Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
~lZ3324
L'invention a pour objet un procédé permettant de
déceler, en un temps très court, de l'ordre de 1 à 3 heures,
aussi bien les substances cancérigènes, que les substances
ayant une activité "spécifiquement anticancéreuse", de même que
les substances "toxiques" et les substances dites "neutres".
Le nouveau procédé selon l'invention consiste en un
test biologique "in vitro" totalement différent des nombreux
tests proposés antérieurement pour évaluer le potentiel cancé-
rigène de certaines substances ~ partir d'une acti.on mutagène
ou autre. Ce test permet de prévoir l`action d'une substance
donnée sur le génome et donc sur la survie de la cel`lule saine
et de la cellule cancéreuse.
--`` ~Z33Z4
--2--
Il est basé sur l'action comparée de la substance à
tester dans la réplication in-vitro des acides désoxyribonu-
cléiques (ADN) provenant de cellules saines d'une part, et de
cellules cancéreuses (ou tumorales) d'autre part.
Il permet ainsi, non seulement de sélectionner les
substances à activité cancérigène et les substances toxiques,
mais, en fait, de classer les substances testées en quatre
groupes:
- Les substances cancéri~ènes qui stimulent forte-
ment la réplication des ADN isolés de tissus (ou cellules)
cancéreux, mais faiblement, quoique significativement, la
réplication des ADN isolés de tissus (ou cellules) sains.
-Les substances neutres qui n'agissent ni sur la
réplication des ADN des tissus sains, ni sur celle des ADN
des tissus cancéreux.
-Les substances "toxiques" qui, à des concentrations
égales à celles des cancérigènes classiques inhibent la répli-
cation des ADN, provenant aussi bien des tissus sains que des
tissus cancéreux. Parmi elles, nombreuses sont celles qui, à
très faibles doses, manifestent leur pouvoir cancérigène.
-Les substances dites "s~écifiquement anticancéreuses"
n'inhibant que peu ou pas la réplication des ADN de tissus
sains, alors qu'elles seraient de puissants inhibiteurs de la
réplication des ADN de tissus cancéreux.
Plus précisément, l'invention concerne un
procédé de détection de substances cancérigènes, spécifique-
ment anticancéreuses, toxiques et neutres, caractérisé en ce
que l'on suit, par mesure de l'ADN radioactif acido-préci-
pitable, la synthèse d'ADN sur matrice d'ADN témoin isolé
de tissus sains, d'une part, et sur matrice d'ADN cancéreux
isolés de tissus cancéreux, d'autre part, dans un milieu
~ ..
.
- ~Z33Z4 2a-
d'incubation contenant quatre désoxyribonucléoside-5'-triphos-
phates dont un radioactif, et une enzyme ADN-polymérase, en
présence de la substance à tester l'action de la substance
à tester étant comparée sur quatre couples différents d'ADN,
chaque couple d'ADN étant constitué par un AD~ témoin
et un ADN cancéreux provenant de tissus du même organe
et de la même espèce animale, ou de cellules en culture
de lignées analogues , et qu'on reconna~t les substances
- cancérigènes à ce qu'elles stimulent plus fortement la ré-
plication de l'ADN cancéreux que celle de l'ADN témoin,
et les substances spécifiquement anticancéreuses, à ce qu'elles
inhibent la réplication, l'initiation de la réplication ou l'é-
longation de la chaine d'ADN en synthèse sur matrice ADN
cancéreux, mais non sur matrice ADN témoin, les substances
toxiques inhibant aussi bien la synthèse de l'ADN cancéreux
que celle de l'ADN témoin, et les substances neutres n'agissant
ni sur la réplication de l'ADN cancéreux ni sur celle de l'ADN
témoin.
La présente invention vise également un réactif pour
la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini ci-dessus, carac-
risé en ce qu'il est constitué par l'ensemble de quatre ~ -
préparations, chaque préparation comprenant un couple AD~ témoin-
ADN cancéreux provenant de tissus du même organe et de la
même espèce animale, ou de cellules en culture de lignées ana-
logues, l'ADN présentant un rapport d'absorbances dans 1' W à
260 nm variant de 2,0 à 2,1 et une teneur en protéines de
0,3 à 0,6%.
Pour réaliser le test, qui en lui-même est très ra-
pide, on doit disposer de différentes préparations, préalablement
et minutieusement contr81ées, d'ADN matriciels isolés de tissus
sains (ADN témoin désigné ci-après ADN T) et d'ADN matriciels
isolés de tissuqcancéreux (désignés ci-après ADN C).
