Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
109Z0~1
La présente invention concerne de nouvelles glycoprGtéines
hydrosolubles isolées d'Hafnia.
De nombreuses préparations d'origine microbienne, cons-
tituées par des corps microbiens lysés, sont décrites dans la lit-
térature par exemple dans les Brevets Spéciaux de Médicaments
5 488 M (Canadian Patents and Developments Limited), 6 495 M ~Ins-
titut de Recherches Scientifiques) et 6 513 M (Institut de Recher-
ches Scientifiques).
Ces lysats microbiens, seuls ou associés à un antibioti-
que servent à déclencher une réaction d'immunisation rapide ou àexalter les défenses de l'organisme vis-à-vis d'une agression mi-
crobienne. Ces lysans proviennent, en général, d'une espèce micro-
bienne déterminée et amènent une immunisation plus spécifique que
générale.
Ils possèdent l'inconvénient d'être généralement aller-
géniques. Leur emploi répété ne peut de ce fait être conseillé.
Dans le brevet n 2043 475, la demanderesse a décrit une
fraction glycoprotéique isolée d'une ou de plusieurs souches sa-
prohytes ou pathogènes possédant un pouvoir immunitaire et une cer-
taine action anti-inflammatoire.
La demanderesse a cherché depuis à préparer de nouveaux
extraits glycoprotéiniques présentant des propriétés anti-inflam-
matoires et irnmunostimulantes, ainsi qu'une bonne tolérance.
La présente demande a ainsi pour objet de nouvelles glyco-
protéines hydrosolubles caractérisées en ce qu'elles sont extraites
de corps microbiens lysés d'Hafnia et en ce que'elles possèdent un
poids moléculaire apparent égal ou supérieur à 300 000.
Le poids moléculaire apparent est le poids moléculaire
déterminé au moyen d'un gel poreux étalonné à l'aide de solutions
macro-moléculaires connues. Parmi les gels poreux étalonnés servant
à determiner le poids moléculaire, on peut retenir les gels connus
sous la marque de commerce Sépharose et notamment les gels
~o~9z~
Sépharose 6 B.
Parmi les glycoprotéines de la présente invention, on
retient notamment les glycoprotéines possédant un poids moléculaire
apparent égal ou supérieur à 1 million.
Parmi les glycoprotéines de l'invention, on retient
notamment les glycoprotéines telles que définies ci-dessus carac-
térisées en ce qu'elles renferment de 40 % à 50 % de substances à
pouvoir biurétogène et de 25 % à 35 % d'oses neutres, ne renferment
pas d'acide diaminopimélique et présentent des maxima d'absorption
dans l'Ultra-Violet à 215 à 260 m,u environ.
Par substances à pouvoir biurétogène, on désigne les
protéines donnant la réaction colorée du biuret.
Par oses neutres, on désigne notamment des hexoses neutres
tels que le glucose, le galactose ou le mannose.
L'absence d'acide diaminopimélique dans les glycoprotéines
telles que définies ci-dessus, indique l~origine non membranaire de
celles-ci.
Parmi les glycoprotéines de l'invention, telles que dé-
finies ci-dessus, on retient plus particulièrement les glycopro-
téines extraites de la souche d'Hafnia déposée à l'Institut Pasteurà Paris sous le n 5 731.
Selon l'invention, les nouvelles glycoprotéines hydro-
solubles telles que définies ci-dessus sont préparées par un procédé
qui est caractérisé en ce que l'on cultive, sur milieu solide ou
liquide, une souche microbienne d'Hafnia, récolte après complet dé-
veloppement les corps microbiens, procède ~ une lyse de ces derniers,
recueille le lysat, traite ce dernier au moyen d'un ou de plusieurs
soivants organiques, recueille le pxoduit brut resultant, le met
en solution aqueuse, soumet cette dernière à une diafiltration sur
membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de sub-
stances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300 000 et
lyophilise la solution ainsi obtenue.
lO~ZO~l
Les souches d'Hafnia peuvent notamment être cultivées
dans des milieux liquides, agités dans des conditions aérobies.
