Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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NOUVF~UX POLY~ 11 )F.~ AYANT UNF. ACTIVITF. DE ~FC~ 1R
NMDA. AC~FS NUCT.F.TQUES CODANT POUR CES
pOT.~ L)FA~ F.T UT~ T~A~TIoNs
La pf~senle invention c~n~P~n~ de nou-,~,x polypepti~e~ et le m~tP~riel
5 génétique pe~ leur P,~r~sion. Plus particulièr~ ell~, elle conre. .~P' deno~lveau~ polypepti~es ayant une activité de r~ceple r NMDA.
L'acide ,~ ique (~ le) est un acide aminé dit P~ e~, dont
l'activité se manifeste par son ,n~ld~;lion avec des receyle! s specifiques. Panni ces
,e:ceyt~s~ un sous-type, désigné réoeyteul~ NMDA (N-méthyl-D-asp~le) semble
10 impliqué, dans le système nerveux central des ...h.-.~-.;rères, dans de nombreux
pr~cessus tels que la pl~ti~ité neuronale, la po~ l;on à long tenne, ainsi que la
mort ~ eur~ ale ou ce~ s désonlles ~np.~l;rs~ Des études ph~m~cologiques et
de biologie moléclllaire ont recP~ nt permis la mise en évidence et le cl~ n~ge de
récel~te~ NMDA de rat, le lé~ple r NMDAR1 [Moliy~Li et al., Nature 354
(1991) 31] et le récep~ r NMDAR2 [Monyer et al., SciPn~ ~ (1992) 12], et d'un
récepte..r NMDA de souris [Y~m~7~ki et al., Febs Lett. ~ (1992) 39].
La p~se"~e invention résulte de la mise en évidence de nouveawc
polypepti-les ayant une activité de ~ce~le!.r NMDA. Bien qu'app~lenanl à la famille
des récepteurs liés à des canaux ioniques, ces nou.,-~u~ polypeptides dirrèrenl des
20 rPcepLeu,s NMDA déjà décrits du point de vue shllc~ l comme du pont de vue
ph~ m~cologique. En particulier, il s'agit de lecepleu.~ d'origine présynaptique,
impliqués not~mment dans la potPn~i~tion à long terme (LTP).
Plus particuli~le~enL~ l'invention résulte de l'isolement et de la caractéri-
sation de no~lveau~ polypeptides, ~P~i nés GR33, ainsi que du m~tPriel génétique25 p~mett~nt -leur eApr~ion ou leur idPntifif~tir-n L'invention réside eg~lemPnt dans la
pr~a~aLion de sondes et de cellules recombinees permettant l'exploitation des
polypeptides GR33 dans le di~ stic et la mise au point de nouvelles molécules
actives.
Un premier objet de l'invention réside donc dans des polypeptides
30 cc,n~pr~,lant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n 1 ou d'un dérivé de
celle-ci.
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Au sens de la pLésel.le invention, le terme dérivé ~P~i~nP toute mo1P~1e
.,e par morlific~ti-~n de nature génétique et/ou cl~ que de la séquence
pep~ ;q,le SEQ ID n 1. Par m~ification de nature génétique etlou chimique, on
peut enlend~e toute mllt~tic~n~ s~1bstitutinn, ~1élétic~n ~dtliti~n et/ou mt~ific~tiQn d'un
5 ou ph~ s résidus. De tels dérivés peuvelll être générés dans des buts différènls. tels
que n..l~ n~ celui d'~ ,n~ ffil~é du peptide pour son(ses) ligand(s), celui
d'améliorer ses IIL~UX de p~l~ ;Qn, celui d'a1l~ er sa ~ ce à des
p~t~ A~5, celui d'a1~ n~e~ et/ou de mo~ifiPr son activité, ou celui de lui co. fe.~. de
nouvelles prop iétés ph~ r~inptiques et/ou bio10~iques. Parmi les dérivés
10 résv1~nt d'une ~rlt~ l, on peut citer par t~y~pmple les polypeptid~ps chi".è,es
oompG,~ll une partie hétérologue suppl .-t~ ;-e liée à une eAI-ên~ilé. Le terme
dérivé cOlll~lelld e~1Pm~nt les polypeptides homt~lQ~1çs au polypeptide SEQ ID n
1, issus d'autres sources cçl11~ es et nnt~mmçnt de cellules d'origine h1lm~ine, ou
d'autres o~ .es, et po~ 1 une activité de même type. De tels polypeptides
15 htlmt~le~nps peuven~ être obtPmle par des t-~l~t~e~c~S d~hybr~ tion etlou de PCR
comme décrit dans les er~ es.
Prèri:~e..l;~llPmPnt les polypepti~ e de l'invention sont des polypeptitles
possé~nt la c~r~citP de lier le glt1t~m~te Encore plus préférPntiç11rmçnt il s'agit de
polypepti-ies ayant une activité de récepteur NMDA. Toujours selon un mode préféré,
les polypeptitl~s de l'invention sont sliec~;h'e~ d'être reconnue par des anticorps
eu~ ie.e~nt la séquence peptidique complete SEQ ID n 1.
Un mode de réalisation particulier de l'invention est représenté par le
polypeptide GR33 co.llp~ena,~l toute la séquence peptidique SEQ ID n 1. Comme
indiqué dans les eYemrl~e, ce polypeptide peut être PYrrimé dans les oeufs de
2s Xénope pour former un léceylei~r au ~ ,.le fonrtionn~Pl, pr~sPnt~n~ toutes les
c~.cle. ;~;ques ph~rm~cologiques d'un ~ceytæl~ NMDA:
- la présence de 100 IlM de NMDA induit un courant entrant;
- l'~hsPnre de glycine du milieu inhibe presque comrletPm-ont la réyonse au
NMDA;
- les réponses au NMDA sont réduites en présence d'antagonistes compétitifs
tels que l'AP5 (acide D-2-amino-5-phosphonovalérique) ou l'AP7 (acide D-2-amino-7-phosphonoheptanoique);
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-la concçntration en NMDA ~onn~nt 50 ~o de la ~ponse maximum (ED50)
est de 10 ~M environ, ce qui correspond aux valeurs d~lell,Pinées dans les cas du
récepteur NMDAR1;
- parmi les autres acides aminés ~ Ie .. ~ testés (glllt~m~te, k~in~te,
- 5 quisqualate, homocy~teale)~ le ~ )t~m~te et l'ho,n~y~ale sont ceux qui in~ i~nt les
plus fortes répollses.
