Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
21235~5
" Composition lipidique polaire d'origine végétale
permett~nt de vehiculer un agent actif et/ou de le
faire pénétrer dans une cellule cible "
La présente invention concerne une
S composition lipidique polaire d'origine végétale
permettant de véhiculer un agent actif et/ou de le
faire pénétrer dans une cellule cible.
Pour des raisons d'ordre écologique, on
cherche actuellement à protéger au maximum les animaux
et à éviter autant que possible de les utiliser au
niveau du laboratoire : cette tendance actuelle,
encouragée par les diverses ligues pour la protection
des bêtes, fait que les produits d'origine animale
sont de plus en plus mal acceptés.
Indépendamment de ces préoccupations d'ordre
philosophique, le développement des produits provenant
du- règne animal pourrait se trouver freiné dans
l'avenir : en effet, ces dernières années, on a vu
apparaître dans le règne animal, et en particulier
chez les ruminants, des virus de type prion qui
attaquent le cerveau et les tissus nerveux et sont
responsables d'atteintes neurologiques extrement
graves.
Or, il n'est pas exclu que de tels virus
soient susceptibles de se propager chez les humains ;
21235~
on craint que leur développement puisse avoir des
consé~uences dramatiques.
Compte tenu de cette incertitude, il existe
actuellement un préjugé à l'encontre des produits
provenant du règne animal.
Il est en particulier à noter ~ue certains
produits extraits des tissus nerveux d'origine bovine
ont, d'ores et déjà, été interdits par la Pharmacie
Centrale des Hôpitaux de Paris.
Cette contrainte nouvelle est source de
difficultés liées au fait que les produits d'origine
animale se trouvent déjà dans un état partiellement ou
totalement synthétisés, tandis que l'utilisation de
produits végétaux exige toujours des manipulations
complémentaires pouvant s'avérer longues et coûteuses.
Compte tenu de ce contexte, les chercheurs
exerçant dans des domaines tels que la dermatologie ou
la pharmacologie tentent de plus en plus à utiliser
des produits provenant du règne végétal ou des
produits d'origine marine en remplacement des produits
animaux, et ce, malgré les difficultés accrues ainsi
rencontrées.
Ces recherches ont abouti, conformément au
document antérieur non publié WO-.~-92/~1 321, à la
mise au point d'un procédé nouveau permettant
d'obtenir - à partir d'un compose végétal tel que de
la farine de céréale ou un extrait tel que du son, ou
encore des lipides extraits de céréale par des
solvants chlorés - un melange lipidique riche en
phospholipides, glycolipides et ceramides et en
particulier un mélange lipidique de base ayant la
composition pondérale suivante :
- céramides 90 %
- lécithines 5 %
- galactolipides 5 %
2123~8~
Il a déjà eté proposé de préparer à partir
de ce mélange lipidique de base des compositions
pouvant etre utilisées dans des domaines tels que la
cosmétologie ou la dermatologie.
On a maintenant découvert, conformément à
l'invention, que ce mélange de base d'origine
exclusivement végétale peut avoir de nombreuses et
importantes autres applications, en particulier dans
le domaine de la pharmacologie.
Les biologistes savent, depuis dejà de
nombreuses années, que toutes les cellules du règne
animal sont entourées de membranes plasmiques qui
constituent des barrières à perméabilité sélective ;
ces cytomembranes dont la texture est largement
constante, sont essentiellement constituées par une
double couche continue de molécules lipidiques
disposées parallèlement entre-elles et réunies par
leurs groupes hydrophobes, dans laquelle diverses
protéines membranaires sont encastrées.
Différents constituants entrent dans la
composition de ces doubles couches lipidiques de la
membrane plasmique et, notamment, des huiles non
polaires, ou des constituants polaires dont il
n'existe pas de classification universellement
reconnue par les spécialistes et parmi lesquels on
peut mentionner:
- les phospholipides tels que la lécithine,
- - les glycolipides ou galactolipides,
- les céramides, les sphingolipides et les
glycosphingolipides.
212~585
3bis
Chaque type de cellule a une composition en
constituants lipidiques notamment en constitutants
lipidiques polaires qui lui est particulière, et les
spécialistes ont pu établir des gammes de compositions
propres à chaque type de cellule.
Le tableau ci-dessous donne à titre
d'exemple les compositions lipidiques approximatives
de différentes membranes cellulaires.
.
