Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
~,\_ ;WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722
1
FRANGhIENTS D'ADN CODANT POUR UN MECANISME DE RESISTANCE AUX BACTÉRIOPHAGES
L'Invention est relative au clonage de
séquences d'ADN portant des gènes codant pour des méca-
nismes de résistance aux phages chez les bactéries, en
particulier les bactéries lactiques.
Certaines des bactéries responsables des fer-
mentations sont très sensibles à l'attaque par les bacté-
riophages, ce qui, étant donné l'importance des fermenta-
tions lactiques en industrie agro-alimentaire, pose un
problème économique considérable. De nombreuses tentatives
ont en conséquence été faites depuis des années, pour
apporter une solution à ce problème.
I1 a dans un premier temps étë proposé
d'utiliser pour la fermentation, des mutants naturels ou
obtenus par mutagénèse, et sélectionnés pour leurs pro
priétés de résistance aux bactériophages. Cette approche
est toutefois considérablement limitée par le fait que,
dans la plupart des cas, ces souches possèdent d'autres
caractéristiques qui sont défavorables à leur utilisation,
et qui sont, par exemple, une croissance très lente, ou
bien la production de mêtabolites qui altèrent les quali-
tés organoleptiques du produit fini. En outre, il est fré-
quent qu'on observe, dans les conditions d'utilisation
industrielle de ces souches, une réversion au phénotype
sauvage, et donc une perte de résistance, au l'apparition
d'une sensibilité à d'autres types de phages (CASSON et
RAVIES, dans Advances in the Microbiology and Hiochemistry
of Cheese and Fermented Milk, eds Ravies F.L. & Law 8,
127-151, Elsevier Applied Science Publishers (1984)j. Ceci
a pour conséquence le fait qu'un très petit nombre de
souches mutantes est effectivement utilisé industrielle-
ment.
Toutefois, l'étude de ces souches a permis de
mettre en évidence l'existence de plusieurs mécanismes
différents de résistance aux phages.
WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCI~/FR91 /00722 _ _,.
2
Trois mécanismes principaux de résistance aux
phages ont été ainsi décrits chez la souche résistante
Lactococcus lactis ME2 [KLAENHAMMER, J. Dairy Sci., ~,
3429-3443, (1989)].
- Dans l'un d'entre eux, dénommé "mécanisme
d'interférence. avec l'adsorption", le produit du gène de
résistance retarde l'absorption du phage sur la bactérie.
- Un deuxième mécanisme dénommé °mécanisme de
restriction/modification" (R/M), fait intervenir une endo
nucléase de restriction qui dégrade l'ADN du phage dès son
entrée dans la bactérie. Toutefois, cette endonucléase est
associée à une méthylase, dotée de la même spécificité ;
il s'ensuit que certains ADN phagiques modifiés par la mé-
thylase peuvent échapper à l'action de l'endonucléase, et
donner naissance à des particules infectieuses. Plusieurs
systèmes R/M de spécificité différente ont été décrits ;
ces systèmes ont une efficacité variable . la fréquence
d'apparition de particules virales renfermant un ADN modi-
fié est comprise entre 10-1 et 10"8. Dans les conditions
de culture industrielle, où lors d'une infection, appa-
raissent de très nombreuses particules virales,
l'efficacité de ce système n'est donc pas suffisante. Tou-
tefois, lôrsque plusieurs systèmes R/M sont présents dans
une même bactérie, la protection conférée parait plus
efficace [JOSEPHSEN et KLAENHAMMfER, Plasmid, ~, 71-75
(1989)1.
~.es g~aes codant gour les m~can~,~~es de ty~t3
R/M connus ~usqu' à présent aat Cous une 3,GC~llisat~,on p~,as-
midique.
- Le troi~idme tape d~ mécanisme de défense
qui a été décrit est dénommé Nmécanisme d'infection abor-
tiveN (Abi). Chez les souches bactériennes qui possèdent
ce type de mécanisme, l'adsorption des phages est normale,
mais la multiplication des phages pour donner naissance â
de nouvelles particules virales ne se produit que dans
quelques cellules. En outre, les phages qui en résultent
WO 92/05260 ~ ~ ~ ~- ~ ~ ~ PGT/FR91/00722
3
ne sont pas capables d'accomplir un cycle lytique complet
lorsqu'ils infectent une nouvelle Cellule.
Tous les mécanismes de type Abi décrits
jusqu'à présent sont codés par des gènes portés par des
plasmides [McKAY et al, Appl. Environ. Microbiol., ~,7, 68
74 (1984)] ; [KLAENHAMMER et SANOZKY, J. Gen. Microbiol.
1531-1541 (1985)] ; [GRUTIER et CHOPIN, Appl.
Environ. Microbiol. ~, 923-927 (1987)] ;
[DALY et
FITZGERALD dans Streptococcal Genetics, eds Ferretti, J. &
Curtiss R. III ; 259-268 ASM, Washington D.C. (1987)] ;
[LAIBLE et a'1. J. Dairy Sci. ~, 2211-2219 (1987)] ;
[MURPHY et al., Appl. Environ. Microbiol. ,~,, 1951-1956
(1988)] ; [JARVIS, Appl. Environ. Microbiol. ,5,~,, 777-783
(1988)] ; [FROSETH et al., J. Dairy Sci. ~, 275-284
(1988)].
Le gène codant pour un mécanisme de résistance
de type Abi, dénommé Hsp, qui est porté par le plasmide
pTR2030 a été cloné et séquencé [HILL et al., Appl.
Environ. Microbiol., ~, 2255-2258 , (1990)]
Les modes d'action des mécanismes de résis-
tance du type Abi n'ont pas encore été élucidés ; il appa-
raît toutefois que l'infection abortive peut résulter de
plusieurs systèmes ayant des mécanismes d'action diffé-
rents, actifs sur différents phages, et à différents
niveaux sur la prolifération virale. I1 a par exemple été
montré que le plasmide pTR2030 est plus actif sur les
phages appartenant au groupe dit des "petits phages à t8te
isométrique" que sur ceux appartenant au groupe des
"grands phages à tâte isométrique" ou au groupe'des phages
"à tâte allongée".
Des observations du même type, concernant une
résistance spécifique à l'attaque par un groupe de phages,
ont été faites sur d'autres plasmides portant des gènes
codant pour des mécanismes de résistance de type Abi [DALY
et FITZGERALD, (1987) ; FROSETH et al., ((1988) ; MURPHY
WO 92/05260 PCT/FR91/00722
. ~(~~.~~J~1
4
et al., (1988)(publications citêes plus haut)] ; STEELE et
McKAY, Plasmid, ~, 32-43 (1989)].
D'autres plasmides, par exemple le plasmide
pIL105 [GAUTIER et CHOPIN, App. Environ. Microbiol., 5~,
923-927 (1987)], et pAJ1106 [JARVIS, App. Environ.
Microbiol. ,5~ 77-783 (1988)] codent toutefois pour des
mécanismes de résistance Abi qui ont une spécificité dif-
férente des précédents et sont efficaces à la fois sur les
phages "isométriques" et les phages "à tète allongée".
D'autres observations montrent également qu'il
existe plusieurs systèmes de résistance de type Abi ; des
expériences d'hybridation entre différents plasmides Abi
ont suggéré que des loci différents êtaient impliqués
[STEELE et al., Appl. Envirôn. Microbiol., ,5"~, 2410-2413
(1989)]. I1 a également été observé que la résistance aux
phages était augmentée lorsque plusieurs séquences d'ADN
codant pour des mécanismes Abi étaient associés.
I1 a été proposé d'utiliser des plasmides
codant pour des mécanismes de résistance aux phages pour
transférer cette résistance chez des souches utilisées
dans l'industrie. Par exemples, des souches bactériennes
contenant le plasmide auto-transférable pTR2030 ont été
utilisées avec succès en fermentation industrielle, et ont
montré une bonne résistance à l'attaque par les bactério-
phages, ce qui montre l'intérêt réel des gènes de résis-
tance du type Abi.