Par ailleurs, les résultats obtenus Illoll~ nl que le polypeptide GR33
con,p~enant toute la séquence peptidique SEQ ID n 1 p~sell~e des particularités par
rapport aux autres récepleul~ NMDA connus. Not~mment, le magné~ium n'a qu'un
0 effet inhibitel~r partiel (30-70~o) alors qu'il inhibe complète-ment l'activité des
récepleul~ NMDA conm.~, et le c~lcium a un effet inhibitellr alors qu'il stimulel'activité des réceple~ NMDA décrits. De plus, ces particularités ph~rm~cologiques
sont liées à des part~ rites ~I,u-;lu,~les. En effet, le polypeptide GR33 SEQ ID n
1, qui conlprend 288 acides aminés et possède un poids moléc ll~ire de 33 kDa
environ, ne comporte qu'un seul dom~ine hy~ophobe (20 à 23 résidus non chargés
du coté C-terminal). Ce polypeptide COlllpOl le é~ m~nt 2 sites potentiels de
glycosylation (Asn 115 et 134) et 4 cystéines qui pourraient être impliquées dans la
formation de structures sec- n~ires.
Un autre mode particulier de réalisation de l'invention est l~plesenlé par un
polypeptide co",p~n~ll la séquence p,e~l~ee sur la figure 1. Cette séquence
correspond à un fragment d'un ~c~leilr hornolo~e au polypeptide SEQ ID n 1,
obtenu à partir d'une banque de cer~ea.l hllm~in
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un
hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessous, par synthèse
chimique, sur la base des séquences c~onneçs SEQ ID n 1 et figure 1 en l~tili~nt les
techniques connu~s de l'homme du métier (synthèse peptidique en phase solide ou
liquide, etc), ou par une cornbin~i.con de ces techniques.
Dans ce qui suit, les polypeptides de l'invention tels que définis ci-dessus
sont de~i~nés par polypeptides GR33.
La présente invention a ég~lçrn~nt pour objet toute séquence nucléotidique
codant pour un polypeptide GR33. Plus préférentiellement, il s'agit d'une séquence
choisie parmi:
FEUILLE DE F~E~IPLACEMENT
ISAIEP
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2~38~S~ ,
(a) tout ou partie de la séquence nucléoti~ique SEQ ID n 1 ou de son brin
cQmp~ nlA;~J
(b) toute séquence hybridant avec une seqllence (a) et codant pour un
polypeptide tel que défini ~ckle~ , et,
(c) les séquel~ces dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégéné-
esc~n~e du code génétique.
Les di~r~l~-tes séquences m~ léoti~iques de l'invention peuv~nt être
d'origine artifi~iP11e ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN,
de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces
10 séquellces peuvenl être obt~ par PYPmp1e par ~rih1~ de banques d'ADN (banque
d'ADNc, banque d'ADN ~E~pnomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de laséquence SEQ ID n 1. De telles l~anques peuv~ -l être préparées à partir de cellules
de dilré~ntes origin~s par des tecl~niques classiques de biologie moléculaire conn.jes
de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention ~XUV~
P~ pmpnt être préparées par ~lllhèse chimique, nol~.. en1 ælon la méthocle des
phospho~ es~ ou encore par des mPth~es mixtes in~ nt la mo iifi~ticn
chimique ou enzymatiqe de séquences o~t~ n~es par criblage de banques.
A titre d'exemple de séquences hybridant avec une séquence (a) et codant
pour un polypeptide selon l'il,venLion, on peut citer la séquence présentée sur la figure
20 2. Un autre PYenlr1e de séquence homolo~le est ~p~s~ é par le clone génomique humain décrit sur la figure 3, P~lPmP,nt isolé par hybridat on
Les séq.lences nllcléotil1iques de l'invention peuv~nl être uti~ é~s pour la
prorluction des polypepti-les GR33 tels que définis précé 4.. ~-.L Dans ce cas, la
partie codant pour ledit polypeptide est génér~lçmPnt placée sous le contrôle de25 ~ permett~nt son eAl)lession dans un hôte cçl1~ ire. Le choix de ces signaux
(promoteurs, termin~tellrs~ etc) peut varier en fonction de l'hôte ce1h~1~ire utilisé. A
cet effet, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvenl faire partie d'un vecteur,
qui peut être à rép1ic~tion ~utonomP, ou intpgratif. Plus particulièrement, des vecteurs
à réplication ~utonome peuvent être p,~pa~s en ~1ti1i~nt des séquences à réplication
30 autonome chez l'hôte choisi. S'2lgi~nt des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être
p,ep~es par exemple en uti1i~nt des séquences homologues à certaines régions du
génome de l'hôte, permett~nt, par recomhin~i~n homologue, l'intégration du vecteur
Les hôtes cPllt-l~ires uti1i~ab1es pour la production des polypepti~les GR33 de
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l'invention par voie recombin~nte sont aussi bien des hôtes euc~yoles que
proca.~otes. Parmi les hôtes ellcalyoles qui convienn~nt on peut citer les cellules
~nim~l~s, les levures, ou les ~h~mpignon~ En particulier, s~agi.ce~nt de levures, on
peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia,
5 Schwanniomyces, ou Han.~e~ l(7. S'~gi.~nt de c~ les ~nim~les, on peut citer les
c~ COS, CHO, C127, les oeufs de Xénope, etc. Parmi les ~h~mpi~on~ on peut
citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes
pnx&~c,les, on préfère utiliser les ba~t~ri,os s..iv~les E.coli, R~/c~ ou
Streptomyces.
Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également
utilisables dans le rlom~in~ pharm~eutique~ soit pour la réalisation de séquences sens
ou ~nti~n.c utilisables dans le cadre d'une thérapie génique, soit encore pour la
réalisation de sondes pellllel~l la détection, par des eApériences d'hybridation, de
l'eA~,~s~ion de récepleul~ NMDA dans des éch~ntillons biologiques et la mise en
évidence d'~ncm~lies génétiques (polymorphis.l,e, mut~tion~) ou d'~A~ ssions
abell~llles.
