Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
~'r2~33'733
,
La présente invention a pour objet un nouveau composé marqué au
tritium apparenté aux rétinoldes, sa préparatlon et son application notamment
dans la détermination de l'affinité des rétino~des pour leur recepteur
cellulaire et/ou dans la déterminatlon de la teneur cellulaire en récepteur
correspondant.
On sait que les rétinoides constituent une classe connue de composés
qui agissent notamment sur la prolifération et la différenciation de nombreux
types de cellules ; voir par exemple B.A. Pawson et Coll., Journal of
~ledicinal Chemistry, Vol.25, n11 pages 1269-1277 (1982).
Les rétinoIdes ont été utilisés en particulier dans le traitement de
diverses maladies dermatologiques dans lesquelles un déréglement des
mécanismes de contrôle de la prolifération et de la différentiation des
cellules épidermiques est impliqué ; voir par exemple l'ouvrage "Update :
Dermatology in General ~ediclne", Edited by Thomas B. Fitzpatrick et al.,
(McGraw-Hill Book Company), publié en 1983, en particulier le chapitre de
D.B. Windhorst et al., The Retinoids, pages 226-237.
Le mode d'action des rétino;des est encore mal connu. Il a toutefois
été montré qu'il existe dans les cellulas un récepteur appelé c~RABP (cellular
Retino;c Acid-Binding Protein) spécifique des rétino~des possédant un
groupement acide.
Ia détermination de la constante d'affinlté (Kd) pour la cRABP, d'un
rétino~de possédant un groupement acide, constitue un moyen particulièrement
rapide d'évaluation de l'activité biologique potentielle dudit rétino~de.
Plusieurs méthodes expérimentales permettent de déterminer la
constante d'affinité d'un ligand pour son récepteur. On peut en particulier
opérer par une méthode directe si le ligand considéré est marqué
radioactivement, ou encore par compétition avec un ligand radioactif si le
ligand considéré n'est pas marqué radioactivement.
Un bon ligand radioactif doit d'une part présenter une affinité
élevée pour son récepteur et d'autre part, présenter une faible fixation sur
toute autre molécule. En outre, il doit être suffisamment stable pour
permettre une utilisation co Dode.
Dans le cas des rétinoIdes acides, le ligand radioactif généralement
utilisé est le plus souvent l'acide rétino;que tritié, soit en position 2
(J.Labelled Compounds and Radiophar~aceuticals XVIII, p.1099, (1980) soit en
position 4 (demande de brevet allemand n3.142.975).
L'acide rétino~que présente certes une excellente affinité pour le
cRABP, avec une fixation non spécifique faible, mais la molécule présente
l'inconvénient de se dégrader rapidement, par radiolyse, oxydation et
photolyse.
JT/AA - BR.74924
. ~, .
..
- 2 -
On a maintenant découvert que l'acide 2-(5,6,7,8-
tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)~6-benzo [b~ -thio-
phène-carboxylique tritié constitue un nouveau ligand
radioactif qui présente une excellente affinité pour la
cR~BP, avec une fixation non spécifique faible. De plus, ce
nouveau ligand est très stable et peut etre obtenu avec une
haute activité spécifique, ce qui le rend particulièrement
utile pour la mesure de l'affinité des rétinoides pour le
cRABP.
La présente invention a ~onc pour ob3et l'acide 2-
(5,6,7,8 tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl -2-naphtyl)-6-benzo
[b] thiophène-carboxylique marqué au tritium et en
particulier dont le groupement méthylidyne en position 3 du
groupement tétrahydronaphtalène est marqué au tritium.
Le produit marqué au tritium décrit
peut, en outre, etre sous la forme de mélanges avec le même
produit non marqué.
~ 'invention a notamment pour objet un nouveau
ligant radioactif, tel que défini ci-dessus, ayant une
activité spécifique supérieure à 1 Ci~mmole et de préférence
au moins egale à 2 Ci/mmole, soit environ 75 GBq/mmole.
D'une ~açon générale, le produit marqué peut être
obtenu selon tout procédé utilisant les méthodes connues en
soi pour marquer les composés chimiques avec le tritium,
comme par e~emple un procédé analogue à celui décrit dans le
Journal of Labelled ~ompounds and Radiopharmaceuticals, vol.
XXII, pp 843-850 (1985).
L'invention a également pour objet un procédé de
préparation du nouveau ligand radioactif tel que défini ci-
dessus. Ce procédé est principalement caractérisé par lefait que l'on prépare un acide 2-(3-halogéno-5,6,7,8-
tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo Cb] thio-
phène-carboxylique e-t qu'on le soumet à l'action d'un agent
réducteur tritié.
~ .
