Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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NOUVEAUX POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE ~TIMULATION
DES COLONIES DE GRANllLOCYTES.
LEUR PREPARATlOl~l~T CQ~POSIII~I~ PH~RMACEUTIQUES
LE$ CON~ENANT
La présente invention concerne de nouveaux polypeptides ayant une activité
de stimulation des colonies de granulocytes humain, leur préparation et des
compositions pharmaceutiques les contenant.
La présente invention concerne en particulier des polypeptides chimères
composés d'une partie biologiquement active constituée par tout ou partie du G-CSF
~o ou d'un variant du G-CSF, et d'une s~ructure stabilisatrice essentiellennent protéique
lui conférant de nouvelles propriétes biologiques.
Le G-CSF humain est un polypeptide sécrété de 174 acides aminés, ayant
un poids moléculaire de 18 kD environ. Il a été isolé initialement à parhr d'unelignée cellulaire cancéreuse (EP 169 566)~ et son gène a été cloné, séquencé, etexprimé dans différents hôtes cellulaires par les techniques du génie génétique (EP
215 126, EP 220 ~20). Un ARNm codant potentiellement pour une forme du G-CSF
ayant 177 acides aminés a par ailleurs été mis en évidence [Nagata S. et al., EMBO
J. ~ (1986~ 575-581]. Le G-CSF possède la capacité de stimuler la différentiation et
la prolifération de cellules p~génitrices de la moelle osseuse en granulocytes. A ce
titre, il possede la eapacité de stimuler les capacités protectrices de l'organisme
contre l'infection en favorisant la croissance des polynucléaires neutrophiles et leur
différentiation aboutissant à la maturité. Il est ainsi capable d'activer les fonctions
prophylactiques de l'organisme, et pellt être utilisé dans différentes situations
pathologiques dans lesquelles le nombre de neutrophiles est anormalement faible, ou
2j dans lesquelles le système immunitaire doit être renforcé. De telles situations
surviennent par exemple à la suite des traitements de chimiothérapie anticancéreuse~
lors de greffes~ et en particulier de greffes de moelle osseuse, ou lors des
leukopenies.
L`un des inconvénients du G-CSF actuellement disponible réside dans le
fait qu'il est dégradé rapidement par l'organisme une fois administré. Ceci est
d'autant plus sensible que le G-CSF est généralement utilise à des doses faibles. De
plus, l'utilisation de doses plus importantes n'a pu permettre d`améliorer les capacités
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`' '; ''`1 `'' ~
thérapeutiques de cette molécule et peut induire des effets secondaires indésirables
Ces phénomènes d'élimination et de dégradation in vivo constituent donc pour
l'instant un obstacle à l'exploitation de l'activité biologique du G-CSF en tantqu'agent pharmaceutique.
La présente invention permet de remédier à ces inconvénients. La présente
invention fournit en effet de nouvelles molécules permettant une exploitation
optimale sur le plan thérapeutique des propriétés biologiques du G-CSF. La
demanderesse a en effet mis en évidence que l'activité optimale du G-CSF se
manifestait lorsque le G-CSF était présent à faible dose et pendant un temps
prolongé. La demanderesse a maintenant réalisé des molécules capables de maintenir
dans l'organisme une activité G-CSF pendant un temps suffisamment long. De plus,la demanderesse a montré qu'il est possible d'exprimer dans des hôtes cellulaires à
des niveaux élevés des fusions génétiques générant des chimères présentant de
nouvelies propriétés pharmacocinétiques et les propriétés biologiques désirables du
G-CSF. En particulier, les polypeptides hybrides de l'invention conservent leur
affinité pour les récepteurs du G-CSF, et sont suffisamment fonctionnels pour
conduire à la prolifération et à la différentiation cellulaire. Les molécules del`invention possèdent par ailleurs une distribution et des propriétés
pharmacocinétiques particulièrement avantageuses dans l'organisme et permettent le
développement thérapeutique de !eur activité biologique.
Un objet de la présente inventi~l concerne donc des polypeptides
recombinants comportant une partie active constituee par tout ou partie du G-CSF,
ou d'un variant du G-CSF, et une structure stabilisatrice essentiellement protéique.
Au sens de la présente invention, le terme variant du G-CSF désigne toute
2s molécule obtenue par modification de la sequence compri~ entre les résidus lhrS86
et Pro759 de la séquence présentée sur la Figure 1, conservant une activité G-CSF,
c'est-à-dire la capacité de stimuler la différenciation des cellules cibles et la
fo~mation de colonies de granulocytes. Cette séquence co~Tesponds à celle du G-CSF
mature dé~crite par Nagata et al. [EMBO J. ~ ~1986) 575-581]. Par modification, on
doit entendre toute mutation, substitution, delétion, addition ou modification
consecutive à une action de nature génétique etlou chimique. De tels variants
peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d`augmenter
l'affinité de la molécule pour le(s) récepteur(s) du G-CSF, celui d`ameliorer ses
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; ! i r. '
nivealL~c de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui
d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou
celui de lui eonférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Des polypeptides de l'invention particulièrement avantageux sont ceux dans
5 lesquels la partie biologiquement active possède:
(a) la séquence peptidique comprise entre les résidus ThrS86 et Pro759 de
la séquence présentée sur la Figure 1, ou,
(b) une partie de la structure (a), ou,
(c) une structure dérivée des structures (a) ou (b~ par modifications
10 structurales (mutation, substitution addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus)
et ayant une activité biologique identique ou modifiée. Ce dernier type de
polypeptides comprend par exemple les molécules dans lesquelles certains sites de
glycosylation ont été modifiés ou supprimés, ainsi que des molécules dans lesquelles
un, plusieurs, voire tous les résidus cystéine ont été substitués. 11 comprend
15 également des molécules obtenues à partir de (a) ou (b) par délétion de régions
n'intervenant pas ou peu dans l`activité, ou intervenant dans une activité indésirable,
et des molécules comportant par rapport à (a) ou (b) des résidus supplémentaires,
tels que par exemple une méthionine N-terminale ou un signal de secrétion.