Les milieux de cultures utilisés sont usuels pour de
telles souches. Ces milieux peuvent, par exemple, comprendre des
extraits de viande, de la peptone de caséine, de la peptone papaq-
nique de soja, des autolysats de levure, des sucres, des élémènts
minéraux et de l'eau distillée.
La lyse des corps microbiens peut être physique, chimique
ou enzymatique.
La lyse physique peut avantageusement être effectuée au
moyen des ultra-sons ou d'un rayonnement pénétrant ou encore par
chauffage.
La lyse chimique peut avantageusement être effectuée par
adjonction d'un agent tensio-actif, tel qu'un sorbate de polyéthy-
lèneglycol ou au moyen d'un antiseptique organomercuriel, tel que
le mercurothiolate sodique, voire au moyen d'un acide minéral ou
organique, tel que l'acide trichloracétique.
La lyse enzymatique est avantageusement effectuée au moyen
d'une enzyme, telle que le lysozyme, le trypsine, la pronase, la
papa~ne, l'~-chymotrypsine.
La lyse, qu'elle soit physique, chimique ou enzymatique,
doit de préférence être poursuivie pendant une durée de 7 à 60 jours.
Le lysat obtenu peut être lyophilisé.
Le traitement du lysat au moyen d'un ou plusieurs sol-
vants organiques est avantageusement effectué au moyen de deux sol-
vants organiques qui peuvent être dans l'ordre, l'acétone et le mé-
thanol. Ce traitement a pour effet d'éliminer les lipides et les
pigments, il doit être pratiqué en agitant vigoureusement et pen-
dant plusieurs heures le lysat avec le ou les solvants organiques.
Les membranes poreuses calibrées présentant un seuil de
rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supé-
rieur à 300 000 peuvent avantageusement être constituées par les
109Z0~1
membranes commercialisées sous la désignation XM 300 par les so-
cié'és ROMICON et AMICON (Amicon Corporation - Lexington - Massa-
chusetts 0 2713 - U.S.A.).
Les membranes poreuses calibrées présentant un seuil de
rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supé-
rieur à 300 000 peuvent se présenter sous la forme de fibres creu-
ses. Parmi ces dernières, on peut retenir notamment les fibres
creuses commercialisées sous la désignation HIP 100 par la société
AMICON précitée.
Selon une variante du procédé, on peut avantageusement
effectuer une diafiltration préliminaire au moyen d'une membrane
poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances
dont le poids moléculaire est inférieur à 300 000.
Pour ce faire, on peut utiliser par exemple des membranes
présentant un seuil de rétention de 100 000 telles que les membranes
commercialisées sous la désignation XM 100 par la société AMICON
précitée.
Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre
de l'invention, le procédé de préparation ci-dessus décrit est ca-
20 ractérisé en ce que:
a) La lyse des corps microbiens est une lyse enzymatique,
b) le traitement du lysat au moyen d'un ou de plusieurssolvants organiques est effectué succesivement au moyen de l'acé-
tone et du méthanol,
c) la membrane poreuse calibrée présentant un seuil de
rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supé-
rieur à 300 000 est une membrane vendue sous la désignation XM 300
par les sociétés AMICON ou ROMICON.
Parmi les lyses enzymatiques, telles que définies ci-
30 dessus, on retient plus particuliè.rement les lyses effectuées aumoyen du lysozyme.
Les glycoprotéines de l'invention sont légèrement colo-
~LO~Z04~
rées en beige, inodores, neutres et hydrosolubles jusqu'à une con-
centration de 25 mg/ml, elles sont par contre insolubles dans des
solvants tels que l'éthanol, le méthanol, l'acétone, l'éther ou le
benzène.
Par chromatographie sur Sépharose 6 B, on a constaté
que le poids moléculaire des produits obtenus est supérieur à 1 mil-
lion.
Le spectre d'absorption dans l'Ultra-Violet montre une
absorption aux courtes longueurs d'onde (maximum aux environs de
215 m,u), caractéristique de la liaison peptidique et une absorption
plus faible aux environs de 260 m,u, caractéristique des acides
nucléiques et des protéines.
Le spectre d'absorption dans l'infra-rouge confirme la
nature en partie peptidique des produits.
Les réactions de caractérisation des sucres ~réaction à
l'orcinol et au carbazole) sont positives.
