respectivement 3 mi-
* marque de commerce.
- 21 -
B
. `
.
. . 10630Z8
nutes et 10 minutes à 60C.
Une électrofocalisation de la superoxyde-dismutase
a permis d'évaluer à 4,1 le point isoélectrique de cette enzyme.
On a déterminé au moyen d'une solu-tion d'ions 2 pré-
parée par voie électrolytique que l'enzyme présentait un maximum
d'activité pour un pH de 8,5 à 10, avec un optimum à pH 9,5.
EXEMP~E 3
-
On a traité une souche No. A~CC 11040 de bactéries
Photobactérium phosphoreum qui sont des bactéries marines et
ont par conséquent une fQrte concentration saline interne.
~ a lyse des bactéries était spontanée dans une solu-
tion d'~DTA 10 3M, pH 7,8.
On a éliminé les débris cellulaires au moyen d'une
centri~ugation à 16 000 tours/minutes pendant 20 minutes et
~ à oa.
Des études préliminaires avaient montré que l'enzyme
superox~de-dismutase était stable à 50C et on a donc éliminé
les autres protéines, ~lles-mêmes thermolabiles, en portant
le lysat pendant 3 minutes à 50C, après une addition de KCl
jusqu'à molarité de 0,1, et on a séparé les protéines dénaturées
par une centrifugation classique.
On a ensuite opéré à 4C. A cette température, on a
réalisé une précipitation fractionnée au moyen de sulfate d'ammo-
nium ajouté en une quantité telle que le mélange ou extrait
; enzymatique traité soit amené à un gradient de concentration
de O à 30 % environ de la saturation à 4C. On a éliminé la
fraction précipitée en centrifugeant pendant 45 minutes à
- 16 000 tours/minutes et à 0C.
On a ajouté au surnageant la quantité de sulfate
d'ammonium requise pour l'amener à 75 % de la saturation à 4C.
On a réuni la fraction précipitée par une centri~u-
gation analogue à la pr~cédente.
- 22 -
1063028
En vue de purifier la superoxyde-dismutase ainsi ex~
traite, on a dissous le précipité recueilli dans un peu de
tampon phosphate 5 x 10 3M, pH 7,8 et on a dialysé contre ce
même tampon pendant 48 heures à 4C, pour obtenir un extrait (A).
On a ensuite séparé les protéines encore présentes
en fonction de la taille de leurs molécules, a l'aide d'un ge]
de Sephadex G 100, dont la réticulation des grains est telle
qu'elle exclut les protéines ayant un poid~ moléculaire superieur
à 100 000, qui donc sortent très rapidement à l'extérieur du
gel. ~es molécules dont le poids moléculaire est plus faible
pénètrent dans le gel et en sont éluées plus ou moins rapidement
selon leur taille.
Pour ce faire, on a mis la résine de Sephadex à
gonfler pendant 3 heures dans l'eau, on l'a dégazée et on a filtré
sur B~chner pour éliminer l'eau; on l'a placée dans le tampon
de filtration et on l'a versée dans une colonne de 50 cm de
long sur 3 cm de diamètre int~rieur, On a équilibré la colonne
par passage de 2 litres de tampon.
On avait au préalable repris l'extrait enzymatique (A)
proven~nt de la dialyse pour le concentrer sur une membrane
Diaflo millipore (P.M. -10) sous pression d'a~ote, jusqu'à un
~olume de 5 ml. On a déposé ce concentrat sur la colonne préparée
comme indiquée ci-dessus et on l'a élué par passage de 500 ml
de tampon phosphate 5 x 1Q 3M, pH 7,8. Le débit était de une
goutte tou-tes les 8 secondes et on a recueilli des fractions
-~ de 2,5 ml, dont celles ayant une activité notable ont été réunies
et concentrées sur membrane Diaflo. On a ainsi obtenu un extrait
concentré (~).
On a réalisé une nouvelle étape de purification par
chromatographie sur une résine échangeuse d'ions à base de DEAE
Sephadex, résine sur laquelle les protéines son-t éluées selon
leur charge, par des tampons de force ionique croissan-te.