21235~5
o o o la o o o o~
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5~ ~ 3
-- V P~
I
2 1 2 3 5 ~ ~
Les chercheurs ont pu prouver que les
constituants polaires des cytomembranes lipidiques ont
un rôle déterminant sur la perméabilité cellulaire et
donc influent sur les possibilités de pénétration des
agents actifs à l'intérieur des cellules.
Or, conformément à l'invention, on s'est
rendu compte que le mélange de base susmentionné a une
composition largement identique à celle des
constituants lipidiques polaires entrant dans la
composition des doubles couches lipidiques des
membranes plasmiques, et, que, à partir de ce mélange
- de base, il est possible de fabriquer, par fractionne-
ments successifs, un mélange lipidique "second" dont
la composition est identique à celle qui est propre à
un type donné de cellules.
L'idée à la base de l'invention est
d'utiliser cette identité pour fabri~uer, à partir du
mélange lipidique polaire de base, une composition
dans laquelle on reconstitue la formule lipidique des
cytomembranes lipidiques pour vehiculer un agent actif
ou faciliter sa pénétration dans une celluIe cible.
A cet effet, l'invention se rapporte à une
composition lipidique polaire d'origine vegétale
caractérisée en ce qu'elle est constituée par une
émulsion aqueuse injectable, intra-articulaire,
topique ou ingérable d'un mélange lipidique polaire
.riche en phospholipides en particulier en lécithine et
en ~éramides, ayant une composition essentiellemen~
identique à celle des constituants lipidiques polaires
30 des cytomembranes lipidique~ des cellules et obtenu à
partir d'un composé végétal tel que de la farine de
céréales ou un extrait tel que du son ou des lipides
extraits de ceréales.
Cette composition, qui peut être pharmaceu-
tique, cosmétique ou encore diététique peut revêtir
FEa.~ r~ Js~ ~NT
21~3~i8~
des formes variées sans pour cela sortir du cadre del'invention et, dans certains cas, la composition peut
même cons~ituer l'agent actif proprement dit.
A titre d'exemple, il est connu qu'un
excès de cholestérol peu~ provoquer le dépôt, sur la
paroi interne des artères, d'une plaque d'athérome
constituée par un mél~nge de cellules chargées de
graisse et de cristaux de cholestérol. La réaction de
la paroi en regard de la plaque d'athérome est
variable : elle commence par une sclérose
(athérosclérose) et est suivie de calcifications
(médiacalcose). Il peut s'ensuivre des thromboses
(coagulation du sang dans l'artère) et des anévrismes
(distention de la paroi).
Or, on a déjà pu mettre en évidence que
les mélanges lipidiques polaires conformes à
l'invention et en particulier les céramides et derivés
sont des émulsifiants du cholestérol : l'injection
dans le circuit sanguin d' un patient dont les artères
sont porteuses de nombreuses plaques d'athérome d'une
composition, conforme à l'invent:ion peut pèrmettre de
faciliter l'élimination de ces dépots ; ce mélange
lipidique va en effet extraire le cholestérol puis
faciliter son évacuation dans 1P circuit sanguin.
Plus précisément, pour obtenir la composi-
tion réellement mise en oeuvre conformément à
l'invention, on utilise la notion de HLB ou
"Hyrophile-Lipophile Balance'! qui correspond à un
classement des émulsifiants selon leur hydrophilie ou
leur lipophilie. Une HLB faible (3 à 5) caractérise
une émulsion à phase continue huileuse, une HLB plus
élevée (10 à 12) une émulsion à phase continue aqueuse
et au-delà une solubilisation.
Or, à partir de cette notion, on a
développé de nombreuses méthodes tant theoriques
21235~3~
qu'expérimentales pour déterminer dans chaque cas
particulier la composition d'un système de tensio-
actifs donnant l'émulsion la plus fine et donc le
couplage optimum de plusieurs tensio-actifs.
Selon l'invention, pour déterminer in
vitro la composition optimale pour l'émulsification du
cholestérol, on a utilisé un processus expérimental
basé sur la recherche par mesure de la conductivité de
la quantité d'eau provoquant l'inversion de phase
d'une émulsion.
On a ainsi obtenu un HLB de 8 à 10.
Conformément à une variante
particulièrement avantageuse de l'invention,
l'émulsion a une composition essentiellement identique
à celle des cytomembranes lipidiques d'une cellule
cible et renferme un agent actif enrobé dans une gaine
du mélange lipidique.