L'inhibition de l'eAp~ion de certains gènes par des oliEonucléotides
~nti~Pn~ s'est avérée être une stratégie pn)...~lle..~ dans le contrôle de l'activité d'un
gène. Les oligonucléotides ~nti~n~ sont des oligonucléotides de petite taille,
20 complem~nt~ires du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider
speçifiquement avec l'ARNm ~ansclil, inhih~nt sa traduction en protéine. L'invention
a ainsi pour objet les oligonncléotides ~nti~enc capables d'inhiber au moins
partiellement la production de polypeptides GR33. De tels oligonll~cleQtides peuvent
être constitués par tout ou partie des séquences nucléotidiques définies ci-avant. Il
25 s'agit généralement de séquences ou de fr~gments de séquences complem~nt~ires de
séquences codant pour des peptides de l'invention. De tels olig~mlcléoti~es peuvenl
être obtenus à partir des séquences SEQ ID n 1 ou donnée dans la figure 1, par
fr~gm~nt~tion, etc, ou par synthèse chimique. Les séquences de l'invention peuvent
également être ~tili~ees en thérapie génique, incorporées à des vecteurs, notamment
30 des v~cleu~ viraux (adénovirus, rétrovirus, virus adéno-~iés, etc).
Comme indiqué ci-dessus, l'invention permet ég~l.om.ont la réalisation de
sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hydrider avec les séquences
- nucléotidiques définies ci-avant qui codent pour des polypeptides GR33 de
FEUILLE D~ REMPLACEMENT
ISA/EP
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~3~Sl 6
-
l'invention, ou avec les ARNm co"espondant. De telles sondes peuv~ être uhli.~ées
in vitro comme outil de ~ gnc)stic~ pour la ~étection de l'~A~l~ion d'un récepteur du
~hlt~m~te GR33, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques
(.I,allv~is épi~e~ge, polymo",hisll.e, mut~tion.~ pnnc~uelles~ etc). Compte tenu des
5 activités multiples des réc~læ~ du glu~ te, les sondes de l'invention peuvent
ainsi pelme~ e d'identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou
psychiatrique comme étant liées aux réce~leUI~ GR33. Ces sondes peuvt:lll également
être l~tili~ées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques
homologues codant pour des polypeptides GR33 tels que définis precé(lemm.?nt à
0 partir d'autres sources cellul~ires et plerér~ntiellement de cellules d'origines
h,--..Aines, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les sondes de l'invention COmpOI~
généralement au moins 10 bases, et elles peuvell~ CO~ er jusqu'à l'intégralité de la
séquence p~s~ ée SEQ ID n 1 ou sur la figure 1 ou de leur brin complémentaire.
r~fé~,.liell~ment ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour
15 cela, dirrér*~tes techniques cnnmles de l'homme du métier peuvenl être employées
(marquage radioactif, el~ymaLql.e, etc). Les conditions d'hybridation dans lesquelles
ces sondes peuvenl être lltili~ées sont indiquées dans les techniques générales de
clon~ge ci-après ainsi que dans les exemrles.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragments
20 d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide GR33 tel que
défini ci-avant. De tels anticorps peuvenl être générés par des méthodes connues de
l'homme du métier, compte tenu des en~eig~n~ donnés dans la présente
dem~n(1e. En particulier, ces anticorps peuv~ll être pr~pa,es par (1) ;...n.,..~ tion
d'un animal contre le polypeptide GR33 dont la séquence est donnée SEQ ID n 1 ou
25 sur la figure 1, ou tout fragment ou dérivé de ceux-ci, (2) prélèvement du sang, et (3)
isolement des anticorps. Ces anticorps peuvenl également être générés par p.ep~lion
d'hybridomes selon les techniques connu~s de l'homme de l'art.
Les anticorps ainsi obtenus peuv~ not~mm~nt être utilisés pour la mise en
évidence et l'i.colem~nt de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des
polypeptides GR33 tels que définis précé~e.. ~.. l à partir d'autres sources
cellulaires et pr~rér~nliPllem~nt de cellules d'origin~s hllm~ines, ainsi qu'illustré dans
les exemples. Ils peuvenl également être utilisés pour la mise en évidence et
l'isolement de polypeptides GR33.
~_Ul' LE ~~ AGE.~"ENT
ISA/EP
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Un autre objet de l'ir.v~l.lion conf~ne les c~-llt~ e recomhin~s capables
d'~Yrrimer à leur sudace un ou plusieurs polypeptilles GR33. Ces ce11t-1r.q peu~être obtPn~ par 1.l1.~ n d'une sequence n~)eleot~ ue telle que définie ci-
dessus codant pour un polypeptide de l'invention, puis culture ~es~litps c~ q dans
5 des C~ nA;I;~ nc d'~ ~s~ion de ladite séq.l~ce.
Les c~ c recomhinee~s selon l'invention peuvel~ être aussi bien des
c~lltl1~s euca",olæq que pl~ca"~s. Parmi les c~ Jlp~q euc~yo~es qui conv;pnnpnt~ on
peut citer les crlltlle.q ~nim~ , les levures, ou les rh~mri~nn~. En particulier,
s'agic~nt de levures, on peut citer les le~ures du genre ,S~7cchnromyces,
lo Kluyv~,~,my~es, Pichia, Schwanniomyces, ou Hnn~r~la. S'a~is.~nt de cpllt~lp~s~nim~ , on peut citer les c~ s COS, CHO, C127, les oeufs de Xénope, etc. Parmi
les rh~mrignon~ on peut citer plus particuliè~n~enl Aspe~illus ssp. ou Trichoderma
ssp. Comme cellules proca,yoles, on préfère utiliser les b~tpr~ s suiv~les E.coli,
Racilh~, ou Streptomyces. Les CPll~ s ainsi obt~nl~s peuven~ être llltili~ées pour
15 .nesu~er la c~p~c;le de difrél~.læs molecl~l~.s à se co ,po ler comme ligand ou com-me
m~ tell. des polypeptilles de l'il~vel~lion. Plus particulièrement, elles peUVèl~l ainsi
être utiliséP~s dans un procédé de mise en évidence et d'isolement de ligands ou de
m~lll~tellrs des polypepti~es de l~i..v~,.li~n, et, plus pr~ré~ m~nt~ d'~gon.~l~s et
d'antagol~i~les du ~l,.l;....~e
Un autre objet de l'invention co~ .. e donc un procédé de mise en évidence
etlou d'i~olem~nt de ligands des polypeptides de l'invention, selon lequel on réalise
les étapes sui~ les:
- on met en contact une molé~)le ou un m~l~n~e cQnt~n~nt différentes
molec..lf~$, eventllell~mPnt non-i~l~ontif~ s~ avec une cellule recomhinee telle que
décrite ci~essus ~,p~;m~.~l à sa surface un polypeptide de l'invention ou avec une
prépala~ion meml) an~ d~une telle cellule dans des conrli~;ons permett~nt l'inter-
action entre ledit polypeptide de l'invention et ladite moléalle dans le cas où celle-ci
pos~è~ie-ait une affinité pour ledit polypeptide, et,
- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en
évidence et/ou l'isolement d'~go,~ s et d'~nt~g~ es du giu~ le pour les
polypeptides de l'invention.