Plus préférentiellemen$, les polypeptides chimères de l'invention
20 comprennent une partie active de type (a).
La partie active des molécules de l'invention peut être couplée à la structure
stabilisatrice protéique, soit directement, soit par l'interrnédiaire d`un peptide de
jonction. De plus, elle peut constituer l'extrémité N-tenninale comme l`extrémité C-
terrninale de la molécule. Préférentiellement, dans les molécules de l'invention, la
2s p~ie active constitue la partie C-terminale de la chimère.
Comme indiqué plus haut, la structure stabilisatrice des polypeptides de
l'invention est essentiellement protéique.
Préférentiellement, cette structure est un polypeptide possédant une demie-
vie plasmatique élevée. A titre d'exemple, il peut s'agir d'une albumine, une
30 apolipoprotéine, une immunoglobuline ou encore une transferrine. Il peut également
s'agir de peptides dérivés de telles protéines par modifications structurales, ou de
peptides synthétisés artificiellement ou semi-artificiellement, et possedant une
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demie-vie plasmatique élevée. Par ailleurs, la stlucture stabilisatrice utilisée est plus
préférentiellement un polypeptide faiblement ou non-immunogénique pour
l`organisme dans lequel les polypeptides de l'invention sont utilisés.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la
structure stabilisatrice est une albumine ou un variant de l'albumine et par exemple
la sérum-albumine humaine (SAH). Il est entendu que les variants de l'albumine
désignent toute protéine à haute demie-vie plæmatique obtenue par modification
(mutation, délétion et/ou addition) par les techniques du génie génétique d'un gène
codant pour un isomorphe donné de la sérum-albumine humaine, ainsi que toute
~; 10 macromolécule à haute demie-vie plasmatique obtenue par modification in vitro de
la pro~he codée par de tels gènes. L`albumine étant très polymorphe, de nombreuxvariants naturels ont dèjà été identifiés, et plus de 30 types génétiques dimrents ont
été répertoriés [Weitkamp L.R. et al., Ann. Hum. Genet. 37 (1973) 219]. Plus
~; ; ptefaentiellement, la structure sta~bilisatrice est une albumine mature.
A titre d'exemp!es on peut citer des polypeptides de l'invention comportant,
~.
dans le sens N-tenninal --> C-terminal, (i) la sequence de la SAH mature coupléedi~ment à la séquence du G-CSF mature (cf. Figure 1), ou (ii) la séquence du G-
CSF mature couplée par l'intermédiaire d'un peptide de liaison à la séquence de la
SAH mature.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation des
molécules chimères décrites ci-avant. Plus précisément, ce procédé consiste à faire
ex;primer par un hôte cellulaire eucaryote o~. procaryote une séquence nucléotidique
codant pour le polypeptide désiré, puis à récolter le polypeptide produit.
Panni les hotes eucaryotes utilisables dans le cadre de la présente invention,
2~ on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier,
- s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomvces,
Kluweromvces, ~ichia, Schwanniomyces, ou ~ansenula. S'agissant de cellules
animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, etc.., Parmi les champignons
susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, on peut citer plus
30 particulièrement ~sp~r~illus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hotes procaryotes, on
préfère utiliser les bactéries telles que E~;~hrerichia coli, ou appaftenant aux genres
~; Conrnebac~erium, BaCillus, ou Streptomyces.
:~
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Les séquences nucléotidiques utilisables dans le cadre de la présente
invention peuvent être préparées de différentes manières. Généralement, elles sont
obtenues en assemblant en phase de lecture les séquences codant pour chacune desparties fonctionnelles du polypeptide. Celles-ci peuvent être isolées par les
5 techniques de l'homme de l'art, et par exemple directement à partir des ARN
messsagers (ARNm) cellulaires, ou par reclonage à partir d'une banque d'ADN
complémentaire (ADNc) isolé à partir de cellules productrices, ou encore il peuts'agir de séquences nucléotidiques totalement synthétiques. Il est entendu de plus que
les séquences nucléotidiques peuvent également être ultérieurement modifiées, par
l0 exemple par les techniques du gènie génétique, pour obtenir des dérivés ou des
vaIiants desdites séquences.
Plus préférentiellement, dans le procédé de l'invention, la séquence
nucléotidique fait partie d'une cassette d'expression comprenant une région
d'initiation de la transcription (région promo~eur) permettant, dans les cellules hôtes,
15 l'expression de la séquence nucléotidique placée sous son contrôle et codant pour les
polypeptides de l'invention. Cette région peut provenir de régions promoteurs degènes fortement exprimés dans la cellule hôte utilisée, l'expression étant constitutive
ou régulable. S'agissant de levures, il peut s'agir du promoteur du gène de la
phosphoglycérate kinase (PGK~, de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
20 ((~PD), de la lact~se (L~4). des énolases (ENO), des alcools deshydrogénases
(~), etc... S'agissant de bactéries, il peut s'agir du promoteur des gènes droit ou
gauche du bactériophage lambda ~PL, PR), ou encore des promoteurs des gènes des
opérons tryptophane (Ptrp) ou lactose (Plac). En outre, cette région de contrôle peut
être modifiée, par exemple par mutagénèse i~vi~rQ, par introduction d'éléments
additionnels de contrôle ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des
substitutions- des éléments originels de contrôle. La cassette d'expression peutégalement comprendre une région de terrninaison de la transcription fonctior~nelle
dans l`hôte envisagé, positionnée immediatement en aval de la séquence
nucléotidique codant pour un polypeptide de l'invention.