Toutefois, le plasmide PTR2030, comme la plu-
part des plasmides de résistance aux phages décrits dans
l'art antérieur, et dont l'utilisation a été suggérée, est
un plasmide "naturel" présent dans des souches résistantes
et transmis à d'autres souches par conjugaison bacté-
rienne. L'utilisation de tels plasmides comporte certaines
limites ; il faut que ces plasmides soient transférables,
ou qu'il puissent être associés à un plasmide mobilisa-
teur ; il faut également qu'ils soient stables dans la
bactérie-h8te et qu'ils ne portent pas de gènes modifiant
PCT/FR91 /00722
~'~:~ WO 92/05260 '~ ~ ~i~ ~ ~
son phénotype de façon défavorable ; il faut en outre,
pour pouvoir associer chez une même bactérie, différents
mécanismes de résistance aux phages, que les plasmides
concernés soient compatibles entre eux. Enfin, cette tech-
5 nique ne permet pas le transfert de gènes de résistance
qui seraient portés, non par l'ADN plasmidique, mais par
l'ADN chromosomique. I1 est donc particulièrement souhai-
table de cloner les gènes responsables de ces mécanismes
de résistance afin de pouvoir les insérer à volonté dans
des vecteurs recombinants appropriés, compatibles entre
eux et compatibles avec la bactérie hôte que l'on sohaite
transformer.
La présente Invention s'est fixé pour but la
mise en évidence et le clonage de séquences d'ADN codant
pour des mécanismes de résistance à l'attaque par des bac
tériophages, et l'obtention de plasmides recombinants,
comprenant ces gènes et permettant leur transfert et leur
expression dans des souches bactériennes impliquées dans
des fermentations industrielles.
La présente Invention a pour objet des frag
ments d'ADN comprenant au moins un gène codant pour un
mécanisme de résistance aux bactériophages, de type Abi,
caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence homo
logue de celle de tout ou partie d'au moins un fragment
choisi dans le groupe constitué par
- le fragment codant pour le mécanisme de
résistance dénommé Abi 416, dont la séquence figure dans
la liste des séquences en annexe sous le numéro
SEQ ID NO : 1.
Ce fragment représente une portion d'un frag-
ment ~I-,EçQRI de 2 kb environ, du plasmide pIL353,
lequel fragment est cloné à partir de l'ADN de L. lattis
ssp lattis IL416.
- l''insert de 9,4 kb environ, du plasmide
pIL352, lequel insert est cloné à partir de l'ADN total de
la souche L. lattis ssp cremoris IL420, et comprend au
WO 92105260 PCT/FR91/00722
~~~'~.~!31
6
moins _un gène codant pour le mécanisme de résistance
dénommé Abi 420.
- le fragment dont la séquence partielle
figure dans la liste des séquences sous le numêro
SEQ ID NO . 3 ;
- le fragment dont la séquence figure dans la
liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 4 ;
- le fragment dont la séquence figure dans la
liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . S.
Les séquences SEQ ID NO . 3, SEQ ID NO .
4, et SEQ ID NO . 5, constituent des cadres ouverts de
lecture respectivement dénommés ORF2, ORF3 et ORF1.
L'Invention englobe également l'insert de 5,7
kb environ du plasmide pIL618, dont la séquence partielle
figure dans la liste des séquences en annexe sous le
numéro SEQ ID NO : 2, et dont les séquences
SEQ ID NO . 3, SEQ ID NO . 4, et SEQ ID NO . 5, représen-
tent des segments. Cet insert de 5,7 kb est cloné à partir
de l'ADN du plasmide pIL105 de la souche L. lactis spp.
cremoris. IL964, et comprend au moins un gène codant pour
le mécanisme de résistance dénommé Abi 105.
Au sens de la présente Invention, on entend
comme séquence homologue, toute séquence ne différant des
séquences conformes à l'Invention que par la substitution,
la délétion ou l'addition d'un, petit nombre de bases, à
conditions bien sflr que la séquence ainsi modifiée
conserve les propriétés fonctionnelles essentielles des
séquences de l'Invention.
Dans ce cadre, on considèrera en particulier
comme homologues deux séquences nucléotidiques qui, du
fait de la dégénérescence du code génétique, codent poux
un méme polypeptide.
La présente Invention englobe également tout
segment d'ADN de plus de 20 pb, s'hybridant avec l'une
"..W0 92/05260 ~ ~ PCT/FR91/00722
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des séquences codant pour des -mécanismes Abi telles que
identifiées ci-dessus, ce qui comprend en particulier des
sondes d'acide nucléique obtenues à partir desdites
séquences, ainsi que les fragments d'ADN de bactéries lac
s tiques clonés en utilisant lesdites sondes.
Les séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3,
SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 ont été comparées avec la
séquence codant pour le mécanisme Hsp, décrite par HILL et
al. [App. Environ. Microbiol., 56, 2255-2258 (1990)J.
Aucune similitude n'a été établie entre ces séquences.
D'autre part, aucune hybridation n'a été
observée entre l'insert de 9,4 kb codant pour le mécanisme
Abi 420 et un fragment de 456 pb provenant du gène codant
pour le mécanisme Hsp.
La présente Invention a également pour objet
des vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'il com-
prennent au moins un fragment d'acide nucléique tel que
défini plus haut. Dans ce cadre, la présente Invention
englobe en particulier
- le plasmide pIL353 . un échantillon de la
souche de L. Iactis ssp lactis IL3127, contenant ledit
plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue
par l'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724
Paris, sous le numéro de dépôt I-999 ;
- le plasmide pIL352 . un échantillon de la
souche de L, lactis ssp lactis IL3128, contenant ledit
plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
C.N.C.M. sous le numéro de dép8t I-1000 ;
- le plasmide pIL618 . un échantillon de la
souche de L. lattis ssp lattis IL3365, contenant ledit
plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
C.N.C.M, sous le numéro de dépôt I-1001.
WO 92/05260 2 ~ ~ PCT/FR91/00722
~~ :, ~~
a
L'Invention a également pour objet les
polypeptides suivants .
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de
lecture de la séquence SEQ ID NO . 1, et dont la séquence
figure dans la liste des séquences sous le numéro
SEQ ID NO . 6.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de
lecture ORF.2, et dont la séquence C-terminale figure dans
la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 7.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de
lecture ORF 3, et dont la séquence figure dans la liste
des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 8.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de
lecture ORF 1, et dont la séquence figure dans la liste
des sêquences sous le numéro SEQ ID NO . 9.
La présente Invention a en outre pour objet
des microorganismes transformés, caractérisés en ce qu'ils
contiennent au moins un fragment d'ADN conforme à
l'Invention codant pour un mécanisme de résistance aux
bactériophages de type Abi.
Lesdits fragments peuvent être portés par des
plasmides, ou bien intégrés dans le chromosome bactérien
par recombinaison ou transposition.
Selon un mode de réalisation préféré des
microorganismes conformes à l'Invention, ils contiennent
au moins deux fragments d'ADN codant chacun pour un mëca
nisme Abi différent.
Selon un autre mode de réalisation préféré. des
microorganismes conformes à l'Invention, ils contiennent
au moins trois fragments d'ADN codant chacun pour un méca
nisme Abi différent.
Selon une disposition préférée de l'un ou
l'autre de ces modes de réalisation, les fragments d'ADN
codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par
un même vecteur.
.:. WO 92/05260 PCT/FR91 /00722
9
Selon une autre disposition préférée de l'un
ou l'autre de ces modes de réalisation, les fragments
d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont por-
tés par des vecteurs diffêrents.
La présente Invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se
réfère à des exemples d'obtention de fragments d'ADN, de
,plasmides recombinants, et de microorganismes transformés
conformes à l'Invention.
I1 va de soi, toutefois, que ces exemples et
les parties descriptives correpondantes, sont donnés uni-
quement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention,
dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
SEMPLE 1 . CLONAGE D' ON FRAGMENtr D' ADN CODANT POaR Lrr.
MR!C!àNT-SMR DE REST~'''AN~'R ADX PiIlrC,ZEg ,ha
La manipulation de l'ADN, le clonage et la
transformation de cellules bactériennes sont, en l'absence
de précisions contraires, effectués selon les protocoles
décrits par MANIATIS et al. [(Molecular cloni,ng : a
laboratory manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor N.Y.(1982)].
Le séquençage des différents fragments d'ADN a
été effectué sur chaque brin, par la méthode des di-
désoxynucléotides, à l'aide d'un séquenceur 370 A (Applied
Biosystems, San Jose, California), en suivant le protocole
préconisé par le fabricant.
L'ADN total de L. Lactis spp cremoris IL416
(Collection du laboratoire de Génétique Microbienne,
Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY
EN JOSAS) est digéré partiellement par l'endonucléase
Sau3A, et des fragments d'une taille moyenne d'environ 10
kb sont ligués au site gril du plasmide pIL253 portant un
gène de résistance à l'érythromycine. Les plasmides pIL253
et pIL252 ont été décrits par SIMON et CHOPIN, Biochimie
~Q", 559-566 (1988)].