- 23 -
`` 1063028
Pour préparer la colonne, on l'a mise à gonfler dans
l'eau, puis on l'a degazée et lavée dans les solutions suivantes:
NaOX 0,5 M
KH2P4 0,5 M
en ay~lt soin de rincer la résine à l'eau distillée entre chaaue
étape, jusqu'à un pH voisin de la neutralité. Après filtration
sur ~chner, on a mis la résine en suspension dans du tampon
phosphate 0,1 M pH 7,8 et on l'a placée dans une colonne de 30 cm
de long sur 3 cm de diamètre intérieur. On a équilibré la colonne
en y faisant passer 300 ml de tampon 0,1 M.
On a placé l'extrait concentré (~) sur la colonne
ainsi préparée. Une fois cet extrait complètement adsorbé, on
; l'a élué par 500 ml de tampon phosphate pX 7,8, composés de
250 ml de tampon phosphate 0,1 M auxquels on a progressivement
ajouté 250 ml de tampon phosphate 0,5 M. ~e débit était de une
goutte toutes les 5 secondes et le volume des fractions recueil-
lies de 2,5 ml. On a réuni les fractions actives et on les a
précipitées par du sulfate d'ammonium, puis conservées sous -
cette forme à - 18 à - 20C.
; 20 ~a pureté de l'enzyme superoxyde-dismutase a pu être
~- contr~lée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
Une détermination du poids moléculaire de l'enzyme au
moyen d'une étude de l'élution lors d'une filtration sur Sephadex
G 200 a permis, à l'aide de la relation ~og(PM) = f (volume
d'élution) et des marqueurs connus, d'attribuer à la superoxyde-
dismutase extraite un poids moléculaire d'environ 40 000.
On a également dé~erminé ce poids moléculaire par une
centrifugation en gradient de sucrose: on a coulé des gradients
de sucrose de 5 a 20 % dans du tampon phosphate 5 x 10 3M, pH 7,8
en mélangeant progressivement 2,60 ml de la solution à 20 %
à 225 ml de la solution à 5 %,dans un dispositif approprié.
On a déposé sur ces gradients de sucrose différents
- 24 -
" 1063028
marqueurs proteiques de poids moleculaire connu et de la supero-
xyde-dismutase. On a rc-alisé l'équilibre par une centrifugation
à 45 000 tours/minute, à 5C et pendant 22 heures. Qn a alors
percé les tubes par le fond et on a recueilli lés fractions de
10 gouttes, sur lesquelles on a mesuré les activités enzymati-
queæ présentées par les différents marqueurs utilisé~. Après
avoir tracé la droite représentant la varia-tion du poids molécu-
laire en .fonction du numéro ae la fraotio~ d'élution, on a éva-
lué à environ 40 000 le poids moléculaire de la superoxyde dis-
mutase extraite de Photobactérium phosphoreum, ce qui confirmait
le ré~ultat précédent.
Pour déterminer le poids moléculaire des sous-unités
de la protéine, on a æoumis cette dernière, ainsi que des mar-
queurs dont le poids moléculaire des sous-unités était connu, à
une migration électrophorétique sur gel de polyacrylamide en
présence de dodécyl sulfate de sodium. ~a résolu-tion graphique
des valeurs trouvées a permis d'attribuer la valeur 20 000 au
poids moléculaire de chaque sous-unité de la molécule de supero-
xyde-dismutase.
Cette dernière s'est avérée être très stable encore
à 50C et présenter un maximum d'activité enzymatique pour un
pH de 9,5 environ.
Une électrofocalisation de la superoxyde-dismutase
a conduit à évaluer à 4,2 le pHi ou point isoélsctrique de
cette enzyme.
Un test colorimétrique tel que décrit précédemment
a permis de relever la présence de fer ferreux dans la protéine,
un anneau rose apparaissant au niveau de la bande protéique
dans un gel de migration électrophorétique préalablement addi-
tionné de bathophénanthroline. ~e nombre d'atomes de fer ~er-
reux par molécule a été évalué comme etant pratiquement égal à
2.
- 25 -
. 1063(~28
EXEMP~E 4 - ~tude de_l'effet pho 110 Protecteur
Ce test est conduit à l'aide d'un appareil XENON, U.V.
Solar Simulator commercialisé par Solar ~ight Company, Philadel-
phie U.S.A.
~ a lumière est produite par une lampe à arc XENON
250 W qui a un spectre semblable à celui du soleil; les lon-
gueurs d'onde vont de 285 nm à 410 nm.