Dans un mode préféré, les poly~?eptides de l'invention résultent de
I'expression dans un hBte euca~ote ou procaryote d'une séquence nucléotidique et de
la sécrétion du produit d'expression de ladite séquence dans le milieu de culture. Il
est en effet particulièrement avantageux de pouvoir obtenir par voie recombinante
des molécules directement dans le milieu de culture. Dàns ce cas, la séquence
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nucléotidique codant pour un polypeptide de l'invention est précédée d'une séquence
"leader" (ou séquence signal) dirigeant le polypeptide naissant dans les voies de
sécrétion de l'hôte utilisé. Cene séquence "leader" peut être la séquence signalnaturelle du G-CSF ou de la structure stabilisatrice dans le cas où celle-ci est une
s protéine naturellement sécrétée, mais il peut également s'agir de toute autre séquence
"leader" fonctionnelle, ou d'une séquence "leader" artificielle. Le choix de l'une ou
l'autre de ces séquences est notamment guidé par l'hôte utilisé. Des exemples deséquences signal fonctionnelles incluent celles des gènes des phéromones sexuelles
ou des toxines "killer" de levures.
En plus de la cassette d'expression, un ou plusieurs marqueurs permettant
de sélectionner l'hôte recombiné peuvent atre additionnés, tels que par exemple le
gène URA3 de la levure S. cerevisiae, ou des gènes conférant la résistance à desantibiotiques comme la généticine (G418) ou à tout autre composé toxique comme
certains ions métalliques.
L'ensemble constitué par la cassette d'expression et par le marqueur de
sélection peut être introduit directement dans les cellules hôtes considérées, soit
inséré préalablement dans un vecteur autoréplicatif fonctionnel. Dans le premier cas,
des séquences homologues à des régions présentes dans le génôme des cellules hôtes
sont préférentiellement additionnées à cet ensemble; lesdites séquences étant alors
20 positionnées de chaque côté de la cassette d'expression et du gène de sélection de
façon à augmenter la fréquence d'intégration de l'ensemble dans le génome de l'hôte
en ciblant l'intégration des séquences par recombinaison homologue. Dans le cas où
la cassette d'expression est insérée dans un système réplicatif, un système de
réplication préféré pour les levures du genre ~ç~m~ est dérivé du plasmide
25 pKD1 initialement isole de K drosophilarum; un système préféré de réplication pour
les levures du genre Sac~haromvces est dérivé du plasmide 2~ de S~ cerevisiae~ De
plus, ce plasmide d'expression peut contenir tout ou partie desdits systèmes de
réplication, ou peut combiner des éléments dérivés du plasmide pKDl aussi bien que
du plasmide 2~
En outre, les plasmides d`expression peuvent être des vecteurs navettes
entre un hôte bactérien tel que ~scherichia coli et la cellule hote choisie. Dans ce
cas, une origine de réplication et un marqueur de sélection fonctionnant dans l'hote
bactérien sont requises. 11 est également possible de positionner des sites de
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, , ,,; . ,
restriction entourant les séquences bactériennes et uniques sur le vecteur
d'expression: Ceci permet de supprimer ces séquences par coupure et religature
vitro du vecteur tronqué avant transformation des cellules hôtes, ce qui peut résulter
en une augmentation du nombre de copies et en une stabilité accrue des plasmidesd'expression dans lesdits hôtes. Par exemple, de tels sites de restriction peuvent
correspondre aux séquences telles que 5'-GGCCNNNNNGGCC-3` (~I) ou 5`-
GCGGCCGC-3' (~I) dans la mesure où ces sites sont extrêmement rares et
généralement absents d'un vecteur d'expression.
Après construction de tels vecteurs ou cassette d'expression, ceux-ci sont
~o introduits dans les cellules hôtes retenues selon les techniques classiques décrites
dans la littérature. A cet égard, toute méthode permettant d'introduire un ADN
étranger dans une cellule peut être utilisée. Il peut s'agir notamment de
transformation, électroporation, conjugaison, ou toute autre technique connue del'homme de l'art. A titre d'exemple pour les hôtes de type levure, les différentes
souches de Kluweromyces utilisées ont été transformées en kaitant les cellules
entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol, selon la
technique décrite par Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1983) 163]. La technique detransformation décrite par Durrens et al. [Curr. Genet. ~ (1990) 7] utilisant
l'éthylène glycol et le diméthylsulfoxyde a également été utilisée. Il est aussi- ~ 20 possible de transformer les levures par électroporation, selon la méthode décrite par
Karube et al. [FEBS Letters 1~ (1985) 901. Un protocole alternatif est égalementdécrit en détail dans les exemples qui suivent.
Après sélection des cellules transformées, les cellules exprimant lesdits
polypeptides sont inoculées et la recupération desdits polypeptides peut être faite,
soit au cours de la croissance cellulaire pour les procédés "en continu", soit en fin de
croissance pour les cultures "en lots" ("batch"). Les polypeptides qui font l'objet de
la présente invention sont ensuite purifiés à partir du surnageant de culture en vue de
leur caractérisation moléculaire, p~iarmacocinétique et biologique.
Un système d'expression préféré des polypeptides de l'invention consiste en
I'utilisation des levures du genre ~l~yveromvces comme cellule hôte, transformees
par certains vecteurs dérivés du réplicon extrachromosomique pKD1 initialement
isolé chez K. marxianus var. drosophîlarum. Ces levures, et en particulier K lactis et
K. fra~ilis sont généralement capables de répliquer lesdits vecteurs de hçon stable et
;~
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possèdent en outre l'avantage d'être incluses dans la liste des organismes G.R.A.S.
