Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
7L?~
1.
" Proc~dé de détection et de dosage d'une substance
biologique par érythroadsorption "
La présente invention est relative au domai~
ne biologique et plus particuli.èrement à la mise en ~-
5 vidence, par érythroadsorption, d'une substance biologi-
que immobilisée sur un support.
Elle concerne notamment des perfectionnements
au procé~dé de détection et de closage d'une substance
biologique par ~rythroadsorption d~crit dans la demande
10 de brevet FR 80 15 293, publiée 15 Jan.1982, no.~,486,657.
Dans cette demande de brevet FR 80 15 2~3 on
a d~jà décrit un procédé de mise en évidence et de dosa-
ge d'une substance biologique par érythroadsorption. Ce
procede met en oeuvre, à ti~re de r~actif de dosage, le
15 produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un li-
gand capable de réagir avec des érythrocytes, et des é-
rythrocytes ~ titre de révélateur.
Ce proc~dé de détection et de dosage d'une
substance biologique par ~rythroadsorption consiste :
1~ à immobiliser sur un support une substance
ayant une affinit~ de fixation pour la subst2nce biolo-
gique ~ doser;
2) à ~aire incuber cette substance avec le
milieu liquide contenant la ~,ubstaDce biologique à do-
25 ser;
3~ a faire incuber, après lavage, le milieu
r~actionnel r~sultant avec le produit de couplage d'un
ligand sp~ci~ique et dlun ligand capable de r~agir avec
des ~rythrocytes;
4) ~ ajouter des érythrocytes; et
5) à déterminer l'érythroadsorption.
Ce proc~d~ est approprié pour doser, ~ titre
de substances biologiques, des antig~nes, des anticorps,
des haptènes, des hormones, des immunoglobulines et
35 au-tres substances d'int~rêt biologique.
~t~
~'
4~L
Selon les enseignements de ce brevet FR
80 15 2~3 la détermination de l'érythroadsorption peut
se faire de plusieurs façons.
Par exemple, on peut constater visuellement
5 que les globules rouges sont adsorbés à la surface du
support sur lequel a ét~ immobilis~e la substance ayant
une af~inité de fixation pour la substance biologique à
doser. Dans ce cas, le procédé permet d'identifier dans
un liquide biologique donné une subs-tance biologique
10 particulière. Si, au contraire, le liquide biologique
ne contient pas la substance biologique particulière,
les érythrocytes ne sont pas adsorbés et forment un cu-
lot au fond du récipient, par exemple des puits de la
microplaque. Le procédé de dosage par érythroadsorption
15 selon ce brevet FR 80 15 293 permet aussi de déterminer
quantita~tivement une substance biologique donn~e. A cet
effet, on élimine les globules rouges n'ayant pas réagi,
par exemple par aspiration à la pipette. Puis on lyse
les érythrocytes adsorbés, par exemple à l'eau distil-
20 l~ée, et on dose par spectrophotom~trie les substanceslibér~es par les globules rouges, par exemple l'hémoglo-
bine ou les substances arti~iciellement introduites par
l'expérimentateur.
L'hémoglobine peut également etre dosée par
~5 une réaction enzymatique Par exemple, on peut utiliser
un des substrats de la peroxydase, tels que l'ortho~di-
anisidine ou l'ortho-phénylè~e-diamine La lecture se
~ait aussi par spectrophotom~trie à 400 nm pour l'ortho-
dianisidine et à 492 nm pour l'ortho-ph~nylène-diamine.
La quantit~ de substances libér~es par les
globules rouges, par exemple la quantité d'hémoglobine
lib~r~e, est proportionnelle à la quantité de la subs-
tance ~ doser, ce qui permet d'obtenir, par exemple, le
dosage d'un ant.g~ne ou d'un anticorps présent dans l'é-
35 chantillon en se r~férant à une gamme étalon d'hemolyse
~ ~l~w~
3~
des globules rouges ~tablie dans les memes conditions.