~ 'irradiation avec ce spectre permet de reproduire
l'érythème solaire. On l'appelle ~ED (minimal erythemal dose)
temps minimal d'irradiation qui donne un érythème 24 ou 48
heures après l'exposition. Cette grandeur est exprimée en
secondes.
~ 'irradiation est effectuée sur des portions de la
peau du dos de sujets volontaires.
En échelonnant les durées d'exposi-tion on détermine
d'abord la MED.
Chaque suje-t est ensuite soumis à une irradiation de
5 MED, certaines zones irradiées de la peau étant traitées par
application du produit étudié, mélangé à un excipient de façon
à former une crème. Certaines parties irradiées de la peau sont
traitées par applicacion de l'excipient seul. On effectue en
:.
même temps l'irradiation d'une partie de peau nue non traitée.
~ e produit étudié es-t une superoxyde-dismutase obtenue
comme à l'exemple 1 ci-dessus.
On évalue subjectivement l'intensité de l'érythème
par lecture 24 ou 48 heures après l'exposition.
On note un ertythème faible par + et un érythème
intense par +*. L'absence d'érythème est notée 0. ~es résul-
ta-ts obtenus sont résumés dans le tableau suivant:
* marque de commerce.
- 26 -
~.~
: `
10630Z8
~raitement peau non excipient produit étudié
traitée seul excipien-t
.... ._ _ .. .. ..
Sujet 1 ~+ + O
Sujet 2 ++ ++ +
Sujet 3 - I _ _ _ _
EXEMPIE 5
Auto-oxydation de la p-phénylènediamine.
On a préparé une solution aqueuse 10 3 molaire de
p-phénylènediamine dans un tampon phosphate pH 8,6. La densité
optique de la solution mesurée à 520 nm au bout de 2 heures est
de 0,07. ~a meme solution contenant 10 unités par millilitre de
1'enzyme préparée comme dan9 1 t exemple 1 ci-dessus conduit à
une densité optique de 0,036, ce qui correspond à 49 % d'inhi-
bition.
EXEMPLE 6
Auto-oxydation du dihydroxy 5,6-indole. -
On a préparé une solution 6,7 x 10 5 molaire de dihydro-
xy-5,6-indole dans un tampon phosphate pH 7,8. La densité opti-
que de la solution mesurée à 330 nm croît de 0,1 unité par minu-
te. En présence de 407 x 10 9g. par millilitre de l'enzyme
citée d~ns l'exe~ple 5, la densité optique cro~t de 0,062 unité
par minute ce qui correspond à 38 ~o d'inhibition.
EXEM~P~E 7
Auto-o~ydation du trihydroxy-1,2,4-benzène.
On prépare une solution aqueuse 10 3 molaire de
trihydroxy-1,2,4-benzène. On ajoute 1 millilitre de cette solu-
tion à 1 millilitre de tampon phosphate pH 7,8. La densité
optique de cette solution mesurée à 480 nm croit de 0,375 unité
- 27 -
1063028
par mi~ute.
Par addition de:
2 x 10 6 g par millilitre d'enzyme définie dans
l'exemple 5 la densité optique cro~t de 0,09 unité par minute,
- ce qui correspond a 76 % d'inhibition.
4 x 10 6 g par millilitre d'enzyme, la densité optique
croît de 0,064 unité par minute, ce qui correspond à 8~ ~ d'in-
hibition.
40 x 10 6 g par millilitre d'enzgme la densité optique
~0 cro~t de 0,023 unité par minute, ce qui correspond à 96,5 ~o
d'inhibition.
- ~XEMPIæ 8
Auto-oxydation de l'ortho-aminophénol.
On prépare une solutlon aqueuse 5 x 10 3 molaire
d'orthoaminophénol. On prépare une solution contenant:
1 millilitre d'eau bidistillée
1 millilitre de la solution ci-dessus
1 millilitre de tampon phosphate pH 9,2
On suit la densité optique de cette solution à 430 nm;
au bout de 15 minutes elle est de 0,22.
Par addition de 2,7 x 10 6 g par millilitre d'enzyme
préparée selon l'exemple 1 la densité optique au bout de 15 minu-
tes est 0,02, ce qui correspond à 91 % d'inhibition. Par addition
~-~ de 27 x 10 6 g par millilitre la densité optique est de 0,01
soit 96 % d'inhibition.