("5~enerally Recognized As ~afe"). Des levures privilégiées sont préférentiellement
des souches industrielles du genre Kluvveromyces capables de répliquer de façon
stable lesdits plasmides dérivés du plasmide pKD1 et dans lesquels a été inséré un
5 marqueur de sélection ainsi qu'une cassette d'expression permettant la sécrétion à des
niveaux élevés des polypeptides de l'invention.
La présente invention concerne également les séquences nucléotidiques
codant pour les polypeptides chimères décrits ci-avant, ainsi que les cellules
recombinantes, eucaryotes ou procaryotes, comprenant de telles séquences.
La présente invention concerne aussi l'application à titre de médicament des
polypeptides selon la présente invention. Plus particulièrement, l'invention a pour
objet toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides tel
que décrit ci-avant. Plus particulièrement, ces compositions peuvent être utilisées
dans toutes les situations pathologiques dans lesquelles le nombre et3ou l'activité des
15 granulocytes doivent être stimulées. Notamment, elles peuvent être utilisées pour la
prévention ou le ~raitement des leukopénies ou de certaines leucémies, ou dans le cas
de greffes ou de traitement anticancéreux, pour renforcer ou restaurer le système
immunitaire.
La presente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples
20 qui suivent, qui doivent être considérés comme ;llustratifs et non limitatifs.
Les représentations des plasmides indiquées dans les Figures suivantes ne sont pas
traçées à l'échelle et seuls les sites de ~estriction importants pour la compréhension
des clonages réalisés ont eté indiqués.
2S ~Ygure 1: Séquence nucléotidique du fragment de restriction ~III
du plasmide pYG1259 (chimère prépro-SAH-G.CSF). Les flèches noires indiquent
la fin des régions "pré" et "pro" de la SAH. Les sites de res~riction ~5~Il"~I et
SstI (~I) sont soulignés. La séquence peptidique du G-CSF est en italique
(ThrS86->Pro759, la numérotation des acides aminés correspond à la protéine
chimère mature).
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~ J ~ r ~
Figure 2: Schématisation des chimères du type SAH-G.CSF (A), du
type G.CSF-SAH ~B) ou G.CSF-SAH-G.CSF (C). Abréviations utilisées: M/LP,
méthionine initiatrice de la traduction, éventuellement suivie d'une séquence signal
de sécrétior.; SAH. sérum-albumine humaine mature ou un de ses variants; G.CSF,
peptide dérivé du G-CSF et ayant une activité identique ou modifiée. La flèche noire
indique l'extrémité N-terminale de la protéine mature.
Figure 3: Carte de restriction du plasmide pYG105 et stratégie de
construction des plasmides d'expression des protéines chimères de la présente
inveneion. Abréviations utilisées: P, promoteur transcriptionnel; T, terminateurtranscriptionnel; IR, séquences répétées inversées du plasmide pKD1; LPSAH,
région "prépro" de la SAH; Apr et Kmr désignent respectivement les gènes de
résistance à l`ampicilline (E. coli) et au G418 (levures).
Figure 4: Caractérisation du matér;el sécrété après 4 jours de culture
(erlenmeyers) de la souche CBS 293.91 transforrnée par les plasmides pYG1266
(plasmide d'expression d'une chimère du type SAH-G.CSF~ et pKan707 (plasmide
contrôle). Dans cette expérience les résultats des panneaux A, B, et C ont été migres
sur le même gel (SDS-PAGE 8,5 ~) puis traités séparemment.
A, coloration au bleu de coomassie; standard de poids moléculaire (piste 2);
surnageant équivalent à 100 ~1 de la culture transformée par les plasmides pKan707
en milieu YPL (piste 1), ou pYG1266 en milieu YPD (piste 3) ou YPL (piste 4).
B, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation
d`anticorps primaires dirigés contre le G-CSF humain: même légende qu`en A.
C, caractérisation immunologique du matériel secrété après utilisation
d'anticorps primaires dirigés contre l'albumine humaine: même légende qu'en A.
2~ Figure 5: Séquence nucléotidique du fragment de restriction HindIII
du plasmide pYG1301 (chimère G.CSF-Gly4-SAH). Les flèches noires indiquent la
fin des régions "pre" et "pro" de la SAH. Les sites de restriction ~I, ~I (~I) et
MstII sont soulignés. Les domaines G.CSF (174 résidus) et SAH (585 résidus) sontséparés par le linker synthétique GGGG. La numérotation des acides aminés
corresponds à la protéine chimère G.CSF-Gly4-SAH mature (763 residus). La
séquence nucléotidique comprise entre le codon de terminaison de la traduction et le
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site HindIII provient de l'ADN complémentaire (cDNA) de la SAH tel que décrit
dans la demande de brevet EP 361 991.
Figure 6: Caractérisation du matériel sécrété après 4 jours de culture
(erlenmeyers en milieu YPD) de la souche CBS 293.91 transformée par les
plasmides pYG1267 (chimère SAH-G.CS~), pYG1303 (chimère G.CSF-Gly4-SAH)
et pYG1352 (chimère SAH-Gly4-G.CSF) après migration sur gel SDS-PAGE
8,5%.
A, coloration au bleu de coomassie; surnageant équivalent à 100 ~I de la
culture transformée par les plasmides pYG1303 (piste 1), pYG1267 (piste 2) ou
o pYG1352 (piste 3); standard de poids moléculaire (piste 4).
B, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation
d`anticorps primaires dirigés contre le G-CSF humain: meme légende qu'en A.