Un autre objet de l'invention con~rn~ un procédé de mise en évidence et~ou
d'i~solement de modtll~tell~ des polypepti~les de l'invention, selon lequel on réalise les
étapes sl~iv~les:
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2~38il~ 8
- on met en contact une molécule ou un mPl~nge co~ A--~ dirr~len~es
moléc--lPs, évenblPllPmPnt non-iriPntifiP,Ps~ avec une cellule recombinPe telle que
décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polype~ptide de l'invention ou avec une
plép~alion membl~laire d'une telle cellule, en plesellce de gl.,l;...-~te, dans des
5 cQn~lition~ permettant l'illle.~ ion entre ledit polypeptide de l'invention et le
glllt~m~te, et,
- on détecte et/ou isole les molec11lp~s c~p~bles de mo(llller l'activité du
gl.,~ e sur ledit polypeptide de l'invention.
Un autre objet de l'invention cr)n~prnp l'utilisation d'un ligand ou d'un
o mocilllatelur identifié et/ou obtenu ælon le procédé décrit ci-avant comme
méfiic~ment. De tels ligands ou modlll~tPl~rs peuve.ll en effet pel.,.t:llle de traiter
cel~ines affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique liées aux
réce~le. .. ~ GR33.
L'invention co~-c~. ..e ég~lPmPnt tout m~Aic~nPnt com~r~n~nl comme
15 p~incipe actif au moins une molécule agic~nt sur un peptide de l'invention.
P~fél~,llliPll~mPnt la molécule est un ligand ou un mo(llll~teur identifié et/ou isolé
selon le procédé décrit précéclPt~....~..l
- D'autres avantages de la p~se"le invention appa a.llont à la lecture des
Py~mples qui suivent, qui doivent être considérés comme illu~alirs et non limit~tifs.
Lé~ende des fi.~ures
SEQ ID n 1: Séquences nucléotidique et peptidique du récepteur GR33 de rat.
Figure 1: Fragment de la séq,lence nucléotidique et peptidique du récepteur GR33
hllm~in.
Figure 2: Carte de restriction du clone génomique humain portant une séquence
homologue à la séquence SEQ ID n 1. EV=EcoRV; El=EcoRl; H=HindIII;
P=PstI; S=SmaI; B=BamHI.
Figure 3: Profil d'hy~ophobicité du poly-peptide GR33 de 288 acides aminés.
Figure 4: Etude pharm~cologi-lue et élec~ophy~iologique du polypeptide GR33 de
288 acides aminés SEQ ID n 1. Les résultats sont exprimés en ~o du courant induit
par 200 ,uM de NMDA seul. GLUT = ghlt~m~tP; HCA = homocy~leale 200 ,uM;
KA = kainate 300 mM; QA = quisqualate 50 ~M; NM-gly = 200 ~M de NMDA en
i'ahsence de glycine; NM+Mg = 200 ~M de NMDA en présence de 200 ~M de
FEUILLE DE REMPLACEMENT
IS~/EP
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Mg2+; AP7 = 200 ,uM de NMDA en présence de 10 ~M d'AP7. Chaque point
esente un moyenne de 5 mesures au moins ~rret luées sur des oeufs de xénope
dirrt ~
Figure 5: Mise en évidence de séquences homolo~es par Northern blot sur des
5 ARNm polyA (1 ~g) de cervelet (piste 1), cortex (piste 2), stn~tum (piste 3) et
hippoc~,llpus (piste 4). La sonde utilisée correspond à l'ADNc complet SEQ ID n 1.
Figure 6: Mise en évidence de polypeptides homologues par Western blot sur des
membranes sy,la~lQson.Ales.
Techni~ues ~énérales de clonage
Les méthocles classiqueme -l llt~ éPs en biologie molec~ ire telles que les
extractions pr~a~ives d'ADN pl~mi-iique, la ce,-llirugation d'ADN pl~cmit3ique en
- gradient de chlorure de cç~ m, l'éle~,~kol)horèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la
purification de fragments d'ADN par électroéllltion, les extractions de protéines au
phénol ou au phénol-chlororo.me, la précirit~tion d'ADN en milieu salin par de
5 l'éthanol ou de l'isopropallol, la k~r~îo,.ation dans Escherichia coli, etc, sont bien
connuPs de l'homme de métier et sont abond~mPnt tl~ntPs dans la Ll~é.~lu e
[Maniatis T. et al., "Mo~ccl~l~r Cloning, a Labo~a~o-y Manual", Cold Spring Harbor
Labo.~lo.y, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current
Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les enzymes de restriction ont été fournies par New F.ngl~n-l Biolabs
(Biolabs), BethPsci~ Research Labo~ ;es (BRL) ou ~mPr~h~m et sont utili~ees
selon les recomm~n~tions des follrni~sPllrs.
Les pl~mi~ie~ de type pBR322, pUC, ~gtll, pGEX et les phages de la série
M13 sont d'origine commerciale.