Une telle composition peut, à titre
d'exemple, renfermer un agent d'hydratation associé,
le cas échéant, à des additifs tels que des vitamines
A ou E et enrobé dans une gaine ayant une composition
identique à celle des cytomembranes lipidiques des
cellules de l'épiderme et en particulier du stratum
cornQum ; les agents d'hydratation présents dans ces
compositions peuvent etre des agents humectants ou
hygroscopiques liposolubles tels que par exemple la
l~noline, des acides gras polyinsaturés notamment la
vitamine F, l'acide linoléique, l'acide gammalinoléni~
que ou l'acide eicosapentaenoique ou encore des agents
hydrosolubles tels que la ~lycérine, les mucopolysac-
charides, les dérivés d'allantoïne, les acides aminés,
l'urée, le sodium, le potassium~
Dans de telles compositions, qui peuvent
être utilisees pour la lutte contre le vieillissement
ou le traitement des brûlés, le mélange lipidique
2123,j~
polaire agit en fait à deux niveaux : il améliore la
permeabilité membranaire vis-à-vis de l'agent actif,
mais, parallèlement contribue lui-même à l'hydratation
des cellules ; on a, en effet, récemment pu mettre en
évidence le rôle dans les mécanismes d'hydratation de
la peau des phospholipides et surtout des céramides
qui sont susceptibles de contribuer à une meilleure
rétention de l'eau, de restructurer l'épiderme et
notamment le ciment intercornéocytaire et d'améliorer
la résistance de la peau aux agressions extérieures.
La composition conforme à l'invention peut
également revêtir la forme d'une composition médica-
menteuse destinée a diverses classes thérapeutiques et
dont l'agent actif peut revêtir des formes variées et
notamment être choisi dans le groupe formé par les
antibiotiques, les anti-inflammatoires, les cortidoï-
des, les antiviraux, les anticancéreux et les
médicaments des pathologies cardiovasculaires.
A titre d'exemple, on peut plus
précisément citer la possibilité de véhiculer les
agents actifs suivants :
.~ .~
2123~i85
. . .
Classe thérapeutique ll Agents actifs
; ~
Cardio-angéiologie Rutine
_
Dermatologie Vitamine A acide
Endocrinologie et Testosterone
hormones
Métabolisme Huiles riches en acide
acide gamma linoléique
acide eicosapentaenoique
acide docosahexaenoique
I _ --
Rhumatologie Hydrocortisone
(anti-inflammatoires
non stéroidiens)
_ I
Immuno allergolo~ie Allergènes
_ , ~ . _
Grâce au choix d'un mélange lipidique
polaire dont la composition correspond à celle des
cytomembranes lipidiques des cellules cibles que l'on
désire traiter, il est ainsi possible d'injecter
l'agent actif directement sur le site voulu où il va
"attaquer" sélectivement les cellules cibles
permettant ainsi, pour un effet et un rendement
améliorés, de diminuer sa concentration et donc
d'éviter autant que possible les effets secondaires.
Les exemples susmentionnés ne sont, bien
.entendu, pas limitatifs et on peut envisager de
nombreuses autres applications de l'invention,
cons-istant notamment à faire rentrer un élément tel
que du sodium dans une cellule déficiente.
Dans tous les cas, la gaine lipidique
polaire constitue, grace à sa composition sélective,
un vecteur permettant d'améliorer la perméabilité de
la cellule cible pour le produit actif.
Il est également possible, selon une autre
. ~
2123~5
caractéristique de l'invention, d'incorporer dans la
composition, en tant qu'agent actif, non pas un
composé à proprement parler "traitant" mais une
substance toxique sélective pour un agent pathogène,
notamment un virus, une bactérie ou un champignon.
Dans ce cas particulier, la gaine lipidique
polaire fait office de "leurre" pour piéger l'agent
pathogène et faciliter son élimination.
On peut utiliser cet aspect de l'invention
pour la lutte contre le sida en enrobant de l'AZT dans
une gaine lipidique polaire dont la composition
correspond à celle des cytomembranes lipidiques des
leucocytes : le virus du sida peut en effet
reconnaltre les lipides constitutifs de la gaine qui
correspondent à sa voie de pénétration normale dans
les cellules et venir ainsi en contact avec l'AZT de
fa~on à favoriser sa destruction.
Le système lipidique polaire du présent
brevet peut être également utilisé comme véhicule de
composants de vaccins nécessaires au renforcement de
1'immunité humorale et cellulaire.
Les caractéristiques de la composition
lipidique polaire qui fait l'objet de l'invention
seront dé~aillées dans les exemples ci-dessous :
EXEMPLE 1 :
On a fabriqué une composition cosmétique
ayant la formule pondérale suivante :
Vitamine E acétate 0,5 ~
Lécithine hydrogénée 0,5 % -
Céramides 0,5 %
Vitamine A 0,1 %
~1 000 000 ui/g)
Conservateurs + Eau.