, ~E:MPI,:E 9
- Inhibition de l'auto-oxydation de la triéthanolamine.
~a triéthanolamine est l'une des bases organiques cou-
ramment utilisée pour la neutralisation de compositions cosméti-
ques contenant des résines acides, par exemple des résines car-
boxyvinyliques du type Carbopol marque de commerce.
~es amines tertiaires de ce type ~orment des complexes
-
- 28 -
106~028
de transfert de charge aYec l'ox~gène, et ces complexes, sous
l'action d'un rayonnemen~ lumineuxS se dissocient pour donner
naissance à des quantités importa~tes d'ions superoxyde. Ces
derniers peuvent entraîner des peroxyda~ions dans les formllles
cosmétiques qui les contiennent. Ces peroxydes, en particulier
ceux dérivant de lipides gras insaturés (fréquem~ent présents
dans les compositions cosmétiques par exemple l'alcool oléique)
ont une action toxique et il est souhaitable d'inhiber leur for-
mation.
En utilisant comme révélateur d'ion superoxyde le bleu
de nitrotétrazolium (ou NBT), comme décrit par I. Friodovich et
Ch ~eauchamp Analytical biochemistry 44, 276 (1971), on a
trouvé que l'addition de superoxyde-dismutase (en abrégé: SOD)
à une solution aqueuse de triéthanolamine permettait d'inhiber
fortement la formation d'ions superoxyde. ~a SO~ utilisée est
celle obtenue à l'exemple 1.
~'inhibition de la formation d'ions supero~yde est
~ évaluée par mesure de la densité optique à 560 nm et de son évo-
`~ lution en fonction du temps d'irradiation. Avec une concentra-
tion en triéthanolamine de 0,4 ~ on observe une inhibition i~por-
tante pour des concentrations en SOD de l'ordre de 10 2 à 10 1
- mg/cm3.
On obtient les mêmes résultats en remplaçant la SOD
obtenue à l'exemple 1 par une quantité équivalente de SOD extraite
d'Escherichia coli ou de Pleurotus olearius.
EXE~P~E 10
Inhibition de l'auto-oxydation du ~i 2
Certaines variébés d'oxyde de titane ou d'oxyde de
zinc conduisent par irradiation à la formation d'ions superoxyde.
C'est ainsi qu'une suspension de Ti 2 dans une solu-
tion contenant du bleu de nitrotétrazolium laissait apparaître
par irradiation à la lumière solaire, une coloration bleue in-
- 29 -
10630Z8
tense révélatrice de la formation d'ions supero~yde a la sur-
face des grains de pigment. Si le même type de suspension est
maintenu à l'obscurité elle conserve sa couleur initiale.
Par contre, lorsqu'à une meme suspension, on ajoute
une solution de superoxyde-dismutase, on obtlent lors de l'ir-
; radiation une très nette inhibition de la coloration bleue.
Pour cette expérience on a utilisé une suspension de100 mg de ~i 2 dans 5 cm3 d'une solutio~ de N.~.T. de concen-
tration 8.10 5 M.
SOD ajoutée 5.10 2 mg
(obtenue à l'exemple 2)
On sait l'importance des pigments minéraux tels que
Ti 2 et Zn O dans Ies compositions cosmétiques susceptibles
d'être utilisées ou stockées à la lumière (compositions de ma-
quillage, compositions anti-solaires....). ~'introduction de
SOD dans ces mê~es compositions permet d'y inhiber la formation
d'ion superox~de et les dégradations qu'il y entraîne.
On obtient les mêmes résultats en remplaçant la SOD
obtenue à l'exemple 2 par une quantité équivalente de SOD
extraite du sang (érythrocupréine).
l~EMP~E 1 1
Inhibition de l'auto-o~.ydation de la riboflavine.
~ es compositions cosmétiques pour le soin ou le trai-
tement de la peau contiennent fréquemment de la riboflavine (vi-
tamine B2). En effet, la présence de cette vitamine est néces-
saire pour maintenir les fonctions normales de la peau.
Il est bien connu que, lorsqu'elle est irradiée en
présence d'oxygène, la riboflavine conduit à la formation d'ion
superoxyde. Ce dernier peut donc induire des peroxydations dans
les émulsions qui contiennent la ribo~lavine et il est alors
souhaitable d'y adjoindre une superoxyde-dismutase pour inhiber
ce phénomène.