Les réactions de caractérisation des liaisons peptidiques
(réaction du biuret, de Lowry et à la ninhydrine) sont également
positives.
Les glycoprotéines de la présente invention ne sont pas
dialysables, elles sont pharmacologiquement stables à la chaleur
(une heure à 105C) et au pH extrêmes (pH 3 et pH 10, quinze heures
à + 4C), elles résistent à l'action d'une enzyme protéolytique telle
que la pronase (24 heures ~ + 37C).
Les produits, objet de la présente inventlon, possèdent
de très intéressantes propriétés pharmacologiques, ils sont doués
notamment de remarquables propriétés anti-inflammatoires, immuno-
stimulantes, ainsi que cl'une très bonne tolérance.
Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie
expérimentale.
Ces propriétés justifient l'utilisation des glycopro-
téines de la présente invention, à titre de médicaments.
iOgZ041
Parmi les médicaments de l'invention, on retient de
préférence, les médicaments caractérisés en ce qu'ils sont consti-
tués par les nouvelles glycoprotéines hydrosolubles obtenues à
partir de la souche d'Hafnia déposée à l'Institut Pasteur sous le
n 5 731.
Parmi les médicaments de l'invention, on retient égale-
ment ceux, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les glyco-
protéines telles qu~obtenues par le procédé de l'invention.
Ces médicaments trouvent par exemple leur emploi dans
le traitement des inflammations de la peau, des muqueuses et comme
anti-prurigineux, en dermatologie, en oto-rhino-laryngologie., en oph-
talmologie, en proctologie ou en gynécologie, air.si que dans le trai-
tement des infections intestinales chroniques ou aigues telles que
les colibacilloses, dans le traitement des toxiinfections alimen-
taires à Salmonelles et à staphylocoques entérotoxiques, dans le
traitement des syndromes dysentériques d'origine microbienne tels que
les shigelloses, dans le traitement des candidoses digestives et
dans le traitement des infections urinaires à Proteus ~ Pseudomonas.
La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le
sujet traité et l'affection en cause, peut être, par exemple de 0,5
mg à 20 mg par jour, par voie orale chez l'homme.
Les nouvelles glycoprotéines telles que définies ci-
dessus, peuvent être employées pour préparer des compositions phar-
ceutiques renferment lesdites glycoprotéines, à titre de principe
actif.
A titre de médicaments, les glycoprotéines de la présen-
te demande peuvent être administrées par les voies digestive, paren-
terale ou localc.
Les compositions pharmaceutiques correspondantes peuvent
être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes
pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par
exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les
1092041
granulés, les solutions, les sirops, les suppositoires, les prépara-
tions injectables, les ovules, les crèmes, les pommades, les lotions,
les gouttes, les collyres, elles sont préparées selon les méthodes
usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à
des excipients habituellement employés dans ces compositions pharma-
ceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'ami-
don, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules
aqueux ou non, les corps gras d'origine anlmale ou végétale, les
dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants,
dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Il va être donné, maintenant, à titre non limitatif, des
exemples de mise en oeuvre de l'invention.
Exemple 1:
Stade A: culture.
On prépare un milieu de culture répondant à la formule
suivante:
- extrait de viande..................................... .690 g
- chlorure de sodium.................................... .690 g
- peptone de caséine.................................... .690 g
- autolysat de levure................................... .690 g
- phosphate bipotassique................................ .483 g
- phosphate monopotassique.............................. .207 g
- glucose............................................... 4104 g
- peptone papainique de soja............................ 2760 g
- eau distillée q.s.p................................... 138 litres
On prépare le milieu de culture en mélangeant successive-
ment l'extrait de viande, le chlorure de sodium, la peptone de casé-
ine llautolysat dc levure, le phosphate bipotassiquc, le phosphate
monopotassique dans environ 20 litres d'eau distillée. On ajuste
le pH aux environs de 7.
On stérilise le milieu à 120C pendant 40 minutes. Les
solutions de glucose et de peptone papainique de soja sont intro-
--7--
~0{32041
duites dans le milieu de culture au moment de l'ensemencement après
avoir été stérilisées ~u préalable.