Pour les ligatures, les fragm~nts d'ADN sont séparés selon leur taille par
électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un
mçlAnge phénoVchlor~fo~n~e, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de
l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recon~r~A~ ations du follrni~setlr.Le remplissage des e,-kemilés 5' prce~..;nç~.lPs est effectué par le fragment de30 Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du
follrni~sellr. La destruction des e~l.emi~és 3' pr~?eminentes est effectuée en présence
de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~n~iAtions dufabricant. La destruction des extrémités 5' pr~éminentes est effectuée par un
tr~itemPnt ménagé par la mlclP~ce S1.
FEUiLLE DE REMPLACEMENT
ISA/EP
WO g3r2567g PCI/F1~93/00557
2~3~S l 10
La mut~nPse dirigée in vitro par oligcdé~yynlrléoti~lps synthétiques est
effectuée selon la mPtho(le développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13
(1985) 8749-8764] en ~tili~Ant le kit distribué par ~ hn~
L'~mplific~tion enzymatique de fr~gment~ d'ADN par la technique dite de
PCR Lolymelase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science ~Q (1985)
1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est
effectuée en utili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les
spécifi~tion~ du f~bric~nt
La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la métho(le
lo développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en
tilis~nt le kit distribué par ~mer~h~m
Pour les expériences d'hybridation, les conditions de stringPnce nor nales sont
génér~lemP-nt les suiv~les: hybridation: 3 x SCC en présence de 5 x Denhart's à
65C; lavage: 0,5 x SSC à 65 C.
1. Clon~e de l'ADNc H500 de la f~lre 1.
Cet exemple décrit le clonage d'un ADNc de 500 pb environ à partir de
ceL~eau h1lm~in, codant pour une partie d'un polypeptide GR33. Cet ADNc a été
obtenu par criblage d'une banque de cet~eau humain au moyen d'anticorps dirigés
contre des protéines liant le gllJ~
1.1. ~l~p~alion de p,.~leines liant le ~lu~ te p~lrifiées
Des membranes synaptosom~les ont été préparées selon la technique décrite
par Michaelis et al. [J. Neurochem. 42 (1984) 397] et solubilisées en présence de
sodium-déoxycholate. Les membranes ainsi solubilisées ont ensuite été soumises àune chromatographie d'affinité sur une colonne de glut~m~te Les p,oléines liant le
gh.~ e ont été éluées par une solution NaCl lM, et dialysées conke un tampon
Tris-HCl en présence de 0,05 % de sodium-déoxy~-hol~te.
1.2. Production d'anticorps polyclonaux.
Des anticorps polyclonaux dirigés contre les protéines liant le glllt~m~te
obtenues ci-dessus ont été pli~pali:S chez la souris. Pour cela, des souris BALB/C ont
été il.lm~lisées avec 50-100 ~g des protéines liant le glut~m~te obtenues ci-dessus en
présence d'adjuvant complet de Freund. Les injections subséquentes (tous les 8 à 10
FEUILLF DE RE~/EPLAC~MEt\!~
IS~JE?
WO 93/25679 2 :1 3 81 5 ~ PCI/FR93/00557
jours) ont été faites avec 5t) llg des p~léines liant le ~lut~m~t~, mais sans adjuvant
cQmrl~t de Freund. Après 5 injecti-)nc, les sérums ont été collçctés et conse,vés
congelés.
1.3. Cnhl~ge d'une banque de ce, veau hllm~in
Les anticorps p,~par~s ci-dessus ont été utilisés pour cribler une banque de
ce,veau hllm~in réalisée dans le v~;~e"r lambda gtll (Clontech). Deux millions de
clones de cette banque ont ainsi été criblés imm~mologirlue...e..l, selon la technique
décrite par Sambrook, Fritsch et Maniatis (Cf techniques générales de clonage). Les
clones positifs i~l.ontifiçs ont ensuite été purifiés à homogénéité par plllci~-rs étapes
lO successives de criblage. A partir de ces clones, un ADNc de 500 pb environ a été
obtenu et séquencé sur les 2 brins. La séquence de cet ADNc, désigné H500, est
présentée sur la figure 1. Aucune homologie particulière n'a été trouvée entre cette
séquence et celles accç~cibles dans les banques.
2. Clona~e de l'ADNc codant l?our le polypeptide GR33 SEO ID n 1.
Cet ~Y~mple décrit le clonage d'un ADNc de 1,7 kb environ à partir de
ce,veau de rat, codant pour le polypeptide GR33 SEQ ID n 1. Cet ADNc a été
obtenu par criblage d'une banque de ce, veau de rat en utilic~nt comme sonde l'ADNc
H500 radiomarqué.
L'ADNc codant pour le polypeptide GR33 SEQ ID n 1 a été obtenu par
criblage d'une banque de cerveau de rat col~LI,liLe dans le vecteur lambda ZAP
(Stratagène). Cette banque a été criblée avec l'ADNc H500 préalablement marqué au
32p par la technique du "random priming" [Feinberg et Vogelstein, Analytical
Biorh~micty 132 (1984) 6}]. L'hybridation a été réalisée dans les conditions de
stringence élevée suivallles: hybridation à 65C, 3-4 x SSC, 5 x Denhardt's, rinçage à
65C, 0,1 x SSC, 1 % SDS. Environ 1 million de clones de la banque ont ainsi étéanalysés. Un clone positif a été isolé et purifié. Le pl~mide porté par ce clone a été
excisé de l'ADN du lambda ZAP au moyen d'un phage helper (Str~t~g.one), et l'ADNc
de 1,7 kb porté par ce pl~cmi~e a été séquencé sur les 2 brins. Une partie de laséquence ainsi obtenue est plt:ænlée sur la SEQ ID n 1.
3. Traduction in vitro de l'ADNc de 1.7 kb
FEUiLLE DE REMPLA~ME~NT
ISA/EP
WO 93/25679 PCr/FR93/00557
2~3~-S~ 12
L'ADNc de 1,7 kb isolé ci-dessus a été traduit in vitro dans le système des
rét~ ocytes de lapin (Promega). Ceci a permis de mettre en évidence une protéineexprimée ayant un poids mol~.l~ire de 35 kDa environ. La protéine déduite de la
séquence SEQ ID n 1 possède un poids théorique de 33,2 kDa. Le profil
5 d'hy~phobicité de la pn~léine de 288 acides aminés rés~lt~nte a été analysé selon le
programme de Kyte et Doolittle [J. Molec. Biol. 157 (1982) 105]. Le profil obtenu
est plesenlé sur la figure 3. Il indique que le polypeptide GR33 co--.prellanl la
séquence entière SEQ ID ne 1 ne possède qu'un ~om~in~ l~y~ln~l)hobe.