La détermination quantitative de l'~rythroad-
sorption dé~inie ci-dessus nécessite donc l'~limination
des globules rouge~ n'ayant pas r~agi et le dosage des
5 substances lib~r~es par les globules rouges ou des sub~
tances arti~ieiellement introduites par l'expérimenta-
teur
Dans ce proc~d~, la substance biologique ~
doser est immobilis~e sur ur. support par fixation sp~-
10 eifique, e'est-à dire par l'interm~diaire dtune subs-
tance ayant une affinit~ de fixatio~ pour la substance
biologique à d~terminer.
On peut ~galement déterminer par ~rythroad-
sorption~ selon le même mode op~ratoire, des substances
15 fixées sur un support par tout autre moyen, par exemple
par adsorption passive ou par liaison chimique.
~ n a maintenant trouvé que la d~termination
de l'erythr~adsorption peut etre effectu~e sans mettre
en oeuvre une ~tape de dosage des substances lib~ré2s
20 par les globules rouges ayant ét~ adsorbé~ ou des subs-
tances introduites par l'exp~rime~tateur Cette détermi-
nation s'effectue d'une mani~re plus simple et permet u-
ne meilleure quantification que celle d~crite dans le
bre~et FR 80 15 293.
Ainsi, la pr~sente invention concerne un pro-
c~d~ de d~tection et/ou de dosa~e, par érythroadsorp-
tion, d'une substance biologique im~lobilisée sur un
~upport qui consiste ~ d~terminer llérythr~adsorption
après avoir, d'une part élimin~ les globules rouges n'-
30 ayant pas r~agi et d'autre part fix~ chimiquement sur
l'immunoadsorbant les globules rouges adsorb~s, unique-
Tnent par mise en oeuvre d'une ~olution d'un agent ixa-
teur ~
Sous son aspect le plus ~éneral, la presente
invention concerne un procede de dosage ~ualitatif etquantitat:if
~A
3a.
d'une substance biologique immobilisee sur un support,
caract~rise en ce qu'il consiste~ tl) ~ faire incuber la
substance immobilisee sur un support avec le produit de
couplage d'un ligand sp~cifique et d~un ligand capable
de reagir avec des erythrocytes; (2) ~ ajouter des
érythrocytes; (3) a mettre l'ensemble en contac~ avec une
solution d'un agent fixateur en séparant les erythrocy~es
non fixés sur ledit ligand, (4~ ~ mesurer l'érythroad-
sorption.
Sous un autre aspect le procede de dosage quali-
tatif ou quantitatif d'une substance biologique par
~rythroadsorption consiste ~ immobiliser sur un support
une substance ayant une affinite de fixation pour la
substance biologique a doser, a faire incuber ladite
substance immobilisee avec le milieu liquide contenant la
~ubstance biologique ~ doser, a faire incuber aprés
lavage, le milieu réactionnel résultant avec le produit de
couplage d'un ligand specifique et d'un ligand capable
de réagir avec des érythrocytes, a ajouter des erythrocytes
et a determiner llerythroadsorption spécifique par hemolyse
ou comptage, ledit procede etant caracterisé en ce que,
aprés avoir ajouté les erythrocytes, on met en contact
avec une solution d'un agen~t de fixation en separant les
érythrocytes non fixés sur le ligand~ avant la mesure de
2S l'erythroadsorption
Sou~ un autre aspect le presente invention
concerne un coffret pour le dosage d'une substance bio-
logique par ledit procédé caractérise en ce qu'il
comporte: des anticorps anti-substance biologique a doser
couples ~ un ligand susceptible de reagir avec des
erythorcytes; du tampon phosphate; une solution d'agent
fixateur; un support; et un support de reférence.
Sous un autre aspect le procéde consiste:
:35
1) ~ faire incuber, après lavage, la substan-
ce immobilisée sur un support avec le produit de cou-
plage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de
réagir avec des érythrocytes;
2) ~ ajouter des ~rythrocytes;
3) à plonger l'ensemble dans une solution d'~
un agent fixateur,
4) à mesurer l'é;rythroadsorption, apr~s avoir
retourné le support a~in de permettre l'~limination des
10 globules rouges n'ayant pas réagi.
A l'aide de la solution d'agent fixateur mise
en oeuvre dans le procédé de l'invention, on fixe chimi-
quement les ~rythrocytes adsorb(és à la surface du sup-
port sur lequel a été immobilisée la substance biologi-
15 que à mettre en évidence et on per~et l'élimination ra-
pide des érythrocytes n'ayant pas réagi. Ainsi il se
forme sur le support un tapis homogène d'~rythrocytes
adsorbés et ~ixés chimiquement, dont la densit~ est
fonction de la concentration de la substance à mettre
20 en évidance.
