Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
~ 1 ~ 4 ~ 3 ~
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MICROGRANULES UTILISABLES EN COMBINAISON AVEC DES
INOCULUMS BACTERIENS, LEUR OBTENTION ET LEUR
APPLICATION EN AGRICULTURE
L'invention concerne le domaine des cultures
agricoles dans lesquelles on utilise des semences, des
plants et tous autres supports de culture connus. Sous
un autre aspect l'invention fait partie de la
technique générale du traitement des sols en
agriculture. Elle est applicable avec beaucoup
d'avantages aux cultures de légumineuses.
Dans la technique antérieure, on a déja proposé
de mettre en oeuvre des inoculums microbiens en
agriculture. Le but de cette technique est d'apporter
au moment de la mise en place dans le sol des graines
ou des plants, les bactéries utiles ou indispensables
pour la croissance de la plante. Les inoculums
utilisés a cet effet peuvent être des cultures
microbiennes liquides, ou sur support solide. Il peut
s'agir également de cultures microbiennes
déshydratées, sous forme de gel ou de lyophilisat.
Les inoculums actuellement mis en oeu~re et
devant faire l'objet d'une homologation sont des
cultures pures, exemptes de contaminant afin de
faciliter le contrôle de qualité, améliorer la survie
et empêcher toute introduction autre que le microbe
autorisé.
On connaît plusieurs techniques différentes
d'utilisation de tels inoculums. Par exemple, dans le
cas des légumineuses, une premiere techniques consiste
a apporter l'inoculum au moment du semis par mise en
contact avec la graine. Une variante consiste a mettre
en oeuvre des graines préinoculées. Une autre
technique prévoit l'inoculation du lit de semences :
l'inoculum est alors apporté dans la raie de semis,
soit sous forme liquide, soit sous forme de
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microgranulés, ceux-ci étant pratiquement épandus a
l'aide de dispositifs connus a cet effet pour
distribuer les produits phytosanitaires. Cette
dernière technique est souvent préférée par les
agriculteurs, car les quantités de produit a manipuler
sont plus faibles que dans le cas de l'inoculation des
semences. Par exemple, il suffit d'utiliser environ 10
kg par hectare de microgranulés au lieu de 80 a 150 kg
de graines dans le cas de l'inoculation des semences.
Les résultats dé~a enregistrés dans la pratique
montrent aussi que l'efficacité de la technique
d'inoculation du lit de semences aussi bonne.
A titre illustratif, on connaît actuellement
une technique qui consiste à mélanger au moment de
l'emploi, à sec, une certaine quantité d'inoculum
bactérien sur support solide, tel que de la tourbe,
avec des microgranulés minéraux d'origine
industrielle, tels que des argiles, des carbonates ou
autres, dont la taille est appropriée pour l'épandage.
Dans la pratique la granulométrie est d'environ 0,2 à
O,8 mm. Une telle technique a l'avantage d'utiliser
des microgranulés peu coûteux, en combinaison avec des
faibles quantités d'inoculums, lesquels peuvent être
facilement conservés à part. Dans une telle technique,
on ne se préoccupe pas vraiment de la fixation de
l'inoculum sur les microgranulés, ceux-ci ne servant
en fait qu'à diluer l'inoculum. La nature de tels
microgranulés peut être très variée et en dehors des
matériaux argileux et minéraux, dé~à cités, on peut
mentionner la tourbe, le sable, les billes de
polyéthylène et autres matieres analogues susceptibles
d'être épandues par les engins agricoles.
Une autre technique connue consiste a inoculer
a l'avance et lors de la fabrication des granulés de
nature diverse, de maniere a réaliser des
~ ~14~739
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microgranulés prêts a l'emploi. On connaît ainsi des
granulés contenant le ou les micro-organismes a
inoculer, a base d'argile, de tourbe, d'alginates, de
vermiculite, de perlite, de gels de divers
polysaccharides, de silice, de sulfate de calcium. Ont
été également décrits des microgranulés comportant des
associations de constituants, par exemple de la
calcite enrobée de tourbe, des gels de polysaccharides
et de silice, des mélanges tourbe-argile et de sulfate
de calcium, des argiles et alginates, entre autres.
Cette technique de réalisation a l'avance des
microgranulés inoculés est séduisante, mais il est
tres difficile de fabriquer ces produits en conditions
stériles et d'assurer un stockage a basse température
compte tenu des volumes impliques, la quantite de
produit a utiliser etant de l'ordre de lO ~g par
hectare par exemple. Par ailleurs, si l'on introduit
aussi des substances nutritives avec le support des
microgranules inocules, il y a un risque accru de
développement de germes contAmi~nts dans le milieu
ainsi enrichi.
Les brevets et demandes de brevet suivants
illustrent cet état de la technique.
Le brevet US-5055293 (ARONSON) a pour objet la
lutte biologique contre les larves d'un insecte
infectant le maïs.
Des granules d'argile inerte, ou d'un autre
matériau minéral ou organique acceptable pour l'usage
agricole, recouvert d'une couche de bactéries Bacillus
laterosporus y sont décrits.
Ils peuvent être vaporisés avec une solution de
cellules ou de spores pouvant contenir des matières
nutritives et des excipients, puis être séchés.
Ce document ne mentionne pas le dépôt de
microorganismes, juste avant l'application en champ,
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21~L7~ 4
sur des granules contenant déjà des matieres
nutritives.
La demande de brevet européen EP-A-0295968
(PIONEER FRANCE MAIS) a pour objet la protection de
microorganismes contenus dans des compositions
d'engrais. Les microorganismes sont microencapsulés
dans une matrice de polysaccharide, puis l'inoculum
ainsi préparé est mélangé a l'engrais sous forme
solide ou sous forme liquide immediatement avant
l'épandage. On notera, qu~il n'est question que
d'engrais minéraux pour la croissance des plantes et
non d'addition de substrats nutritifs pour obtenir une
croissance dans le sol d'un microorganisme. De plus,
les microorganismes sont prémicroencapsules avant leur
melange a l'engrais.