.. ~ .
- `
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Les préparations d'ADN C sont obtenues en utilisant
comme matière première, différents tissus cancéreux ou tumeurs,
provenant d'un organe humain ou animal, tels que sein, poumon,
ovaire, neuro-carcinome, ascites, etc. On peut également utiliser
des cultures de cellules cancéreuses telles que les cellules KB,
les cellules Hela, etc.
Les préparations d'ADN T sont obtenues de même en
utilisant comme matière première des tissus sains provenant de
divers organes humains ou animaux, ou des cellules saines culti-
vées "in-vitro" dans des milieux appropriés.
Pour chaque test, il faut disposer d'au moins quatre
couples dlADN ma~riciels de provenance différente, chaque couple
étant constitué par une préparation d'ADN T et une préparation
d'ADN C provenant du même organe, d'une même espèce animale. On
utilise, par exemple, au moins quatre couples choisis parmi les
suivants : ADN T et ADN C isolés de tissus de poumon; ADN T et
ADN C isolés de tissus de sein; ADN T et ADN C isolés de tissus
d'ovaire; ADN T de cellules primaires de rein de singe (RS) ou
de cellules "Vero", ou de cellules "SIRC" en culture et ADN C
de cellules KB ou de cellules ~ela, ou de cellules L, en
culture.
La nécessité d'effectuer le test sur au moins quatre
couples d'ADN provenant d'organes différents s'explique par le
fait que certaines substances qui sont "neutres" vis-3-vis des
ADN isolés d'un organe donné, se révèlent cancérigènes ou au
contraire spécifiquement anti-cancéreuses vis-3-vis des ADN
isolé8 d'un autre organe, ou de cellules en culture.
Par ailleurs, certaines substances qui se comportent
comme des substances "spécifiquement anticancéreuses" lorsqu'elles
sont présentes ~ de relativement faibles concentrations dans le
milieu réactionnel, deviennent toxiques à des concentrations
plus ~levées. Il est donc nécessaire d'effectuer le test avec
des milieux réactionnels contenant une gamme de concentrations
de la substance à tester, entre O et 100 ~g.
Pour isoler l'ADN, soit à partir de tissus sains, soit
3 partir de tissus cancéreux, o~n utilise un procédé classique
- ` ~.
.. ' ~'~
li~3324
4.-
d'isolement et de purification ~. Marmur, J. Mol. Biol. 3, 208,
1961), modifié. Lorsqu'on utilise un tissu cancéreux ou une
tumeur, il faut d'abord les débarrasser des tissus sains ou
douteux avoisinants, et réciproquement les tissus sains doivent
être exempts d,e tous tissus douteux.
Le tissu est, immédiatement après exérèse, soit congelé
à -20C, soit finement broyé au masticateur en présence de tampon
2SSC (contenant 17,4 g de NaCl et 10,7 g de citrate trisodique
pour 1 litre d'eau distillée stérile) en solution aqueuse sté-
rile (1 à 3 ml de tampon selon le volume de tissu) et d'une con-
centration finale de 0,2% de laurylsulfate (par addition d'une
solution mère aqueuse de laurylsulfate à 20%).
Pour éliminer les protéines et conserver l'ADN, plu-
sieurs extractions sont pratiquées en présence de tampon 2SSC et
lS de phénol (solution contenant 10% d'eau), suivies d'extractions
au chloroforme et de centrifugations suivant la technique clas-
sique d'isolement et de purification des ADN. L'ADN, présent
dans les phases aqueuses,est précipité dans de l'alcool à 96,
ramassé à la baguette en verre, dissous dans un faible volume
de lSSC, puis traité par les ribonucléases pancréatiques et Tl, ! -
ce qui nécessite tout un cycle supplémentaire de repurification
au phénol, puis au chloroforme. L'ADN est dialysé contre une
sblution de 2SSC ~24 heures à 4C) dosé par absorption dans
l'ultraviolet et gardé congelé ~ -20C, plusieurs mois si néces-
saire. Avant d'être utilisé, l'ADN est dialysé de nouveau pendant
quelques heures contre de l'eau distillée stérile.