Par "agent ~ixateur" selon l'invention on dé~
signe tout a~ent capable de fixer les érythrocyte~ sur
le support tout en évitant l'h~molyse de ceux-ci.
On r~alise :Eréque~ment des fixations de cellu-
25 les vivantes en histologie pour l'~tude de celles-ci.
Les agents fixateu~s mis en oeuvre ~ cet ef~et doivent
être t~ls qu'ils permettent la ~ixation desdites cellu-
les avec un minimum de perturbations des structure~ cel-
lulaires (voir Histochemistry, PEARSE Churchill Living-
30 stone 3e ed. 1968 et "La Cellule" ~. DURAND et B. FAVARDCollec~ion Hexmann Paris 1967).
Dans le cas présent, il importe peu qu'il y
ait ou non des perturbations des structures cellulaires,
mais il est impéra-tif que la fixation, lorsqu'elle a
35 lieu, soit ~aite dans des condi-tions qui évitent l'hémo-
lyse des érythrocytes.
La plupart des agents fixateurs monofonction-
nels ou plurifonctionnels couramment utilisés dans le
domaine de l'histologie conviennent aux ~illS de l'in-
S vention, en particulier les aldéhydes, tels que le ~or-
maldéhyde, le glutaraldéhyde, ce dernier étant préf~ré.
La concentration de la solution en l'agent
fixateur doit être suffisante pour permettre la fixa-
tion chimique des érythrocytes ayant réagi, mais elle
10 ne doit pas atteindre la concentration qui provoquerait
une ~ixation en masse de tous les érythrocytes.
A titre d'exemple, on indiquera que, lorsque
l'agent fixateur est le glutaraldéhyde, la concentration
de la solution doit être comprise entre 0,1 et 0,5 % en
15 poids.
Le produit de couplage mis en oeuvre à titre
de réacti~ dans le proc~dé selon l'invention est le pro-
duit de couplage d'un ligand sp~cifique et d'un ligand
capable de réagir avec des érythrocytes
Par "li~and" spéci~ique on désigne dans la
pr~ésente description toute substance soluble qui peut
r~agir de façon spécifique avec la substance ayant une
affinit~ pour la substance biologique ~ doser ou avec
la substance biologique elle-même.
Par "substance soluble" on désigne dans la
pr~sente descri~tion toute substance soluble dans les
milieux couramment utilisés pour les ré~actions biologi-
ques. Il peut s'agir de milieux aqueux, tels que les
milieu~ physiologiques, ou des m~langes de milieux a-
30 queux et organiques
De plus~ le ligand spécifique mis en oeuvre
doit être tel que le produit de couplage ligand spéci-
~ique-ligand capable de réagir avec des érythrocytes
soit soluble en milieu aqueux.
Par "milieu aqueux", on d~signe selon l'in-
~3~
vention les milieux aqueux, tamponnés ou non, couram-
ment utilisés dans le domaine biologique, tels que les
solutions tampon phosphate, les solutions tampons conte-
nant un d~tergent, tel que le Tween*ou de la gélatine,
5 la s~rumalbumine bovine, la lactalbumine bovine et au-
tres substances habituellement mises en oeuvre dans de
tels domaines.
Les ligands sp~ci~iques r~pondant ~ une telle
d~finition sont notamment les anticorps, les antig~nes
lO macromol~culaires, les haptènes, les hormones et leurs
r~cepteurs et substances similaires. Parmi les ligands
sp~cifiques cités ci-dessus, on utilise le plus commu-
n~ment les anticorps et les antigènes.
Le ligand capable de r~agir avec de~ érythro-
15 cytes est une substance qui possède des sites de recon-
~aissance de d~terminants spécifiques des ~rythrocytes
ou des substances fix~es sur des ~rythrocytes.