-
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.. . : , :
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- : .'.:. ' : ' ' '
` . ~Z~37~3
L'agent reducteur est par exemple de l'hydrogène
tritié utilise en présence d'un catalyseur convenable,
notamment un catalyseur à base de palladium.
La reduction du dérivé 3-halogéné est effectuée de
preference à température et sous pressiorl ambiantes, par
exemple à 15-30 C sous une pression de 1 bar (soit environ
105 Pa).
Le dérivé halogéné utilisé comme produit de départ
est de préférence le dérivé bromé.
L'acide 2-(3-halogéno-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-
tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo ~b~ thiophène-carboxylique
peut lui-même êtxe préparé à partir de l'acide 2-(5,6,7,8-
tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo ~b] thio-
phene-carboxyli~ue par l'action d~'un agent d'halogén~tion
(en particulier de bromation). Par exemple, le dérivé bromé
peut être obtenu par l'action d'un agent de bromation tel
que la N-bromo-succinimide dans le diméthylformamide à une
température réactionnelle pouvant aller de 0 à 50 C et de
preference de 0 à 20 C.
L'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-
2-naphtyl~-6-benzo Cb~ thiophène-carboxylique est un produit
connu (appelé ci-après composé A) et peut être obtenu selon
le procédé décrit par exemple dans la demande de brevet
français n 85.13747 (2.570.377) déposée le 17 septembre
25 1985.
L'invention a également pour objet, à titre de
produit intermédiaire
.. _, , .. , . . .... , . .. ._ . . . .. , _ _ _ . _ . _ . . . . . . ... . .... _ . . .
.
.' . '-, :
- : : ~
'733
obtenu dar.s le procédé décrit ci-dessus, l'acide 2-(3-halogéno-5,6~7,8-tétra-
hydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b~ thiophène-carboxylique, et en
particulier le dérivé bromé.
Le ligand radio-actif de l'invention peut également etre obtenu au
départ de l'acide 2-(5,~,7,8-tétrahydro-5,5,~,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-
benzo ~b] thiophène carboxylique par échange isotopique avec de l'eau tritiée
en présence de ~latine et d'acide acétique à une température allant de
préférence de 2~ à 150C. Dans ce cas, l'échange isotopique se fait
préférentiellement avec les protons aromatiques du ligand.
L'invention a également pour obJet l'utilisation de l'acide
2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo ~b~ thiophène-
carboxylique tritié, en particulier tritié en position 3 du groupement
tétrahydronaphtalène comme marqueur radioactif notamment dans la détermination
de l~affinité, de la présence ou de la teneur des rétino~des à groupement
carboxylique et/ou dans la quantification du récepteur cRABP desdits
rétino;des.
Par exemple, le marqueur radioactif de l'invention peut être utilisé
lors de la purification du récepteur cRABP par les méthodes classiques de
chromatographie d'échange d'ions ou d'exclusion sous basse ou haute pression:
il suffit d'ajouter à l'extrait tissulaire utilisé comme produit de départ une
quantité déterminée du ligand radioactif. Le récepteur cRABP se trouve ainsi
lui-même marqué et on peut facilement repérer sa présence ou son absence dans
une fraction donnée.
La connaissancé des courbes de fixation sur le récepteur permet
également l'utilisation du marqueur de l'invention dans la quantification du
récepteur.
Le marqueur radioactif de l'invention peut également etre utilisé
dans la caractérisation d'anticorps contre le composé A, ces anticorps
~obtenus selon les méthodes classiques d'anticorps anti-haptènes) étant
eux-memes utilisables dans la détermination du produit A fixé ou non sur son
récepteur.
Le marqueur radioactif de l'invention peut aussi être utilisé dans
l'étude du mécanisme d'action intracellulaire et du métabolisme général du
composé A.
"'`~ 'i ' '
.~ . - : . ~ .~, : , -
,
: - : .
3~33
- 3a -
La présente invention sera mieux comprise a la
lecture de la description qui va suivre faite avec référence
aux dessins suivants:
- la figure 1 est un,graphique où sont représentées
en abscisses les concentrations initiales du ligand étudié,
et en ordonnées, les concentrations à l'équilibre du
complexe ligand-récepteur;
- les figures 2 à 7 sont des graphiques où sont
représentées en abscisses les concentrations croissantes du
ligand froid étudié (en moles/litre), et en ordonnées la ,
fixation du ligand radioactif ~en ~ du maximum).
Les exemples suivants illustrent l'invention sans
toutefois la limiter.
'~
. . . .
...