Figure 7: Activité sur la prolifération cellulaire in vitrQ de la lignée
murine NF-S60. La radioactivité (3H-thymidine) incorporee dans les noyaux
cellulaires après 6 heures d'incubation est représentée en ordonnée (cpm); la
quantité de produit indiquée en abscisse est exprimée en molarité (unités arbitraires).
Figure 8 : Activité sur la granulopoièse in vivn chez le rat. Le nombre de
neutrophiles (moyenne de 7 animaux) est indiquée en ordonnée en fonction du
temps. Les produits testés sont la chimère SAH-G.CSF (pYG1~66, 4 ou 40
mg/rat/jour), le G-CSF référence (lQ mg/rat/jour), la SAH recombinante purifiée à
partir de surnageant de Kluyveromvces la~tis (rHSA, 30 mg/rat/jour, cf~ EP
361 991), ou du sérum physiologique~
~ED~
TECHNlQUES GENERALES DE CLONAGE
2s Les méthodes classiquement utilisées en biologie moleculaire telles que les
extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique
en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agsrose ou
d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction
de protéines au phénol ou au phénol-chlorofonne, Ia precipitsdon d'ADN en milieusalin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dsns ~cherichia coli
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11
etc... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la
littérature ~Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al.
(eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York,
s 1987].
Les enzymes de restriction ont été fournies par New E ngland Biolabs
(Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisees
selon les recommandations des fournisseurs.
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont
10 d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par
électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un
mélange phénol/chloro~orme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de
l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' p~oeminentes est effectué par le fragment de
Klenow de l'ADN Polymérase I d'~Qli (Biolabs) selon les spécifications du
fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en presence
de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisee selon les recommandations du
fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un
traitement ménagé par la nucléase Sl.
La muta~énèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est
effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13
(1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de
PCR ~olymérase-catalyzed Chain ~eaction, Saiki R.K. et al., Science j~Q (1985)
1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. ~$5 (1987) 335-350~ est
effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les
specifications du fabricant~
La vérification des sequences nucléotidiques est effectuée par la méthode
développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en
utilisant le kit distribué par Amersham~
Les transformations de K. lactis avec l'ADN des plasmides d'expression des
protéines de la présente invention sont effectuées par toute technique connue del'homme de l'art, et dont un exemple est donné dans le texte.
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~ 1 2
Sauf indication contraire, les souches bactériennes utilisées sont E. coli
MC1060 (~IPOZYA, X74,~ 11, ~K, strAr), ou E. coli TG1 (~, ~QA,B, supE,
thi, hsdD5 / F~D36, ~A+B+, laclq, ~Z, M15).
Les souches de levures utilisées appar~iennent aux levures bourgeonnantes et
5 plus particulièrement aux levures du genre Kluvveromvces. Les souche K. laçtisMW98-8C (~, ~, ~" ~, K+, pKD1) et K. Iactis CBS 293.91 ont été
particulièrement ut;lisées; un échantillon de la souche MW98-8C a été déposé le
16 Septembre 1988 au Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) à Baarn
(Pays-Bas) où il a été enregistré sous le numéro CBS 579.88.
Les souches de levures transformées par les plasmides d'expression codant
pour les protéines de la présente invention sont cultivées en erlerlmeyers ou enfermenteurs pilotes de 21 (SETRIC, France) à 28C en milieu riche (YPD: 1 %
yeast extract, 2 % Bactopeptone, 2 ~o glucose; ou YPL: 1 % yeast extract, 2 %
Bactopèptone, 2 % lactose) sous agitation constante.
EXEMPLE 1: CONSIRUCTION D'UN FRAGMENT DE RESI`RICTION
~IIt~N~)III INCLllANT LA PARTIE MATURE DU G~CSF HUMAIN
Un fragment de res~iction ~II-HindIII incluant la forme mature du G-CSF
humain est généré, par exemple selon la stratégie suivante: un fragment de
restriction ~I-~III est d'abord obtenu par la technique d'amplification
enzymatique PCR en utilisant les oligodéoxynucléotides Sq2291 (5`^
CAAGGATCCA~GCTTCAGGGCTGCGCAAGGTGGCGTAG-3`, le site HindlII
est souligné) et Sq2292 (5'-CGGCIG~AC~TTAGGCTTAACCCCCCTG-
GGCCCTGCCAGC-3', le site ~I est souligné) comme amorce sur le plasmide
BBG13 servant comme matrice. Le plasmide BBG13 comporte le gène codant pour
la forme B (174 acides aminés) du G-CSF ma~ure humain, o~tenu auprès de British
Bio-technology Limited, Oxford, England. Le produit d'amplification enzymatique
d'environ 550 nucléotides est ensuite digéré par les enzymes de restriction ~l et
~indIII et cloné dans le vecteur pUC19 coupé par les mêmes enzymes, ce qui génère
le plasmide recombinant pYG1255. Ce plasmide est la source d'un fragment de
restriction M~ j~III, dont la séquence est incluse dans celle de la Figure 1. Unfragment de restriction ~II-~ndIlI codant pour la même sequence polypeptidique
peut egalement être généré par la technique d'amplification PCR à partir des cDNA
correspondants, dont la séquence est connue lNagata S~ et al~, EMBO J~ ~ (1986)
WO 93/1~21 l ; I .~ PCI /FR93/00086
~ ., " " ~ i ,."
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575-581]. Ces cDNA peuvent être isolés par les techniques de l'homme de l'art, par
exemple en utilisant le kit distribué par Amersham, à partir d'une lignée cellulaire
humaine exprimant le G-CSF, et par exemple la lignée cellulaire CHU-2 de
carcinome humain [Nagata et al., Nature ;~2 (1986) 415-418].