A titre de tels ligands, on peut citer les
anticorps anti-globules rouges, l'avidine, la biotine
20 e~ produits analogues On peut ~galement utiliser une
lectine. Ainsi, le produit de couplage d'un ligand sp~-
cifique avec un ligand capable de r~agir avec des éry-
throcytes peut être le produit de couplage entre une
leotine et un ligand sp~ci~ique, tel que décrit dans le
25 brevet FR 80 11 470, publiée 27 Nov. 1981, no 2,482,981,
cite a titre de reférence. Le produit de couplage d'un
ligand specifique avec un ligand capable de reagir avec
des ~rythrocytes peut egalement être le produit de
couplage entre une albumine et un ligand specifique, tel
30 que decrit dans la demande de brevet FR 82 04 247, publiee
12 Mars.1982,no.2,523,311, cit~ a titre de reference.
La détermination de 1' rythroadsorption peut
être e~fectu~e soit visuellement, soit avec un photomè-
tre r~glé ~ 414 nm, une loupe binoculaire ou un micros-
35 cope invers~.
Le proc~d~ de l'invention est appropri~ pour
* marque de commerce.
~` t~ J 1~ IL
7.
mettre en évidence, soit de manière quantitative, soitde manière qualitative, toute substance immobilisée sur
un support d'une façon quelconque.
A titre de support, on peut utiliser n'impor-
5 te quel support insoluble plat, présentant ou non descavités, tel que par exemple des feuilles ou bandes,
des microplaques ou des tubes.
A titre de substance constitutive de tels
supports, on peut utiliser la cellulose et ses dérivés,
10 le polyacrylamide, les polyméthacrylates d'alkyle et
autres polym~res d'origine naturelle ou synthétique
ainsl ~ue le verre.
On utilise avantageusement des microplaques
pour immobiliser la substance biologique à doser, par
15 exemple des microplaques en polystyrène, ayant de~
puits en forme de U ou de V ou des puits ~ fond plat.
On peut également utiliser de3 tubes individuels ainsi
que des supports plats, par exemple des feuilles de ni-
trate de cellulose.
Par exemple, lorsque le support est une feuil-
le de nitrate de cellulose, :La substance à mettre en é-
vidence peut y être fixée ou déposée directement ou in-
directement, par exemple par empreinte après une élec-
trophorèse. De cette manière, on peut mettre en éviden-
25 ce des IgG humaines.
Le proc~dé de l'invention convient également
pour la détection des clônes d'hybridomes qui synthéti-
sent des anticorps spbci~iques des antigènes ayant ser-
vi à la fabrication dasdits hybridomes. Dans ce cas, on
30 pr~lève les surnageants des clônes, on fixe les surna-
geants sur le nitrate de cellulose en ~euille et on ré-
vèle la présence de l'anticorps en ajoutant un antigène
spécifiq~e marqu~ avec un ligand capAble de réagir avec
les érythrocytes
Selon le procédé de l'invention, on peut met-
~3~
~.
tre en évidence aussi bien une substance isol~e, qu'une
substance contenue dans un milieu impur, étant donné que
l'on met en oeuvre un réactif spéci~ique de la substance
à déterminer
S Selon une autre variante du procédé de l'~n-
vention la substance biologique à mettre en ~vidence
peut etre immobilisée sur le suppor-t d'une mani~re spé~
cifique, c'est-à dire par l'intermédiaire d'une substan-
ce ayant une a~finité de ~ixation pour la substance bio-
10 logique considérée.
Dans ce cas particulier, on immobilise tout
d'abord sur le support une substance ayant une a~finité
de ~ixation pour la substance biologique à doser, puis
on fait incuber cette substance ainsi immobilisée avec
15 le milieu liquide contenant la substance biologique à
déterminer; on peut alors effsctuer une détermination
~uantitative ou dosage. Sous cet aspect, le proc~dé de
l'invention concerne un perfectionnement au proc~dé de
détection et de dosage, par érythroadsorption d'une
20 substance biologique décrit dans la demande de brevet
FR 80 15 2g3.
Selon cette variante, le procéd~ de l'inven-
tion consiste :
1) ~ immobiliser sur un support une substance
25 ayant une a~inité de fixation pour la substance biolo-
gique ~ doser;
2) ~ faire incuber cette substance avec le mi-
lieu liquide contenant la substance biologique à doser;
3) ~ faire incuber, après lavage, le milieu
30 réac-tionnel résultant avec le produit de couplage d'un
ligand sp~ci~ique et d'un ligand capable de reagir avec
des ~rythrocytes;
4) à ajouter des ~rythrocytes;
5) ~ plonger l'ensemble dans une solution d'un
35 agent ~ixate~ur.