2 1 2 3 `~
Cette composition s'est avérée très stable
et à un toucher particulier qui plaît aux
utilisatrices.
EXEMPLE 2 :
S Compte rendu d'un test réalisé dans les
Laboratoires de la Faculté de Pharmacie de Chatenay
Malabry (France) dans le but de vérifier l'activité
d'un mélange lipidique polaire conforme à l'invention
sur la protection par les corticoides contre une
att~que radicalaire.
Le principe de ce test consiste à soumettre
des hématies isolées de leur plasma à une agression de
type oxydatif dans des conditions contrôl.ées et
standardisées de façon à leur permettre de mettre en
jeu tout leur équipement enzymati~ue et moléculaire
pour résister à cette agression jusqu'à modification
de la membrane cellulaire et éclatement et lyse de la
cellule.
Plus précisément, différentes préparations
contenant des hématies ont été soumises à une attaque
par des radicaux libres organiques produits par
décomposition thermale d'un composé azoté soluble dans
l'eau particulier : le chlorhydrate de 2,2'-azo-bis-2
amidinopropane (100 n~), sous atmosphère d'air à 37 C.
On a ainsi pu produire une quantité connue et
constante de radicaux peroxydés.
A intervalle régulier dans le temps, on a
prélevé, dans la préparation, un petit volume de
surnageant et on a analyse son contenu en hémoglobine
par spectrophotométrie (l = 540 nm ou 405 nm).
- La résistance dè la population d'hématies de
chacune des préparations testées a alors été exprimée
par le temps de demi lyse, c'est-à-dire le temps de
li~ération de 50 ~ du contenu en hémoglobine.
Pour réaliser ce test, on a choisi des
r _ . ~ . ;. ~. .~ . .
2123~8~
hématies humaines isolées préalablement lavées et
remises en suspension dans de l'hematocrite (à 11 %) ;
ces cellules présentent, en effet, l'avantage d'avoir
une demi-vie relativement courte (environ 110 jours)
5 et de posséder tout l'équipement moleculaire et
enzymatique de la protection anti-radicaux libres, ce
qui leur permet d'être représentatives des autres
cellules de l'organisme.
Pour réaliser ce test, on a préalablement
préparé les compositions suivantes conformes à
l'invention :
Composition A
Vitamine E acétate 2
Lécithine hydrogénée
Céramides 1 %
Vitamine A acide 0,05
Conservateurs ~ Eau.
Composition B
Vitamine E acétate 2 ~
Lécithine hydrogénée 1 %
Céramides 1 %
Dexamethasone 0,02 %
Conservateurs + Eau.
On a ensuite fabrique le~ cinq préparations
tests suivantes :
1 : Hématies
2 : Hématies + Composi~ion A (1/10)
3 : Hématies + Cvmposition B (1/10)
4 : Hématies + Betneval (marque déposée)
(1/10)
` S : Hématies + Effederm (marque déposée)
(1/10).
2123~
Le Betneval et l'Effederm correspondent à
des médicaments du commerce renfermant respectivement
de la dexaméthasone et de la vitamine A acide à des
concentrations similaires à celles des compositions A
et B conformes à l'invention.
Le tableau ci-dessus donne les temps de
demi lyse T50 exprimés en minute ob~enus pour chacune
des préparations testées :
¦ Préparation l T50 ]
;
15 1 ~
Ces résultats montrent que l'addition des
deux produits du commerce ne protège que très
faiblement la durée de vie des hematies soumises à un
"stress" radicalaire, tandis que les deux compositions
conformes à l'invention qui ont été testées ont permis
d'obtenir une protection de beaucoup supérieure.
EXEMPLE 3 :
- Compte rendu d'un tPst réalisé au
Laboratoire du Tissu Conjonctif du CNRS de Creteil
(France) dans le but de vérifier l'activité d'un
mélange lipidique polaire conforme à l'invention sur
l'inhibition d'une enæyme particulière, l'élastase
leucocytaire humaine (ELH) qui présente la propriéte
de détruire l'élastine et donc de provoquer un
vieillissement cellulaire et d'altérer également les
parois artérielles.
212~
L'activité du mélange conforme à l'invention
a été comparée à celle de l'acide oléique, substance
de référence.