-4 - ~Z93 ~3~
EXEMPLE 1
Acide 2-t3- H -5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-
6-benzo ~b~ thiophènecarboxylique.
a) Un mélange dudit acide non tritié (500 mg ; 1,37 mmole) et de
N-bromosuccinimide (302 mg ; 1,70mmole) dans 15 ml de DMF est agité à
température ambiante pendant 24 heures, sous atmosphère d'azote. Le mélange
obtenu est ajouté à 30ml d'acide chlorhydrique N et le produit est extrait
avec de l'éther éthylique (130ml). La phase éthérée est séparée, lavée à
l'eau, séchée sur sulfate de magnésium anhydre, et les solvants évaporés sous
pression réduite. On obtient ainsi un solide brun pâle que l'on recristallise
deux fois dans un mélange iso-octane/tétrahydrofuranne (50:50) pour obtenir
380mg (63%) d'acide 2-(3-bro~o-5,6,7,8J-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-
naphtyl)-6-benzo ~b~ thiophènecarboxylique qui fond à 272-275C.
Analyse élémentaire:
Calculé: C: 62,30 H: 5,23 Br: 18,02 0: 7,22 S: 7,23
Trouvé: 62,49 5,06 17,9h 7,44 7,77
La position de l'atome de brome est confirmée par analyse du spectre
de proton du composé ci-dessus, et comparaison avec le spectre RM~ du
produi~ non bromé.
b) Le composé bromé obtenu (25mg ; 0,05mmole) est dissous dans 2ml
de dioxanne sec. IOmg de palladium sur charbon (10%) et 20 microlitres
(0,14mmole) de triéthylamine sont a~outés. Le mélange résultant est agité à
température ambiante, sous atmosphère de tritium (pression environ 1 bar),
pendant 20 heures. Le catalyseur est éliminé par ~iltration et les solvants
évaporés sous vide.
Le résidu est dissous dans un mélange de méthar.ol et d'acétate
d'éthyle, puis les solvants sont évaporés sous pression réduite. Cette
procédure est répétée deux fois. Le résidu obtenu est alors dissous dans un
minimum de tétrahydrofuranne et purlfié par chromatographie sur plaque
préparative (plaque de silice 0,2 x 20 x 20cm, éluant : mélange dichloromé-
thane/méthanol 9:1). La bande fluorescente sous irradiation UV à 366nm est
recueillie.
Ie produit final est dissous dans 10ml de méthanol. Sa pureté est
vériflée par chromatographie sur couche mince (plaque de silice, éluant comme
ci-dessus). Une seule tache est apparente sous irradiation UV (254 et 366nm)
et lors du comptage bêta. Par HPLC (phase inverse, colonne Zorbax* ODS,
éluant : mélange acétonitrile/solutlon d'acide acétique à 0,02% dans l'eau
95:5), un seul pic est détecté par UV ou en utilisant un détecteur bêta.
L'activitë spécifique déterminée par spectrométrie de masse est
environ 300GBq/mmole (8,0 Ci/m~ole).
* (marque de commerce)
, - , . .~ .,
: : , . .
`~` _5 _ ~ ~ ~3 7~3
L'activité totale obtenue, mesurée par comptage a~1 scintillateur
liquide est 4.3mCi.
Caractéristiques de la fixation du composé de l'exemple 1 sur le
récepteur soluble cRABP.
.
La fixation du composé revendiqué avec la c~BP a été caractérisée
par des expériences de saturation. La fixation totale (non spécifique +
spéciflque) ~cou~be a), est obtenue par incubation de concentrations
croissantes (jusqu'à un maximum de 50nM) du composé revendiqué avec une
quantité constante (0,3ml) d'un homogénat de test:Lcules de rat (organe riche
en cRABP). La fixation non spécifique du composé tritié est déterm~née en
parallèle, par la mesure de la fixation avec des concentrations croissantes du
ligand radioactif en présence d'un large excès (1~M) d'acide rétino~que
(courbe c). Un temps d'incubation de deux heures est nécessaire à
l'établissement de conditions ~léquilibre.
Une fois l'équilibre atteint, le complexe cRABP-ligand tritié est
séparé du ligand non lié par filtratlon sur colcnne de gel d'exclusion
Sephadex G 25 (colonnes Bio-Rad*econo, 0,5x20cm): 18 complexe est élué (pic
d'élution à 2,5ml), tandis que le ligand non lié est retenu en totalité sur la
colonne. Il en résulte une séparation totale entre produit lié et non lié.
L'éluticn est faite directement dans des tubes à scintillation et la
radioactivité est mesurée par comptage.
Les résultats ainsi obtenus sont analysés par régression
non-linéaire utilisant comme modèle lléquation de Clark: (A.J. Clark, The mode
of action of drugs on cells; A. Arnold and Co., London, 1933).
Sur la figure 1, on a représenté ren abscisses les concentrations
initiales du ligar.d étudié, et en ordonnées, les concentrations à l'équilibre
du complexe ligand-récepteurl.