6) ~ mesurer l'érythroadsorption, après avoir
retourné le support afin de permettre l'élimination des
globules rouges n'ayant pas r~agi.
La substance ayant une affinité de fixation
5 vis-~-vis de la substance biologique ~ doser peut être
toute substance capable de se ~ixer de façon sp~cifique
avec ladite substance biologique. Par exemplej si la
substance biologique à doser est un anticorps, la subs-
tance ayant une af~inité de ~i~ation sera alors un an-
10 tigène et r~ciproquement.
La substance ayant une a~finité de fixationpour la substance biologique à doser est immobilisée
sur un support quelconque par des techniques classiques.
Les supports, par exemple ceux constitués de
15 ~euilles de nitrate de cellulose sur lesquels est fixée
la substance ayant une affinité de fixation pour la
substance biologique ~ doser constitue un moyen pour la
mise en oeuvre du procédé de l'invention.
Les premières étapes du procédé ci-dessus, à
20 savoir les ~tapes 1 à 3 sont réalisées conformément au
brevet ~ 80 15 293. Si besoin est, 1'homme de 1'art
pourxa se ré~rer à la description de ce brevet.
Cependant, on rappellera ci-après le mode o-
pératoire général pour le dosage des anticorps, sans
25 pour au~ant en limiter la portée de l'invention à ce
seul type de dosage.
Au cours de la première ~tape du proc~de de
l'invention on immobilise sur un support des antig~nes
(~g ) .
L'immobilisation des antigènes, qui consti-
tuent dans ce cas particulier la substance ayant une
affinité pour la substance biologique à doser, à savoir
l'anticorps, est réalisée par exemple par adsorption
passive ou, si nécessaire, par liaison covalente selon
35 la nature du support.
~P3~
1~ .
L'étape ~2) consiste en une incubation de 1'-
antigène immobilisé avec le liquide biologique conte-
nant l'anticorps (Ac) à doser, par exemple le sérum à
titrer. Après cette étape d'incubation, au cours de la-
5 quelle l'antigène (Ag) interagit avec l'anticorps ~Ac)correspondant, s'il est présent dans le sérum à tester,
on lave le suppor-t à l'aide d'une solution tampon, par
exemple une solution de tampon phosphate contenant é-
ventuellement un détergent tel que le "Tween" dénommé
10 ci~après PBS ou PBS Tween.
L'~tape (3) du procédé de l'invention consis-
te à incuber le support résultant de l'étape (2) avec
un produit de couplage ligand spécifique-ligand capable
de r~agir avec des érythrocytes. Dans ce cas particu-
15 lier, le ligand spéci~ique est un anticorps dirige con-
tre les immunoglo~ulines de l'espèce humaine ou animale
du s~rum à titrer. Après cette incubation, on lave le
systeme résul-tant comme d~crit ci-dessus pour éliminer
le produit de couplage nlayant pas réagi Puis, on ajou~
~O te des ~rythrocytes, qui sont adsorbés par le produit
de couplage seulement si le sérum à titrer contient 1'-
anticorps correspondant à l'antigène immobilisé, sinon
les érythrocytes ne sont pas fix~és et tombent au fond du
récipient
Quel que soit le mode d'immobilisation de la
substance biologique à d~terminer, on ajoute, selon un
mode de r~alisation préféré du proc~dé de l'invention,
suf~isamment d'érythrocytes pour remplir jusqu'à débor-
dement les puits de la microplaque utilisée comme sup-
30 port, a~in d'~viter la formation de bulles d'air dans
les puits de ladite plaque. On recouvre ensuite ladite
plaque, par exemple avec un film souple en matière plas-
tique. Ainsi revêtue, la microplaque est plongée dans la
solution d'agent ~ixateur, par exemple une solution de
35 glutaraldehyde, puis re-tournée le fond vers le haut. La
~3~
11 .
plaq~e flotte à la surface de la solution et le film
est retiré En opérant de cette ~açon, les globules
rouges non adsorbés sp~cifiquement sont ~liminés de la
pla~ue, parce qu'ils tombent dans le fond du récipient
5 contenant la solution de l'agent fixateur.