- 30 -
- 1063028
E~P~E 12
Sh~npooing colorant moussant
ule C12H25-0 CH2-~HO~I - CH2-SO-C~2-C~IOH-CH O~ 0 g
Nonyl phénol à 9 moles d'oxyde d'éthylène 20 g
Diéthanolamine de coprah 10 g
Butylglycol 7 g
Propylèneglycol ~5 g
NH4 OH a 22Bé (11 M) 12 ml
Sulfate de m~diamino anisol 0,030 g
; 10 Résorcine 0,400 g
m-aminophénol base 0,150 g
p-aminophénol base 0,087 g
~ nitro para phénylène diamine 0,004 g
`~. p-toluylène diamine 1 g
SOD obtenue à l'exemple 3 0,05 g
~isulfite de sodium (d _ 1,32) i,2 ml
eau q.s.p. 100 g
On melange 50 g de cette formule avec la rnême quantité
- d'eau oxygénée à 20 volumes et on applique sur les cheveux le
gel obteml. Après 30 minutes de pause, on rince et sèche les
cheveux.
Sur des cheveux bruns, on obtient une nuance châtain.
Dans la composition ci-dessus, on peut remplacer la
SOD obtenue à l'exemple 3 par une quantité équivalente de SOD
obtenue à l'exemple 1 ou à l'exemple 2.
EXEMP~ 13
Crème support de teinture (coloration d'oxydation)
Cétyl stéaryl sulfate de sodium 3 g
Alcool cétyl stéarylique 10 g
~0 Diéthanolamide oléique 4 g
Ammoniaque à 22 ~é 10 ml
Sulfate de m-dia~ino anisol 0,048 g
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Résorcine 0,420 g
m-aminophénol base 0,150 gNitro p-phénylènediamine 0,085 g
P-toluylènediarnine 0,005 gBisulfite de sodium (d = 1,32) 1,2 g
Superoxyde dismutase de l'exemple 1 0,1 g
Eau q.s.p. 100 g
On mélange 30 g de cette crème avec 45 g d'eau oxygénée
à 20 volumes et on applique sur les cheveux la crame lisse obte-
nue. Après un temps de pause suffisant on rince et on sèche les
cheveux.
EXE~P~E 14
Gel moussant ou solution épaissie.
Alcool oléique à 12 moles d'oxyde d'éthylène 9 g
Méthyl cellulose 2,5 g
Superoxyde dismutase de l'exemple 2 0,2 g
Parfum 0,1 g
Eau q.s.p. 100 g
Cette composition s~applique sur la peau. Elle peut
également, par addition d'un agent de bronzage artificiel tel quela dihydroxyacétone, former une composition pour le bror.zage arti-
ficiel de la peau.
On a obtenu une composition analogue en remplaçant la
SOD de l'exemple 2 par une quantité équivalente de la SOD obte-
nue à l'exemple 3.
~XEMPIæ 15
Crème (pour le corps)
Cire de sipol (alcool cétyl stéarylique partiellement
oxyéthylené commercialisé par SINNOVA-~RANC~)5 g
Huile-de vaseline 6 g
Myristate d'isopropyle 3 g
Glycérine 10 g
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. 1063028
Parfum 0,2 g
SOD obtenue à l'exemple 3 0,5 g
~au q.s.p. 100 g
On a obtenu une crème analogue en remplaçant dans la
composition ci-dessus la SOD de l'exemple 3 par une quantité
équivalente de SOD de l'exemple 1 ou de SOD extraite de Pleuro-
tus oléarius gillet.