L'ADN est caract~risé par son absorbance dans l'ultra-
violet à 260 nm et 280 nm. Le rapport typique 260/280 varie de
2,0 ~ 2,1 se~on la préparation. Le contenu de l'ADN en protélnes
varie de 0,3 à 0,6%, et celui des polyribonucléotides ayant
résisté à l'action des nucléases et contaminant l'ADN doit être
compris entre 1 à 3%. L'ARN (acide ribonucléique) peut être
éliminé par dégradation par KOH 0,3 M (concentration finale)
pendant 16 heures à 36C, et l'ADN est ensuite dialysé et con-
servé comme indiqué précédemment.
Une préparation d'ADN-polymérase est également
nécessaire pour effectuer le test.
11233z~
Du fait que les ADN-polymérases isolées des tissus des
mammifères synthétisent les ADN par un mécanisme identique ~
celui qu'utilise l'AD~-polymérase I d'~scherichia coli, on peut
utiliser une ADN-polymérase ADN-dépendante et de préférence
llADN-polymérase I isolée et partiellement purifiée ~ partir
d'extraits d'E. coli M 500 Sho-R et à partir d'E. coli sauvage
T 3000. L'enzyme doit être passée deux fois successivement sur
colonne DEAE cellulose, selon la méthode d~crite afin de présenter
un rapport 280~260 de l'ordre de 1,5 à 1,8 (M. PLAWECKI et
M. BELJANSKI, C.R. Acad. Sci. Paris, 278, série D, 1974, p. 1413
et M. BELJANSKI et col., C.R. Acad.~Sci. Paris, 280, série D,
1975, p. 363).
Le milieu réactionnel, ou milieu d'incubation, dans
lequel on suit la réplication de l'ADN en présence de la subs-
tance à tester comprend, pour 0,15 ml (volume final) :
- 0,5 3 1 ~g d'ADN matriciel (ADN-T ou ADN-C)
- 4 désoxyribonucléoside-5'-triphosphates (chacun 5 ~anomoles)
- 25 ~ M de tampon tris-HCl ~pH exactement 7,65)
- 0,- à 100 ~ de substance 3 tester
- 2 ~g de Mg C12
- 40 à 80 ~g d'enzyme ADN-polymérase, ajoutée après tous les
autres constituants du milieu.
Les quatre désoxyribonucléoside-5'-triphosphates
comprennent :
- le désoxyguanosine-5'-triphosphate,
- le désoxycytidine-5'-triphosphate,
- le désoxyadénosine-5'-triphosphate,
- le thymidine-5'-triphosphate, l'un d'entre eux étant radioactif
(3H ou I~C ; 50.000 coups par minute). Comme composé radioactif,
on utilise de préférence le (méthyl-3H)thymidine-5'-triphosphate.
La concentration de substance à tester dans le milieu
varie de 0,- à 100 ~g, car certaines substances, cancérigènes
lorsqu'elles sont fortement diluées, deviennent toxiques à des
concentrations plus élevées.
Il faut donc effectuer l'essai avec une gamme de
concentration en commençant par de faibles concentrations de
la substance à tester.
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L'incubation est effectuée pendant 10 minutes, ~ 36C,
et la réaction est arrêtée par addition d'acide trichloracétique
~ATC) ~ 5~.
Sans attendre, le précipité, constitué par l'ADN
S synthétisé radioactif est filtré sur millipores en verre, lavé
~ l'ATC 5%, séché,et la radioactivité est déterminée dans un
spectromètre Packard (compteur à scintillations) l'échantillon
plongeant dans le liquide approprié au compteur.
On a ainsi étudié comparativement la synthèse in-
vitro d'ADN sur matrices d'ADN témoins et d'ADN cancéreux enprésence de diverses substances chimiques connues comme ayant
des propriétés cancérigènes :
- le 3-méthyl-cholantrène (MC)
- la nicotine (NIC)
- le 9,10-diméthyl-1,2-benzanthracène (DMBA)
- le benzo (a) pyrène
- le 4-benzènesulfonamido-S nitrobenzène (DCBN)
- un extrait d'amiante, etc.
La figure 1 représente les courbes tracées pour les
trois premiers composés ci-dessus (MC, NIC et DMBA) en portant
en ordonnées la quantité d'ADN radioactif 3H synthétisé (en coups
par minute) en présence d'ADN-T et d'ADN-C, en fonction de la
quantité de substance à tester dans le milieu réactionnel.
On voit, d'après ces courbes, que chacune des subs-
tances testées stimule la réplication de l'ADN, mais la stimula-
tion est nettement plus forte pour l'ADN cancéreux que pour
l'ADN témoin.