Le principe de ce test consiste à mesurer
1'inhibition de l'activité enzymatique par différentes
préparations testées en suivant la cinétique à 410 nm
de la dégradation d'un substrat S correspondant
essentiellement à l'élastine le : Me-O-Suc-Ala2-Pro-
Val-pNa (N-Méthoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-Nitro-
anilide) Dans ce test, on mesure, dans le temps,
l'evolution de la concentration en p-Nitroanil:Lne qui
se trouve libérée sous l'effet de l'activ:ite de
1'enzyme ELH sur le substrat S.
Pour réaliser ces tests, on a utili~é en
tant que tampons de réaction T :
- soit le tris-HCl 0,1 M + 0,01 % de triton
X-100 à pH 8,
- soit le tris-HCL 0,1 M à pH 8.
De manière générale, on a pu observer une
meilleure inhibition dans le tris-HCL, mais une
activité enzymatique plus faible que dans le tampon
tris-HCL + 0,01 % de triton X-100.
Dans le cadre de cet exemple :
.- la figure 1 représen~e l'activité anti-elastasique
de-l'acide oléique de référence,
- la figure 2 représente l'actlvite anti-élastasique
3~ de la préparation A,
- la figure 3 représente l'activité anti-élastasique
de la préparation B,
- la figure 4 représente l'activité anti-élastasi~ue
de la préparation C,
- la figure 5 représente l'activité anti-élastasique
2123~
de la préparation D.
Plus précisément :
Pour chacune des sustances testées, on a
préparé les cuves 1 à 5 dont la composition est
répertoriées dans le tableau ci-après :
.
-~
. .
2123585
16
E E I ~~ E
i h ~ O ~ O ~
~ ~0~ t~
_ - o o-- ,n~ ~
a~
O
~ ~ _ ~ I
o :1 ~ R
L~ ~ 1~ P~ u~
FE ~Q ~ ?
2 1 2 3 5 g 3
On a ensuite agité chacune des cuves
pendant 30 mn à 37C de manière à laisser à 1'enzyme
le temps d'agir sur son substrat.
On a ensuite effectué la lecture à 410
nm de la concentration en p-nitro-aniline et reporté
les résultats obtenus sur des courbes 1 à 5 qui
correspondent aux cuves de même numérotation. Les
courbes numérotées 1 correspondent à la référence
tandis que les courbes 2 et 3 représentent les
cinétiques en l'a~sence de préparations testées et les
courbes 4 et 5 en présence de ces préparations.
Sur chacune de ces courbes, on a
reporté, en abcisse, le temps en minutes et, en
ordonnée, la déviation optique DO lue à 410 nm.
Les préparations testées ont été les
suivantes :
- Préparation A : Ceramide 1 % + lécithine hydrogénée
1 960 - Préparation B : Céramide 1 % + lécithine hydrogénée
1 ~ ~ Vitamine E acétate 2 %
- Préparation C : Céramide 1 ~ ~ lécithine hydrogénée
1 ~ + Vitamine E acétate 2 ~ +
Vitamine A acide 0,05 %5 - Préparation D : Ceramide 1 ~ ~ lécithine hydrogénee
1 % + Vitamine E acétate 2 % +
- Dexamethazone 0,02 ~.
Pour l'acide oléique de reférence, on a
procédé de manière quelque peu différente vu que l'on
a utilisé sept cuves de mesure à partir desquelles on
a établi, à chaque fois, les courbes correspondant au
suivi de la cinétique de la li~ération de p-nitro-
aniline. Les courbes 1 à 3 correspondent respective-
ment, comme pour les préparations conformes à
212~S8~
18
l'invention, à la courbe de référence et auxcinétiques en l'absence d'acide oléique. Les courbes 4
et 5 correspondent à une concentration en acide
oléique égale à 0,1 ~g/ml tandis que les courbes 6 et
7 correspondent à une concentration en acide oléique
de 1 ~g/ml.
Les courbes correspondant à l'acide oléique
de référence ainsi qu'aux préparations A à D sont
jointes en annexe.
Sur chacune d'entre-elles, on a mesuré le
pourcentage d'inhibition de l'activité anti-
élastasique de chacune des différentes préparatLon au
bout de 10 mn et on a trouvé les résultats suivc~nts :
Acide oléique de référence à 0,1 yg/ml : 36 %
Acide oléique de référence à 1 ~g/ml : 84 %
Préparation A : 45 %
Préparation B : 24 %
Préparation C : 29 %
20 Préparation D : 51 ~.
Ces résultats permettent de prouver
clairement l'activité anti-élastasique des
compositions conformes à l'invention et, en particu-
lier, des céxamides.
Cette activité n'avait jusqu'à présentjamais été démontrée.
, I
3~
FE~gS~ c~ r ~