La souche d'Hafnia (Institut Pasteur n 5 731) cultivée
sur milieu gelosé, est ensemencée dans 50 cm3 de milieu de culture.
Cette solution, servant d'inoculum est introduite dans le reste du
bouillon de culture. On ajuste le volume total du milieu de cul-
ture à 138 litres par addition d'eau distillée stérile.
Le milieu de culture est maintenu à 37C et le pH est
ajusté automatiquement à 7 (par addition dlune solution d'ammoniaque
ou par addition d'une solution d'acide chlorhydrique).
La croissance des germes est appréciée au photomètre,
le nombre de germes est calculé en fonction de la densité optique
déterminée en comparaison avec une courbe étalon.
Après complet développement, soit environ après 7 heures,
le milieu renferme environ 1 milliard de germes au cm3.
Stade B: lyse
_ _ _ _ _ _ _ _ _
A 138 litres de bouillon de culture obtenu au stade A ci-dessus,
on ajoute une solution aqueuse de chlorhydrate de lysozyme, (stéri-
lisée par filtration sur membrane millipore 0,22 ,u) afin d'avoir
une concentration finale de 160 ~de chlorydrate de lysozyme par cm3
de milieu de culture.
On laisse en contact une heure à 56C en présence de
0,25 g d'EDTA par litre de bouillon, de 862,5 mg de mercurothiolate
sodique et de 80 g de polysorbate (commercialisé sous le nom de
Tween 80) par litre de bouillon de culture.
On poursuit la lyse pendant 7 jours à 37C dans des
conditions steriles.
On recueille lc lysat, hornogene'~ise par ayitation puis
lyophilise.
On obtient 7900 g d'une poudre brune.
Stade C: traiternent.
a) Par l'acétone.
lO~Z041
On met en suspension dans 138 litres d'acétone froid
la totalité de la poudre obtenu au stade B ci-dessus, puis agite
vigoureusement pendant 3 heures à 3500 tours/minute.
Après 3 heures, la suspension est filtrée sur verre
fritté. On recueille une poudre jaune que l'on essore rapidement.
b) Par le méthanol.
La poudre obtenue précédemment (7295 g~ est mise en sus-
pension dans 138 litres de méthanol froid et agitée vigoureusement
pendant 3 heures à 1500 tours/minute.
Après 3 heures, la suspension obtenue est décantée,la
plus grande partie du surnageant est soutirée par siphonnage,le res-
tant de la solution est filtré sur verre fritté.
La poudre essorée est séchée à température ambiante sous
vide pendant 24 heures. On obtient alors 3988 g d'une poudre beige
claire.
Stade D: diafiltration.
_______ _____________
On met en solution dans 6 fois 1~ litres d'eau distillée
contenant l g/l de merthiolate, 6 fois 600 g de poudre obtenue au
stade C ci-dessus.
On maintient la solution sous agitation à + 4C pendant
24 heures, centrifuge pendant 2 heures à ~000 tours/minute, puis à
90 000 g dans une cen~rifugeuse en continu avec un débit de 6 1/
heure.
On récupère la solution que l'on complète à 10 litres
avec de l'eau distillée filtrée (sur membrane millipore 0,22 ,u). On
introduit la solution obtenue dans un appareil à diafiltrer équipé
de membranes poreuses dont le seuil de rétention est de 300 000 et
le diamètre apparent des pores d'approximativement 2 A (membranes
commercialisées par la société AMICON ou par la société ROMICON sous
la désignation XM 300).
On fait circuler dans l'appareil 50 volumes d'eau distil-
lée, soit un volume de 500 litres.
lO~Z041
La durée de l'opération est d'environ 48 heures.
La solution diafiltrée est récupérée puis centrifugée
en continu à 90 000 g avec un débit de 6 litres/heure.
On obtient 9,5 litres d'une solution que l'on lyophilise.
On recueille finalement 105 g de glycoprotéines sous
forme d'une poudre blanc-beige, cotonneuse et très hyg.oscopique.
Analyses:
- C % 37~9
- H % 6
- N % 7,5
Teneurs en:
-eau 9 %
-phosphore 0,01 %
-chlore 0 %
-protéines - biuret 51 %
-sucres - orcinol 29 % (hexoses neutres)
- carbazole 1,5 % (acides uroniques)
Spectres U.V. : - un maximum à 216 m/u
- un maximum à 258 m,u
I.R. : confirme la nature en partie peptidique des pro-
duits.