4. Expression du yolype~tide GR33 SFO ID n 1 dans les oeufs de Xéno~e et étude
l0 pharmacolo~ique et électrophysiolo~ique.
Le fragment d'ADNc isolé dans l'exemple 2 a été l~ansc~il en ARNm et
microinjecté dans des oeufs de Xénope. Les oeufs microinjectés ainsi obtenus ontensuite été testés pour leur c~pac;~P à lier certains ligands de récepleu~ NMDA
marqués ou pour leur compolle...ent vis-à-vis de mocllll~te.lrs de ces rPcept~lrs.
4.1. Transcription in vitro
Le pl~cmi(le cc-~le~..l l'ADNc de 1,7 kb codant pour le polypeptide GR33
SEQ ID n 1 a été linP~ri~é en présence de l'enzyme SmaI, puis soumis à une étape de
transcription en présence de l'ARN polymérase du phage T7. La transcription a été
effectuée en utili~nt le Kit Strat~n~ selon les reco.. ~n.1~tions du fabricant.
4.2. Microinjection
L'ARN synthhique obtenu ci-dessus en solution dans l'eau stérile a été
utilisé (5 ng) pour être injecté dans des oeufs de xénope matures (stades V et VI) dans
un volume de 50 nl. Les oeufs ont ensuite été ..~ nilc 3 jours à 19C dans des
plaques multi-puits dans un milieu Barth supplem~ntée d'antibiotiques (Miledi etSumikawa, Biomed. Res. 3 (1982) 390).
4.3. Etude pharmacologique et électrophysiologique
Les oeufs ainsi obtenus ont ensuite été testés pour la présence à leur surface
de récep~e~ NMDA fonctionnels. Pour cela, les oeufs ont été transférés en milieuOR-2 modifié, dépourvu de m~gn~ lm, de ccs,-,posilion: NaCl 88 mM, KCl 2,5
- 30 mM, CaCl2 1 mM, tampon HEPES 10 mM, pH 7,4 ajusté avec de la soude. Les
FEUILLE DE REMPLACEMENT
ISA/EP
wO g3/2s679 2 1 3 8 1 5 1 PCl/FR93/00557
différentes drogues (lig~nrl~ ou mo~ te lrs) ont été appliquées par perfusion (10
ml/mn) pen~l~nt 10-30 secc-n~l~.s, sous une di~l~nce de potentiel imposée de -80 ou -
90 mV. Les ré~lt~t~ ob~ s sont p,esentés sur la figure 4. Ils montrent que:
- l'application de gll~t~m~t~ (0,1-1 mM) ou de son agoniste, le NMDA (200
5 ~M), induit un coul~anl "inward", alors que d'autres agonistes du glut~m~te dont le
kainate (300 mM) et le quisqualate (50 ,uM) n'ont que peu ou pas d'effet. Ces résultats
indiquent que les oeufs injectes pl~s~ n~ à leur surface des récep~euls au glut~m~te
col~plés à des canaux ioniques fonctionnels, de type NMDA.
- la réponse induite par le NMDA (200 ~M) est abolie lorsque le milieu ne
contient pas de glycine, ou lorsque les ant~gon;~les du NMDA, AP5 ou AP7, sont
appliqués (200 ~M) sim-llt~nPm~nt au NMDA. Ce résultat indique que la réponse auNMDA des oeufs injectés est pharmacologiquement co,l.p~ble à celle d'un
réceptet)r NMDA natif.
- la réponse induite par le NMDA (200 ,uM) est ~imim~ee lorsque l'on ajoute
du m~gn~sium (200 ~M) dans le milieu, ou lorsque l'on al1gm~nte la concentrationexterne en calcium (2,5 mM).
5. Recherche de sé~uences nucléotidiques et de polypeptides homolo~ues dans
d'autres tissus
La séquence nucléotidique SEQ ID n 1 a ensuite été utilisée comme sonde
pour la mise en évidence de séquences homologues à partir d'autres tissus. Pour cela,
2 techniques ont été utili.~ees:
- l'hybridation en Northern blot,
- l'hybridation in situ.
Les tissus utilisés pour la recherche de séquences homologues sont les
suivants d'origine murine: cervelet, cortex, str ~t~m, hippocampus.
5.1. Recherche en Northern Blot
Les ARNm-polyA ont été p~pares à partir des tissus indiqués ci-dessus
selon la technique à l'isothiocyanate de gu~ni(linium décrite par Chirgwin et al.
[Bior~e--.;,l. y 18 (1979) 5294], suivie d'un passage sur colonne d'oligodT-cellulose.
Ces ARNm ont ensuite été fractionnés sur gel d'agarose, puis transférés sur
membranes de nylon (Hybond N+). La sonde utilisée pour l'hybridation correspond à
l'ADNc de 1,7 kb entier décrit dans l'exemple 2 (SEQ ID n l) préalablement marqué
FEUiL' E DE RFMPLACEh~EN~
lS~aJEP
WO g3/25679 PCI/FR93/00557
2~J 38~S1 14
au 32p selon la technique décrite par Maniatis et al (Cf techniques générales declonage). L'hybridation avec les di~Çe.e.l~ tissus a été réalisée dans des conditions de
strin~en~e élevées: hybri~lation à 42C, 6 x SSC, 50 % fo....~-..;(le, 1 x Denhardt's,
rinçage à 65C, 0,1 x SSC, 1 % SDS.
s Cette étude a permis de mèttre en évidence des fragm~nt~ d'ADN spécifiques
homologues dans tous les tissus étudiés (figure 5).