CA 02091061 2001-10-26
La digestion de l'ADN bactérien et la ligation
dans le plasmide sont effectués selon les protocoles
décrits par SIMON et al. [FEMS. Microbiol. Lett. ;,~,
239-241 (1985)] et LOUREIRO DOS SANTOS et CHOPIN, (FEMS
5 Microbiol Litt., ~, 209-212 (1987)].
Le produit de ligation est utilisé pour trans-
former des bactéries de la souche L. Lactis ssp lactis
IL1403, qui est une souche dépourvue de plasmides [CHOPIN
et al., Plasmid, j,,,Z, 260-263 (1984)], par transformation
10 de protoplastes selon la technique décrite par SIMON et
al., [Appl. Environ. Microbiol., ~,, 394-395 (1986)]. Les
bactéries résistantes à l'ézythromycine sont ensuite
sélectionnées sur la base de leur résistance aux phages ;
des colonies incluses dans un milieu à l'agar sont
15 dispersées dans une solution saline, à l'aide d'un mélan-
geur ULTRA-TURAX""' 'f18/20 (20.000 rpm et 2 ml de la suspen-
sion sont utilisées pour inoculer 100 ml de milieu M17
(TERZAGHI et SANDINE, Appl. Microbiol. ~, 807-813 (1975)]
dans lequel le lactose est remplacé par du glucose
20 (Ml7glc), et contenant 5~tg/ml d'érythromycine. Aprés
incubation pendant une nuit à 30'C, 100 X11 de différentes
dilutions de la culture sont mélangés à 50 [t1 de CaCl2 O, 1
M, et 107 particules phagiques.
Après 5 mn à température de la pièce, 3 ml de
25 milieu Ml7glc agar additionné d'ézythromycine sont ajou
tés, et le mélange est versé à la surface d'un milieu de
culture solide Ml7glc agar + érythromycine. Des cultures
de contrôle sont effectuées, avec une culture de la souche
IL1403, en l'absence d'ézythromycine.
30 Les colonies résistantes aux phages sont
clonées.
Dans ces conditions un clone résistant à
l'attaque phagique et contenant un plasmide recombinant
portant un insert de 5 kb environ a été cloné. Ce plasmide
35 recombinant a été dénommé pIL353. Un échantillon de la
souche de L. lactis ssp lactis IL3127, contenant ledit
,<::.,WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCf/FR91/00722
11
plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue
par l'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724
Paris, sous le numéro de dépôt I-999
La figure 1 montre la carte de restriction du ~~
plasmide pIL353. Les distances entre les sites de restric-
tion sont indiquées en kb.
A partir du plasmide pIL353 un fragment
~I-SRI de 2,1 kb contenant la totalité de la séquence
codant pour le mécanisme Abi 416 a été sous-cloné. Ce
fragment a été séquencé, et le gène codant pour le méca-
nisme Abi 416 a été identifié.
La séquence de gène est indiquée dans la liste
des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 1.
Le séquençage de l'insert de 2,1 kb a égale
ment mis en évidence la présence sur celui-ci, immédiate
ment en amont du gène de structure du mécanisme Abi 416,
d'une séquence d'insertion du type ISS1 ; les séquences
promoteur du gène Abi 416 sont situées dans cette séquence
d'insertion.
$~,~LE 2 : OIaONàGB D' ûN P'RAGL~NT D8 9 . 5 kb DE L' ADN
TOTlL DE L~ SOOCI;E L . r ~!CTrS SSP LACTIS =Ld ~ n _
GODANT PO1QR L8 MECANI8b18 Abi 420
L'ADN total de L. lactis ssp lactis IL420
(Collection du Laboratoire de Génétique Microbienne,
Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY
EN JOSAS) a été digéré par l'endonucléase Sau3A, et cloné
dans le plasmide pTL252 [Simon et Chopin, Biochimie ~,Q,,
559-566, (1988)], selon le protocole décrit à l'exemple 1.
Aprés transformation,de bactéries de la souche
L. lactis ssp lactis IL1403, et sélection des bactéries
résistantes aux phages, comme décrit à l'exemple 1, un
clone contenant un insert de 9,4 kb environ a été isolé.
Cet insert est porté par le plasmide recombi-
nant pIL352, dont la carte de restriction est montrée ~ ,
figure 2. Un échantillon de la souche de L. lactis ssp ~r
WO 92/05260 ~ ~; S~ ~ ~~ ~ ~ PCT/FR91/00722 , . .
12
lactis IL3128, contenant- ledit plasmide, a étë dêposé le
13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M, sous le numéro de
dépôt I-1000
Des expériences d'hybridation ont été
effectuées entre l'insert de 9,4 kb et un fragment de
456 pb provenant du gène Hsp décrit par HILL et al. Aucune
hybridation n'a été observée, non seulement en conditions
stringentes (42'C, tampon à 50$ de formamide) mais aussi
en conditions non stringentes (42'C, tampon à 25~ de
formamide).
CLONAGE D' ON FRArr~nrrrr D ~ ADN DQ PLI s~Tn~
1ZL105, CODANT POUR LR ~~ArJr~ at,t ~ n~
Le plasmide pIL 105 a été décrit par GAUTIER .
et CHOPIN (App. Environ. Microbiol. ~, 923-927 (1987)]
L'ADN de ce
plasmide est digéré par ~3A et
cloné dans le site ,g,~HI de pIL252, selon la procédure
décrite à l'exemple 1.
Un plasmide recombinant portant un insert de
6,4 kb, codant pour le mécanisme Abi 105 a été
sélectionné. Ce plasmide est dénommé pIL 305, et sa carte
de restriction est montrée figure 3.~~
Un fragment ~çç$V-~I de 700 pb a étê excisé
de l' insert de 6, 4 kb de pIL305 ; le plasmide résultant,
contenant un insert de 5,7 kb, a été dénommé pIL618 , un
échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3365,
contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre
1990, auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dép8t I-1001
t / L'insert de 5,7 kb a été partiellement
vséquencê. La fi ure 4 montre '
9 1 organisation de cet
insert . (~1 - Séquences répétées inversées de ISS1 ;
Tnase - Transposase de ISS1 ; .... - séquence non
déterminée).
WO 92/05260 ~ fl ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722
13
La séquence SEQ ID NO : 2 représente environ
4,6 kb des 5,7 kb de l'insert (les bases sont numérotées
de façon continue, sans tenir compte des parties non
séquencées). Cette séquence comprend 4 cadres ouverts de
lecture.
L'un d'entre eux, commençant à la base 2289 de
la SEQ ID NO : 2, appartient à un élément d'insertion de
type ISS1, et correspond à la séquence codant pour la
transposase de ISS1.
Les 3 autres cadres ouverts de lecture sont
respectivement dénommés ORF 2, ORF 3 et ORF 1.
La séquence partielle (codant pour l'extrémité
C-terminale du polypeptide) de ORF 2 est comprise entre '
les bases 1 et 677 de la séquence SEQ ID NO . 2. Cette
même séquence figure séparément dans la liste des séquence
sous le numéro SEQ ID NO . 3.
La séquence de ORF 3 est comprise entre les
bases 670 et 1140 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; elle
figure séparément dans la liste des séquences sous le
numéro SEQ ID NO : 4.
La séquence de ORF 1 est comprise entre les
bases 3177 et 4001 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; elle
figure séparément dans la liste des séquences sous le
numéro SEQ ID NO : 5.
II. - RE~T_STA_NCE A L'ATTAQUE pus~TnrrR r!n~RER
PAR DES PLASM=DEa pOgT~rrr LES BEOQENCEa D!,~ntJ s~~' 4? 6.~,
èbi 420 et Abi 105
F.~i.
L'étude a été effectuée en utilisant comme
témoin la souche IL1403, dépourvue de plasmides.
Les souches transformées par les plasmides
pIL352 et pIL353 et pIL618 sont respectivement dênommées
IL1403/pIL352 et IL403/pIL353, et IL1403/pIL618.
Des e5cpériences d'adsorption effectuées au
préalable montrent que l'adsorption des particules pha
giques est identique pour la souche témoin IL1403 et pour
WO 92/05260 ~ ~ ~ ~' ~N ~ ~ PCT/FR91/00722
14
les souches transformées (de l'ordre de 97~ en 15
minutes).
Une expérience de croissance en une seule
étape, a été effectuée selon le protocole suivant .
Une culture de bactéries lactiques au milieu
de la phase de croissance exponentielle est mise en sus-
pension dans du milieu frais à une concentration de
107 CFU/ml, et mélangée à une suspension de phages à
106 PFU/ml (phage bIL66, de type isométrique).
Le mélange est incubé pendant 10 minutes pour
permettre l'adsorption des phages, puis dilué 10 fois, en
présence de sérum antiphage, et incubé pendant 5 minutes à
37'C, -ce qui permet de neutraliser environ 99~ des phages
non adsorbés.