La demande europeenne EP-A-0203708 (AG~ACE~US)
concerne un procede d'adsorption de bacteries en phase
stationnaire par melange des suspensions de bacteries
avec un support granulaire, chimiquement inerte et
poreux, puis sechage. Aucune substance nutritive n'est
ajoutee a ces granules.
Enfin, la demande européenne EP-A-0479 402
(LIJIMA, RYUSUKE) a pour objet une methode de
production d'un fertilisant mycélien dans laquelle on
incube des thermoactinomycètes en présence d'un
support poreux, ledit support ayant été au préalable
malaxé avec de l'acide pyrolignique.
Les thermoactinomycetes sont laissés en
fermentation durant au moins deux jours en maintenant
la température entre 55 et 80-C.
Les microorganismes ne sont donc pas ajoutés
juste avant l'application en champ des granules.
La présente invention appartient a la technique
générale d'inoculation microbienne a l'aide de
microgranulés a inoculer extemporanément. Elle a
W094/06733 ~ 14 ~ 7 3 ~ PCT/FR93/0090l
principalement pour objet d'utiliser des microgranulés
qui, apres enfouissement dans les sols, permettent
d'améliorer la survie et d'obtenir une multiplication
des micro-organismes de l'inoculum.
Sous un premier aspect, l'invention concerne
des microgranulés comprenant un support solide et au
moins une substance capable de favoriser la croissance
des germes d'un inoculum microbien avec lequel les
micro-granules sont mis en contact au moment de
l'emploi.
Les microgranulés selon l'invention ne sont pas
inoculés à l'avance. Ils sont mis en oeuvre, au moment
de l'emploi, conjointement avec l'inoculum microbien.
Sous un autre aspect, l'invention a aussi pour
objet un procédé pour améliorer le rendement des
cultures agricoles, dans lequel on utilise un inoculum
contenant au moins une culture microbienne et des
microgranulés, ledit procédé étant caractérisé en ce
que les microgranules comprennent au moins une
substance capable de favoriser la croissance des
germes de l'inoculum.
Le procéde de l'invention consiste donc a
utiliser des microgranules contenant une su~stance,
notamment un substrat nutritif, capable de favoriser
la croissance des germes de l'inoculum, lesdits
microgranules étant prepares a l'avance et pouvant
être stockes a l'etat sec, et a les inoculer au moment
de l'emploi par un inoculum microbien, afin d'obtenir
dans le sol une meilleure survie et une croissance de
cet inoculum.
Pour les besoins de la presente invention, on
peut utiliser tout type de microgranules obtenus par
broyage ou granulation, qu'il s'agisse de
microgranules de nature minerale ou organigue, ou des
melanges de tels granulés. Parmi les granules
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2~ ~73~ 6
d'origine minérale, on peut citer les argiles
industrielles et les mélanges argileux, qui ont donné
de bons résultats pratiques. Quant aux microgranulés
d'origine organique, on peut citer divers substrats
granulés ou broyés, à base de tourbe, compost, résidus
végétaux et autres. La littérature technique contient
de nombreux exemples de microgranulés utilisables
ainsi que des indications sur la granulométrie
souhaitable. Il convient de choisir des dimensions de
grains qui conviennent a l'épandage avec les engins
sgricoles usuels, et on sait qu'une dimension
appropriée pour la taille des microgranulés est de
l'ordre de 0,2 a 0,8 mm, a titre indicatif et non
limitatif.
Selon la caractéristique essentielle de
l'invention, les microgranulés en cause sont enrichis
a l'avance, par mise en contact des microgranulés
proprement dits et du substrat d'enrichissement,
le~uel consiste en au moins une substance capable de
favoriser la croissance des germes de l'inoculum
microbien.
Dans la pratique, l'enrichissement des
microgranulés a l'avance peut être réalisé par
imbibition, immersion ou pulvérisation des
microgranulés et séchage ultérieur, par granulation
d'une suspension de matériau solide et du substrat
d'enrichissement ou par mélange des microgranulés avec
les substrats d'enrichissement finement broyés. Selon
ce mode de réalisation, les microgranulés préparés a
l'avance peuvent être stockés secs, de façon a ne pas
permettre le développement des micro-organismes durant
le stockage.
Pour ce qui est des substances ou substrats
d'enrichissement, on peut utiliser tout produit
capable de favoriser la survie et la multiplication du
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germe a inoculer, soit directement en permettant ou
stimulant sa croissance, soit en limitant la
croissance des germes compétiteurs du sol. On peut
notamment utiliser des substrats carbonés comme le
glucose, le glycérol et toute autre source de carbone
convenant a la croissance de la plupart des micro-
organismes ou bien au contraire faire appel a des
substrats carbonés spécifiques du germe a favoriser.
Il est également possible d'utiliser d'autres
produits, not~mment azotés ou phosphorés et plus
généralement tout nutriment susceptible de permettre
la croissance du germe a inoculer. Mais, selon le
concept inventif présentement décrit, on peut aussi
utiliser des biocides compatibles avec le germe a
inoculer mais susceptibles d'inhiber la croissance des
compétiteurs ou de la ralentir, tels que des produits
actifs dans le sol contre les bactéries, les
champignons et les protozoaires. Ces types de produits
sont connus de l'homme du métier et peuvent être
notamment choisis parmi les antibiotiques , les
fongicides et plus généralement tout produit
phytosanitaire.
Il a été indiqué précédemment que dans le
procédé de l'invention on pouvait utiliser un inoculum
contenant au moins une culture microbienne. De fait,
l'inoculation peut faire appel a un ou plusieurs
germes, qui peuvent être apportés successivement ou en
mélange. Les microgranulés sont inoculés par
l'utilisateur, au moment de l'emploi ou peu de temps
avant celui-ci. Tous les types d'inoculum peuvent être
utilisés, quels que soient leur support et leur
conditionnement, par exemple des inoculums sur support
solide, tel que la tourbe, des inoculums liquides, des
inoculums en gel ou des inoculums lyophilisés.