5.2. Recherche par hybridation in situ
Les ex~rien~es d'hybridation in sitU ont été ré~ s sur des sections
cryostatées de cerveau de rat selon la technique décrite par Hafen et al. [EMBO J. 2
0 (1983) 617]. La sonde utilisée pour ces eApé,iences correspond à l'ADNc de 1,7 kb
entier décrit dans l'~Y~mple 2 (SEQ ID n 1) préalablement marqué au moyen de
déoxyuridine tnphosph~te marquée à la digoxig~-nine (dig-U, Boehringer ~nnh~im)
selon la technique décrite par Dumas et al. [J. ~e~sci. Res. ~ (1990) 569]. Ce
marquage non radioactif ainsi que la détection des hybrides ont été réalisés par test
in"l-uno-enzymatique en uti~ nt des anticorps anti digoxig~nine conjugués à la
phosph~t~e ~lc~lin~, qui sont révélés en présence d'un substrat chromogénique del'en_yme, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosph~te et le sel de tétra7olit-m du
"nitroblue" en suivant les recon\...~n~tions du fabricant (Boehringer Mannheim)
L'hybridation avec les dir~éfe.,~ tissus a été réalisée dans des conditions de stringence
élevées: hybridation à 42C, 6 x SSC, 50 % fo.. ~-~-.. itle, 1 x Denhardt's, rinçage à
65C, 0,1 x SSC, 1% SDS.
Cette étude a permis de mettre en évidence des séquences homologues selon
l'invention notamment dans les cellules de Purkinje et dans les cellules granulaires du
cervelet, dans les cellules pyr~mid~l~s des régions CA1 et CA3 de l'hippocampus, et
2s dans certaines régions du cortex.
Il est ~nt.on-lu que les même expériences peuv~nl être répétées en utili~nt
d'autres tissus et not~mment des tissus d'origine hllm~ine, et d'autres sondes. Par
ailleurs, les séquences homologues mises en évidence lors de ces expériences peuvent
évic~emment être ensuite isolées et/ou ~mplifiées par les techniques classiques de
30 biologie moléculaire.
- . FEUILLE L)E REM~'LACEMENT
ISA/EP
wo g3,256,g 2 1 3 8 1 5 1 rCr/~Rg3/no557
6. Utili~tion d'~nticor~s ~nh-polype~tides G~3 po~r la rni~ en évidence de
séq~ ces ~l~rléoti~liQues et de polr~ept;des homolo~ues ~l~nc d aul~es tic~lc
Des ~ullicol~s polyrl~ n~ c anti polypepti~es GR33 ont été pf~pa~s et
utilisés pour la mise en évidence par des P~ ;P~cPc de Weste~n blot de polype~ti~l~s
homok~ s à partir d'autres tissus.
6.1. ~p~ ~I;on des anticorps.
Un fr~mPnt de l'ADNc co.~lP~ la région codant pour le polypeptide
GR33 SEQ ID n 1 décrit dans l'exemple 2 a été généré par-PCR au moyen des
oli~nnl~rléotides sp~ifillues su~
o (i) TAATACGACTCACTATAGGATCCGACCCCGGCCTCCAGCA
(ii) GCAATTAACCCTCACTAAAGAATTCCCGATGTGTGGGGAGG
Ces oli~nnucléotides col,cs~>olldelll Ic~ iv~ ent aux positiQnc 124 et
1104 sur la céqllenre SEQ ID n 1.
Le produit de cette ~n~plific~ti~n a ensuite été sous cloné dans le vecteur
d'eAplc~ion d'E.coli p&EX-2 lSmith et John~on, Gene 67 (1988) 31] de manière à
peilllellr~ son eA~I~s~ion sous forme d'une protéine de fusion avec la ~hlt~thic-n-S-
félase (GST-GR33). La plole,lle de fusion ainsi produite a ensuite été purifiée et
utilisée comme ~nti~n~ pour pr~ar~ des anticorps chez le lapin. Pour cela, les
lapins ont été ;~ nieé~c avec 50-100 ~g d'~nti.~n~ en présence d'adjuvant complet
de Freund. Après 3 s~ c, une nouvelle injection a été faite avec 50 llg d'~ntiE~ne~
mais sans adjuvant co...pl~t de Freund. Après 2 inje~tir~n~ les sérums ont été
collectec et conselv~s conE~
6.2. Mise en évidence de séquence. homologues
Des membranes ~..~ oso...AlPs ont été préparées selon la technique décrite
25 par Mi~h~ et al. [J. Ne~r~ el". 42 (1984) 397] et solubilisées en présence de
0,5 % de sodium-déoxy hc~l~te Environ 50 ~g de protéines ainsi obtenllPs ont étésoll"lises à une analyses électrophorétique sur gel SDS à 10 ~o. Les protéines ont
ensuite été transférées sur nitrocellulose et mises en contact avec les anticorps
p,~parés en 6.1. ci dessus. Les anticorps liés ont ensuite été révélés au moyen du
30 système de détection ECL (Ame~h~m).
,
WO 93/25679 PCI/FR93/00557
2~ 381S~ 16
Comme il app&~ sur la figure 6, cette étude a permis de mettre en évidence
dans les m~mhr~n~s ~ osc!~n~l~ dirre~nls polypeptides col,.p~n~ll tout ou
partie de la séquence peptidique SEQ ID n 1 et ayant des poids molec~ ires de 35
kDa, 69-70 kDa, 97-98 kDa et 110 kDa environ.
5 7. I~olement et cara~élisalion d'un clone ~énomique humain codant ~our un
polypeptide GR33.
Cet exemple décrit l'i~olem~nt et la ca~a~ ,.l;on d'un clone génomique
h11m~in codant pour un polypeptide GR33. Ce clone a été obtenu par criblage d'une
banque hllm~ine en utili~nt comme sonde l'ADNc H500 radiomarqué.
Le clone hllm~in de la figure 2 a été obtenu par criblage d'une banque
g~nomique h.. Ai~ con~huile dans le vecteur lambda EMBL3 (Clontech). Cette
banque conti~nt des inserts gi~nomiques de 13 kb environ insérés dans le site SalI du
vecteur lambda EMBL3. Cette banque a été criblée avec l'ADNc H500 préalablement
marqué au 32p par la technique du "random priming" [Feinberg et Voge1~tçin,
15 Analytical Bio~h~mi~y 132 (1984) 6]. L'hybri(latic)n a été réalisée dans les
conditions de strin~nre élevée suivdllles: hybridation à 65C, 3-4 x SSC, 5 x
Denhardt's, rinçage à 65C, 0,1 x SSC, 1 % SDS. Environ 2.105 clones de la banque
ont ainsi été analysés. Un clone positif a été isolé et purifié. Le pl~cmide ainsi obtenu
(AE17) porte un insert g~nomique de 12 kb environ, dont une carte de restriction est
20 plésenlée sur la figure 3. La séquence codant pour le polypeptide GR33 est située
dans le fragment 3' HindIII-PstI de 6,5 kb du pl~mide ~E17.