Il peut être également souhaitable d'insérer un linker peptidique entre la
partie SAH et G-CSF, par exemple pour permettre une meill~ure présentation
fonctionnelle de la partie transductrice. Un fragment de` restriction ~II-HindIII est
par exemple généré par substitution du fragment ~II-,~I de la ~igure 1 par les
oligodéoxynucléotides Sq2742 (5'-TTAGGCTTAGGTGGTGG~GGTACCCCCC-
TGGGCC-3', les codons codant pour les résidus glycine de ce linker particulier sont
soulignés) et Sq2741 (5'-CAGGGGGGTACCGCCACCACCTAAGCC-3'~ qui
forment en s'appariant un fragment ~II-~I. Le plasmide pYG1336 ainsi généré
comporte donc un fragment de restriction ~II-HindIII, dont la séquence est
identique à celle de la Figure 1 à l'exception du fragment ~II-,~I.
EXEMPLE 2: FUSIONS EN PHASE TRADUCTIONNELLE ENTRE LA
SAH ET LE C~-CSF HUMAIN
E.2.1. Fusion traductionnelle du type SAH-G.CSF.
Le plasmide pYG404 est décnt dans la demande de brevet EP 361 991. Ce
plasmide comporte un fragment de restriction ~III codant pour le gène de la
prépro-SAH précédé des 21 nucléotides naturellement présents immédiatement en
amonl de l'AT~ initiateur de traduction du gène ~ de S. cerevisiae. Plus
particulièrement, ce fragment comporte un fragment de restriction HindIII-~II
correspondant à la totalité du gène codarlt p~ur la prépr~SAH à l'exception des trois
acides aminés les plus C-terminaux (résidus leucine-glycine-leucine). La ligature de
ce fragment avec le fragment ~stII-HindIII du plasmide pYG1255 permet de
générer le fragment HindIII du plasmide pYG1259 qui code pour une p~otéine
chimère dans laquelle la forme B du G-CSF mature est positionnée par couplage
génétique en phase traductionnelle en C-terminal de la molécule de SAH. La
séquence nucléotidique de ce fragment de restriction est donnée à la Figure 1, ainsi
30 que la séquence polypeptidique de la chimère correspondante (SAH-G.CSF, cf.
Figure 2, panneau A).
Un fragment de restriction ~III identique à l`exception du fragment ~II-
~I peut également être facilement généré et qui code pour une protéine chimère
Wo 93/15211 PCr/FRs3/00086
s~
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dans laquelle la forme B du G-CSF mature est positionnée par couplage génétique
en phase traductionnelle en C-terminal de la molécule de SAH et d'un linker
peptidique particulier. Par exemple ce linker est constitué de 4 résidus glycine dans
le fragment HindIII du plasmide pYG1336 (chimère SAH-Gly4-G.CSF. cf. Figure
5 2, panneau A).
E.2.2. Fusion traductionnelle du t~pe G.CSF-SA}I.
Dans un mode réalisation particulier, les techniques combinées de
mutagénèse dirigée et d'amplification PCR permettent de construire des gènes
hybrides codant pour une protéine chimère (Figure 2, panneau B) résultant du
10 couplage traductionnel entre un peptide signal ~et par exemple la région prépro de la
SAH), une séquence incluant un gène ayant une activité G-CSF, et la forme maturede la SAH ou un de ses variants moléculaires. Ces gènes hybrides sont
préférentiellement bordés en 5' de l'ATG initiateur de traduction et en 3' du codon de
fir. de traduction par des sites de restriction ~dIII. Par exemple l'oligodéoxy-
15 nucléotide Sq2369 (5'-GlTCTACGCCACC~GCGCAGCCCGGTGGAGGCGGT-
GATGCACACAAGAGTGAGGlTGCI CATCGG-3', les résidus soulignés
(optionnels) correspondent dans cette chimère particulière à un linker peptidique
composé de 4 résidus glycine) permet par mutagénèse dirigée de mettre en phase
traductionelle la forme mature du G-CSF humain du plasmide BBG13
20 immédiatement en amont de la forme mature de la SAH. ce qui génère le plasmide
intermédiaire A. De façon similaire, I'utilisation de l`oligodéoxynucléotide Sq2338
[5'-CAGGGAGCl`~GCAGGGCCCAGGGGGC~l~CGACGAAACACACCCCTG-
GAATAAGCCGAGCT-3' (brin non codant), les nucléotides complémentaires aux
nucléotides codant pour les premiers résidus h-terminaux de la forme mature du G-
2s CSF humain sont soulignés] permet par mutagénèse dirigée de coupler en phasetraductionnelle de lecture la région prépro de la SAH immédiatement en amont de la
forme mature du G-CSF humain, ce qui génère le plasmide intermédiaire B. On
génère ensuite le fragment HindIII de la Figure 5 en associant le fragment ~III-SstI du plasmide B (jonction région prépro de la SAH ~ fragment N-terminal du
30 GCSF mature) avec le fragment ~I-~III du plasmide A ~jonction G-CSF
mature-(glycine)x4-SAH mature]. Le plasmide pYG1301 contient ce fragment de
restriction ~lIII particulier codant pour la chimère G.CSF-Gly4-SAH fusionnée
immédiatement en aval de la région prépro de la SAH.
:
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~ ,: J ~ ' 7
E.2.3. Fusion traductionnelle du type G.CSF-SAH-G.CSF.
Ces mêmes techniques de mutagénèse dirigée et d'amplification de l'ADN in
vitro permettent de construire des gènes hybrides dans lesquelles une séquence
codant pour une activité G-CSF est couplée aux extrémités N- et C- terminales de la
5 SAH ou un de ses variants moléculaires (Figure 2, panneau C). Ces gènes hybrides
sont préférentiellement bordés en 5' de l'ATG initiateur de traduction et en 3' du
codon de fin de traduction par des sites de restriction ~j~III.