C'est techniques d'inoculation sont connues de
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l'homme du métier et n'ont pas à être décrites plus en
détail.
L'invention peut être appliquée avec un ou
plusieurs micro-organismes susceptibles d'être
utilises dans l'inoculation des semences, des plants,
des supports de culture et des sols. Il s'agit
notamment de tous les micro-organismes utilisables
pour favoriser directement la croissance des plantes,
tels que ceux appartenant aux espèces Rhizobium,
Bradyrhizobium, Azospirillum, ainsi que les
champignons ecto- et endomycorhizogenes. Des resultats
probants ont été obtenus avec le micro-organisme
Bradyrhizobium japonicum. Entrent également dans le
cadre de l'invention les micro-organismes utilisables
en lutte biologique contre les maladies des plantes et
les ravageurs, comme les bactéries antagonistes des
bactéries et des champignons phytopathogenes (P.G.P.R.
: Plant Growth Promoting Rhizobacteria, Pseudomonas,
Agrobacterium, Bacillus et autres genres similaires),
les champignons antagonistes des champignons
phytopathogenes (Fusarium, Trichoderma, et autres
especes similaires) et les bactéries et champignons
entomopathogenes (Bacillus thuringiensis, Beauveria,
et autres espèces similaires). On peut encore citer
les micro-organismes utilisables dans la dépollution
et la bioremédiation des sols.
L'invention procure des avantages par rapport à
l'utilisation traditionnelle d'inoculum. On sait en
effet que l'efficacité des inoculations microbiennes
dans l'agriculture dépend directement du nombre de
germes vivants et efficaces apportés. Il est également
connu que les pertes immédiates à l'inoculation sont
généralement très importantes et sont dues
principalement a la mortalité des germes apportés par
dessication. On s'efforce donc à l'heure actuelle de
W094/06733 ~1~ 4 7 ~ ~ PCT/FR93/00901
9 ~, .
trouver des procédés qui permettent d'augmenter la
dose possible de micro-organismes à inoculer. Mais il
- faut aussi limiter les pertes de micro-organismes lors
de l'utilisation aux champs, tout en tenant compte des
limites physiques, les quantités possibles à inoculer
étant limitées par le poids de graines ainsi que par
les équipements disponibles, aussi bien qu'économiques
(coûts de production, stockage). Pour cette raison, on
a déjà proposé dans la technique antérieure de
réaliser la croissance du micro-organisme inoculé dans
les sols, mais seulement après inoculation. Certaines
tentatives ont été faites pour ajouter des substrats
nutritifs directement dans le sol, par exemple un
substrat carboné. Mais il faut alors ajouter au sol,
par exemple dans le cas du traitement d'un lit de
semences, entre 20 et 200 kg de substrat carboné par
hectare, ce qui correspond à des quantités totalement
irréalistes en grandes cultures.
L'invention permet d'obtenir une croissance
dans le sol des germes apportés en augmentant leur
nombre, ce qui se traduit soit par un effet amélioré
de l'inoculation, soit par un effet de sécurité au cas
où des conditions difficiles sont présentes lors du
traitement d'inoculation, ce qui peut etre le cas d'un
inoculum partiellement déficient ou d'une mortalité
anormale à l'inoculation. Grace à l'invention, la dose
de micro-organismes mise à la disposition de la
semence ou de la plante peut etre augmentée ou
maintenue dans d'excellentes conditions de sécurité.
On a déjà dit précédemment que l'on connaissait
dans la technique antérieure l'utilisation de
microgranulés, et plus particulièrement de
microgranulés préinoculés c'est-à-dire inoculés à
l'avance lors de la fabrication. Par rapport à une
telle technique de microgranulés préinoculés, la
-
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présente invention procure de nombreuX avantages, en
particulier les suivants :
- l'invention permet d'utiliser des
microgranules du commerce, géneralement peu coûteux,
- l'enrichissement en substrat nutritif peut
etre réalisé sans exigence de stérilité et est donc
moins couteux,
- risques nuls ou très reduits de développement
de germes contaminants dans les microgranulés au
stockage tstockage sec), alors que de tels risques
apparaissent sur des microgranulés préinoculés,
- stockage possible a température ordinaire sur
une longue durée, les propriétés du microgranulé
n'étant pas liées au nombre de germes qu'il contient
et a leur survie, alors qu'on connalt l'effet
défavorable de la température pour la survie d'un
inoculum et des microgranulés préinoculés,
- stockage au froid possible de l'inoculum
microbien en petit emballage séparé des microgranulés,
lesquels peuvent être conditionnés en emballage
volumineux,
- possibilités variées de jouer sur la nature
et la concentration des substrats, l'adaptation de la
nature et de la spécificité du substrat au germe a
inoculer,
- possibilité d'addition de biocides
défavorisant les competiteurs, sans ris~ues de
toxicité par contact prolongé entre l'inoculum et le
microgranulé.
L'invention sera maintenant illustrée sans etre
aucunement limitée par des exemples de mise en oeuvre
au laboratoire et au champ .
La figure l représente les résultats obtenus
avec des granules enrichis de Bradyrhizobium
japonicum. Le développement des microorganismes ( en
7 3 9
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ordonnée ) est suivi en fonction du temps (en jour).
1es figures 2 et 3 illustrent la croissance de
populations de la souche de Pseudomonas C7Rl2 sous
forme liquide (L), sous forme argile normale (A) et
sous forme argile enrichie (Ae), respectivement en sol
naturel (figure 2 ) et en sol desinfecte (figure3).