Le mélange est ensuite dilué à nouveau dans du
milieu M17 pour stopper l'action de l'antisérum, puis
incubé à 30'C. Pendant cette incubation, des aliquots de
1 ml sont prélevés, à 5 minutes d'intervalle et étalés sur
plaques de milieu solide.
Les plages de lyse obtenues pendant la période
de latence donnent le nombre de centres infectieux. Celles
obtenues pendant la phase finale stationnaire donnent le
nombre de phages résultant de la multiplication des phages
utilisés pour l'infection. Le rendement unitaire, qui
permet d'évaluer la multiplication des phages, est obtenu
,en divisant le nombre de phages après multiplication, par
~'~le nombre de centres infectieux.
U La figure 5 montre le résultat de cette expé
rience . le nombre de PFU par ml est représenté en fonc
tion du temps (en minutes), après l'infection, pour les
souches IL1403 (O), IL1403/pIL618 (O), IL1403/pIL353 (~),
IL1403/pIL352 (1)
La période de latence est similaire pour
toutes les souches. Le nombre de centres infectieux
obtenus sur les souches IL1403/pIL352, IL1403/pIL353 et
IL403/pIL618 représente respectivement 0,2~, 12~ et 3~ des
jWO 92!05260 ~ ~ ~1 ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722
phages adsorbés. Le rendement unitaire sur la souche
IL1403 est de 190, et décroît à 60 pour la souche
IL1403/pIL352, à 25 pour la souche IL1403/pIL353, et 50
pour IL1403/pIL618.
5 Les plages de lyse formées par le phage bIL66
sur ces souches transformées, sont très petites, turbides,
et à peine visibles, ce qui est observé dans les infec
tions virales abortives. En outre, les phages obtenus à
partir de ces plages ne sont plus infectieux pour Les
10 souches bactériennes transformées.
EXEMPLE 5 . C'OMPARAr_gON DES MECANIE~S =Abi 105 .~~ d2n
et Abi 416
Différents types de phages attaquant les bac
téries lactiques ont été utilisés pour cette expérimenta
15 tion . les phages bIL38, bIL66, bIL70 sont de type isomé
trique ; les phages bIL188 et bIL67 sont de type à tête
allongée.
Le Tableau I montre les résultats obtenus .
TABLBAQ Z
Phage bIL38 bIL66 bIL170 bIL67 bIL188
Plasmide
Abi 416 + + + - -
Abi 420 + + - - -
Abi 105 + + + + +
Le mécanisme Abi 105 est actif sur les 5
phages testés, alors que les mécanismes Abi 416 et Abi 420
sont actifs seulement sur les phages isométriques. Seul le
mécanisme Abi 416 est actif sur le phage bIL170.
$~CEMPLE 6 . EggET CON~OTNT DE~MECrA~T~9 Aha ~
Abi 416 et Abi 420
Cet effet est étudié en introduisant les frag-
ments d'ADN portant les gènes codant pour ces
3 mécanismes, dans la bactérie IL1403. ,
WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR9~/00722 ..:-v,,
16
Comme les plasmides pIL252 et pIL253 sont
incompatibles, l'insert de 5 kb du plasmide pIL353 a été
transféré au site ~lII du vecteur plasmidique pGKV259
[Van der Vossen et al., appl. Environ. Microbiol. ~,
2452-2457 (1987)J, le plasmide ainsi obtenu, dénommé
pIL377 est compatible à la fois avec le plasmide pIL105
(portant le gène Abi105) et le plasmide pIL353. Ces
plasmides sont transférés séparément, deux à deux, ou tous
les trois ensemble, dans la bactérie IL 1403.
,,.:,>,;s WO 92/05260 ~ PC7"/FR91/00722
17
Le tableau II montre les résultats obtenus.
TAHLRATT TT
PFU/ml bIL38 bIL66 bIL170 bIL67 bIL188
Souche
IL1403 3.9x108 7.7x109 6.3x108 6.3x108 2.7x107
IL1403 5.Ox102*l.Ox107*<10 1.4x109 9.6x107
(pIL377)
IL1403 5.Ox103*l.Ox105*1.2x109 1.5x108 1.2x107
(pIL352)
1 IL1403 5.Ox104*8.Ox107*5.Ox103*<10 <10
0
(pIL105)
IL1403
(pIL377, <10 <10 <10 5.7x108 5.7x107
pIL352)
IL1403
(pIL377, <10 l.Ox10.4*<10 <10 <10
pIL105)
IL1403
(pIL352, <10 2.Ox105*2.OX103*<10 <10
pIL105)
IL1403
(pIL377, <10 <10 <10 <10 <10
pIL352,
pIL105)
*Plages turbides peu visibles.
Une synergie de l~efficacité de ces mécanismes
est en outre observée. Par exemple, le nombre de plages
formées par le phage bIL 38 est divisé par 106 sur la
souche IL1403/pIL377, par 106 sur la souche IL1403/pIL4105
et par plus de 108 sur la souche IL1403/pIL105/pIL 377,
WO 92/0S260 ~ ~ ~ ~ v, PCT/FR91/00722 ...-.,:.
18
par rapport au nombre de plages formées sur la souche
IL1403.
Des résultats similaires sont observés pour
les autres pliages dans la plupart des combinaisons
étudiées.
Lorsque les 3 mécanismes Abi sont associés
dans une même bactérie, l'infection phagique est pratique-
ment inexistante. Ceci a été confirmé par une expérience
de croissance en une seule étape effectuée avec bIL66 sur
la souche IL1403/pIL352/pIL105/pIL377 ; le nombre de cel-
lules infectées et de pliages libérés était en dessous du
seuil de sensibilité de la méthode.
Ainsi que cela ressort de ce qui prêcède,
l' Invention ne se limite nullemer,.t à ceux de ses modes de
. 15 mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui
viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en
embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent
venir à l'esprit du technicien en la matière, sans
s~êcarter du cadre, ni de la portée, de la présente
Invention.
PCT/FR91 /00722
a ..., WO 92/0S260
19
SEQ. ID N' . 1
TYPE DE SEQüENCE : Nucléotide
LONGÜEÜR DE LA SEQûENCE : 960 paires de bases
TYPE D8 MOLBCÜLE : ADN génomique
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL416
PROPRIETES . Gène codant pour le mécanisme de résistance aux
bactériophages Abi 416
CARACTERISTIQUBS : Les séquences soulignées représentent .
- De 80 à 89 pb : site de liaison aux ribosomes
- De 8 à 14 pb, et de 34 à 38 pb : promoteurs -35 et -10
- De 901 à 926 pb : séquence terminateur
TATCCTCGCTGTCATTTTTATTCATTTTACACAGACTTATCAGAA
51
AACTTTGCAACAGAACCAGAAAAAGAATAAAAAT~TAAT
ATGGAT 100
ATTGAA GTT ACTTTT GAGCAA GTTGAT AGC TTTATG 139
GAT
AAGCAA CAA AAAAAA ATAGAT AGTTGG CTT TCTTTT 178
CAG
GATAAC ATG ATTCCA ACTGGA ATCATG AAG CAACAA 217
CCA
GAGCAG AAG GTAAAC ACGTTG AGAATG ATT TTAAAA 256
AAA
ATGTTG CTA AATACG AGAGAT GTATTA AAT GGCTTA 295
ATT
ATTGTT TTA GCTACG AATAAC ATGACT TCT TCTATG 334
GAA
ATTTTG CAT ACCTTG ATAGAA AATACA ATA AATATT 373
AAA
GGATAT GCT AAATTT TATAAA ACTAAA GAT TATCAT 412
CTA
TCTTTT TGT TTGATA AAAGAA GATAAG AAG CTTTTT 451
AAT
GGTAAT GAA GTAAAT CAAAAA GCCAAT ATC TCTTTC 490
ACA
GTGAAA TCA GGTGAA AAACAT ACACAT ATA TATCTT 529
GAA
GATTAT CAA ACATGT AAAGTA GCACAT CCT AACTTT 568
GAA
CTTCAA TTG AATTTA TTAAAA AACTAC TAC CCTGAA 607
ATA
TTTTCT GAG AAATTA CTAACA TTTGAC CTT AATGAT 646
GAG
AAAATA TTT GAAGAC GAAATA AAAGTA ATA CCGATT 685
GGA
TCAAAA CCT ATAGTC AATACG ATTGAT GAA GTTATG 724
AAA
AATGAA ATA AAAGAA ATTGTT TTAAAA TAC AATCAG 763
GCT
GACATG TGT GTTACA TCAAAA TTAGGA GAA ATTTCA 802
AAA
CTTACC CCT CAAGAA AAATTT GATAAG CTA AAAGAC 841
ATC
ATTTGA CAAAATTAAATTAGCATTCGGGGTTATCACCCTTTTTGATAAA
890
CTAATAAAGTA AT CTT A TT~_rmrAGCTGTTTTTGTGTATACT 941
. A .A
T ..