On a obtenu des résultats analogues pour toutes les
substances cancérigènes testées.
Certaines substances cancérigènes, surtout les colo-
rants, par exemple l'orange d'acridine, doivent être testées à
des concentrations très faibles, car à des concentrations élevées,
elles deviennent toxiques et inhibent aussi bien la réplication
de l'ADN témoin que celle de l'ADN cancéreux.
La figure 2 représente les courbes obtenues avec
l'orange d'acridine, dans les memes conditions que celles ayant
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permis d'établir la figure 1. On voit sur cette figure qu'avec
0,005 ml d'orange d'acridine tO,l mg/ml) dans le milieu, la
stimulation de la réplication de l'ADN-C est nettement plus
forte que celle de l'ADN-T, mais entre 0,005 et 0,1 ml d'orange
S d'acridine dans ~.e milieu, cette substance ralentit la synthèse,
aussi bien de l'ADN-C que de l'ADN-T.
Un deuxième groupe de substances, dites "substances
neutres" n'ont aucun effet, ni stimulateur, ni inhibiteur sur
la réplication des ADN-T, ni sur celle des ADN-C.
La figure 3 représente les c,ourbes, obtenues dans
des conditions analogues à celles ayant permis d'établir la
figure 1, avec une substance neutre dénommée "Xabar" et qui est
une association de nicotinate de réserpiline, de théophylline
et de papavérine. L'acide nicotinique, la pipérazine, sont
classer parmi ces substances neutres.
La figure 6 représente les courbes obtenues dans des
conditions analogues à celles ayant permis d'établir la figure 1,
en utilisant différentes hormones génitales (estrone et estradiol)
aux concentrations indiquées sur la figure 6. L'estrone et l'es-
tradiol stimulent faiblement la replication de l'ADN T isolé detissus sains de sein et très fortement celle de l'ADN C isolé
de tissus canc~reux de sein. Des résultats semblables ont été
observés avec l'ADN des ovaires. Par contre, les hormones géni-
tales n'ont pas d'action sur la réplication de l'ADN.provenant .
de tissus témoins et cancéreux tels que tissus de poumon oude foie.
L'extrême sensibilité de la réaction de réplicati.on
des ADN sains et cancéreux permet de déceler également un effet
simplement toxique. En présence des substances toxiques à de
faibles concentrations, on observe une inhibition de la réplica-
tion des ADN sains, de même qu'une inhibition de la réplication
des ADN cancéreux, essentiellement par inhibition de l'activité
enzymatique.
La figure 4 illustre cette inhibition non sélective
pour le Diquat (dibro~nure d'éthylène-l,l-bipyridylium-2,2).
Le procédé selon l'invention p.ermet enfin de recon-
naître les substances ayant des propriétés spécifiquement anti-
.: ~
llZ3324
cancéreuses. Ces substances inhibent la réplication, l'initia-
tion de celle-ci ou l'élongation (ou les deux) de la chaîne
dlADN en voie de synthèse lorsque ces substances sont en présence
de l'ADN cancéreux; par contre, elles ne doivent avoir que peu
ou pas d'action sur la réplication des ADN-T.
Le propre(et la définition théorique) d'une substance
"spécifiquement anticancéreuse" est de différencier un tissu
cancéreux d'un tissu sain, puis de détruire l'un et non pas
l'autre. D'après le procédé selon l'invention, seront rangées
dans la catégorie "anticancéreux spécifiques" les substances
capables de différencier les ADN d'origine cancéreuse des ADN
d'origine non cancéreuse, et d'inhiber la réplication du premier
sans inhiber celle du second. Selon l'invention, la courbe
théorique d'une substance spécifiquement anticancéreuse, c'est-
à-dire inhibant la seule réplication de l'ADN-C doit se présenter
se].on le schéma représenté dans la figure 5.
Le test selon l'inventiGn permet ainsi de sélectionner
les substances selon l'action qu'elles exercent comparativement,
sur la réplication de l'ADN témoin et sur celle de l'ADN cancéreux.
Il permet essentiellement de reconnaître, d'une part,
des substances ayant un pouvoir cancérigène, d'autre part, des
substances ayant une activité "spécifiquement anticancéreuse"
et peut ainsi servir à effectuer un premier tri avant l'étude
pharmacologique dans la recherche de nouveaux médicaments anti-
cancéreux.