EX~IP~E 16
Crème (pour le corp~)
Cire de Sipol 6 g
Perhydrosqualène 4 g
Palmitate d'isopropyle ` 2 g
Glycerine 15 g
- Parfum o 3 g
`' SOD de l'exemple 1 o~5 g
Eau q.s.p. 100 g
On a obtenu une crème analogue en remplaçant dans la
composition ci-dessus la SOD de l'exemple 1 par une quan~ité
équivalente de SOD extraite d~Escherichia coli No. ATCC 15224
EXEMP~E 17
~ait de beau-té pour le corps
Huile de Purcellin (Dragoco) 2 g
Huile de vaseline 6 g
Alcool oléique 1 g
Myristate d'isopropyle 1,5 g
Monostéarate de glycérine 2 g
Stéarine 1,4 g
Alcool cétylique 0,1 g
Parfum 0.9 g
Carbopol 941 (Goodrich Chem. Co) 0,~5 g
trriéthanolamine pure 0,35 g
Parahydroxybenzoa~,e de butyle 0,04 g
* marque de commerce
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æ ~
. -" 1063028
Triéthanolamine pure 0,7 g
Agent conservateur 0.3 g
Propylène glycol 5 g
Rhodorsil antimousse 410 (R.P.) 0,2 g
Hydroviton (Dragoco) : mélange d'amino-acides,
' de principes hydratants de la peau et de
lactate de sodium allantoine (tampon) 1,5 g
~l¢ool (96 ~) 5 ' g
Colorant F.D.C. blue 1 (Kohnstamn) à 1 % dans l'eau 0,03 g
10 SOD de l'exemple 1 0.08 g
Eau déminéralisée 71,55 g
100,00 g
On a obtenu un lait de beauté analogue en remplaçan-t
la SOD obtenue à l'exemple 1 par une quantité équivalente de
SOD extraite du sang (érythrocupréines).
EXEMP~E 18
Amélioration de l'état de la peau in vivo
~ 'experience est faite ~ur de~ rats fe~elles dont on
modifie expérimentalement l~état de la peau sous l'action du
propionate de testostérone et que l'on traite par la superoxyde
dismutase en application topique.
~ 'action de,la superoxyde dismutase est appréciée par
examen clinique de la peau et par diverses déterminations bio-
chimiques.
1) Pro-tocole expérimental :
Qua-tre séries de 8 rats femelles agées de 40 jours sont
utilisés.
1ère serie :
Rats recevant un implant intra-peritonéal de 30 - 40 mg
`~ 30 de propionate de testostérone.
2ème_série :
M~me traitement ~ue la première série, avec en outre
* marque de com~erce.
- 34 -
~:,
. ,.,~ ~
.. .,,~,
-` 10630Z8
; une application quotidienne de 15 U de superoxyde-dis-
rnutase dans ~,3 ml de sérum physiologique sur le
dos préalablement tondu, 5 jours par se~aine.
3ème ~série :
Témoins sans aucun traitement.
~ es animaux sont sacrifiés 20 jours après le début
de l'expérience pour les déterminations biochimiques.
2) Examen clin~
~e propionate de testostérone administré à des rats
femelles provoque des modifications cutanées qui se manifestent
par une augmentation de l'activité cellulaire au niveau de la
couche de malpighi, une augmentation de l'épaisseur des couches
épidermiques et un encombrement sébacé plus important.
~ a peau devient plus épaisse et plus rêche, elle est
aussi moins élastique au toucher.
C'est ce que l'on observe sur la série No. 1.
~ es observations sont faites par trois personnes dif-
férentes en aveugle.
Au contraire, les rats de la 2ème série ont une peau
analogue à celle des rats de la série témoin No. 3: peau douce,
souple et élastique au toucher.
3) Déterminations biochimiques:
Les résultats obtenus sur des fragments de peau sont
reportés dans le tableau ci-joint.
Ils sont exprimés en milliunités par minute et par
cm2 de peau, ou bien en milliunités par minute et par mg de
protéines présentes dans le fragment de peau.
_ 35 _
-`` 1063~Z8
~AB~EAU
- Variations biochimiques cutanees en fonction du traitement de
rats femelles, par le propionate de testos-térone associé ou non
à la SOD administrée par voie topique.
.. . .. . .. _ . . _ .
Témoins ~estotérone ~estostérone
+ SOD
:;
mu/min/cm2 6600 6500 10 400
Cyto~
mu/min/mgProt 13100 9500 13 700
cytox: cytochrome-oxydases
; ~'examen de ces résultats montre que la superoxyde
dis~utase, administrée par voie topique, a une action nette sur
les cytochrome-oxydases rapportées aux protéines. Alors que la
testostérone provoque une forte diminution, le traitement à la
SOD pexmet de retrouver le même taux que chez les témoins.
On sait que les cytochrome-oxydases permettent de
caractériser la respiration cellulaire.
~0 ~a superoxyde dismutases améliore la respiration
cellulaire cutanée et les qualités de la peau: douceur au tou-
cher, souplesse et élasticité.
~' - ' . .
,j.
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