Les figures 4 et 5 représentent l'évolution du
nombre de plantes de lin saines (en ordonnée) en
fonction du nombre de jour ( en abscisse)
respectivement en sol naturel (figure 4) et en sol
désinfecté (figure 5) traitées par différentes
formulations de microorganismes.
EXEMPLE l: Microqranulés inoculés par BradYrhizobium
japonicum.
On exposera d'abord tous les moyens et modes de
réalisation de l'expérimentation et ensuite les
résultats de celle-ci.
SOUCHES
Tous les essais en serre et au champ sont
réalisés avec la souche G49 commerciale (IARI SBl6,
New Delhi) de Bradyrhizodium ~aponicum. La culture
choisie est celle du soja.
On sait gue, pour cette plante, la nodulation
(nombre de nodosités, poids des nodosités) croît quand
la dose de Bradyrhizobium japonicum apportée augmente.
Par ailleurs, le rendement est lié à la nodulation.
Pour suivre l'évolution de populations
introduites dans les sols, on a utilisé une souche de
B.japonicum résistante a des antibiotiques. Au
laboratoire, a été isolé sur boîte de Pétri contenant
des antibioti~ues un mutant spontané de G49 résistant
a la rifampicine (l00 mg/ml) et a la kanamycine (200
mg/ml), dont la stabilité a été vérifiée et qui a été
denomme G49RfKm.
Cette nouvelle souche a été déposée a la
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73~ 12
collection CNCM de l'Institut Pasteur sous le N I-
1264 le ll Septembre 1992.
MICROGRANULES
Il s'agit de produits commerciaux repondant aux
criteres suivants :
- densité suffisamment élevée pour permettre
une bonne descente dans le microgranulateur,
- granulométrie : assez fine et homogene,
comprise entre 0,2 et 0,8 mm,
- pH compatible avec la survie des bactéries,
- absence de toxicité vis-a-vis des bactéries
inoculées,
- mélange avec un inoculum facile a réaliser,
retenant suffisamment la tourbe, et donnant un produit
homogene.
On a utilisé des granulés ayant une porosité
suffisante et ne se déstructurant pas dans l'eau, afin
de conserver toutes leurs propriétés lors des phases
d'imprégnation (par la solution d'enrichissement) et
de séchage. Cette procédure n~altere pas la facilité
de distribution des microgranulés par
microgranulateur.
Deux types de microgranulés répondant a ces
exigences ont été mis en oeuvre, l'un appelé K, a base
de cristoballite, et l'autre M, forme de
montmorillonite calcinée.
Le tableau 1 donne les caractéristiques
essentielles de ces microgranulés.
~44'7~
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TABLEAU 1
Caractéristi~ues essentielles de microqranulés
K et M utilisés dans les expérimentations
K M
Composition cristoballite te
(silice) calcinée
illite < 10 % (argile)
Teneur en eau
à pF 2,5 (point de
ressuyage d'un sol) 0,64 0,39
à pF 4,2 (point de
flétrissement) 0,48 0,21
pH 5,5 7,8
Granulométrie :
> 0,8 mm 1,0 ~ 1,4 %
0,8 - 0,25 mm 98 % 98 %
< 0,25 mm 1 % 0,2 %
Densité :
humidité 0 % 0,57 1,0
humid~té 13 % 1,0
humidité 30 % 0,70
Nombre de particules par kg 13 à 17X106 5 a 8X106
30 Déstructuration par l'eau non non
SUBSTRATS D'ENRICHISSEMENT
Ils sont formés essentiellement d'une source de
carbone, d'une source d'azote, et d'éléments minéraux.
Les produits retenus pour l'enrichissement sont
dissous dans l'eau. Le volume ne doit pas être
excessif, de façon a être absorbé entierement par la
porosité des microgranulés. Mais il doit être
suffisamment élevé pour, d'une part entraîner une
dissolution complete des produits, d'autre part
-40 permettre une homogénéisation du mélange avec les
microgranulés avant son absorption complete.
-Cette solution est apportée sur les
microgranulés secs, l'ensemble étant brassé
immédiatement afin d'obtenir un mélange uniforme. Elle
7 3 ~ ~
W O 94/06733 14 PC~r/FR93/00901
est absorbee par la porosite.
Un sechage ulterieur permet de laisser le
substrat nutritif sec dans cette porosité, autorisant
une conservation longue, même dans des conditions non
steriles.
Les concentrations utilisées pour les
expérimentations varient de 16 à 96g de matières
organiques (exprimées en carbone organiques), par kg
de microgranulés secs.
FONGICIDES ASSOCIES
Après un test sur leur efficacité contre les
champignons du sol et leur innocuité vis-à-vis des
souches inoculées, les produits retenus sont ajoutes
dans la solution d'enrichissement, avant leur
incorporation dans les microgranulés.
SOLS ET SUPPORTS DE CULTURE UTILISES
Essais au champ
L'essentiel du travail a été conduit sur un sol
argileux du domaine de l'INRA - Dijon, et une partie
secondaire a concerné un sol sableux de la région. Ces
sols étaient au départ dépourvus de B. japonicum.
Les caractéristiques essentielles sont données
dans le tableau 2.
2~L7~
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Tableau 2 : Caractéristiques des sols utilisés
pour les essais au champ
CaractéristiquesSol argileux Sol
5 sableux
Granulometrie en g/kg
argile 382 75
limon 562 227
sable 56 698
Humidite equivalente en p 100 28.1 9.9
Carbone organique methode Anne 16.06.9
15 en g/k
Matières organiques en g/kg 27.5 11.9
Azote organique total en g/kg 1.560.67
(Méthode Kjeldahl)
pH eau 7.0 7.3
Calcaire total 0 0
25 Capacite d'echange cationique
Metson en meq p 100 21.7 4.3
Essais au laboratoire.
Ils ont ete realises pour leur presque totalite
avec le même sol argileux que celui utilise pour les
essais au champ. Ce sol est depourvu de B. japonicum.