L'action de l'agent ~ixateur, tel que le glu-
tarald~hyde a deux e~ets :
1) les globules rouges trait~s par le gluta-
rald~hyde décantent plus rapidement que les globules
10 rouges non trait~s;
2) les globules rouges liés de ~açoll spécifi-
que 5ur la phase solide sont alors fix~s chimiquement
par le glutaraldéhyde, de sorte que, la stabilit~ est
augment~e.
Lorsque les globules rouges non liés sont é-
liminés, la plaque est ret~urnée e~ ~vitant que les bul-
les d'air p~nètrent dans les puits. Les puits, ayant re-
çu un échan$illon n~gatif, sont vides. Les fonds des
puits ayant reçu ltéchantillon positif sont recouverts
20 par un tapis de globules rouges dont la densit~ est
fonction de la concentration de la substance à doser.
Le r~sultat final peut etre lu ~ l'oeil nu,
avec un photombtre régl~ à 414 nm ou à l'aide d'une
loupe binoculaire ou d'un microscope invers~.
Lorsqu'on utilise un support plat pour l'immo-
bili~ation de la substance biologlque ~ mettre en ~vi-
dence, par exemple une ~euille, on le ~ixe dans le ~ond
d'un récipient avant l'additlon des ~rythrocytes et on
opère comme ci-dessus.
Pour la mise en oeuvre du proc~dé de l'inven-
tion, on met en oeuvre une suspension d'~rythrocytes
dont la concentration n'a pas une importance critiqueO
Il suf~it dans la pratique de choisir une concentration
capable de fournir l'~rythroadsorptioIl optimale. Grâce
35 ~ l'op~ration de retournement du support, qui constitue
~Z~3~7L.~1
12 .
une caractéristique essentielle du procéd~ de l'inven-
tion, les érythrocytes éventuellement en excès ne gê-
nent absolument pas la lecture, puisqu'ils sont ~limi-
nés. En général, des concentrations de l'ordre de 0,5 %
5 sont convenables. On peut, cependant, sans inconvénient,
utiliser des concentrations de 1 ou 2 %. On notera qu'-
en dessous de 0,5 %, on n'est pas sur que l'érythroad-
sorption soit optimale. Ceci constitue un avantage im-
portant, car on n'a pas besoin d'étalonner de façon
10 précise la valeur des concentrations des suspensions
d'érythrocytes.
Le procédé de l'invention permet d'étendre 1'-
utilisation de la technique d'~rythroadsorption aux mé-
thodes immuno-chimiques qui n~cessitent l'utilisation
15 d'un procédé de visualisation. Ainsi, les procédés d'au-
t~radiographie, de coloration enzymatique, de fluores-
cence peuvent être remplacés avantageusement par ce nou-
veau procédé qui consiste à visualiser une substance en
utilisant successivement un conjugué r~alisé en couplant
20 le ligand spécifique de la substance recherchée avec une
lectine ou un anticorps anti-~lobules rouges, et une
suspension de globules rouges.
La présente invention concerne également un
co~ret pour la d~tection d'une substance biologi~ue,
25 ledit co~iret comprenant :
- des anticorps anti-substance biologique ~
doser couplés ~ un li~and susceptible de r~-
agir avec des érythrocytes
- du tampon PBS;
- une solution d'agent ~ixateur;
- un support
- un support de r~f~rence
Le support de r~férence mis en oeuvre dans le
cof~ret selon l'invention est obtenu par le procédé de
35 détection de l'invention. Pour la r~alisation de ce sup-
13 .
port de r~férence on immobilise une substance biologi-
- que donnée avec le produit de couplage d'un ligand sp~-
cifique et d'un ligand capable de réagir avec des éry-
throcytes, on ajoute ensuite des érythrocytes de préfé-
5 rence frais et on plonge l'ensemble dans une solution
d'un agent de fixation, on retourne le support afin de
permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas
réagi et on obtient ainsi un support de référence, c'-
est-à-dire un support sur lequel sont ~ixés des éryth-
10 rocytes en une quantité correspondant à la substancebiologique donnée
Pour illustrer mais sans aucunement limiter
le perfectionnement selon l'invention, on donne les e-
xemples ci-après :
15 EXE~PLE 1 : Détection qualitative d'IgG humaines adsor-
b~es sur une feuille de nitrate de cellulose.