ATAAATAAAGAGTTTTCAA 960
WO 92/05260 ~ ~ c.~ ~ ~~ ~ ~ PCT/FR91/00722 r..:,.-,~..
SEp. ID NO : 2 20
TYPE DE SEQUBNCE : Nucléotide
>;ONGÜEDR D8 IDA SEQUBNCE : 4, 6 kb environ
TYPE DE MOLBCOLE : ADN génomique
ORiGINB : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105
PROPRIETES : comprend au moins un gène intervenant dans le
mécanisme de résistance aux bactériophages Abi 105
C~rR,ACTERISTIQQES
- De 1 à 677 pb : cadre ouvert de lecture ORF2
- De 670 à 1140~pb : cadre ouvert de lecture ORF3
- De 2289 à 2777 pb . cadre ouvert de lecture de la
transposase de ISS1 (partiellement séquencé)
- De 3177 à 4001 pb : cadre ouvert de lecture ORF1
De 2229 à 2246 pb et de 2833 à 2851 . séquences repétées
inversées de ISS1
./
N~AG~TAT~TCG.ATT~ATT~TTG~TAT~CGT~TGG~TTA~TCC~ATG~AAT 38
TAT AAC CAA TAC GAA CAT TAC AGC GTG AAA GGG GGA CGG 77
AGA GCC GAC CAA GTG GAA GCC TAC CGC CCC CCC TCA ATA 116
AAA GTG AAA GAA TTG CGA GAA ATA ACT GAT ACA ATA AAT 155
GAA CAT CAA CAT TTC CCC CAT TTT GAA ACT AGA GTA TTA 194
AAA AAA GCA ATT GAA GAA ATC AAC GCT CAC ACC TCT TTT 233
AAT GTG ACC TAT GAG AAA GTC~AAA AAA GGG CGT TCA ATT 272
GAT TCT ATT GTC TTT CAT ATT GAG AAG AAA CGC TTG GCA 311
GAC GAT AAC AGC TAC AAG TTG GAA GAT AAA GTC TAC CAA 350
GAA GAT AAA GCA CGT AAA GCA GAA ACA GAA AAA GAC CTT 389
GTT TTC CAA GCT ATG CAA AGC CCT TAT ACA CGG CTG TTG 428
ATT GAA AAT ATG TTT TTA AAT GTT TAT GAA ACA ACG GAC 467
AGT CAA ATA ATG GCA GGC TTA CAG AAA AAC GTT TAT CCA 506
CTT TAT GAC GAG TTA AAG GAA TTA AGA GGG CTA AAT GGT 545
GTC AAA GAC CAC TTG TCT TAT GTA TCT AGC AAA CAA GAA 584
GCC TAT TCT AAA CGC AAT GTA GCG AAG TAT TTG AAG AAA 623
GCC ATT GAA CAA TAC CTA CCA ACC GTT AAA AGG CAG GAC 662
TTA AAC CAT GAG TGA 677
II/ II/ II
ATG AGT GAA GAC TTA AAA ACC ATA AAA GAG TTG 702
GCG GAC GAG TTA GGG GTA AGT AAA TCA TAT GTT GAT AGG 741
ATA ATA CGC ATA CTC AAA TTG CAT ACT AAA TTA GAT AAA 780
GTA GGT AAT AAG TAT GTA ATT TCT AAA AAG CAA GAA AAA 819
TCT ATA ATA ACA AGG ATT GAA AAT TCT AAA TCA ACA ACT 858
GAA ACG CAT ACT GAA TCA ACA ACT CAA TCG CAC ACT AAA 897
GTT GAT GCA GAA GTT GAT TTT TTG AAA GAA GAA ATC GCA 936
TAT CTT AAA AGT AAT CAC GAT AAA CAA TTG ACC AAC AAA 975
GAC AAA CAG ATA GAA ACC TTA AGC AAT CTA TTA GAC CAG 1014
CAA CAG CGA TTA GCT TTG CAA GAT AAA AAG TGG CTA GAA 1053
GAA TAC AAG GCA GAA ATA AAC GAC TTA AAA GCC CTA AAA 1092
ATG CCC TCA GAG GCA CGA AAG AGG AAC AAT CAA ATT ATC 1131
GTT CAC TAG AAAAAGAAAAGGGACTTTGTACAAACCATACAAGAATCT 1179
TATGAATCTGAAATCAAAGTCTTAAATCAAAAACTAGCTGAACAAGAAGAA 1230
CAAATACAGGAGATACAAAAAGAAAAAGAAACCAAAGAAAAAAAATGGTTT 1281
CAGTTTTGGAAGTGAGGTAATTTATGGCACAAACCTTTGATAGAAAA,ATTT 1332
TAAGAGCCTTACAAGATAATGGTGTAAGAGAAATCAGAGCTTATGAAGTCG 1383
TTTCAAAACGTTTGACAATCTTTCAAACAGACAGAGGAACGTTTAAATATA 1434
GCGATAGTTTATATCGGCTAGTTGCCCCAAGACAAGAATTATGGAGGAATT 1485
GCACGACTGGTTTTATTTCAGAAGAAAAATACCATTTCTACAAAAAATAAA 1536
ATATCTAAGTTTGAAAGAATAAATAAAAGCCCTTAAAAATGATTTTAGGGC 1587
TTATTATTATTCAAGTGGCATAATTCTACTCAAAACCATTTAAAAGGGCTT 1638
,. W0 92/05260 ~ '~ ~ ~ ~a ~ ~ PCT/FR91/00722
S$Q. ID NO : 2 '(suite) 21
AAAAGGCAAAATATGAGCTTATAGGACGATTCAAGCATTAAAGGGAGTGAA 1689
AAATTTATTTTTCAATTTCTTTAGTGCTTTTTCGTTGGTTTGCTCAACGAC 1740
AGGAGCAGTCAGATTGAAAATCTGAAATATATTCAAATTATTTTCCTAAGG 1791
GCGCACTTATATACCATGAAAAATCATGGTATAAAATGCCAATATTTTAGA 1842
TTAAACGTGTTGGAAAAACTCGCTTTGCTCATGTAAATAAAAACGTTATAA 1893
AGTATTATAGCGAGCTTAGTAAGTGGATATACACTTACGGTAAAAAGGGTT 1944
CTGTTGCGAAGTCAAAGATTTATACGAAAATGTCTTAAAAGAATTTGAAAT 1995
TAAGCTCTAATTTTTTTCAAAAAGGGGGATTGGGGGACACCACCAAAAATA 2046
AAAAGATTCGTCTGAAACGAACAAAAATAAAATTGGAAATTTTAGGTTTTG 2097
TGAGTGAAAGATGAATACTTTTTACTGTACTTGGGTACCCAAGTGCTAAGT 2148
TCACTAAAGACACTAACCCCCTATTTTGAGCTTTCAGAGTTGACAGATATT 2199
TGTGAGGTTGACAAGATGAAAATAATTCA - -TT -TT - A n ~TTTA_n n n 2 2 5 0
ATCAAAATCAAATACAAGGTTTATAATCCTTCTTGTTC TTA AGC TAA 2297
TAT TCC CAT TAA GAC CTT AAT CTC AGT AGA TAC CGA AAA 2336
TCC GAA GAG CGT TCC ATT TCT CGG GTC TTT TTT GTA TAT 2375
TCC TCG AAT TGT TTC CAA TGC CCT TAA TCG TGG TTG AGG 2414
CAA GTT CGT AAG ACT TCG ATA AAA TTT ATT GCG TCG TTT 2453
GAT TGG TCG ATG GTC TTG CTC AAT GAG GTT ATT GAG ATA 2492
CTT CAC. GGT TCG ATG CTC TGT CTT AGT ATA TAA ACC GTT 2531
ACT CTG TAA CTT TCT AAA TGC AGA ACC AAT AGA GGG CGC 2570
TTT ATC CGT GAC AAT TAC TCT TGG TTG ACC AAA CTG TTT 2609
ATG TAG TCG TTT CAA GAA CGC ATA AGC AGC TTG AGT ATC 2648
CCG TTT CTT GCG TAG CCA GAT GTC TAA AGT CAA TCC ATC 2687
CTC ATC AAT TGC ACG ATA GAG ATA ATG CCA ACG ACC TTT 2726
GAT TTT GAT ATA AGT TTC ATC CAT TTT CCA CGA ATA G/.. 2763
TT~AAA~ATG~ATT~CAT~TACTCTGTCCTCTCTGTCTTTTTTCTCAATTTTACA 2813