L'hydrolyse par l'acide chlorhydrique 6 N à 110C pen-
dant 24 heures des glycoprotéines obtenues ci-dessus, suivie d'une
chromatographie sur plaque de cellulose avec l'un des systèmes sol-
vants suivants: n-butanol-acide acétique-eau (60-30-30), isopro-
panol-ammoniaque (2/3-1/3) ou méthanol-pyridine-acide acétique-
eau (18-50-4-28) montre l'absence d'acide diaminopimélique dans ces
hydrolysats. Cette absence d'acide diaminopimélique dans les hydro-
lysats indique l'origine non membranaire des glycoprotéines obtenues
selon l'invention.
L'étude de la courbe des densités optiques à 280 m~u de
l'éluat de la chromatographie sur Sépharose 6 B des; glycoprotéines
--10--
lO9Z041
obtenues à l'exemple 1 en fonction des Ve/Vo, montre que celles-ci
ont un poids moléculaire supérieur à 1 million.
(Le Vo correspond au volume d'élution d'un dextran de
poids moléculaire supérieur à 1 million, totalement exclu sur Sé-
pharose 6 B dont le poids moléculaire limite d'exclusion est de 1
million.
Le Ve correspond au volume d'élution des glycoprotéines
d'Hafnia obtenues).
Exemple 2:
En opérant comme aux stades A et B de l'exemple 1, on
prépare 90 litres de lysat que l'on lyophilise.
On obtient 4570 g d'une poudre jaune-brun.
Stade C' traitement.
__ ____ __________
a) Par l'acétone.
On extrait la poudre obtenue ci-dessus au moyen de 90
litres d'acétone froid, comme indiqué au stade C a) de l'exemple 1.
b) Par le méthanol.
On extrait le produit obtenu ci-dessus au moyen de 90
litres de méthanol froid comme indiqué au stade C b) de l'exemple 1.
On sèche à froid sous vide et obtient 1765 g d'une poudre beige.
Stade D: diafiltration.
On met en suspension dans 15 litres d'eau distillée,
600 g de la poudre obtenue au stade C ci-dessus, agite à + 4C pen-
dant 15 heures,et centrifuge la solution à 4000 tours/minute pendant
2 heures puis en continu à 90 000 g avec un débit de 6 litres/heure.
On obtient 14 litres de solution que l'on introduit dans
un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil
de retention est de 300 000 et dont le diamètre apparen-t des pores
est approximativement de 2 A (membranes commercialisées par la so-
ciété AMICON ou par la société ROMICON, sous la désignation XM 300).Les 14 litres de solution sont lavés par 40 volumes d'eau distillée.
La durée de l'opération est de 48 heures environ.
--11--
109Z0~1
La solution finale est centrifugée à 90 000 g puis lyo-
philisée.
On obtient 55,6 g d'une poudre blanc-beiye , cotonneuse
et très hygroscopique.
Analyses
- C % 40,3
- H % 6
- N % 8,3.
Teneurs en:
- eau 10 %
- phosphore 0,025 %
- chlore 0 %
- protéines -biuret 41 %
- sucres -orcinol 26 % (hexoses neutres).
Spectres U.V.: maximums à 215 et 257 m~
I.R.: confirme la nature en partie peptidique des
produits.
- Absence d'acide diaminopimélique.
- Poids moléculaire sur Sépharose 6 B supérieur à 1 million.
Exemple 3:
On a préparé des comprimé répondant à la formule:
- glycoprotéines obtenues à l'exemple 1......................... 5 mg
- excipient q.s. pour un comprimé terminé à 200 mg
(Détail de l'excipient: lactose, talc, amidon, stéarate de
magnésium).
Exemple 4:
On a preparé une pommade répondant à la formulc:
- glycoprot~incs obtenues à l'exemple 2......................... 200 mg
- excipient q.s.p............................................... 100 g.
Etude pharmacoloqique.
a) Activité anti-inflammatoire.