EXEIVIPLE 3: CONSTRUCTlON DES PLASMIDES D'EXPRESSION
Les protéines chimères des exemples précédents peuvent etre exprimées dans
lo les levures a partir de promoteurs fonctionnels, ~égulables ou constitutifs, tels que,
par exemple, ceux présents dans les plasmides pYG105 (promoteur LAC4 de
Kluvveromvces ~ ), pYG106 (promoteur ~ de Sac~haromyc~s cerevisiae),
pYG5~6 (promoteur PHO5 de S. cerevi~), ou des promoteur hybrides tels que
ceux portés par les plasmides décrits dans la demande de brevet EP 361 991.
Par exemple, le fragment de restriction HindIII du plasmide pYG1259 est
cloné dans l'orientation produc~ive dans le site de restriction ~III du plasmided`expression pYG105, ce qui génère le plasmide d`expression pYG1266 (Figufe 3).
Le plasn2ide pYG105 corresponds au plasmide pKan707 décrit dans la demande de
brevet EP 361 991 dans lequel le site de restriction HindIII a été détruit par
mutagénèse dirigée (oligodeoxynucleotide SqlO53: 5'-GAAATGCATAAGCTC-
TI`GCCATTCTCACCG-3') et dont le fragment SalI-SacI codant pour le gène
ll~3 a été remplacé par un fragment de restriction ~I-SacI comportant le
promoteur ~4 (sous la forme d'un fragment ~lI-~III) et le terrninateur du
gène pGK de S~ cerevi~iae ~sous la forme d'un fragment ~III-~I). Le plasmide
pYG105 est mitotiquement très stable en l'absence de généticine (G418) et permetd'exprimer la protéine chimère à partir du promoteur L~4 de K. lactis, notammentquand la source carbonnée est du lactose~ Dans une autre exemplification, le clonage
dans l'orientation productive du fragment de restriction ~III du plasmide
pYG1259 dans le site HindIII du plasmide pYG106 génère le plasmide d'expression
pY&1267~ Les plasmides pYG1266 et pYG1267 sont isogéniques entre eux à
l'exception du fragment de restriction ~lI-~lindIII codant pour le promoteur LAC4
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de K. Iactis (plasmide pYG126~) ou le promoteur PGK de S. cerevisiae (plasmide
pYG1267).
Dans une autre exemplification, le clonage dans l'orientation productive du
fragment de restriction HindIII du plasmide pYG1336 Ichimère SAH-Gly4-G.CSF,
s cf. E.2.1.) dans le site HindIII des plasmides pYG105 et pYG106 génère les
plasmides d'expression pYG1351 et pYG1352, respectivement.
De même, le clonage dans l'orientation productive du fragment de restriction
~ndIII du plasmide pYG1301 (chimère G.CSF-Gly4-SAH, cf. E.2.2.) dans le site
HindIII des plasmides pYG105 et pYG106 génère les plasmides d'expression
lo pYG1302 et pYG1303, respectivement.
EXEMPLE 4: TRANSFORMATION DES LEVIJRES
La transformation des levures appartenant au genre Kluweromvces, et en
particulier les souches MW98-8C et CBS 293.91 de K. lactis, s'effectue par exemple
par la technique de traitement des cellules entières par de l`acétate de li~ium (Ito H.
et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168), adaptée comme suit. La croissance descellules se fait à 28C dans 50 ml de milieu YPD, avec agitation et jusqu'à une
densité optique à 600 nm ~DO600) comprise entre 0,6 et 0,8; les cellules sont
récoltées par centrifugation à faible vitesse, lavées dans une solution stérile de TE
(10 mM Tris HCI pH 7,4; 1 mM EDTA), resuspendues dans 3-4 ml d'acétate
lithium (0,1 M dans du TE) pour obtenir une densité cellulaire d'environ 2 x 108cellules/ml, puis incubées à 30C pendant 1 heure sous agitation modérée. Des
aliquotes de 0,1 ml de la suspension résultante de cellules compétentes sont incubés
à 30~C pendant 1 heure en présence d'ADN et à une concentration finale de 35 % de
polyéthylène glycol (PEGqo~o, Sigma). Après un choc therrnique de S minutes à
2s 42C, les cellules sont lavees 2 fois, resuspendues dans 0,2 ml d'eau stérile et
incubées 16 heures à 28C dans 2 ml de milieu YPD pour perrnettre l'expression
phénotypique de la fusion ORF1-APH exprimée sous contrôle du promoteur Pk1;
200 ~1 de la suspension cellulaire sont ensuite étalés sur boites YPD sélectives(G418, 200 ~g/ml)~ Les boites sont mises à incuber à 28C et les transforrnants
apparaissent après 2 à 3 jours de croissance cellulaire.
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i r ~ t
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EXEMPLE 5: SECRETION DES CHIMERES
Après sélection sur milieu riche supplémenté en G418 les clones
recombinants sont testés pour leur capacité à sécréter la forme mature des protéines
chimères entre SAH et G-CSF. Quelques clones correspondant à la souche K. lactisCBS 293.91 transformée par les plasmides pYG1266 ou pYG1267 (SAH-G.CSF),
pYG1302 ou pYG1303 (G.CSF-Gly4-SAH~ ou encore pYG1351 ou pYG1352
(SAH-Gly4-G.CSF) sont mis à incuber en milieu liquide complet sélectif à 28C.