F~UILLE DE REhAPLACE~MEN~
ISA/EP
W O 93/25679 P(~r/FR93/00557
21381Sl
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(Bl RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C VILTT~': ANTONY
(E PAYS: FRANCE
(F CODE POSTAL: 92165
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouveaux polypeptides ayant une activite
de recepteur NMDA, acides nucleiques codant pour ces polypeptides et
utilisations.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1
(iv) FORME T-T-~TRT-T' PAR ORDTNA~uR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
20 (B) ORDTN-A~uR: IBM PC compatible
(C) ~Y~.IE D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
ti) CARACTERISTIQUES DE LA ~:Q~
(A) LON~u~uK: 1200 paires de bases
(B) TYPE: acide nucleique
(C) NOMBRE DE.BRINS: double
(D) CONFIGURATION: 1in~ire
(ii) TYPE DE MOTT~'C~T~T~': ADNc
(vi) ORIGINE:
(B) SOUCHE: Rat
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPT.~M~NT: 211..1û77
(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "Recepteur GR33 de rat"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
AllCCGGGCA GCCTAGG~AG AGCCAGTCGG CCCAGGCCCC l~ lGCC TGGCCTCAGC 60
TCCCCGCCCC CCCGCCGCGC ACCTTACCCG CACATCCCTC GGAGGTCTAG CCGGGTGCCC 120
CCAGACCCCG GCCTCCAGCA CAGAGGCAAG AGGCAGAGAG CAGCAGCGGA GGCGGGAGGA 180
CGAAGAAGGG GAGGAGGAGC CC~rCGCAGG ATG AAG GAT CGG ACT CAG GAG CTG 234
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu
1 5
CGG AGT GCA AAA GAC AGT GAC GAT GAA GAG GAA GTG GTT CAT GTG GAT 282
Arg Ser Ala Lys Asp Ser Asp Asp Glu Glu Glu Val Val His Val Asp
CGA GAC CAC TTT ATG GAT GAG TTC TTT GAG CAG GTG GAA GAG ATC CGA 330
Arg Asp His Phe Met Asp Glu Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg
GGC TGC ATC GAG AAA CTG TCC GAG GAT GTG GAG CAA GTG AAG AAA CAG 378
Gly Cys Ile Glu Lys Leu Ser Glu Asp Val Glu Gln Val Lys Lys Gln
WO 93/25679 PCI/FR93/OOSS7
2~3815 1 18
CAC AGT GCC ATT CTT GCT GCC CCC AAC CCC GAT GAG AAG ACT AAA CAG 426
His Ser Ala Ile Leu Ala Ala Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Gln
GAG CTG GAG GAC CTC ACG GCA GAC ATC AAA AAG ACG GCA AAC AAG GTC 474
Glu Leu Glu Asp Leu Thr Ala Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val
:j
CGG TCC AAG TTG AAA GCG ATC GA~iCAG AGC ATT GAG CAG GAA GAG GGG 522
Arg Ser Lys Leu Lys Ala Ile~G`lu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly
100
TTG AAT CGT TCT TCT GCA GAC CTG CGT ATC CGT AAG ACC CAG CAC TCC 570
Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser
15 105 110 115 120
ACA CTC TCA CGG AAG TTC GTG GAG GTA ATG ACC GAA TAT AAT GCA ACT 618
Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val Glu Val Met Thr Glu Tyr Asn Ala Thr
125 130 135
CAG TCT AAG TAC CGG GAC CGC TGC AAG GAC CGT ATC CAG AGG CAG CTG 666
Gln Ser Lys Tyr Arg Asp Arg Cys Lys Asp Arg Ile Gln Arg Gln Leu
140 145 150
GAG ATC ACT GGC AGG ACT ACT ACC AAC GAA GAG CTG GAA GAC ATG TTG 714
Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr Thr Asn Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu
155 160 165
GAA AGC GGG AAG CTG GCC ATC TTC ACG GAC GAC ATC AAA ATG GAC TCG 762
Glu Ser Gly Lys Leu Ala Ile Phe Thr Asp Asp Ile Lys Met Asp Ser
170 175 180
CAG ATG ACA AAG CAA GCC CTG AAT GAG ATA GAG ACA AGG CAC AAT GAG 810
Gln Met Thr Lys Gln Ala Leu Asn Glu Ile Glu Thr Arg His Asn Glu
35 185 190 195 200
ATC ATC AAA CTG GAA ACC AGC ATC CGA GAG CTG CAC GAC ATG TTT GTG 858
Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Val
205 210 215
GAC ATG GCC ATG CTC GTG GAG AGC CAG GGT GAG ATG ATC GAC CGA ATT 906
Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile
220 225 230
GAG TAC AAT GTG GAA CAT TCT GTG GAC TAC GTG GAG CGA GCC GTG TCC 954
Glu Tyr Asn Val Glu His Ser Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser
235 240 245
GAC ACC AAG AAA GCT GTG AAA TAT CAG AGC AAG GCC AGG AGG AAG AAA 1002
Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys
250 255 260
ATT ATG ATC ATC ATT TGC TGT GTG GTG CTG GGG GTG GTC TTG GCG TCA 1050
Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys Val Val Leu Gly Val Val Leu Ala Ser
55 265 270 275 280
TCT ATT GGG GGG ACA CTG GGC TTG TAGGCCCCTA CCCTTCTCTT CCCCAGGACC 1104
Ser Ile Gly Gly Thr Leu Gly Leu
285
CTCCCCACAC ATCGGGAGCA ATACCCCCAC CACCCTTTCA CTCTTTCCCC TGCTCCAAGC 1164
- TCACTCCCAA AACAGACCCA GGCAGTTCCA GCCTCT 1200