PLANTE
Tous les essais ont ete realises avec la
variete de soja Maple Arrow, de type indetermine et
appartenant au groupe de precocite OO.
INOCULUMS
En cas d'utilisation de la souche G49 normale,
l'inoculum, tourbe ou liquide, est un produit
commercial ("Biodoz", de la Societe LIPHA ).
L'inocolum de la souche G49 resistante
(G49RfKm) est produit au laboratoire.
Une fiole contenant un milieu de culture
liquide,a base d'extrait de malt, est inoculee
stérilement a partir d'un tube gélosé contenant la
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souche. Elle est ensuite placée sur une table
d'agitation (200 rpm) a 28 C pendant 6 a 7 jours. La
culture obtenue alors constitue l'inoculum liquide
utilise, qui peut être conserve plusieurs mois a 4 C.
Pour la production d'inoculum tourbe, on part
d'une tourbe stérile de même origine que celle de
l'inoculum commercial. Dans un flacon contenant 30g de
ce produit, a 12% d'humidité, on ajoute 12 ml
d'inoculum liquide. Après homogénéisation et
maturation 2 a 3 s~ines a température ambiante, on
obtient un produit qui a sensiblement les memes
propriétés que la tourbe commerciale: humidité de 55-
60%, richesse de 1'ordre de 109 germes par gramme de
tourbe.
TECHNIQUES D'INOCULATION DES MICROGRANULES
On a retenu une proportion correspondant a
celle de l'inoculation au champ, soit 4 ~ d'inoculum
pur par rapport aux microgranules.
Compte tenu des quantites nécessaires pour
l'introduction dans le sol, des facilités de
manipulation et de la précision espérée, on a
travaillé sur des lots de 25 g de microgranules
(mesurés secs et sans enrichissement), en flacons de
250 ml.
Pour l'utilisation avec l'inoculum tourbe, les
microgranulés sont d'abord humidifiés au niveau voulu.
Ensuite, chaque lot est inoculé avec 1 a 1,3 g
d'inoculum, le tout étant homogénéisé, puis utilisé
dans les minutes suivantes.
Lorsqu'ils sont employés avec un inoculum
liquide, les microgranulés, secs au départ, reçoivent
un inoculum préalablement dilué de facon a apporter
simultanement 1 ml d'un inoculum pur pour 25 g de
microgranulés, mais aussi la quantité d'eau nécessaire
pour être a l'humidité voulue (7,5 ml pour K et 3,25
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17 ~
ml pour M dans la plupart des expérimentations). Après
agitation pour homogénéisation, les microgranules sont
- utilises rapidement.
Techniques d'introduction dans les sols et
d'incubation
Après tamisage à 4 mm ou à 2 mm, les sols sont
introduits dans des flacons en verre, soit à raison de
50 g de sol sec dans un flacon de 500 ml, soit de 20 g
dans 250 ml. L'humidité est ajustee 24 h à l'avance,
en general au niveau de 80 ~ de la capacite de
retention en eau.
Dans ces flacons, sont introduits
respectivement 300 mg et 120 mg de microgranules, ce
qui represente respectivement environ 4500 et 1800
microgranules pour K, 2100 et 800 pour M.
Les flacons sont ensuite agités manuellement de
façon à répartir les microgranulés dans tout le volume
de sol.
Les flacons inoculés sont mis à incuber en les
fermant avec un film plastique, destiné à empêcher la
perte d'eau tout en permettant les échan~es
respiratoires. Ils sont ensuite placés à l'obscurité,
en general à 20- C, mais aussi à 15- C ou à 28- C pour
certains essais.
Les denombrements sont realises sur la totalite
d'un flacon après plusieurs jours d'incubation.
Denombrements en boîtes de Petri
L'essentiel des mesures consiste en des
denombrements de populations de B. japonicum capables
de former des colonies sur boîtes de Petri contenant
un milieu de culture gelose. Ces denombrements sont
realises à plusieurs stades de l'inoculation :
- inoculums eux-mêmes, avant utilisation, sur
des ~uantites generalement de 1 ml ou 1 g,
- microgranules après inoculation, en
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w14~7~ 18
travaillant soit sur la totalité d~un lot, soit sur
des aliquotes,
- sols ayant reçu des microgranulés inoculés,
en travaillant sur la totalité du contenu d'un flacon.
5Les produits a dénombrer pour leur richesse en
B. japonicum sont introduits dans 100 ml d'une
solution d'extraction et placés sur une table
d'agitation (200 rpm) pendant 30 minutes.
Des dilutions successives sont ensuite
réalisées au 1/10, et les suspensions bactériennes
obtenues sont étalees sur les milieux de denombrement
par l'une des deux methodes suivantes.
En absence de sol, un appareil (Spiral System)
dépose un volume connu de la suspension sur le milieu
gelose d'une boîte de Petri. Celle-ci est ensuite mise
a incuber à 28- C, puis les colonies presentes sont
denombrees a 5 ou 6 jours, d'ou un comptage en ufc
(unites formant une colonie). Un calcul a partir des
dilutions utilisees permet de determiner la richesse
du produit à analyser.
En presence de sol, l'sppareil precedent est
inutilisable, et les denombrements sont realises par
la methode appelee "double couche". Un faible volume,
0,1 ou 0,2 ml, d'une suspension a denombrer est
introduite dans un tube a hémolyse contenant 3 ml de
solution gelosee à 0,7 % en surfusion (43 C). Apres
homogeneisation, ce melange est etale sur une boîte de
Petri contenant le milieu de culture gelose, ainsi que
les antibiotiques et fongicides auxquels la souche
G49RfKm est resistante.
Apres incubation 7 jours a 28- C, les colonies
presentes sur les boîtes sont denombrees, les
dilutions etant realisees de façon a compter entre 30
et 300 colonies par boîte.