L'activité anti-inflammatoire des produits a été déter-
-12-
0~1
minée sur des rats mâles par la technique de l'oedème podal à la
carraghénine (Winter, Risley, Nuss) Proc- SoC.Exp, Biol. Med. 1961,
111, 544-7.
Les animaux re,coivent dans l'articulation tibio-tarsienne
d'une patte postérieure 0,05 ml d'une suspension de carr~ghénine à
1 %. Le produit étudié est administré par voie intrapéritonéale à
des doses de 10 ~ /kg et de 100 ~ /kg une heure avant l'injection de
la carraghenine.
Le volume de la patte traitée est mesuré, à l'aide d'un
plethysmomètre, avant et 3 heures après l'injection de la carréghé-
nine.
Les résultats sont exprimés en pourcentage de régression
de l'oedème par rapport aux témoins.
Les résultats obtenus figurent dans le tableau 1 ci-
dessous.
Tableau 1
: Pourcentage de diminution
. de l'oedème
Doses ~
Pro 1 . 10 ~/kg 100 d /kg
de l'exemple 1 : 64 % : 79,5 %
'.
de l'exemple 2 . 59 % 75 %
b) Etude de l'appel cellulaire.
Les glycoprotéines obtenues à l'exemple 1 sont administrées par voie
intrapéritonéale à des lots de cobayes, à des doses de 50 et
100 ~/kg.
Une nwnération des cellules péritonéales est effectuée
48 heures après l'injection des glycoprotéines.
La comparaison de cette numération avec celle effectuée
sur des animaux non traités montre qu'il n'a pas d'appel cellulaire.
c) Etude de la tolérance.
-13-
i~D9Zo4~
L'administration par voie sous-cutanée à des souris des
glycoprotéines obtenues aux exemples 1 et 2,à des doses de 250 ~ /kg
et 1000 ~/kg sous un volume de 0,2 ml ne provoque aucune intoléran-
ce locale ou générale.
Aucun signe d'inflammation dans le tissu sous-cutané
n'a été relevé.
d) Activité anti-bactérienne qénérale préventive.
Les glycoprotéines sont administrées à des doses de
1000 ~/kg et 5000 ~/kg par voie intrapéritonéale, à des lots de
20 souris 6 jours et 48 heures avant l'injection par la même voie
de germes d~une souche de Klebsiella Pneumoniae correspondant res-
pectivement à 100 et 500 fois la DL50 (dose létale 50).
La mortalité est suivie pendant les 7 jours qui suivent
l'injection des germes de Klebsiella Pneumoniae et comparée à celle
d'un lot témoin d'animaux ayant re,cu du sérum physiologique à la
place du produit étudié.
Les résultats exprimés en pourcentage de protection
des-animaux traités (pour les produ~ts des exemples 1 et 2) figurent
dans le tableau 2 ci-après:
Tableau 2
\
\ Germes :
\ 50 . x 100 . x 500
Doses
en ~/kg \ '
,
1000 : 40 : . 70
. '.
5000 : 40 20
e) Stimulation des défenses non spécifiques.
Cette stimulation a été étudiée sur le test de la
clearance au carbone chez la souris en s'inspirant de la technique
d'Halpern (C.R. Soc. Biol. 148, 1954, 431).
-14-
- l~)9Z041
Cette stimulation se traduit par une augmentation de
l'activité phagocytaire après l'injection du produit par voie intra-
péritonéale.
Les glycoprotéines des exemples 1 et 2 donnent respec-
tivement une augmentation de 77,5 % et 88 % à la dose de 250 ~/kg
et de 31 % et 86 % à la dose de 100 ~/kg au temps 30 minutes.
f) Evolution du poids de la rate.
Deux injections par voie intrapéritonéale à des souris,
à 48 heures d'intervalle, des glycoprotéines obtenues aux exemples
1 et 2, aux doses de 100, 250 et 500 ~'/kg n'augmentent pas de fa,con
significative le poids de la rate.
g) Toxicité ai~e - détermination de la DL50.
La dose létale S0 (DL50) par voie intrapéritonéale, chez
la souris a été déterminée par la méthode de Behrens et Karber.
Elle est de 50 mg/kg pour les glycoprotéines obtenues à
l'exemple 1.
-15-