CTAAAATAGATTTTTTGG_AAAACTTTGCA_ACAGAACCATAAAAAGCAACAAAAAC 2868
CTTATTAAATAAGTAA'ITTTTCATCTTGTGTTTTTTTTACAAAATTTAAAGTTCT 2923
GGAAATTGGCTGCT'1'TATGGACATAAAATTTAAAAAATAAAAGGCTACTAATTAA 2978
TTATAAAAGATTCAAGAAATCAAATTAATAGATAACATATTAATCTTAGGGTTAG 3033
CTCATTTATTGAAAATAAACTTTTGCTCCTTC
~$Ç~TATTTAGGATAATATGT 3088
T~gg~TATATATCAGTACTTGCCACGCCTCTGCTTIGTATGCGCATTATGGCC 3143
AGGCTTTT'I',TTTTATCATTTTG T ATG AAA AAT AAA CAA 3191
TTA CAA AAA TAC AAA AGA ACC TCT ATG AAT ATT TTT AGG ACA 3233
AAA TAT CGT AGA ATT ATT TCT TCA AGT CAT TAT ATA AAA AGA 3275
GAT AAG ATT CCA AAG ATA AAC AAT GGA CTA CTA ATC AAA GAA 3317
GAC TTA AAA GAT TTT TAT TCC TTT GAA AAA ATA AAA AAA AAA 3359
ATT GAT AAA AGT GTT CGT ATT GAA GAA AGT GAG CTC GCT ATT 3401
CTA AAA GAG TTT ATA GAT AAG ACA GGA TAT TTT AGA TTT AGT 3443
ATC TAT TTA AAG TTG ATG AAG GAT ATT GAG GGA GTA ACT GTG 3485
ATT GAT ATT ATT AAA ACT TGT CAA CTA GAT GGG TAC ATT AGG 3527
GAT AAT TTG TTT AGT TTT ACA ACC AGA TTA GAA ATG TTC TGG 3569
AAA AAA ACT ATC GTG GAT ACT ATG TGT TTA AAC TAT GAG ACT 3611
AAC GAT TTT TTT CAT AAT ATC AAT AGT CAA TGT TAC TTA GAT 3653
AAA AAA ATA TAT AAG AAT GAT GAA TGG GGT AAT CTA ATT ATT 3695
CAA GAG TTT AAT AAG AGC TTT TTT TCG AAT AAT AGT CCA GCA 3737
TTT AAG CAT CAT AAA AAT AAA AGG AAA AAC TGT ATT CCA ATT 3779
TGG GCA TTA TTT GAG GGA TTA ACG TTT GGA CAA ATA AAT ACT 3821
TTC ATT ACC CAA TTG GAT GCA AGA TAT TAT AAT GCT TGG GTT 3863
TCA TCT ATA TAT AAT AAT CCT GCA TAT AAA AAG CCT ATG AAA 3905
AGC TGG ATA ACC GTA ATA CGT ACA TCA AGA AAT AGA TCT GCA 3947
CAT AAT TCA AGA ATT TAT GGT TTG AAA GCA CCC GAT GTT CCT 3989
ATG GAT TTT TAA AAAAGACATCACGGTAACTATTTTTCTGATAACAAATCA 4040
AAAAATATAGATTCTACTTTGTTATT'TGGAACTCTTTATGTCATTAAGCACTTAT 4095
TCATGTATGAGAATGATCATATAAAAGAGAATTGGAATAATTZ"rATTTATAAACT 4150
CAATGATAAACTATTAGAAATAAAAAAAATAGAAAAAAGTCAGTATGGTTTTTCT 4205
GAGGATTGGGTTAAACAGTTAGAAATAATAGATTAAATTTTAAGGAGCAATAGTC 4260
TCCCTTTTAGTGT 4273
WO 92/05260 PCT/FR91/00722
z~~ ~~~1
22
SBQ. NO : 3
ID
TYPE S8QU8NCE
DB :
Nuclotide
LONGBR LA SEQQBNCB : 677pb
D8
TYPE i~OLBCOLB
D8 :
ADN
gnomique
ORIGINE: plasmide
Streptococcus pIL105
cremoris
IL964
;
CARACTBRISTIQUBS e RF2 (squence
. cadre lecture
ouvert O
d
partielle> du fragment SEQ NO: 2 code
ID ; pour
la
partie
C-terminale du polypeptide
.. . .... .. ... . ..
~ .. ./
~ ~
~
~
N AG 38
TAT
TCG
ATT
ATT
TTG
TAT
CGT
TGG
TTA
TCC
ATG
AAT
TAT CAATAC GAA CAT TAC GTG AAA GGGGGA CGG 77
AAC AGC
AGA GACCAA GTG GAA GCC CGC CCC CCCTCA ATA 116
GCC TAC
AAA AAAGAA TTG CGA GAA ACT GAT ACAATA AAT 155
GTG ATA
GAA CAACAT TTC CCC CAT GAA ACT AGAGTA TTA 194
CAT TTT
AAA GCAATT GAA GAA ATC GCT CAC ACCTCT TTT 233
AAA AAC
AAT ACCTAT GAG AAA GTC AAA GGG CGTTCA ATT 272
GTG AAA
GAT ATTGTC TTT CAT ATT AAG AAA CGCTTG GCA 311
TCT GAG
GAC AACAGC TAC AAG TTG GAT AAA GTCTAC CAA 350
GAT GAA
GAA AAAGCA CGT AAA GCA ACA GAA AAAGAC CTT 389
GAT GAA
GTT CAAGCT ATG CAA AGC TAT ACA CGGCTG TTG 428
TTC CCT
ATT AATATG TTT TTA AAT TAT GAA ACAACG GAC 467
GAA GTT
AGT ATAATG GCA GGC TTA AAA AAC GTTTAT CCA 506
CAA CAG
CTT GACGAG TTA AAG GAA AGA GGG CTAAAT GGT 545
TAT TTA
GTC GACCAC TTG TCT TAT TCT AGC AAACAA GAA 584
AAA GTA
GCC TCTAAA CGC AAT GTA AAG TAT TTGAAG AAA 623
TAT GCG
GCC GAACAA TAC CTA CCA GTT AAA AGGCAG GAC 662
ATT ACC
TTA CATGAG TGA 677
AAC
,.,W0 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91 /00722
' 23
SBQ. ID NO : 4
TYPB D8 SBQUBNCB : Nucléotide
LONG08DR DB LA SBQUENC$ : 471 pb
TYPE DS MOLBCOI~B : ADN génomique
ORIaINB : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105
CliRI~CTBRISTIQOBS : cadre ouvert de lecture ORF3 du fragment
SEQ ID NO: 2 ;
ATG AGTGAA GACTTA ACC AAAGAG TTG 702
AAA ATA
GCGGACGAG TTAGGG GTAAGT AAA TCA GTTGAT AGG 741
TAT
ATAATACGC ATACTC AAATTG CAT ACT TTAGAT AAA 780
AAA
GTAGGTAAT AAGTAT GTAATT TCT AAA CAAGAA AAA 819
AAG
TCTATAATA ACAAGG ATTGAA AAT TCT TCAACA ACT 858
AAA
GAAACGCAT ACTGAA TCAACA ACT CAA CACACT AAA 897
TCG
GTTGATGCA GAAGTT GATTTT TTG AAA GAAATC GCA 936
GAA
TATCTTAAA AGTAAT CACGAT AAA CAA ACCAAC AAA 975
TTG
GACAAACAG ATAGAA ACCTTA AGC AAT TTAGAC CAG 1014
CTA
CAACAGCGA TTAGCT TTGCAA GAT AAA TGGCTA GAA 1053
AAG
GAATACAAG GCAGAA ATAAAC GAC TTA GCCCTA AAA 1092
AAA
ATGCCCTCA GAGGCA CGAAAG AGG AAC CAAATT ATC 1131
AAT
GTTCACTAG 1179
WO 92/05260 ~ ~ j ~ d ~ ~ PCT/FR91/00722 ,.. ~,
24
SBQ. ID NO : 5
TYPE DE SEQüENCE : Nucléotide
LONGOE>?R DE LA SEQüENCB : 1240 pb
TYPE DE MOLEC~LE : ADN génomique
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105
CARACTERISTIQ~ES . comprend le cadre ouvert de lecture ORF1
du fragment SEQ ID NO: 2 ;
Les séquences soulignées représentent .