35Tous les denombrements sont realises avec 3
~1~4739
W O 94/06733 PC~r/FR93/00901
1~ , ,,
répétitions pour chaque traitement, et les résultats
sont donnés avec les écarts-type calculés.
- Essais au champ
Les essais mis en place sur les sols
précédemment décrits sont des dispositifs à 4 blocs
complets.
Le semis est effectué fin Avril-début Mai,
l'objectif étant d'apporter 600 000 graines par
hectare (variété Maple Arrow) inoculées a la dose
agronomique, soit 10 kg de microgranulés par hectare,
en lignes espacées de 30 cm. Ceux-ci sont enrichis et
inoculés dans les mêmes conditions que pour les
travaux au laboratoire, en lots de 1 kg, l'inoculation
ayant lieu au champ quelques minutes avant le semis.
L'irrigation est réalisée en cours de saison,
en fonction des besoins de la culture.
RESULTATS
Les résultats des expérimentations sont
rapportés ci-apres.
La figure 1 résume les résultats obtenus lors
d'essais de laboratoire, comparant des microgranulés
enrichis(E) ou non enrichis (M), inoculés par un
inocolum liguide et incubés dans un sol non stérilisé,
maintenu humide (H) ou soumis a la dessication (S).
Nombre de germes B. japonicum récupérés apres
inoculation en liguide sur microgranulés et
introduction dans le sol, en fonction du temps et
selon le déssechement du sol en cours d'incubation.
Les légendes de la figure sont : N = microgranulés non
enrichis, E = microgranulés enrichis GLY3C, H= sol
maintenu humide (82% de la capacité de rétention en
eau) pendant les 21 jours, S = sol soumis a un
déssechement naturel apres 7 jours d'incubation.
D'apres les résultats illustrés sur la figure
1, on voit que :
W094/06733 ~1~ 4 7 3 9 20 PCT/FR93/0090l
- apres 7 jours, les microgranulés enrichis
permettent d'obtenir une multiplication de B.
japonicum d'un facteur supérieur à 10 par rapport aux
microgranulés non enrichis,
- apres 21 jours, les microgranulés enrichis
maintiennent le nombre de B. japonicum à un niveau 10
fois supérieur à celui obtenu avec les microgranules
non enrichis quand le sol est maintenu humide et a un
niveau plus de 100 fois superieur quand le sol se
desseche.
Les tableaux 3 à 7 resument les resultats
obtenus lors d'essais au champ. Pour chaque tableau,
les donnees d'une même colonne suivies de la même
lettre ne sont pas statistiquement differentes au
seuil de 5 % suivant le test de Newman et Keuls.
Dans les tableaux 3 et 4, sont rassembles les
premiers resultats obtenus au cours d'essais au champ
en 1988 et 1989 respectivement. Ils montrent un effet
significatif de l'enrichissement sur la nodulation.
Les tableaux 5, 6 et 7 concernent des essais
effectues en 1990 et 1991 avec diverses conditions de
traitement, telles qu'indiquées en bas de chaque
tableau.
Dans le tableau 5, les traitements
correspondant à l'invention (microgranulés enrichis
inocules par un inoculum tourbe) sont les traitements
3, 6, 8, 10.
On peut constater une augmentation du nombre de
nodosites par plantes au stade V3, générale pour tous
les traitements, comparé au témoin microgranulés non
enrichis (traitement 2). Cette augmentation est
significative seulement pour les traitements 6 et 10.
De même, on obtient une augmentation du taux d'azote
des graines pour les traitements 3, 6, 8, 10,
significative seulement pour les traitements 8 et 10.
W094/06733 21 PCT/FR93/00901
Dans le tableau 6, les traitements 2, 6, 9 et
10 correspondent a l'invention (microgranulés enrichis
- inoculés par inoculum tourbe (2 et 6), ou par inoculum
liquide (9 et lO)).
Avec un inoculum tourbe (2 et 6 compares a 1),
on constate une augmentation du nombre de nodules, non
significative au stade V3, mais significative au stade
R4 pour le traitement 6 (ajout d'un fongicide dans
l'enrichissement).
Avec un inoculum liquide (lO comparé à 9), on
obtient une augmentation significative de la
nodulation a V3 et R4, ainsi qu'une augmentation
significative du taux d'azote des graines.
Dans le tableau 7, les traitements 2, 3, 4, 5,
(inoculés avec un inoculum tourbe) et 10 (inoculé avec
un inoculum liquide) correspondent a l'invention.
Avec l'inoculum tourbe (2, 3, 4, 5 comparés a
1), on obtient des augmentations non significatives de
la nodulation aux stades V3 et R4, mais des
augmentations significatives du taux d'azote des
graines. A noter que ce dernier effet est obtenu avec
différents substrats carbonés.
Avec l'inoculum liquide (10 comparé a 9), on
obtient une augmentation significative importante de
la nodulation (V3 et R4) et du taux d'azote des
graines.
EXEMPLE 2: Microqranulés inoculés Par Fusarium ou
Pseudomonas.
Parmi les malsdies cryptogamiques dont sont
affectées les plantes maraîcheres et les plantes
horticoles, la fusariose vasculaire, trachéomycose dûe
aux formes pathogenes du champignon Fusarium
oxysporum, est l'une des plus problématiques car il
n'existe pas a ce jour de moyen de lutte chimique
spécifique.
W094/06733 ~J l ~ 47 3 22 PCT/FR93/0090l
Par contre, la lutte biologique faisant appel à
la compétition entre une forme non pathogene et la
forme pathogène spécifique de la meme espece de
Fusarium oxysporum donne des resultats satisfaisants
dans les conditions de culture sous serre, soit en
substrat artificiel, soit en sol désinfecté. Le
principe consiste a introduire l'inoculum non
pathogène dans le substrat au moment du semis ou du
repiquage. De plus, l'effet antagoniste de souches non
pathogenes de F.oxysporum peut etre augmenté si l'on
co-inocule certaines bactéries fluorescentes
appartenant au genre Pseudomonas.