La différence entre les courbes a (fixa~ion totale~ et c (fixation
non spécifique) donne la courbe de fixation spécifique (courbe b). L'analyse
de cette courbe permet d'obtenir la constante de dissociation à l'équilibre,
(Kd) qui est la concentration de produit nécessaire pour saturer 507 du
récepteur soluble. Cette constante est une mesure de l'affinité du ligand pour
son récepteur, le Kd étant inversement proportionnel à l'affinité, (plus le Kd
est faible, plus l'affinlté est grande). La courbe de fixation totale (a) est
analysée de la même manière, après introduction d'une composante linéaire (la
fixation non spécifique) au modèle de regression; la courbe de fixat~on
spécifique obtenue de cette manière (courbe b) est en parfait accord avec
celle obtenue par différence.
Cette analyse donne une valeur de Kd de 2,7+0,5nM. La fixation
spécifique est saturable et réversible. La fixation non spécifique est
~A~ ~ * ( marque de commerce)
.
: ~ .
-6 - ~ 3~
linéalre et non saturable dans la gamme de concentrations utilisées, et
représente moins de 10% de la fixation totale. Dans les mêmes conditions, la
valeur du Kd de l'acide rétinolque est 2+0,8nM, la fixation non spécifique
représentant approximativement 25% de la fixation totale.
Compar on avec l'acide rétinoIque tritié.
Les figures 2 à 7 correspondent à des expériences de compétition et
montrent la similitude des caractéristiques de la ~ixation de l'acide
rétino~que9 et du composé de l'exemple 1.
Ces expériences de compétition sont effectuées de la façon suivante:
on mélange une quantité fixe de ligand radioactif (correspondant sensiblement
à la demi-saturation de la quantité fixe de récepteur qui sera utilisée), avec
des quantités croissantes de ligand froid ~non rad:Loactif). Puis on a~oute le
récepteur; et on détermine la quantité de ligand radioactif fixée à
l'équilibre (en % de la fixation initlale en l'absence de ligand froid, pour
la quantité de récepteur considéré).
Dans les figures 2 à 7, on a porté en abscisses les concentrat-lons
croissantes du ligand froid étudié (en moles/litre), et en ordonnées la
fixation du ligand radioactif (en % du maximum). Les ligands étudiés sont les
suivants:
Figure 2: ligand radioactif: composé de l'exemple 1
ligand froid: acide r~tino~que
Figure 3: ligand radioactif: acide rétinoique tritié
ligand froid: le même que pour la figure 2
Figure 4: ligand radioactif: composé tritié de l'exemple 1
ligand froid: meme composé mais non marqué (composé A)
Figure 5: ligand radioactif: acide rétinolque trltié
ligand froid: le même que pour la figure 4
Figure 6: ligand radioactif: composé de l'exemple 1
ligand froid: acide p- ~ E)-2-(5 9 6,7,8-tétrahydro-
5,5,8z8~tétraméthyl-2-naphtyl)-propèny~ -benzoïque
(Hoffmann-La Roche), appelé ci-après composé B
Figure 7: ligand radioactif: acide rétinoique tritié
ligand froid: le même que pour la figure 6.
A partir des courbes de compétition des figures 2 à 7, on détermine
dans chaque cas la IC50 (concentration de ligand froid réduisant l'attachement
du ligand tritié de 50%). Cette valeur IC50 permet de calculer dans chaque cas
la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) pour le ligand froid.
On a trouvé les valeurs suivantes:
Figure 2: Kd=4nM+19%
Figure 3: Kd=4nM+44%
JT/AA - BR.74924
.
, ~ .
- :
~j , .~.
_7 - ~9~33
Figure 4: Kd=6nM+30%
Figure 5: Kd=6nM~19%
Figure 6: Kd=16nM+58%
figure 7: Kd=20nM+24%
Les figures 2 et 3 montrent les courbes de compétition de l'acide
rétinolque froid avec le composé de l'exemple 1 (figure 2) et avec l'acide
rétino;que tritié (figure 3). Les constantes de dissociation calculées dans
l'un et l'autre cas sont les mêmes, ce qui suggère que les deux ligands
radioactifs ont des spécificités de fixation similaires.
De la même manière, on voit (figures 4 et 5) que les valeurs de Kd
obtenues pour le composé A, en utilisant l'un ou l'autre ligand marqué, sont
les mêmes.
Cela est également vérifié dans le cas du composé B (figures 6 et
7).
En conclusion, dans tous les cas étudiés ci-dessus, les Kd calculés
sont indépendants du ligand tritié utilisé, ce qui montre que ces ligands se
lient au même récepteur avec des spécificités semblables, et que l'on peut
remplacer l'un par l'autre pour la détermination de la fixation des rétino~des
sur la cRABP.
JT/AA - BR.74924
..; ~ : ,
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