On a dépos~ 2/ul d'un tampon borate, 0,1 ~ pH
8,0 contenant des concentrations variables d'IgG humai-
nes (de 100/ug/ml à l/ug/ml) sur une feuille de nitrate
20 de cellulose. Après évaporation (15 minut0s à tempéra-
ture ambiante) et saturation avec de la g~latine, la
feuille de nitrate de cellulose a été incub~e avec un
conjugué réalisé en couplant des anticorps anti-IgG hu-
maines avec des anticorps antiglobules rouges. Deux heu-
25 res plus tard, la feuille a été lavée, attach~e physi-
quement au fond d'un récipient. Le récipient a ensuite
ét~ rempli avec une suspension (0,5 %) de globules rou-
ges de mouton. Après une heure, les globules rouges ont
~té ~limin~s en renversant doucement le récipient dans
30 une solution pbysiologique tamponnée contenant 0~2 % de
glutaraldéhyde. Quand tous les globules rouges ont été
~liminés~ on a retourn~ la feuille. De cette façon, il
a été possible de voir un dépôt de globules rouges lors~
que la quantité d'IgG humaines fixées sur la feuille de
35 nitrate de cellulose était égale ou supérieure à 2 ng.
~P3~
14.
EXEMPLE 2 : D3sage d'IgE humaines
Grâce ~ ce procédé d'élimination des érythro-
cytes n'~yant pas réagi, on peut ~tablir des courbes
d'étalonnage en utilisant des quantités données d'anti-
S corps et d'antigènes~ telles que celles représentée surla figure annex~e, sur laquelle on a port~ en abscisses
la concentration en IgE en Ul/ml de solutions connues
d'IgE et en ordonnées le pourcentage d'érythroadsorp~
tion par rapport au plateau 100 % défini pour une con-
10 centration en IgE de 100 UI/ml.
Pour établir cette courbe, on a procéd~ de lamanière suivante : les puits d'une plaque à fonds plats
ont ~t~ remplis par 100/ul d'anticorps anti IgE (l/ug/
ml). La plaque a ~té incubée pendant 2 heures à 37~C et
15 une nuit à 4~C, puis lav~e avec du PBS contenant 0,1 %
de Tween 20. Les puits ont reçu alors 100/ul d'une dilu-
tion du sérum de r~f~rence contenant une quantité connue
d'IgE. La plaque a ensuite été incubée 4 heures à 37C
et 1 nuit à 4C. Après l'incubation, la plaque a été de
20 nouveau lavée et chaque puits à reçu 100/ul d'une solu-
tion d'anticorps anti IgE couplés avec des anticorps
anti-globules rouges de mouton. Après l'incubation (2
heures à 37C) et lavage de la plaque, les puits ont é-
t~ remplis par 400/ul d'une suspension de globules rou-
25 ges de mouton (0,5 %). Une heure plus tard, les globulesrouges non adsorh~s de ~açon sp~ci~ique ont été élimin~s
selon le mode op~ratoire dé~crit dans l'exemple 1 et 1'-
absorption de la lumière ~ 414 nm a été mesurée avec un
photom~tre Titertek Multiskan MC. Les puits ayant re~u
30 la solution d'IgE ~ 100 UI/ml ont servi de réf~rence
(100 % d'~rythroadso.rption) pour calculer le pourcenta-
ge d'erythroadsorption.
EXEMPLE 3 :
Avec une bandelette de nitrate de cellulose
préparée selon le proc~dé d~crit à l'exemple 1, on peut
3'~
15.
doser les IgG présentes dans un ~chantillon de s~rum.
L'intensit~ des taches d'érythrocytes ayant r~agi avec
les anticorps anti IgG-lectine est comparée ~ celles
pr~sentes sur la bandelette de r~férence et permet la
5 d~tection et le dosage des IgG pr~sentes dans ledit ~-
chantillon.