Le but des expérimentations de cet exemple est
de tester un mode de formulation original qui consiste
a donner un avantage compétitif a l'inoculum par
incorporation d'une source de nutriments dans le
support de formulation. Les dynamiques de populations
de bactéries du genre Pseudomonas Sp. ont été mesurées
a la fois en sol natural et en sol désinfecté.
L'activité des microorganismes inoculés a également
été testée dans des biotests réalisés en serre
utilisant le couple plante hôte-pathogene lin
F.oxysporum f.sp. lini.
MATERIEL ET METHODES
1- Les souches et les véqétaux.
Fusarium oxysporum souche Fo47B10, mutant
spontané résistant au bénomyl de la souche Fo47
utilisée en lutte biologique (n- de collection CNCM I-
1363).
Fusarium oxysporum f.sp. lini, souche Foln 3,
(n de collection CNCM I-1362) pathogene du lin.
Pseudomonas fluorescent souche C7R12 mutant
spontané résistant a la rifampycine de la couche C7
utilisée en lutte biologique (n de collection CNCM I-
35 1361).
7 3 9
W O 94/06733 23 PCI/FR93/00901
Le lin Linum usitatissimum, variété Opaline,
sensible a la fusariose vasculaire.
2- Le sol.
Sol limono-argileux prélevé dans la région de
Dijon, séché à l'air et tamisé a 2mm. (composition:
sable 15 ~, limon 47%, argile 35%, C 1.2 %, CaC03 0%,
pH 6,9).
Le sol est distribué dans des containers en
aluminium a raison de 140 g de sol sec/container. Le
sol désinfecté a été passé 3 fois 1 heure a
l'autoclave a 120 C a 24h d'intervalle. L'humidité du
sol est ajustée a pF3 ( 20% sol sec) lors de
l'inoculation.
3. Les inoculums
3.1- PréParation des inoculums fonqiques Pour
les biotests.
Les champignons sont cultivés 5 ~ours sur
milieu malt liquide agité a 25-C (malt Difco lOg, eau
déminéralisée 1000 ml). La culture est ensuite filtrée
pour éliminer le mycélium. Les spores contenues dans
le filtrat sont lavées 3 fois a l'eau stérile par
centrifugation 20 min, 4000 g.
L'inoculum de la souche de Fusarium non-
pathogene Fo47B10 est préparé sous forme d'inoculum
liquide (suspension de spores dans l'eau stérile).
L'inoculum de la souche de Fusarium pathogene
Foln3 est préparé sous forme de formulation talc: le
culot final est repris dans un volume d'eau minimum
(environ 20% du volume initial de la culture) et est
incorporé a du talc vierge (1 volume de culot -2
volumes de talc). Le mélange est mis a sécher 48h dans
une étuve ventilée a 20 C. Le talc est ensuite
pulvérisé et tamisé a 200 ym. Il est conservé a 4 C.
Son titre est mesuré avant toute utilisation. Le talc
inoculé est éventuellement dilué dans du talc vierge
W094/06733 ~ 24 PCT/FR93/0090l
lorsque des faibles densités d'inoculum sont
nécessaires.
3.2. Préparation des inoculums bactériens
Dans ce cas, l'argile est enrichie avec du
glycérol comme source de carbone a raison de 120 g de
glycérol/kg d'argile. Les bactéries produites sur
milieu solide King B (Peptone Difco 20g, glycérine
12.6g, K2HPO4 1.3g, MgSO47H2O 1.5g, Agar 15g, eau
distillée 1000 ml) sont récupérées dans de l'eau
stérile et lavées 3 fois par centrifugation (20 min,
4000g). Elles sont incorporées a l'argile au moment de
leur introduction dans le sol.
Les témoins sont réalisés par inoculation
directe de la suspension de bactéries lavées dans un
volume permettant d'ajuster l'humidité à la valeur de
pF3.
4- Les analyses
Chaque container constitue une unité
expérimentale. 3 unités expérimentales constituant 3
répétitions indépendantes sont réalisées pour un
traitement donné. Les containers incubent a 25-C. Les
dynamiques de population sont suivies pendant 20 a 30
jours.
A intervalles de temps réguliers, 5g de sol par
unité expérimentale sont prélevés, mis en suspension
dans 100 ml d'eau et agités fortement pendant 15 min
sur un agitateur constituant les suspensions meres.
Une série de suspensions dilutions au 1/10 est
réalisée a partir de chacune de ces suspensions meres.
Les dénombrements fongiques sont réalisés par
incorporation de 1 ml de la suspension au niveau de
dilution considéré dans du milieu malt agar+bénomyl en
surfusion (malt lOg, agar 15g, acide citrique apres
autoclavage 250 mg, Benomyl apres autoclavage 10 mg
sous forme de benlate a 50% de matiere active, eau
21 4 ~
W094/06733 25 PCT/FR93/00901
déminéralisée 1000 ml). 5 boîtes par niveau de
dilution sont ensemencées.
Les dénombrements bacteriens sont realisés par
étalement aux billes de 100 ~1 de la suspension au
niveau de dilution considére sur du milieu King B agar
additionne de 75 mg/l de rifampycine. Trois boîtes par
niveau de dilution sont ensemencees.
Les boîtes sont mises à incuber à 25-C et sont
lues apres 24h pour les bacteries et 48 a 72h pour les
champignons.
5- Les biotests
Les traitements identiques a ceux prevus pour
les dynamiques de population sont realises de maniere
concommitante a ces derniers et incubent dans les
mêmes conditions. Les containers sont ouverts aussi
frequemment que ceux destines a l'étude des
dynamiques. Les biotests sont realises apres que les
populations aient atteint un plateau en l'occurrence,
apres 30 jours d'incubation.