- De 133 à 137 pb : site de liaison aux ribosomes
De 33 à 38 pb, et de 57 à 62 pb : promoteurs -35 et -10 de
ORF1
CTCATTTATTGAAAATAAACTTTTGCTCCTTC~TATTTAGGATAATATGT3088
T~TATATATCAGTACTTGCCACGCCTCTGCTTTGTATGCGCATTATGGCC3143
AGGCTTTTTTTTTATCATTTTG T ATG AAA AAT AAA CAA 3191
TTA CAA AAA TAC AAA AGA ACC TCT ATG AAT ATT TTT 3233
AGG ACA
AAA TAT CGT AGA ATT ATT TCT TCA AGT CAT TAT ATA 3275
AAA AGA
GAT AAG ATT CCA AAG ATA AAC AAT GGA CTA CTA ATC 3317
AAA GAA
GAC TTA AAA GAT TTT TAT TCC TTT GAA AAA ATA AAA 3359
AAA AAA
ATT GAT AAA'AGT GTT CGT ATT GAA GAA AGT GAG CTC 3401
GCT ATT
CTA AAA GAG TTT ATA GAT AAG ACA GGA TAT TTT AGA 3443
TTT AGT
ATC TAT TTA AAG TTG ATG AAG GAT ATT GAG GGA GTA 3485
ACT GTG
ATT GAT ATT ATT AAA ACT TGT CAA CTA GAT GGG TAC 3527
ATT AGG
GAT AAT TTG TTT AGT TTT ACA ACC AGA TTA GAA ATG 3569
TTC TGG
AAA AAA ACT ATC GTG GAT ACT ATG TGT TTA AAC TAT 3611
GAG ACT
AAC GAT TTT TTT CAT AAT ATC AAT AGT CAA TGT TAC 3653
TTA GAT
~
AAA AAA 3695
ATA TAT AAG AAT GAT GAA TGG GGT AAT CTA ATT ATT
CAA GAG TTT AAT AAG AGC TTT TTT TCG AAT AAT AGT 3737
CCA GCA
TTT AAG CAT CAT AAA AAT AAA AGG AAA AAC TGT ATT 3779
CCA ATT
TGG GCA TTA TTT GAG GGA TTA ACG TTT GGA CAA ATA 3821
AAT ACT
TTC ATT ACC CAA TTG GAT GCA AGA TAT TAT AAT GCT 3863
TGG GTT
TCA TCT ATA TAT AAT AAT CCT GCA TAT AAA AAG CCT 3905
ATG AAA
. 3947
AGC TGG ATA ACC GTA ATA CGT ACA TCA AGA AAT AGA
TCT GCA
CAT AAT TCA AGA ATT TAT GGT TTG AAA GCA CCC GAT 3989
GTT CCT
ATG GAT TTT TAA AAAAGACATCACGGTAACTATTTTTCTGATAACAAATCA4040
AAAAATATAGATTCTACTTTGTTATTTGGAACTCTTTATGTCATTAAGCACTTAT4095
TCATGTATGAGAATGATCATATAAAAGAGAATTGGAATAATTTTATTTATAAACT4150
CAATGATAAACTATTAGAAATAAAAAAAATAGAAAAAAGTCAGTATGGTTTTTCT4205
GAGGATTGGGTTAAACAGTTAGAAATAATAGATTAAATTTTAAGGAGCAATAGTC4260
TCCCTTTTAGTGT 4273
-:,WO 92/05260 2 ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722
1i r.1
SEQ. ID NO : 6
Ti'PB DE SEpDENCE : polypeptide
LONGQBDR DE LA SEQUBNCE : 250 acides aminés
TYPB DE MOLECOLE : protéine
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL416 ; séquence codée par
le gène de structure Abi 416
Met Asp Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Gln Val Asp Ser Phe Met
05 10 15
Lys Gln Gln Gln Lys Lys Ile Asp Ser Trp Leu Ser Phe Asp Asn
20 25 30
Met Pro Ile Pro Thr Gly Ile Met Lys Gln Gln Glu Gln Lys Lys
40 45
Val Asn Thr Leu Arg Met Ile Leu Lys Met Leu Leu Ile Asn Thr
50 55 60
Arg Asp Val Leu Asn Gly Leu Tle Val Leu Glu Ala Thr Asn Asn
65 70 75
Met Thr Ser Ser Met Ile Leu His Lys Thr Leu Ile Glu Asn Thr
80 g5
Ile Asn Ile Gly Tyr Ala Leu Lys Phe Tyr Lys Thr Lys Asp Tyr
95 100 105
His Ser Phe Cys Asn Leu Ile Lys Glu Asp Lys Lys Leu Phe Gly
110 115 120
Asn Glu Thr Val Asn Gln Lys Ala Asn Ile Ser Phe Val Lys Ser
Glu Gly Glu Lys HisSThr His Ile 130
Tyr Leu As 135
140 p TYr Gln Glu Thr
145 150
Cys Lys Val Ala His Pro Asn Phe Leu Gln Leu Ile Asn Leu Leu
155 160
165
Lys Asn Tyr Tyr Pro Glu Phe Ser Glu Glu Lys Leu Leu Thr Phe
170 175 180
Asp Leu Asn Asp Lys Ile Phe Gly Glu Asp Glu Ile Lys Val Ile
185 190 195
Pro Ile Ser Lys Pro Lys Ile Val Asn Thr Ile Asp Glu Val Met
200 205 210
Asn Glu Ile Ala Lys Glu Ile Val Leu L220Tyr Asn Gln Asp Met
215 225
Cys Lys Val Thr S230Lys Leu Gly Glu Ile Ser Leu Thr Pro Ile
235 240
Gln Glu Lys Phe Asp Lys Leu Lys Asp Ile
245 250
WO 92/05260 PCT/FR91/00722 .:-:;
c~ ~~ .~ is r .~
~U~.~ 'v ~~6
SBQ. ID NO : 7
TYPE D8 SEQ>?ENCE : polypeptide ; séquence C-terminale
LONGUBQR DE LA SEQÜ8NC8 : 224 acides aminés
TYPE DB MOLBCOLE : protéine
ORIGINE . Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par
le cadre ouvert de lecture ORF2 du fragment d'ADN portant le
mécanisme de résistance Abi 105
Tyr~Ser~Ile~Ile~Leu~Tyr~Arg~Trp~Leu~Ser~Met~Asn~Tyr~Asn Gln
05 10 15
Tyr Glu His Tyr Ser Val Lys Gly Gly Arg Arg Ala~Asp Gln Val
20 25 30
Glu Ala Tyr Arg Pro Prô Ser Ile Lys Val Lys Glu Leu Arg Glu
35 40 45
Ile Thr Asp Thr Ile Asn Glu His Gln His Phe Pro His Phe Glu
50 55 60
Thr Arg Val Leu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Ile Asn Ala His Thr
65 70 75
Ser Phe Asn Val Thr T~r Glu Lys Val Lys Lys Gly Arg Ser Ile
80 85 90
Asp Ser Ile Val Phe His Ile Glu Lys Lys Arg Leu Ala Asp Asp
95 100 105
Asn Ser Tyr Lys Leu Glu Asp Lys Val Tyr Gln Glu Asp Lys Ala
110 115 120
Arg Lys Ala Glu Thr Glu Lys Asp Leu Val Phe Gln Ala Met Gln
125 130 135
Ser Pro Tyr Thr Arg Leu Leu Ile Glu Asn Met Phe Leu Asn Val
140 145 150
Tyr Glu Thr Thr Asp Ser Gln Ile Met Ala Gly Leu Gln Lys Asn
155 160 165
Val Tyr Pro Leu Tyr Asp Glu Leu Lys Glu Leu Arg Gly Leu Asn
170 175 180
Gly Val Lys Asp His Leu Ser Tyr Val Ser Ser Lys Gln Glu Ala
185 190 195
Tyr Ser Lys Arg Asn Val Ala Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Ile Glu
200 205 210
Gln Tyr Leu Pro Thr Val Lys Arg Gln Asp Leu Asn His Glu
215 220
:W0 92/05260 2 ~ ~ ~. ~A ~ ~ PCT/FR91/00722
27
SEQ. ID NO : 8
TYPB DE SBQÜENCE : polypeptide
LONGQ81?R DE LA SEQ>?ENCE : 156 acides aminés
TYPE DE MO1JECQLE : protéine
ORIGINE . Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par
le cadre ouvert de lecture ORF3 du fragment d'ADN portant le
mécanisme de résistance Abi 105
Met Ser Glu Asp Leu Lys Thr Ile Lys Glu Leu Ala Asp Glu Leu
05 10 15
Gly Val Ser Lys Ser Tyr Val Asp Arg Ile Ile Arg Ile Leu Lys
20 25 30
Leu His Thr Lys Leu Asp Lys Val Gly Asn Lys Tyr Val Ile Ser
35 40 45
Lys Lys Gln Glu Lys Ser Ile Ile Thr Arg Ile Glu Asn Ser Lys
50 55 60
Ser Thr Thr Glu Thr His Thr Glu Ser Thr Thr Gln Ser His Thr
65 70 75
Lys Val Asp Ala Glu Val Asp Phe Leu Lys Glu Glu Ile Ala Tyr
80 85 90
Leu Lys Ser Asn His Asp Lys Gln Leu Thr Asn Lys Asp Lys Gln
95 100 105
Ile Glu Thr Leu Ser Asn Leu Leu Asp Gln Gln Gln Arg Leu Ala
110 115 120
Leu Gln Asp Lys Lys Trp Leu Glu Glu Tyr Lys Ala Glu Ile Asn
125 130 135
Asp Leu Lys Ala Leu Lys Met Pro Ser Glu Ala Arg Lys Arg Asn
140 145 150
Asn Gln Ile Ile Val His
155
WO 92/05260 ~ ~ C~ ~ (~ ~ PCT/FR91/00722 .