Les surnageants cellulaires sont alors testés après électrophorèse en gel d'acrylamide
à 8.5 ~o, soit directement par coloration du gel d'acrylamide par du bleu de
c oomassie (Figure 4, panneau A), soit après immunoblot en utilisant comme
anticorps primaires des anticorps polyclonaux de lapin spécifiquement dirigés contre
le G-CSF humain, ou contre la SAH. Lors des expériences de détection
immunologique, le filtre de nitrocellulose est d'abord incubé en présence de
l'anticorps spécifique, lavé plusieurs fois, incubé en présence d'anticorps de chèvre
anti-lapin biotinylés, puis incubé en présence d'un complexe avidine-pér~xydase en
utilisant le Hkit ABC" distribué par Vectastain (Biosys S.A., Compiègne, France). La
réaction immunologique est ensuite révélée par addition de diamin~3,3' benzidinetetrachlorydrate (Prolabo) en présence d'eau oxygénée, selon les recommandationsdu fournisseur. Les résultats de la Figure 4 démontrent que la protéine hybride SAH-
G.CSF est reconnue à la fois par des anticorps dirigés contre l'albumine humaine(panneau C) et le G-CSF humain (panneau B). Les resultats de la Figure 6 indiquent
que la chimère SAH-Gly4-G.CSF (piste 3) est particulièrement bien sécrétée par la
levure KuweromYces, possiblement du fait que la présence du linker peptidique
entre partie SAH et partie G-CSF est plus favorable à ~n repliement indépendant de
ces 2 parties lors du transit de la chimère dans la voie sécrétoire. De plus la fusion N-
terrninale (G.CSF-Gly4-SAH) est également sécrétée par la levure Klu~veromvces
(Figure 6, piste 1).
EXEMPLE 6: PURIFICATION ET CARACTERISATION MOLECULAIRE
DES PRODUITS SECRETES
Après centrifugation d'une culture de la souche CBS 293.91 transformée par
- les plasmides d'expression selon l'exemple 3, le surnageant de culture est passe à
travers un filtre de 0922 mm (Millipore), puis concentré par ultrafiltration ~Amicon)
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en utilisant une membrane dont le seuil de discrimination se situe à 30 kDa. Le
concentrat obtenu est alors ajusté à 50 mM Tris HCl à partir d'une solution stock de
Tris HCI lM (pH 6), puis déposé par fractions de 20 ml sur une colonne (5 ml)
échangeuse d'ions (Q Fast Flow, Pharmacia) équilibrée dans le même tampon. La
5 protéine chimère est alors éluée de la colonne par un gradient (0 à 1 M) de NaCl. Les
fractions contenant la protéine chimère sont alors réunies et dialysées contre une
solution de Tris HCl 50 mM (pH 6) et redéposées sur colonne Q Fast Flow (1 ml)
équilibrée dans le même tampon. Après élution de la colonne, les fractions contenant
la protéine sont réunies, dialysées contre de l'eau et Iyophilisées avant caracté-
l0 risation: par exemple, le séquençage (Applied Biosystem) de la protéine SAH-G.CSF
sécrétée par la levure CBS 293.91 donne la séquence N-terminale attendue de la
SAH (Asp-Ala-His...), démontrant une maturation correcte de la chimère immédia-
tement en C-terminal du doublet de résidus Arg-Arg de la région "pro" de la SAH
(Figure 1).
5 EXEMPLE 7: ACIIVITE BIOLOGIQUE DES CHIMERES ENTRE SAH EI
G-CSF
E.7.1. Activité biologique in vitro.
Les chimères purifiées selon l`exemple 6 sont testées pour leur capacité à
permettre la prolifération in vitro de la lignée murine IL3-dépendante NFS60, par
20 mesure de l'incorporation de thymidine tritiée essentiellement selon le protocole
décrit par Tsuchiya et al. lProc. Natl. Acad. Sci. (1986) 8~ 7633]. Pour chaque
chimère~ les mesures sont réalisées entre 3 et 6 fois dans lm test trois points (trois
dilutions du produit) dans une zone ou la rèlation entre quantité de produit actif et
incorporation de thymidine marquée (Amersham) est linéaire. Dans chaque plaque
2s de microtitration, l'activité d'un produit réference constitue de G-CSF humain
recombinant exprimé dans des cellules mammifères est également systématiquement
incorporé. Les résultats de la Figure 7 démontrent que la chimère SAH-G.CSF
(pYG1266) sécrétée par la levure Kluwero~e~ est capable in vitro de transduire
un signal de prolifération cellulaire pour la lignée NFS60. Dans ce cas particulier,
30 l'activité spécifigue (cpm/molarité) de la chimère est environ 7 fois plus faible que
celle du G-CSF référence (non couplé).
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E.7.2. Activité in vivo
L'activité de stimulation des chimères SAH/G-CSF sur la g~nulopoièse in
vivo est testée après injection sous-cutanée chez le rat (Sprague-Dawley/CD, 250-
300 g, 8-9 semaines) et comparée à celle du G-CSF référence exprimé à partir de
5 cellules de mammifère. Chaque prodllit, testé à raison de 7 animaux, est injecté par
voie sous-cutanée en région dorso-scapulaire à raison de 100 ml pendant 7 jours
consécutifs (J1-J7). 500 ml de sang sont recueillis aux jours J-6, J2 (avant la 2ème
injection), J5 (avant la 5ème injection) et J8, et une numération sanguine est
effectuée. Dans ce test, I'activité spécifique (unites de neutropoièse/mole injectée) de
10 la chimère SAH-G.CSF (pYG1266) est identique à celle du G-CSF référence
(Figure 8). Puisque cette chimère particulière possède vitro une activité spécifique
7 fois plus faible que celle du G-CSF référence (Figure 7), il est donc démontré que
le couplage génétique du G-CSF sur la SAH en modifie favorablement les propriétés
pharmacocinétiques.