Le principe des biotests consiste à introduire
dans le sol contenant soit la souche de Fusarium
Fo47B10, soit la souche de Pseudomonas C7R12 soit les
deux, une souche de Fusarium oxysporum pathogene du
lin, la souche Foln3 est de cultiver du lin sur ce
sol. L'activite antagoniste de Fo47B10 et de C7R12 est
mesuree relativement au nombre de plantes saines
restantes.
3g de talc apportant 104 propagules de Foln3/g
de sol sont melanges au sol de chaque container
(melange realise au Turbula type T2C, 20'). Pour les
experimentations de co-inoculation, la souche Fo47B10
est apportee sous forme d'une suspension de spores
apres l'incorporation de l'argile inoculee par
Pseudomonas, dans un volume qui permet d'ajuster
l'humidite a la valeur de pF3.
W 0 94/06733 ~ ~ A 4 ~ 3 9 26 PC~r/FR93/00901
Les densites théoriques d'inoculum sont de 105,
104 et 107 CEU/g de sol sec pour respectivement
Fo47B10, Foln3 et C7R12, quelque soit le mode de
formulation. Les formulations argile, argile enrichie
et liquide sont codées A, Ae, et L respectivement dans
le texte et dans les figures. Le sol est ensuite
réparti dans les 12 puits d'une rangée d'une plaque de
polystyrene comportant 20 rangées. Le volume d'un
puits est d'environ 10 ml. Les plaques sont placées en
chambre climatisée dans les conditions suivantes:
photopériode 15h-9h, intensité lumineuse 13000 lux,
humidite 80% la nuit et 60% le jour, température 15 C
la nuit et 17 C le jour pendant 15 jours puis 20-C la
nuit et 26 C le jour les 8 semaines restantes. Les
arrosages sont effectués 2 fois/jour a l'eau du
robinet et 1 fois/semaine avec de la solution
nutritive.
Notation: Les notations sont faites tous les
trois jours a partir de la 3eme semaine apres la date
de mise en place du biotest en chambre climatisée. Les
plantes présentant des symptômes de fusariose sont
coupées (un isolement est réalisé pour vérification)
et le nombre de plantes saines restantes est
enregistré et exprimé sous forme d'un pourcentage
relatif au nombre initial de plantes.
RESULTATS
1. DYNAMIOUES DE POPULATIONS:
1.1 Dynamique de Population de C7R12 en sol
naturel.
Les résultats sont représentés sur la figure 2
dans laquelle L, A et Ae signifient respectivement
culture liquide, argile et argile enrichi.
L'inoculum apporte est en théorie de 107
bactéries/g de sol sec. L'inoculum liquide autorise
une récupération immédiate des germes de 70%, et les
7 ~ ~
W094/06733 27 PCT/FR93/00901
populations de Pseudomonas se maintiennent à une
densité proche de la valeur initiale, soit 3,2 107.
L'inocolum A autorise une recupération immédiate des
germes de 1,3% et se stabilise dans le sol a ce
niveau. Par contre, si l'inoculum Ae n'autorise qu'une
récupération immédiate des germes de 0,02%, la
population inoculée selon cette formulation passe de
1,3 105 a 8,5 107 en 4 jours et se stabilise a un
niveau supérieur a la population obtenue avec
l'inoculum liquide.
1.2 DYnamique de PoPulation de C7R12 en sol
désinfecté.
La encore, le pourcentage de récupération varie
avec le type de formulation. Il est de 42% pour la
formulation liquide contre 0,6% pour la formulation
Ae. Dans tous les cas, la densité de la population de
Pseudomonas augmente fortement. Les plateaux atteints
par les traitements L et A sont proches et voisins de
108 par exces. Ce plateau est superieur dans le cas du
traitement Ae où la densite atteinte est superieure a
109 (2,3 109) bacteries/g sol sec.
Les résultats sont représentés sur la figure 3.
II. A~llvll~ ANTAGONISTE
2.1- C7R12 en sol naturel.
Les résultats sont repris sur la figure 4. La
souche Fo47blO seule occasionne un retard important
dans l'apparition des symptômes. La co-inoculation
avec Pseudomonas augmente légerement ce retard et
aboutit à l'issue du test à un pourcentage de survie
supérieur a celui obtenu avec Fo47B10 seul, mais il
n'est pas possible de différencier les deux
formulations A et Ae.
2.2- C7R12 en sol desinfecte.
Comme le montre la figure 5, la souche Fo47B10
ne fait que retarder l'apparition des symptômes, mais
W094/06733 PCT/FR93/00901
~ 1 447~ 28
dans une proportion moindre que celle observee dans le
cas du sol naturel. La co-inoculation avec Pseudomonas
formule A permet d'augmenter ce retard. La plus grande
efficacite est cependant obtenue avec la formulation
Ae.
DISCUSSION - CONCLUSION
On constate que l'apport de nutriments azotes
et carbones dans le support de formulation (Ae) permet
une croissance tres importante des populations
bacteriennes introduites, aussi bien en sol naturel
qu'en sol desinfecte. Si la croissance de bacteries
introduites en sol desinfecte n'est pas un phenomene
nouveau, on peut constater neanmoins que la capacite
biotique du milieu a ete augmentee par l'apport
d'argile enrichie, alors que les plateaux obtenues
avec les deux autres modes de formulation sont
confondus. Par contre, la croissance d'une population
bacterienne et son etablissement a une densite elevee
(> 107 bacteries/g sol sec) n'ont que rarement ete
decrits en sol naturel.
On observe une meilleure efficacite protectr~ce
de la co-inoculation Fusarium-Pseudomonas en s~l
desinfecte via la formulation Ae qui s'explique, par
une densite plus elevee de la population bacterienne.
En sol naturel, cet effet est moins marque car
l'efficacite propre de Fusarium importante dans ce cas
peut difficilement etre amelioree mais la tendance va
cependant dans le sens d'un effet benefique de la
formulation Ae.
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