v ~. a~
28
SBQ. ID NO : 9
TYPE DE SEQÜENCE : polypeptide
LONGÜBUR DE LA SÉQUENCE : 274 acides aminés
TYPE D8 MOLECOLE : protéine
ORIGINE . Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par
le cadre ouvert de lecture ORF1 du fragment d'ADN portant le
mécanisme de résistance Abi 105
Met Lys Asn Lys Gln Leu Gln Lys Tyr Lys Arg Thr Ser Met Asn
05 10 15
Ile Phe Arg Thr Lys Tyr Arg Arg Ile Ile Ser Ser Ser His Tyr
20 25 30
Ile Lys Arg Asp Lys Ile Pro Lys Ile Asn Asn Gly Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Glu Asp Leu Lys Asp Phe Tyr Ser Phe Glu Lys Ile Lys Lys
50 55 60
Lys Ile Asp Lys Ser Val Arg Ile Glu Glu Ser Glu Leu Ala Ile
65 70 75
Leu Lys Glu Phe Ile Asp Lys Thr Gly Tyr Phe Arg Phe Ser Ile
80 85 90
Tyr Leu Lys Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Thr Val Ile Asp
95 100 105
Ile Ile Lys Thr Cjrs Gln Leu Asp Gly Tyr Ile Arg Asp Asn Leu
110 115 120
Phe Ser Phe Thr Thr Arg Leu Glu Met Phe Trp Lys Lys Thr Ile
125 130 135
Val Asp Thr Met Cys Leu Asn Tyr Glu Thr Asn Asp Phe Phe His
140 ~ 145 150
Asn Ile Asn,Ser Gi55Cys Tyr Leu Asp Lys Lys Ile Tyr Lys Asn
160 165
Asp Glu Trp Gly Asn Leu Ile Ile Gln Glu Phe Asn Lys Ser Phe
170 175 180
Phe Ser Asn Asn Ser Pro Ala Phe Lys His His Lys Asn Lys Arg
185 190 195
Lys Asn Cys Ile Pro Ile Trp Ala Leu Phe Glu Gly Leu Thr Phe
Gly Gln Ile Asn ThrOPhe Ile Thr Gln LeuSAsp Ala Ar 210
215 220 g Tyr 225
Asn Ala Trp Val Ser Ser I1e Tyr Aan Asn Pro Ala Tyr Lys Lys
230 235 24,0
Pro Met Lys Ser Trp Ile Thr Val Ile Arg Thr Ser Arg Asn Arg
245 250 255
Ser Ala His Asn Ser Arg Ile Tyr Gly Leu Lys Ala Pro Asp Val
260 265 270
Pro Met Asp Phe
~''~~~~W092/05260 ~ û ~ ~ ~ ~ 1 PCT/FR91/00722
29
MICRO-ORGANISMES
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COLLECTION NATIONALE DE CULTURES
DE MICROORGANISMES
DE L'INSTITUT PASTEUR
Adflleo d1 IvnanYaon o eeoet
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28, rue du Dcoteur Toux, 75724
PARIS CEDEX 15 (FRANCE)
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13 SEPTEMBRE 1990 I I-999
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En ce qui concerne les dsignations
dans lesquelles un brevet
europen est demand, un chantillon
du micro-organisme dpo-
s ne sera accessible, jusqu'
la publication de la mention
de la dlivrance du brevet
europen ou jusqu' la date
laquelle la demande sera rejete,
retire o rpute retire,
que par la remise d'un chantillon
un expert dsign par
le requrant (rgle 28.4 de
la CBE).
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BREVET EUROPEENf FINLANDE,
NORVEGEf MONACO, CANADA,
USA, AUSTRALIE, JAPON
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W0 92/05260 PCT/FR91/00722 '~~~ '
' 30
MICRO.ORGANISMES
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COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES
DE L'INSTITUT PASTEUR
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28, rue du Dcoteur Toux, 75724 PARIS CEDEX 15 (FRANCE)
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13 SEPTEMBRE 1990 I-1000
s. IwolcATlow~ su~~u~lIwTAmâa ~ c~ n. r.m.u. qtr. .r M.....al. un. rrut,
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En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet
européen est demandé, un échantillon du micro-organisme dépo-
sé ne sera accessible, jusqu'à la publication de la mention
de la délivrance du brevet européen ou jusqu'à la date à
laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée,
que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par
le requérant (règle 28.4 de la CBE).
C. h'ATS otil~tlt~ toult u~p11161 X11 IIIOICATIOIIf iollT Deit11111~ a <H lao
IMNallono na aont pas ~onnla pour
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BREVET EUROPEEN, FINLANDE, NORVEGE, MONACO, CANADA,
USA, AUSTRALIE, JAPON
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Inl.lnallanal ~ ~(apNlfl.r (a noue O~n~lal. d~~ Ina,~~.,
eauon. p, u" . Ho d orle du d~pet.)
L. a W pN~anta lauilla a ~t~ ePu1 awd N dantanda lnt.rnaUOnal.lor.qw e.ll.~el
a ~t1 dlpoalo (1 v1r10~r par l'oRla. Ha~oeur)
. .~ ~~~.._,
(fonellonndr. avtorlN)
a D.11 d. eclpu0n (~n prov.nanC. du d~pol.nl) ou b Bur..u Int.rn.tlonal n'
(fonetlonnde autorlM) ._
iormulalr. PCTIR011i1 tJanvl.r 1111)
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~~'O 92/05260 PCT/FR91 /00722
31
MICRO-ORGANISMES
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au mleroeroanlama ntanuonnl
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A. 101NTIitCATION Dtl 010T
D'autraa dlpeta vont IdantIRa
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COLLECTION NATIONALE DE CULTURES
DE MICROORGANISMES
DE L'INSTITUT PASTEUR
Adralaa do l'InHltuflon da
dlplt (p Cempna le eeda postal
at la paya) ~ _ ._ _ r_
28, rue du Dcoteur Toux, 75724
PARIS CEDEX 15 (FRANCE)
Data da dlplt
N d'ordre
13 SEPTEMBRE 1990 I-1001
1. IN01CAT10Nti 11IL~1b111TAi1tli
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Nrte hWlle olpeNW t lolnH
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En ce qui concerne les dsignations
dans lesquelles un brevet
europen est demand, un chantillon
du micro-organisme dpo-
s ne sera accessible, jusqu'
la publication de la mention
de la dlivrance du brevet europen
ou jusqu' la date
laquelle la demande sera rejete,
retire ou rpute retire,
que par la remise d'un chantillon
un expert dsign par
le requrant (rgle 28.4 de la
CBE).
c. tTATS ot11o111s ~oult usousli
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001111f11 a (N 111 Indlt1t11na
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BREVET EUROPEN, FINLANDE, NORVEGE,
MONACO, CANADA,
USA, AUSTRALIE, JAPON
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(fonellonnalra autenN)
Fermuldre PCT~Ilenlr r.1-w-i-.
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